JPH01277490A - プライマーｄｎａ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、遺伝子のクローニングに有効に使用できるプ
ライマーＤＮＡに関するものである。
ライマーＤＮＡに関するものである。
（従来の技術および発明が解決しようとする問題点）
現在、生物活性を有する蛋白質の遺伝子をクローニング
する方法が種々提案されている。
する方法が種々提案されている。
例えば、目的とする蛋白質が精製されている時は、その
蛋白質の一部のアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配
列に相当するオリゴヌクレオチドを合成し、そのオリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズするクローンをｃＤＮＡ
ライブラリーから選択する方法が知られている。
蛋白質の一部のアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配
列に相当するオリゴヌクレオチドを合成し、そのオリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズするクローンをｃＤＮＡ
ライブラリーから選択する方法が知られている。
一方、目的とする蛋白質が精製の困難なものである時は
、その蛋白質のｍＲＮＡを分離してｃＤＮＡライブラリ
ーを作製し、そのｃＤＮＡライブラリーを用いてｍＲＮ
Ａをバイブリド形成法で選択し、さらに翻訳したものの
活性を測定することを繰返して単一のｃＤＮＡを分離す
る方法が知られている。
、その蛋白質のｍＲＮＡを分離してｃＤＮＡライブラリ
ーを作製し、そのｃＤＮＡライブラリーを用いてｍＲＮ
Ａをバイブリド形成法で選択し、さらに翻訳したものの
活性を測定することを繰返して単一のｃＤＮＡを分離す
る方法が知られている。
しかしながら、後者の方法では、少なくとも数百μｇの
ｍＲＮＡを必要とするため、少量の、例えば数μｇのｍ
ＲＮＡからでもｃＤＮＡをクローニングできる方法の開
発が望まれていた。
ｍＲＮＡを必要とするため、少量の、例えば数μｇのｍ
ＲＮＡからでもｃＤＮＡをクローニングできる方法の開
発が望まれていた。
かかる方法として、目的とする蛋白質のｍＲＮＡをポリ
リンカーの上流にｄＴ鎖を有するｐｃＤＶ１−ＰＬプラ
イマーＤＮＡにハイブリダイズして、ｃＤＮＡを合成し
、それをＳＰプロモーターを有するヘククーに組込み、
宿主を形質転換して目的蛋白質のｃＤＮＡをクローニン
グする方法が提案されている（特開昭６２’−７４２９
１号公報）。
リンカーの上流にｄＴ鎖を有するｐｃＤＶ１−ＰＬプラ
イマーＤＮＡにハイブリダイズして、ｃＤＮＡを合成し
、それをＳＰプロモーターを有するヘククーに組込み、
宿主を形質転換して目的蛋白質のｃＤＮＡをクローニン
グする方法が提案されている（特開昭６２’−７４２９
１号公報）。
しかし、」二連の様にプライマーＤＮＡを使用して少量
のｍＲＮＡから目的とする蛋白質のｃ Ｄ Ｎ Ａをク
ローニングする方法において使用し得るプライマーＤＮ
Ａの種類は未だ少ないのが現状であった。
のｍＲＮＡから目的とする蛋白質のｃ Ｄ Ｎ Ａをク
ローニングする方法において使用し得るプライマーＤＮ
Ａの種類は未だ少ないのが現状であった。
（問題点を解決するための手段）
そこで本発明者は、かかる方法において有利に使用し得
る新規なプライマーＤＮＡを提供すべく検討を重ねた結
果、特定のプラスミドｐＵＣ１９に着目し、その特定の
断片を更に修飾したものが、プライマーＤＮＡとして有
利に使用し得ることを知得し、本発明を完成するに至っ
た。
る新規なプライマーＤＮＡを提供すべく検討を重ねた結
果、特定のプラスミドｐＵＣ１９に着目し、その特定の
断片を更に修飾したものが、プライマーＤＮＡとして有
利に使用し得ることを知得し、本発明を完成するに至っ
た。
即ち、本発明の要旨は、プラスミドｐＵＣ１９由来の制
限酵素Ｓａβ■切断部位を含む制限酵素ＰｓｔＩ−Ｐｖ
ｕｌＩ切断断片から得られるプライマーＤＮＡであって
、該制限酵素、巴牡Ｉ切断部位の３′−末端にポリ （
ｄＴ）が付加され、且つ該制限酵素５ａｎｌ切断部位に
下記塩基配列で示されるＤＮＡ断片が挿入されているこ
とを特徴とするプライマーＤＮＡに存する。
限酵素Ｓａβ■切断部位を含む制限酵素ＰｓｔＩ−Ｐｖ
ｕｌＩ切断断片から得られるプライマーＤＮＡであって
、該制限酵素、巴牡Ｉ切断部位の３′−末端にポリ （
ｄＴ）が付加され、且つ該制限酵素５ａｎｌ切断部位に
下記塩基配列で示されるＤＮＡ断片が挿入されているこ
とを特徴とするプライマーＤＮＡに存する。
５ ’ −ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣ
ＣＴＣＧＡＧ−３’３ ’ −ＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＡ
ＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴ−５’以下本発明を説明す
るに、本発明で使用するプラスミドｐＵＣ１９は容易に
入手し得る公知のプラスミド（例えば、Ｇｅｎｅ、３３
，１０３−１１９ （１９８５）、ｒＴＯＹＯＢｏ
１９８８／８９遺伝子工学研究用試薬総合カタログ」東
洋紡績社製）である。
ＣＴＣＧＡＧ−３’３ ’ −ＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＡ
ＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴ−５’以下本発明を説明す
るに、本発明で使用するプラスミドｐＵＣ１９は容易に
入手し得る公知のプラスミド（例えば、Ｇｅｎｅ、３３
，１０３−１１９ （１９８５）、ｒＴＯＹＯＢｏ
１９８８／８９遺伝子工学研究用試薬総合カタログ」東
洋紡績社製）である。
本発明のプライマーＤＮＡは例えば、次の様な方法によ
り得ることができる。即ち、まず、プラスミドｐＵＣ１
９を制限酵素ＳａβＩで切断し、該切断部位（１ケ所）
に別途化学合成した下記塩基配列のＤＮＡ断片を挿入し
、２重鎮の環状プラスミドに修復する。このＤＮＡ断片
は下記に示す通り制限酵素Ｎｏｔｌ、Ｓｆ ｉｌ、Ｎｃ
ｏＩ及びＸｈｏｌの切断部位を右′ｔス 川Ｉ 次いで、上記ＤＮＡ断片を導入された環状プラスミドを
制限酵素ＰｓｔＩで切断（切断個所１ケ所）し、Ｐｓｔ
Ｉ切断部位の３′−末端に常法に従いターミナルトラン
スフェラーゼでポリ （ｄＴ）を付加する。ボ’Ｊ（ｄ
Ｔ）は、通常６０〜８０塩基程度とする。
り得ることができる。即ち、まず、プラスミドｐＵＣ１
９を制限酵素ＳａβＩで切断し、該切断部位（１ケ所）
に別途化学合成した下記塩基配列のＤＮＡ断片を挿入し
、２重鎮の環状プラスミドに修復する。このＤＮＡ断片
は下記に示す通り制限酵素Ｎｏｔｌ、Ｓｆ ｉｌ、Ｎｃ
ｏＩ及びＸｈｏｌの切断部位を右′ｔス 川Ｉ 次いで、上記ＤＮＡ断片を導入された環状プラスミドを
制限酵素ＰｓｔＩで切断（切断個所１ケ所）し、Ｐｓｔ
Ｉ切断部位の３′−末端に常法に従いターミナルトラン
スフェラーゼでポリ （ｄＴ）を付加する。ボ’Ｊ（ｄ
Ｔ）は、通常６０〜８０塩基程度とする。
次いで、制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、約１３５ｂｐ（
