JPH01277499A - Ｌ−α−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、Ｌ−α−アミノ酸の製造法に関する。更に詳
しくはミコプラナ属またはプロタミノバクタ−Ａ”Ｃに
人ｊ；するａｌｌ　ｉ＾！に含ま才しているＩ、−アミ
ノ酸アミド不斉加水分Ｉ？ＩＩ＋′酵素（以下■、−ア
ミダーゼと記す）を使用し、■〕■、−α−アミノ酸ア
ミドから対応するＬ−α−アミノ酸を製造する方法に関
するものである。

Ｌ−α−アミノ酸は、医薬品、食品添加物、飼料添加物
、および各種工業薬品の中間体として重要なものである
。

「従来の技術」 従来、α−アミノ酸を有機合成的方法により製造する場
合、得られるα−アミノ酸がＤＬ−体であることから、
いかにして工業的に有利に光学分割を行うかが大きな課
題であった。

ＤＬ−α−アミノ酸の光学分割を行う方法としては、物
理化学的方法、生化学的方法等があるが、これらの中で
後者に関しては例えば次の方法が実用化されている。

（１）ＤＬ−α−アミノ酸のＮ−アシル体に微生物の有
するアシラーゼを作用させる方法および （２）Ｉ）Ｉ、−α−アミノ酸のヒダン１〜イン誘導体
しこ微生物のイｉするヒダン１−イナーゼを作用させる
方法 しかしながら、これらの方法は高価な原料を必要とし、
且つ反応系も複雑であることから経済的な不利は避は難
い、といった欠点を有している。

一方、ＤＬ−α−アミノ酸アミドを基質として、これに
微生物が生産するＬ−アミダーゼを作用させ、対応する
Ｌ−α−アミノ酸を得る方法として、バチルス属、バク
テリジウム属、ミクロコツカス属、およびプレビバクテ
リジウム属の有する微生物が生産する酵素アミダーゼを
用いる方法（公表昭５６−５００３１９号）、種々の酵
母、細菌類が生産する酵素アミダーゼを用いる方法（特
開昭５７−１３０００号、同５９−１５９７８９号およ
び同６０−３６４４６号）、エンテロバクタ−・クロア
ッセイ（Ｎ−７９０１）またはシュードモナス　５Ｐ（
Ｎ−７１３１またはＮ−２２１１）が生産する酵素■、
−アミダーゼを用いる方法（特開昭６２−５５０９７号
）、等が知られている。

しかしながら、これらの方法では、いずれも用いられる
微生物菌体が有する■、−アミダーゼ活性が弱く、ＤＬ
−α−アミノ酸アミドからのＬ−α−アミノ酸の工業的
生産に用いるには適さない。

［問題を解決するための手段、作用］ 本発明者らは、ＤＬ−α−アミノ酸アミドを基質として
、これらを効率良く対応するＬ−α−アミノ酸に転換す
る酵素を含有する微生物を自然界から探索したところ、
ミコプラナ属およびプロタミノバクタ−属のそれぞれに
属する細菌の中に高いＬ−アミダーゼ活性を示す菌株を
発見して、この発見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、 　Ｈ２ 一般式が　ＲＣＨＣＯＮＨ２（ただし、式中Ｒは低級ア
ルキル基、置換低級アルキル基、フェニル基、置換フェ
ニル基、フリル基、ピリジル基、チアゾリル基、イミダ
ゾリル基、およびインドリル基を示す）で示されろｒ）
１．−α−アミノ酸アミドに、ミコブラナスづ（または
プロタミノバクタ−属に属する細−１の菌体あるいは菌
体処理物を作用させ、対応する１、−α−アミノ酸を得
ることを特徴とする［、−α−アミノ酸の！Ｉｉ造法で
ある。

本発明の一般式で示されるＤ　ｔ、−α−アミノ酸アミ
ドのＲの低級アルキル基および置換低級アルキル基の低
級アルキル基には特に制限はないが、たとえばメチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル
およびｓｅｅ　−ブチルなどのＣ，−Ｃ，の直鎖または
分枝した低級アルキル基が好適であり、また置換低級ア
ルキル基、置換フェニル基のそれぞれに含まれる置換基
は、たとえば、ヒドロキシ、メ１−キシ２、メルカプト
、メチルメルカプト、アミノ、グアニル、カルボキシル ン、フェニル、ヒドロキシフェニル、イミダゾリル、お
よびインドリルなどである。