ポリ （ｄＴ）を除いたＤＮＡ断片の大きさ）のＤＮＡ
断片を得ることによって、本発明のプライマーＤＮＡを
得ることができる。
ポリ （ｄＴ）を除いたＤＮＡ断片の大きさ）のＤＮＡ
断片を得ることによって、本発明のプライマーＤＮＡを
得ることができる。
本発明のプライマーＤＮＡは、第１図にその概略を示す
ようにプラスミドｐＵＣ１９のＡａｃＺ遺伝子に由来す
るＤＮＡ配列を有し、その上流に、前記合成りＮＡ断片
による制限酵素Ｎｏｔｌ、５ｆｉＩ、ＮＣ０Ｉ及びＸｈ
ｏｌの切断部位の外に、プラスミドｐＵＣ１９に由来す
る制限酵素■旦■、ＳａｆｌＸＸｂａｌＸＢａｍＨＩ。
ようにプラスミドｐＵＣ１９のＡａｃＺ遺伝子に由来す
るＤＮＡ配列を有し、その上流に、前記合成りＮＡ断片
による制限酵素Ｎｏｔｌ、５ｆｉＩ、ＮＣ０Ｉ及びＸｈ
ｏｌの切断部位の外に、プラスミドｐＵＣ１９に由来す
る制限酵素■旦■、ＳａｆｌＸＸｂａｌＸＢａｍＨＩ。
Ｓ ｍ ａ Ｉ 、 ｘ１且１ 、、Ｓ ａ ｃ Ｉ及
びＥｃｏＲＩの切断部位を含むポリリンカーを有する。
びＥｃｏＲＩの切断部位を含むポリリンカーを有する。
そしてＰｓｔＩ切断部位の３′−末端にポリ （ｄＴ）
を有する。
を有する。
以下に、本発明のプライマーＤＮＡを使用して遺伝子を
クローニングする方法の１例を説明する。
クローニングする方法の１例を説明する。
（第１段階）本発明のプライマーＤＮＡと、目的物質を
産生ずる細胞から常法にてポリＡ″ＲＮＡを分離し、蔗
糖密度勾配法等により得られる目的物質のｍＲＮＡを含
むｍＲＮＡ群とをハイブリダイズさせ、逆転写酵素及び
ＤＮＡポリメラーゼ■ ゛を用い、常法に従
って二本鎖ｃＤＮＡを合成する。
産生ずる細胞から常法にてポリＡ″ＲＮＡを分離し、蔗
糖密度勾配法等により得られる目的物質のｍＲＮＡを含
むｍＲＮＡ群とをハイブリダイズさせ、逆転写酵素及び
ＤＮＡポリメラーゼ■ ゛を用い、常法に従
って二本鎖ｃＤＮＡを合成する。
（第２段階）次いで、ＥｃｏＲＩメチラーゼ処理してこ
のｃＤＮＡ鎖をＥｃｏＲＩによる切断から保護した後、
ｃＤＮＡ鎖の両末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付加する。
のｃＤＮＡ鎖をＥｃｏＲＩによる切断から保護した後、
ｃＤＮＡ鎖の両末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付加する。
（第３段階）上記のｃＤＮＡをＳＰ６プロモーターを有
するλｇｔｌｏ等のλファージベクターのＳＰ６プロモ
ーターの下流にあるＥｃｏＲＩ切断部位に挿入して組換
えファージＤＮＡ群を得る。
するλｇｔｌｏ等のλファージベクターのＳＰ６プロモ
ーターの下流にあるＥｃｏＲＩ切断部位に挿入して組換
えファージＤＮＡ群を得る。
ＳＰ６プロモーターを有するλｇｔｌｏは次の様にして
得ることができる。即ち、例えばプラスミドｐＧＥＭ２
（プロメガ・バイオチック社製）のようなＳＰ６プ
ロモーターを有する公知のプラスミドから、常法により
適当な制限酵素、例えば１３ａｍＨＩを用いてＳＰ６プ
ロモーターを含むＤＮＡ断片を分離する。一方、公知の
λフアージベクター、例えばλｇｔｌＯＤＮＡ中に５つ
ある制限酵素Ｂ ａ ｍ ＨＩ認識切断部位を公知のＢ
ａｍＨＩメチラーセにより制限酵素ＢａｍＨＩによる切
断から保護し、同ＤＮＡ中に唯一ある制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ認識切断部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガ
ーゼおよびＢａｍＨＩリンカ−を用いてＢａｍＨＩ部位
に変換する。その後、この新たに作成したＢ ａ ｍ
ＨＩ部位にＳＰ６プロモーターを含むＤＮＡ断片を挿入
することによって得ることができる。
得ることができる。即ち、例えばプラスミドｐＧＥＭ２
（プロメガ・バイオチック社製）のようなＳＰ６プ
ロモーターを有する公知のプラスミドから、常法により
適当な制限酵素、例えば１３ａｍＨＩを用いてＳＰ６プ
ロモーターを含むＤＮＡ断片を分離する。一方、公知の
λフアージベクター、例えばλｇｔｌＯＤＮＡ中に５つ
ある制限酵素Ｂ ａ ｍ ＨＩ認識切断部位を公知のＢ
ａｍＨＩメチラーセにより制限酵素ＢａｍＨＩによる切
断から保護し、同ＤＮＡ中に唯一ある制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ認識切断部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガ
ーゼおよびＢａｍＨＩリンカ−を用いてＢａｍＨＩ部位
に変換する。その後、この新たに作成したＢ ａ ｍ
ＨＩ部位にＳＰ６プロモーターを含むＤＮＡ断片を挿入
することによって得ることができる。
（第４段階）得られた組換えファージＤＮＡ群を常法に
より組換えλフアージ粒子群を形成させる。次いで、こ
のλフアージ粒子群を宿主、例えば大腸菌等に感染、増
殖させた後、各クローンから得られる組換えλフアージ
ＤＮＡを鋳型として、常法に従い、ｍ７Ｇ （５’）ｐ
ｐｐ （５’）Ｇ等の存在下、Ｓ Ｐ ６ ＲＮＡポリ
メラーゼを用い試験管内転写を行い、真核細胞のｍＲＮ
Ａに特有なキャップ構造をもったｍＲＮＡを得（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２，７０
５７゜１９８４）、これをアフリカッメガエルの卵母細
胞内で翻訳して、得られる蛋白質について活性試験等を
行ない、目的物を選択する。
より組換えλフアージ粒子群を形成させる。次いで、こ
のλフアージ粒子群を宿主、例えば大腸菌等に感染、増
殖させた後、各クローンから得られる組換えλフアージ
ＤＮＡを鋳型として、常法に従い、ｍ７Ｇ （５’）ｐ
ｐｐ （５’）Ｇ等の存在下、Ｓ Ｐ ６ ＲＮＡポリ
メラーゼを用い試験管内転写を行い、真核細胞のｍＲＮ
Ａに特有なキャップ構造をもったｍＲＮＡを得（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２，７０
５７゜１９８４）、これをアフリカッメガエルの卵母細
胞内で翻訳して、得られる蛋白質について活性試験等を
行ない、目的物を選択する。
かくして、目的蛋白質の遺伝子をクローニングすること
ができる。
ができる。
（発明の効果）
本発明のプライマーＤＮＡは、構造遺伝子に含まれる確
率が比較的低い制限酵素ＮｏｔＩおよび５ｆｉｌ切断部
位を有するので、λフアージベクターに挿入されたｃＤ
ＮＡを切断することなく試験管内転写における転写終結
を行うことがおおむね可能であり、またλファージをベ
クターとすることによって、より長い外来遺伝子を高い
効率でクローニングすることができ、しかもクローン化
ＤＮＡとして得られることなどから、十分な数のｃＤＮ
Ａライブラリー作製が容易であること、更にまた、サル
モネラ・チフイムリムファージｐｈａｇｅ）ＳＦ３が有
するＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６フアージプロモーター
下流のいかなるＤＮＡをも特異的に転写するという性質
を応用して、目的蛋白質をコードするｍＲＮＡを試験管
内で十分量得られるので、少量のｍＲＮＡからでも有利
に目的蛋白質の遺伝子をクローニングすることができる
。
率が比較的低い制限酵素ＮｏｔＩおよび５ｆｉｌ切断部
位を有するので、λフアージベクターに挿入されたｃＤ
ＮＡを切断することなく試験管内転写における転写終結
を行うことがおおむね可能であり、またλファージをベ
クターとすることによって、より長い外来遺伝子を高い
効率でクローニングすることができ、しかもクローン化
ＤＮＡとして得られることなどから、十分な数のｃＤＮ
Ａライブラリー作製が容易であること、更にまた、サル
モネラ・チフイムリムファージｐｈａｇｅ）ＳＦ３が有
するＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６フアージプロモーター
下流のいかなるＤＮＡをも特異的に転写するという性質
を応用して、目的蛋白質をコードするｍＲＮＡを試験管
内で十分量得られるので、少量のｍＲＮＡからでも有利
に目的蛋白質の遺伝子をクローニングすることができる
。
（実施例）
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定される
ものではない。
、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定される
ものではない。
実施例１ （Ｉ〕 ＣＤＡライブラリーの作製（ｉ
）ｃＤＮＡプライマーＤＮＡの作製プラスミドＤＮＡｐ
ＵＣ１９（東洋紡績社製〕のポリリンカーＤＮＡ中の制
限酵素５ａｎＩ切断部位に、ＮｏｔＩおよび５ｆｉＩ切
断部位を含んだ合成二重鎖ＤＮＡ、即ち、 ５ ’ −ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴ
ＣＧＡＧ−３’３ ’ −ＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＡ
ＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴ−５’を挿入、Ｔ、ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合し、ｐＵＣ１９Ｎｓを得る。これ
により大腸菌ＨＢ１０１を常法（Ｇｅｎｅ、１０，６３
．１９８０）で形質転換し、形質転換株のうちｐＵＣ１
９Ｎｓを持つ株を選択し、該プラスミドＤＮＡを常法に
より分離した。
）ｃＤＮＡプライマーＤＮＡの作製プラスミドＤＮＡｐ
ＵＣ１９（東洋紡績社製〕のポリリンカーＤＮＡ中の制
限酵素５ａｎＩ切断部位に、ＮｏｔＩおよび５ｆｉＩ切
断部位を含んだ合成二重鎖ＤＮＡ、即ち、 ５ ’ −ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴ
ＣＧＡＧ−３’３ ’ −ＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＡ
ＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴ−５’を挿入、Ｔ、ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合し、ｐＵＣ１９Ｎｓを得る。これ
により大腸菌ＨＢ１０１を常法（Ｇｅｎｅ、１０，６３
．１９８０）で形質転換し、形質転換株のうちｐＵＣ１
９Ｎｓを持つ株を選択し、該プラスミドＤＮＡを常法に
より分離した。
ｐＵＣ１９Ｎ３２００μｇに３５０ユニツトの制限酵素
江Ｉを反応液４００μｊ２（１０ｍＭｌ−リス−塩酸（
ｐＨ７，５） 、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
塩化ナトリウムおよび１ｍＭジチオスレイトーノａで作
用させて、３７℃で５時間反応させた。反応液をフェノ
ール・クロロホルムで抽出後、エタノール沈澱及び７０
％エタノール洗浄を行ってＤＮＡを回収した。
江Ｉを反応液４００μｊ２（１０ｍＭｌ−リス−塩酸（
ｐＨ７，５） 、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
塩化ナトリウムおよび１ｍＭジチオスレイトーノａで作
用させて、３７℃で５時間反応させた。反応液をフェノ
ール・クロロホルムで抽出後、エタノール沈澱及び７０
％エタノール洗浄を行ってＤＮＡを回収した。
このＤＮＡのＰｓｔＩ断端に末端デオキシヌクレオチシ
ルトランスフェラーゼ（ＴｄＴａｓｅ）を反応液２００
μｎ（１４０ｍＭカコジル酸す１ヘリウム、３０ｍＭ１
−リス−塩酸（ｐＨ６，８） 、１ｍＭ塩化コバルト、
０．１ｍＭジチオスレイトール、０、２ ｍ Ｍ ｄ
Ｔ （３Ｈ−ｄ Ｔ Ｔ Ｐ ４ μＣｉ含有）および
ＴｄＴａ ｓ ｅ １０８ユニツト〕中で作用させて、
１０分おきに３ Ｉ−Ｉ −ｄ Ｔ Ｔ Ｐのとりこみ
を測定して、ｄＴ鎖伸長をモニターしながら、平均長７
０塩基のｄＴ鎖を付加した。０．２ＭＥＤＴＡ２０μｌ
と１０％５ＤＳＩＯμβを加えて反応を止め、フェノー
ル／クロロホルムで抽出、エタノール沈澱および７０％
エタノール洗浄してＤＮＡを回収した。次にこのＤＮＡ
を２００ユニツトの制限酵素兄ｖｕ’ｌｌで３７°Ｃ１
５時間反応液〔５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ）リ
ス−塩酸（ｐＨ７，５） 、１０ｍＭ塩化マグネシウム
および１ｍＭジチオスレイトール〕中で消化した後１％
アガロースゲル上で電気泳動し、小さい方のフラグメン
トをＤＥＡＥ−ペーパー法（ＤｒｅｔｚｅｎＧ、ら、Ａ
ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１２゜２９５．１９８１
）で分取した。得られたＤＮＡ断片を４００μｌのＮＴ
Ｅ溶液（１Ｍ塩化すＩ−ＩＪウム〜１０ｍＭ）リス−塩
酸（ｐＨ７，４） −１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、０℃
に冷却した。このＤＮＡをＮＴＥ溶液で平衡化した０、
５ ｍｌのオリゴｄＡカラムに吸着させ、固液３０ｍ
７！で洗浄した後室温に戻した。６５“Ｃの蒸留水で吸
着したＤＮＡを溶出させ、溶出液をフェノール／クロロ
ホルムで抽出して、エタノール沈澱を２回くり返し７０
％エタノールで洗浄してｃＤＮＡブライマーＤＮＡを得
た。
ルトランスフェラーゼ（ＴｄＴａｓｅ）を反応液２００
μｎ（１４０ｍＭカコジル酸す１ヘリウム、３０ｍＭ１
−リス−塩酸（ｐＨ６，８） 、１ｍＭ塩化コバルト、
０．１ｍＭジチオスレイトール、０、２ ｍ Ｍ ｄ
Ｔ （３Ｈ−ｄ Ｔ Ｔ Ｐ ４ μＣｉ含有）および
ＴｄＴａ ｓ ｅ １０８ユニツト〕中で作用させて、
１０分おきに３ Ｉ−Ｉ −ｄ Ｔ Ｔ Ｐのとりこみ
を測定して、ｄＴ鎖伸長をモニターしながら、平均長７
０塩基のｄＴ鎖を付加した。０．２ＭＥＤＴＡ２０μｌ
と１０％５ＤＳＩＯμβを加えて反応を止め、フェノー
ル／クロロホルムで抽出、エタノール沈澱および７０％
エタノール洗浄してＤＮＡを回収した。次にこのＤＮＡ
を２００ユニツトの制限酵素兄ｖｕ’ｌｌで３７°Ｃ１
５時間反応液〔５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ）リ
ス−塩酸（ｐＨ７，５） 、１０ｍＭ塩化マグネシウム
および１ｍＭジチオスレイトール〕中で消化した後１％
アガロースゲル上で電気泳動し、小さい方のフラグメン
トをＤＥＡＥ−ペーパー法（ＤｒｅｔｚｅｎＧ、ら、Ａ
ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１２゜２９５．１９８１
）で分取した。得られたＤＮＡ断片を４００μｌのＮＴ
Ｅ溶液（１Ｍ塩化すＩ−ＩＪウム〜１０ｍＭ）リス−塩
酸（ｐＨ７，４） −１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、０℃
に冷却した。このＤＮＡをＮＴＥ溶液で平衡化した０、
５ ｍｌのオリゴｄＡカラムに吸着させ、固液３０ｍ
７！で洗浄した後室温に戻した。６５“Ｃの蒸留水で吸
着したＤＮＡを溶出させ、溶出液をフェノール／クロロ
ホルムで抽出して、エタノール沈澱を２回くり返し７０
％エタノールで洗浄してｃＤＮＡブライマーＤＮＡを得
た。
（ｉｉ）ベクターＤＮＡの作製
ＳＰ６プロモーターを含むプラスミドｐＧＥＭ２ 〔プ
ロメガバイオチク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ）社
製、ｌＤＮＡ１００μｇを制限酵素ＮａｅｌｌＯＯユニ
ットにより反応液（２０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８，０） 、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、５ｍＭ２−ＭＥおよび１００．ｌｊｇ／ｍｊ！Ｂ
ＳＡ）中で３７℃５時間消化し、フェノール／クロロホ
ルムにてＤＮＡを抽出、エタノール沈澱乾燥を行う。
ロメガバイオチク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ）社
製、ｌＤＮＡ１００μｇを制限酵素ＮａｅｌｌＯＯユニ
ットにより反応液（２０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８，０） 、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、５ｍＭ２−ＭＥおよび１００．ｌｊｇ／ｍｊ！Ｂ
ＳＡ）中で３７℃５時間消化し、フェノール／クロロホ
ルムにてＤＮＡを抽出、エタノール沈澱乾燥を行う。
回収したＤＮＡと、１５００ｐｍｏｌｅのリン酸化した
ＢａｍＨＩリンカ−（東洋紡績社製）とを、宝酒造製ラ
イゲーションキットを用いて、説明書の指示に従い結合
した。Ｂ ａ ｍ ＨＩリンカ−を有するプラスミドＤ
ＮＡを１％アガロースゲルより回収し、制限酵素Ｂａｍ
１（１１００ユニツトにて反応液（５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム、１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５） 、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムおよび１ｍＭジチオスレイトール〕
中にて反応させる。このものを５％アクリルアミド上で
電気泳動し、ＳＰ６プロモーターを含む小さい方のフラ
グメントを切り出した。ゲルより抽出後、フェノール／
クロロボルム抽出、エタノール沈澱、乾燥を行った。
ＢａｍＨＩリンカ−（東洋紡績社製）とを、宝酒造製ラ
イゲーションキットを用いて、説明書の指示に従い結合
した。Ｂ ａ ｍ ＨＩリンカ−を有するプラスミドＤ
ＮＡを１％アガロースゲルより回収し、制限酵素Ｂａｍ
１（１１００ユニツトにて反応液（５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム、１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５） 、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムおよび１ｍＭジチオスレイトール〕
中にて反応させる。このものを５％アクリルアミド上で
電気泳動し、ＳＰ６プロモーターを含む小さい方のフラ
グメントを切り出した。ゲルより抽出後、フェノール／
クロロボルム抽出、エタノール沈澱、乾燥を行った。
λファージλｇｔｌｏ （プロメガバイオチク社）ＤＮ
Ａ５μｇを２０μβの反応液〔８μＭアデノシルメチオ
ニン、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５） 、１ｍ
ＭＥＤＴＡおよび０．４ ｍｇ／ｍ Ｉ！ Ｂ ＳＡ〕
中で３７℃で２０分間ＢａｍＨＩメチラーゼにより処理
して、λｇｔｌＯＤＮＡが制限酵素ＢａｍＨＩで切断で
きぬようにした。このものをフェノール／クロロホルム
抽出、エタノール沈澱、洗浄した後、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ５ユニットにより反応液（１００ｍＭ塩化ナトリウム
、５０ｍＭトリス−塩酸（１）Ｈ７，５） 、１０ｍＭ
塩化マグネシウムおよび１ｍＭジチオスレイトール〕中
でＤＮＡを切断し、フェノール／クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱・洗浄した。このＥｃｏＲＩフラグメント
を反応液（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７、５） 、１
ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ、５ｍＭジチオスレイトール
、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび２０ｍＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、、ｄＣＴＰ））中
で１０ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩを作用させ断端
を平滑末端とした後、１００ｐ１００ｐのＢａｍＨＩリ
ンカ−（東洋紡績社製）と宝酒造製ライゲーションキッ
トを用いてＤＮＡを結合させ、フェノール・クロロホル
ム抽出およびエタノール沈澱、洗浄を行った。このもの
を反応液（１０ｍＭＩ−リス−塩酸（ｐＨ７，５） 、
５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムお
よび１ｍＭジチオスレイトール〕中で５ユニツトの制限
酵素ＢａｍＨＩと３７°Ｃで５時間反応させ、再びフェ
ノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱、洗浄を施
した後、さらにこのＤＮＡを５０μｌの反応液Ｃ５０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ９，０）、１ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１ｍＭ塩化亜鉛および１ｍＭスペルミジン〕中で１
ユニツトのアルカリホスファターゼと３７°Ｃで６０分
間反応させることによってＢａｍＨＩ断片の５′末端を
脱リン酸化し、セルフ−ライゲーション（Ｓｅｌｆ−１
ｉｇａｔｉｏｎ）がおこらぬようにした。
Ａ５μｇを２０μβの反応液〔８μＭアデノシルメチオ
ニン、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５） 、１ｍ
ＭＥＤＴＡおよび０．４ ｍｇ／ｍ Ｉ！ Ｂ ＳＡ〕
中で３７℃で２０分間ＢａｍＨＩメチラーゼにより処理
して、λｇｔｌＯＤＮＡが制限酵素ＢａｍＨＩで切断で
きぬようにした。このものをフェノール／クロロホルム
抽出、エタノール沈澱、洗浄した後、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ５ユニットにより反応液（１００ｍＭ塩化ナトリウム
、５０ｍＭトリス−塩酸（１）Ｈ７，５） 、１０ｍＭ
塩化マグネシウムおよび１ｍＭジチオスレイトール〕中
でＤＮＡを切断し、フェノール／クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱・洗浄した。このＥｃｏＲＩフラグメント
を反応液（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７、５） 、１
ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ、５ｍＭジチオスレイトール
、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび２０ｍＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、、ｄＣＴＰ））中
で１０ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩを作用させ断端
を平滑末端とした後、１００ｐ１００ｐのＢａｍＨＩリ
ンカ−（東洋紡績社製）と宝酒造製ライゲーションキッ
トを用いてＤＮＡを結合させ、フェノール・クロロホル
ム抽出およびエタノール沈澱、洗浄を行った。このもの
を反応液（１０ｍＭＩ−リス−塩酸（ｐＨ７，５） 、
５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムお
よび１ｍＭジチオスレイトール〕中で５ユニツトの制限
酵素ＢａｍＨＩと３７°Ｃで５時間反応させ、再びフェ
ノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱、洗浄を施
した後、さらにこのＤＮＡを５０μｌの反応液Ｃ５０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ９，０）、１ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１ｍＭ塩化亜鉛および１ｍＭスペルミジン〕中で１
ユニツトのアルカリホスファターゼと３７°Ｃで６０分
間反応させることによってＢａｍＨＩ断片の５′末端を
脱リン酸化し、セルフ−ライゲーション（Ｓｅｌｆ−１
ｉｇａｔｉｏｎ）がおこらぬようにした。
５５μｐの反応停止液Ｃｌ０ｍＭ１−’Ｊスス−酸（ｐ
Ｈ８，０） 、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥ
ＤＴＡおよび１％５ＤＳ）を加え 、６８°Ｃで１０分
間加熱しアルカリホスファターゼを失活させた後、フェ
ノールクロロホルム抽出、エタノール沈澱、乾燥を行っ
た。
Ｈ８，０） 、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥ
ＤＴＡおよび１％５ＤＳ）を加え 、６８°Ｃで１０分
間加熱しアルカリホスファターゼを失活させた後、フェ
ノールクロロホルム抽出、エタノール沈澱、乾燥を行っ
た。
次のこのものと前述のようにして得られたＳＰ６プロモ
ーターを含むＢａｍＨＩ断片ＤＮＡと宝酒造製ライゲー
ションキットを用いて結合させた。
ーターを含むＢａｍＨＩ断片ＤＮＡと宝酒造製ライゲー
ションキットを用いて結合させた。
次にこのＤＮＡをイン・ビトロ・パンケージング・キッ
ト（プロメガ社製）を用いλフアージ粒子に再構成し、
宿主大腸菌ＮＭ６４１に感染、プレート上で増殖させた
後、ＳＰ６プロモーターＤＮＡ断片を有するλｇｔｌｏ
の感染によって生じた透明な単一プラークのうちいくつ
かより各々λファージＤＮＡを抽出し制限酵素地図を作
製した結果、ＳＰ６プロモーター断片の挿入を確認した
ものをλｇｔｌＯ３Ｐ６とした。
ト（プロメガ社製）を用いλフアージ粒子に再構成し、
宿主大腸菌ＮＭ６４１に感染、プレート上で増殖させた
後、ＳＰ６プロモーターＤＮＡ断片を有するλｇｔｌｏ
の感染によって生じた透明な単一プラークのうちいくつ
かより各々λファージＤＮＡを抽出し制限酵素地図を作
製した結果、ＳＰ６プロモーター断片の挿入を確認した
ものをλｇｔｌＯ３Ｐ６とした。
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡの合成
ウシ胃組織より分離したｐ ｏ １ ｙＡ” ＲＮＡを
蔗糖密度勾配法により分画し２．６キロベース（ｋｉ
１ｏｂａｓｅ Ｈｋｂ）の大きさの画分のＲＮＡｌ０μ
ｇに対し、（ｉ）で得たプライマー２．１ｐｍｏｌｅを
用いて１００μｌの反応液（５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ
Ｈ８，３） 、５０ｍＭ塩化カリウム、８ｍＭ塩化マグ
ネシウム、１ｍＭｄＮＴＰ （ｄＡＴＰＸ ｄＧＴＰ
、ｄＣＴＰ。
蔗糖密度勾配法により分画し２．６キロベース（ｋｉ
１ｏｂａｓｅ Ｈｋｂ）の大きさの画分のＲＮＡｌ０μ
ｇに対し、（ｉ）で得たプライマー２．１ｐｍｏｌｅを
用いて１００μｌの反応液（５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ
Ｈ８，３） 、５０ｍＭ塩化カリウム、８ｍＭ塩化マグ
ネシウム、１ｍＭｄＮＴＰ （ｄＡＴＰＸ ｄＧＴＰ
、ｄＣＴＰ。
およびｄＴＴＰ） 、１０ｍＭジチオスレイトール、６
０ニーＳ１７ ｌ・ＲＮａ ｓ ｉ ｎおよび１０，１
ｊＣ４α−：＋ｚｐ−ｄＧＴＰ）中で１００ユニツトの
逆転写酵素を加えて３２Ｐ−ｄＧＴＰのとりこみをモニ
ターしながら４２℃で反応させた結果、２時間の反応で
７２４ｎｇの鋳型ＲＮＡとｃＤＮＡの第−鎖とのハイブ
リッドが合成された。さらにこのものをフェノール／ク
ロロホルム抽出、エタノール沈澱させた後１００μｌの
反応液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ （ｐＨ７，６） 、６８
ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５
ｍＭβ−ＮＡＤおよび０．６ｍＭｄＮＴＰ）中で３０ユ
ニツトのＥ、ｃ。
０ニーＳ１７ ｌ・ＲＮａ ｓ ｉ ｎおよび１０，１
ｊＣ４α−：＋ｚｐ−ｄＧＴＰ）中で１００ユニツトの
逆転写酵素を加えて３２Ｐ−ｄＧＴＰのとりこみをモニ
ターしながら４２℃で反応させた結果、２時間の反応で
７２４ｎｇの鋳型ＲＮＡとｃＤＮＡの第−鎖とのハイブ
リッドが合成された。さらにこのものをフェノール／ク
ロロホルム抽出、エタノール沈澱させた後１００μｌの
反応液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ （ｐＨ７，６） 、６８
ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５
ｍＭβ−ＮＡＤおよび０．６ｍＭｄＮＴＰ）中で３０ユ
ニツトのＥ、ｃ。
上上ｐＤＮＡポリメラーゼ■および１ユニツトのＲＮａ
ｓ ｅＨによりｃＤＮＡの第−鎖を鋳型として１４℃
で１時間、さらに２３°Ｃで１時間反応させ、第二鎖を
合成し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈
澱後、１．６μｇのウシ胃組織ｍＲＮＡ由来の二本鎖ｃ
ＤＮＡ群を得た。このｃＤＮＡを３０ｐｎの反応液（３
３ｍＭ）リス−酢酸（ｐＨ７，９） 、６６ｍＭ酢酸カ
リウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５μｇヌクレアー
ゼ・フリーＢＳＡおよび０．８ ｍ Ｍ ｄ Ｎ Ｔ
Ｐ ）中で９ユニツトのＴ４ポリメラーゼを３７℃で３
０分間反応させ、フェノール／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱および洗浄を行った。この操作で両端が平滑
末端となったｃＤＮＡを１ｏμｌの反応液〔８μＭＳ−
アデノシルーし一メチオニン、１００ｍＭ１−リス−塩
酸（ｐＨ７，５）１ｍＭＥＤＴＡおよび０．４■／ｍＩ
！ＢＳＡ）中で５ユニツトのＥｃｏＲＩメチラーゼによ
り制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位のアデニンをメチル化す
ることにより、制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断されぬよ
う修飾した。さらにこの修飾したｃＤＮＡ群を１０，１
７ｊ！の反応液（５ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）
、５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール
、２．７ｍＭＡＴＰおよび０．１１１ｇ／Ｉｌｌリン酸
化ＥｃｏＲＩリンカ−（東洋紡績製）〕中で２００ユニ
ツトのＴ４ＤＮＡリガーゼにより１４℃で一晩反応させ
ることにより、その両端にＥｃ ｏＲ１リンカ−を付加
した。さらにこのものをセファロースＣＬｄＢカラム（
ファルマシア社製）を通すことにより、余分なリンカ−
を除き、結局５９０ｎｇのＢｃ ｏＲＩリンカ−付加さ
れたＥｃ ｏＲ１メチラ一ゼ処理二本鎖ｃＤＮＡを得た
。
ｓ ｅＨによりｃＤＮＡの第−鎖を鋳型として１４℃
で１時間、さらに２３°Ｃで１時間反応させ、第二鎖を
合成し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈
澱後、１．６μｇのウシ胃組織ｍＲＮＡ由来の二本鎖ｃ
ＤＮＡ群を得た。このｃＤＮＡを３０ｐｎの反応液（３
３ｍＭ）リス−酢酸（ｐＨ７，９） 、６６ｍＭ酢酸カ
リウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５μｇヌクレアー
ゼ・フリーＢＳＡおよび０．８ ｍ Ｍ ｄ Ｎ Ｔ
Ｐ ）中で９ユニツトのＴ４ポリメラーゼを３７℃で３
０分間反応させ、フェノール／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱および洗浄を行った。この操作で両端が平滑
末端となったｃＤＮＡを１ｏμｌの反応液〔８μＭＳ−
アデノシルーし一メチオニン、１００ｍＭ１−リス−塩
酸（ｐＨ７，５）１ｍＭＥＤＴＡおよび０．４■／ｍＩ
！ＢＳＡ）中で５ユニツトのＥｃｏＲＩメチラーゼによ
り制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位のアデニンをメチル化す
ることにより、制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断されぬよ
う修飾した。さらにこの修飾したｃＤＮＡ群を１０，１
７ｊ！の反応液（５ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）
、５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール
、２．７ｍＭＡＴＰおよび０．１１１ｇ／Ｉｌｌリン酸
化ＥｃｏＲＩリンカ−（東洋紡績製）〕中で２００ユニ
ツトのＴ４ＤＮＡリガーゼにより１４℃で一晩反応させ
ることにより、その両端にＥｃ ｏＲ１リンカ−を付加
した。さらにこのものをセファロースＣＬｄＢカラム（
ファルマシア社製）を通すことにより、余分なリンカ−
を除き、結局５９０ｎｇのＢｃ ｏＲＩリンカ−付加さ
れたＥｃ ｏＲ１メチラ一ゼ処理二本鎖ｃＤＮＡを得た
。
次に（ｉｉ ）で得られたベクターλｇ ｔ １０ＳＰ
６ １０ｐｇを反応液２００μｊ２ （５０ｍＭ）リス
−塩酸（ｐＨ７，５） 、１００ｍＭ塩化ナトリウム、
１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭジチオスレイト
ール〕中で３０ユニツトの制限酵素Ｅｃ ｏＲＩと３７
℃で６０分間反応させ、λｇｔ１０ＳＰ６ＤＮＡ中唯−
のＥｃｏＲＩ認中部−を切断した後、フェノール／クロ
ロホルム抽出、エタノール沈澱、洗浄した。さらにこの
ＤＮＡの５′末端を（１１）で述べたような方法で脱リ
ン酸化しこのうち４μｇのベクターＤＮＡと、上記の操
作で得られたｃＤＮＡＬ２０ｎｇ （モル比−２：１）
とを５μｌの反応液（６０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，
５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、１ｍＭＥＤＴＡおよび２ ｍ Ｍ Ａ
Ｔ Ｐ ）中ニテ、２０ Ｑユニット（ＤＴ ４ＤＮ
Ａリガーゼと１４℃で一晩反応させることにより結合さ
せた。５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）
−１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加え６５°Ｃで５分間加熱した
後、前述のイン・ビトロ・パッケージング・キットを用
い、説明書の指示に従ってイン・ビトロ・バソヶージン
グヲ行いｃＤＮＡを有するλフアージ粒子をＤＮＡ１μ
ｇあたり約３０万クローン得た。
６ １０ｐｇを反応液２００μｊ２ （５０ｍＭ）リス
−塩酸（ｐＨ７，５） 、１００ｍＭ塩化ナトリウム、
１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭジチオスレイト
ール〕中で３０ユニツトの制限酵素Ｅｃ ｏＲＩと３７
℃で６０分間反応させ、λｇｔ１０ＳＰ６ＤＮＡ中唯−
のＥｃｏＲＩ認中部−を切断した後、フェノール／クロ
ロホルム抽出、エタノール沈澱、洗浄した。さらにこの
ＤＮＡの５′末端を（１１）で述べたような方法で脱リ
ン酸化しこのうち４μｇのベクターＤＮＡと、上記の操
作で得られたｃＤＮＡＬ２０ｎｇ （モル比−２：１）
とを５μｌの反応液（６０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，
５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、１ｍＭＥＤＴＡおよび２ ｍ Ｍ Ａ
Ｔ Ｐ ）中ニテ、２０ Ｑユニット（ＤＴ ４ＤＮ
Ａリガーゼと１４℃で一晩反応させることにより結合さ
せた。５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）
−１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加え６５°Ｃで５分間加熱した
後、前述のイン・ビトロ・パッケージング・キットを用
い、説明書の指示に従ってイン・ビトロ・バソヶージン
グヲ行いｃＤＮＡを有するλフアージ粒子をＤＮＡ１μ
ｇあたり約３０万クローン得た。
〔■〕試験管内転写
（ｉ）鋳型ＤＮＡの調製
（１）で得たλファージｃＤＮＡライブラリーよりλフ
アージＤＮＡを常法により抽出し、約３０万クローンの
ファージ粒子より約１■のファージＤＮＡを得た。この
うち３０ｐｇを１００μ’ ノ反応液（１５０ｍ Ｍ塩
化ナトリウム、１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，９）
、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００μｇ／ｍｆＢｓＡ
および０．０１％トリトンＸ−１００）中で３０ユニツ
トの制限酵素Ｎｏｔｌを用いて３７℃で５時間消化した
後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱お
よび乾燥を行って得られたＤＮＡを試験管内転写の鋳型
ＤＮＡとした。このＤＮＡを用いて後述の試験管内転写
およびサブスタンスにレセプターの発現試験を行ったと
ころ、サブスタンスにレセプターの発現が認められ（サ
ブスタンスＫによる１００μＡの外向き電流の惹起）、
確かにＮｏｔＩが適当な制限酵素であることがわかった
。従って、Ｎｏｔｌを用いて消化して得られるＤＮＡを
試験管内転写の鋳型ＤＮＡとして以後用いた。
アージＤＮＡを常法により抽出し、約３０万クローンの
ファージ粒子より約１■のファージＤＮＡを得た。この
うち３０ｐｇを１００μ’ ノ反応液（１５０ｍ Ｍ塩
化ナトリウム、１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，９）
、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００μｇ／ｍｆＢｓＡ
および０．０１％トリトンＸ−１００）中で３０ユニツ
トの制限酵素Ｎｏｔｌを用いて３７℃で５時間消化した
後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱お
よび乾燥を行って得られたＤＮＡを試験管内転写の鋳型
ＤＮＡとした。このＤＮＡを用いて後述の試験管内転写
およびサブスタンスにレセプターの発現試験を行ったと
ころ、サブスタンスにレセプターの発現が認められ（サ
ブスタンスＫによる１００μＡの外向き電流の惹起）、
確かにＮｏｔＩが適当な制限酵素であることがわかった
。従って、Ｎｏｔｌを用いて消化して得られるＤＮＡを
試験管内転写の鋳型ＤＮＡとして以後用いた。
（ｉｉ）試験管内転写
〔■〕で得られた３０万クローンのファージｃＤＮＡラ
イブラリーを５万クローンずつのグループに分け、各グ
ループのファージ粒子よりＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｎ
ｏｔＩで消化した。
イブラリーを５万クローンずつのグループに分け、各グ
ループのファージ粒子よりＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｎ
ｏｔＩで消化した。
このうち３μｇの鋳型ＤＮＡを用い、５０μｌの反応液
〔２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、６ｍＭ塩化マ
グネシウム、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭジチオスレ
イトール、１ユニツト／μ１ＲＮＡｓ ｉｎ、０．２ｍ
ＭｒＮＴＰ （ＡＴＰ。
〔２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、６ｍＭ塩化マ
グネシウム、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭジチオスレ
イトール、１ユニツト／μ１ＲＮＡｓ ｉｎ、０．２ｍ
ＭｒＮＴＰ （ＡＴＰ。
ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ） 、１ｍＭｍ７Ｇ （５’
）ｐｐｐ （５’） Ｇ （２個のＧが５′同志で結合
しさらに一方のグアニンの７位がメチル化されたもの；
Ｐ Ｌ バイオケミカルズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）製） 、０．１μｗ／ｍｎＢｓＡおよびα−”Ｐ
７ＧＴＰ ２００００ Ｃｐｍ）中で３ユニット−のＳ
Ｐ ６ ＲＮＡポリメラーゼを用い、４０ ’Ｃで１
時間試験管内転写を行った。反応後５ｏユニットのＲＮ
Ａ５ｉｎと１μｇのＲＮＡ５ｅフリーＤＮＡ５ｅを加え
鋳型ＤＮＡを分解した後、転写されたＲＮＡをフェノー
ル・クロロホルムで抽出後、以下のようにしてゲルろ過
性により基質のｒＮＴＰがら分離した。すなわち、１ｍ
ｌの使い捨てシリンジに１０ｍＭ）’Ｊスス−酸（ｐＨ
７，０）および０．１％ＳＤＳで平衡化したセファデク
スＧ−１００（ファルマシア社製〕を充填する。このカ
ラムに上記反応液を供して、１３００ｒ、ｐ、ｍ、で４
分間遠心して、溶出液中に合成ｍＲＮＡを回収した。
）ｐｐｐ （５’） Ｇ （２個のＧが５′同志で結合
しさらに一方のグアニンの７位がメチル化されたもの；
Ｐ Ｌ バイオケミカルズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）製） 、０．１μｗ／ｍｎＢｓＡおよびα−”Ｐ
７ＧＴＰ ２００００ Ｃｐｍ）中で３ユニット−のＳ
Ｐ ６ ＲＮＡポリメラーゼを用い、４０ ’Ｃで１
時間試験管内転写を行った。反応後５ｏユニットのＲＮ
Ａ５ｉｎと１μｇのＲＮＡ５ｅフリーＤＮＡ５ｅを加え
鋳型ＤＮＡを分解した後、転写されたＲＮＡをフェノー
ル・クロロホルムで抽出後、以下のようにしてゲルろ過
性により基質のｒＮＴＰがら分離した。すなわち、１ｍ
ｌの使い捨てシリンジに１０ｍＭ）’Ｊスス−酸（ｐＨ
７，０）および０．１％ＳＤＳで平衡化したセファデク
スＧ−１００（ファルマシア社製〕を充填する。このカ
ラムに上記反応液を供して、１３００ｒ、ｐ、ｍ、で４
分間遠心して、溶出液中に合成ｍＲＮＡを回収した。
溶出液中の３２ｐのカウントを測定し、合成ｍＲＮＡ量
を見積もった。上記条件で６．５μｇの合成ｍＲＮＡが
回収された。このｍＲＮＡをフェノール／クロロホルム
抽出、エタノール沈澱および乾燥後、蒸留水に溶かした
（１■／ｍβ）。
を見積もった。上記条件で６．５μｇの合成ｍＲＮＡが
回収された。このｍＲＮＡをフェノール／クロロホルム
抽出、エタノール沈澱および乾燥後、蒸留水に溶かした
（１■／ｍβ）。
（ＩＩＩ）サブスタンスにレセプターｃ ＤＮＡのスク
リーニング （１）で得られたｃＤＮＡライブラリーを５万クローン
ずつのグループに分け、（ＩＩ）に従イｍＲＮＡを合成
し、各々のグループ由来のｍＲＮＡ）容液（１■／ ｍ
１２ ）を８用型した。
リーニング （１）で得られたｃＤＮＡライブラリーを５万クローン
ずつのグループに分け、（ＩＩ）に従イｍＲＮＡを合成
し、各々のグループ由来のｍＲＮＡ）容液（１■／ ｍ
１２ ）を８用型した。
成熟メスのアフリカッメガエル（Ｘ ｅ ｎ ｏ ｐ
ｕｓｌａｅｖｉｓ）を２０分間氷水につけて麻酔し、解
剖して卵母細胞を取り出し、修正ハース（Ｂａｒｔｈ’
ｓ）培養？＆ （Ｃｏ ｌ ｅｍａｎ、Ａ、。
ｕｓｌａｅｖｉｓ）を２０分間氷水につけて麻酔し、解
剖して卵母細胞を取り出し、修正ハース（Ｂａｒｔｈ’
ｓ）培養？＆ （Ｃｏ ｌ ｅｍａｎ、Ａ、。
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓ
ｔａｔｉｏｎ−ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒ
ｏａｃｈ、編者Ｈａｎｅｓ、Ｂ、Ｄ、、及びＨｉｇｇｉ
ｎｓ、Ｓ、Ｊ、、ｐｐ２７１ ＩＲＬＰｒｅｓｓ１９
８４）中で白金線を使用して卵母細胞を１個ずつに分離
した。合成ｍＲＮＡ溶液（ｌｆｆｆ／ｍｎ）４０ ｎ
Ｅずつを、１個の卵母細胞にキャピラリーとマイクロマ
ニュピレータ−を用いて実体顕微鏡下にて注入した。１
種類の合成ｍＲＮＡ溶液につき５０個を使用し、ｍＲＮ
Ａ注入後修正ハース培養液に卵母細胞を戻し、１８℃に
て２日間保温した。
ｔａｔｉｏｎ−ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒ
ｏａｃｈ、編者Ｈａｎｅｓ、Ｂ、Ｄ、、及びＨｉｇｇｉ
ｎｓ、Ｓ、Ｊ、、ｐｐ２７１ ＩＲＬＰｒｅｓｓ１９
８４）中で白金線を使用して卵母細胞を１個ずつに分離
した。合成ｍＲＮＡ溶液（ｌｆｆｆ／ｍｎ）４０ ｎ
Ｅずつを、１個の卵母細胞にキャピラリーとマイクロマ
ニュピレータ−を用いて実体顕微鏡下にて注入した。１
種類の合成ｍＲＮＡ溶液につき５０個を使用し、ｍＲＮ
Ａ注入後修正ハース培養液に卵母細胞を戻し、１８℃に
て２日間保温した。
培養した卵母細胞の外層をデュモン鉗子にて除いた後、
１個ずつ容量約０．４ ｍ Ａの膜電位記録槽に入れ、
リンゲル溶液（１１５ｍＭ塩化ナトリうム、２．５ｍＭ
塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウムおよび５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７，４））で毎分４ｍｊ２の流速で
潅流した。４Ｍ酢酸カリウム溶液を満たした２木のガラ
ス微小電極を卵母細胞に刺入し、膜電位をＯｍＶに固定
した後、槽内の濃度が４０秒間１μＭになるようにサブ
スタンスＫを加え、細胞全体の電流を測定した。もしサ
ブスタンスにレセプターが発現していれば塩素イオンの
透過性促進により外向きの電流が検出されるので、これ
を指標に各ｃＤＮＡクローンのグループについてサブス
タンスにレセプターｍ ＲＮ Ａ由来ｃＤＮＡのスクリ
ーニングを行った。
１個ずつ容量約０．４ ｍ Ａの膜電位記録槽に入れ、
リンゲル溶液（１１５ｍＭ塩化ナトリうム、２．５ｍＭ
塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウムおよび５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７，４））で毎分４ｍｊ２の流速で
潅流した。４Ｍ酢酸カリウム溶液を満たした２木のガラ
ス微小電極を卵母細胞に刺入し、膜電位をＯｍＶに固定
した後、槽内の濃度が４０秒間１μＭになるようにサブ
スタンスＫを加え、細胞全体の電流を測定した。もしサ
ブスタンスにレセプターが発現していれば塩素イオンの
透過性促進により外向きの電流が検出されるので、これ
を指標に各ｃＤＮＡクローンのグループについてサブス
タンスにレセプターｍ ＲＮ Ａ由来ｃＤＮＡのスクリ
ーニングを行った。
表１に示す通り、３０万クローンのｃＤＮＡライブラリ
ー中に（ｉ）で述べたようにサブスタンスにレセプター
ｃＤＮＡが存在したので、それを５万個ずつ６グループ
に分は同様のスクリーニングを行い、陽性のグループを
１つ見出し、順次グループ分けとスクリーニングをくり
かえし最終的にサブスタンスにレセプターのｃＤＮＡク
ローンλ５ＫＲ５６を得た。
ー中に（ｉ）で述べたようにサブスタンスにレセプター
ｃＤＮＡが存在したので、それを５万個ずつ６グループ
に分は同様のスクリーニングを行い、陽性のグループを
１つ見出し、順次グループ分けとスクリーニングをくり
かえし最終的にサブスタンスにレセプターのｃＤＮＡク
ローンλ５ＫＲ５６を得た。
第１図は、本発明のプライマーＤＮＡの概略図を示す図
面である。
面である。
Claims (1)
- （１）プラスミドｐＵＣ１９由来の制限酵素￥Ｓａｌ￥
I 切断部位を含む制限酵素￥Ｐｓｔ￥ I −￥Ｐｖｕ￥
II切断断片から得られるプライマーＤＮＡであって、該
制限酵素￥Ｐｓｔ￥ I 切断部位の３′−末端側にポリ
（ｄＴ）が付加され、且つ該制限酵素￥Ｓａｌ￥ I 切
断部位に下記塩基配列で示されるＤＮＡ断片が挿入され
ていることを特徴とするプライマーＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10615588A JPH01277490A (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | プライマーｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10615588A JPH01277490A (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | プライマーｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01277490A true JPH01277490A (ja) | 1989-11-07 |
Family
ID=14426421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10615588A Pending JPH01277490A (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | プライマーｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01277490A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001027633A (ja) * | 1999-05-07 | 2001-01-30 | Inst Of Physical & Chemical Res | 相互作用するタンパク質の検出方法 |
-
1988
- 1988-04-28 JP JP10615588A patent/JPH01277490A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001027633A (ja) * | 1999-05-07 | 2001-01-30 | Inst Of Physical & Chemical Res | 相互作用するタンパク質の検出方法 |
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