本発明の一般式で示されろＩ）１．−α−アミノ酸アミ
１くの代表例として、アラニンアミド（１）　Ｉ、−″
を省略。以下同様）、バリンアミド、ロイシンアミド、
イソロイシンアミド、セリンアミド、スレオニンアミド
、システィンアミド、シスチンアミド、メチオニンアミ
ド、リジンアミド、アルギニンアミド、アスパラギンア
ミド、グルタミンアミド、フェニルグリシンアミド、フ
ェニルアラニンアミド、チロシンアミド、トリプトファ
ンアミドおよびヒスチジンアミドなどがある。

細菌の菌体またはその処理物によってこれらの基質を不
斉加水分解して、それぞれの基質に対応するＬ−α−ア
ミノ酸が得られる。

本発明に用いられる細菌は、ミコプラナ属ま解し、対応
するＬ−α−アミノ酸を生成する能力を有する菌株であ
れば良く、特に制限はない。

ミコプラナ属に属する細菌の代表例としては、ミコプラ
ナ・デイモルファ　（Ｍｙｃｏｐ　ｌ；＋ｎ；Ｉ（Ｉ　
ｉｍｏｒ−ｐｌ＋ａ）およびミコプラナ−ブラタ（Ｍｙ
ｃｏｐｌ；ｕ＋；＋ｂｕｌｌａｔ、ａ）が知られている
。これらのうちミコプラナ−デイモルファ　ＡＴＣＣ４
２７９（＝ＩＦＯ１３２９１）、ミコプラナ−デイモル
ファ　ＮＣＩＢ　　９４．３９．ミコプラナ・デイモル
ファ　ＩＦＯ１３２１３，ミコプラナ・ブラタ　ＡＴＣ
Ｃ４２７８（＝ＩＦＯ１３２９０）、ミコプラナ・ブラ
タ　ＮＣＩＢ　　９４４０、ミコプラナ−ブラタ　ＩＦ
Ｏ１３２６７およびミコプラナ　ＳＰ　　ＩＦｏ　　１
３２４０　等が特に好ましい。

プロタミノバクタ−属に属する細菌の性質は、Ｚｅｎｔ
ｒａｌｂｌ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｐａｒａｓｉｔｅｎ
ｋｄ、Ｉｎｆｅｋｔｉｏｎ−ｓｋｒ、ｌＩｙｇ、Ａｂｔ
、２，７１：　１９３−２３２（１９２７）に記載され
ており、菌種名として　プロタミノバクタ−・アルボフ
ラバス　Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｏｆ
ｌａｖｕｓ（Ｔｙｐｅ　５ｐｅｃｉｅｓ）と　プロタミ
ノバクタ−・ルバー　Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ
　ｒｕｂｅｒとが記載されている。また、Ａｎｎ−１１
ｏｇｏｒ−、Ｉ：５：３−６０　（１９５：３）　　に
ば　プロタミノバクタ−・ルブラｔ＼　Ｉ’ｒｏ１．ａ
ｍｉ−ｎｏｂａｃｌ、ｃｒ　ｒｕｂｒｕｍ　　が、（）
Ｓｌ」：ｌ、７（ｉ／Ｉ、’ｌ−／ｆｉには１’ｒｏＬ
ａｍｉｎｏｂａＣＬｅｒ　　ｒｕｌ）ｃｒ　　５ｕｂｓ
ｐ−＋ｎａｃｌ＋１ｄａｎｕｓ　　が、また、ＬＩＳＰ
　：ｌ、６（ｉ’Ｊ、３７０　ニハ　　プａタミノバク
タ−０チアミノフアーガス　Ｐｒｏｔａｍ＋　ｎｏｂ；
］Ｃｊ、ｅｒｊｈｉａｍｉｎｏｐｈａｇｕｓ、プロタミ
ノバクタ−・カンジダ　Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅ
ｒ　ｃａｎｄｉｄｕｓが記載されている。しかしながら
、前記の菌株のうち、Ｐｒｏ−しａｍｉｎｏｂａｃｔｅ
ｒ　　ｒｕｂｅｒ、Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｊｅｒ　
　ｒｕｂｒｕｍ。

およびＰｒｏｔａｍｊｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒｕｂｅｒ　
５ｕｂｓｐ、ｍａｃｈｉｄ−ａｌｌＵＳはＰｒｏｔｏｍ
ｏｎｕｓ　ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓと再同定され（丁ｎｔ
、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．．３４：１８８
−２０１　１９８４）、また、Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａ
ｃｔｅｒ　ｔｈｉａｍｉｎｏｐｈａｇｕｓおよびＰｒｏ
ｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｎｄｉｄｕｓはＭｅｔ
ｈｙｌｏｂａｃ−ｉｌｌｕｓ　ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓと
再同定され（Ｉｎｓｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、■ａｃｔｅｒｉ
ｏ１．，３６．５０２１９８６）、現在のところ　プロ
タミノバクタ−属の菌種としては、Ｐｒｏｔａｍｉ−ｎ
ｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｏｆｌ、ａｖｕｓのみが存在し
ている。

Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｏｆｌａｖｕ
ｓ　　の蘭学的性質は、前記のＺｅｎｔｒａｌｂｌ−１
’１ａｃｔｅｒｉＯ１，Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ、ｌｎ
ｒｃｋＬｉｏｎｓｋｒ−１１ｙｇ−Ａｂｌ、、２，７↓
：　１９：ｌ−２：１２（１！１２７）に記載されてい
るが、その後、この菌種のＩ’ｙ−ρＱ　ｓｌ；ｒａｊ
ｎの性質が再検討され、グラム陽性の桿菌で、胞子を形
成せず、キノンタイプはＨに−９（＋１２）で、ＣＩ６
：Ｏ，Ｃｒｕｌ　を主成分とする菌体脂肪酸組成を有す
ることが、また、この菌株はｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍグル
ープに入る菌株であることが報告されている（Ｉｎｓｔ
、Ｊ、５ｙｓｔ６ロａｃｔｅｒｉｏｌ　、　。

３４：１８８〜２０１１９８４）。

このように、本発明に用いられるＰｒｏｔａｍｉｎ−ｏ
ｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｏｆｌａｖｕｓは、現在のところ
、分類学上の位置付けが確定されておらず、今後、新属
の創設または他の属への移動が行われる可能性がある菌
種である。

また、現在のところ、この菌種に含まれる菌株としては
、プロタミノバクタ−・アルボフラバスＰｒｏｔａｍｉ
ｎｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ　ＡＴＣＣ８
４５８（＝ＩＡＭ　　１０４０　　＝ＩＦ０　３７０７
　　＝ＮＣｒＢ　　８１６７　　＝ＮＣＴＣ２８７５）
が存在する。本発明では、この菌株を好適に使用するこ
とができる。

本細菌（本発明で使用される細菌　以下同様）のも・１
養に使用される培地は４本！４１＋菌が資化し得る炭素
源を少なくとも含有しているコ１［を要し、さらに適量
の窒素源および無機塩などを含有する培地であれば良く
、合成培地および天然培地のどちらでも良く、特別な培
地を必要としない、炭素源としては、本菌が資化し得る
炭素源であれば良く特に制限はなく、たとえば糖蜜、ペ
プトン、肉エキス、およびコーンステイープ。

リカーなどの天然物ならびにグルコース、フラクトース
、シュクロース、ソルビトール、グリセリンおよびマン
ニトールなどの糖類、エタノールおよびｎ−プロパツー
ルなどのアルコール類、酢酸、クエン酸、こはく酸など
の有機酸などを用いることができる。

窒素源としては、たとえばアンモニウム塩、硝酸塩など
の無機窒素化合物および／または、たとえば尿素、コー
ンステイープ・リカー、カゼイン、ペグ１ヘン、酵母エ
キスなどの有機性窒素含有物質が用いられる。

無機成分としては、たとえばカルシラ１１塩、マグネシ
ウム塩、カリウｌ＼塩、ナ１〜リウ１１塩、リン酸塩、
マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバ
用１〜塩、はう素化合物およびよう素化合物が用いられ
る。

高い酵素活性を得るために培地へ〇Ｌ−α−アミノ酸ア
ミドを添加することも効果的である。

この際、添加するＤＬ−α−アミノ酸アミドは本発明の
一般式で示されるＤＬ−α−アミノ酸アミドであればい
ずれでもよいが、目的とするし一α−アミノ酸に対応す
るＤＬ−α−アミノ酸アミドを用いることがなお効果的
である。

培養条件は、温度２０〜４２℃、好ましくは２５〜４０
℃、　ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８である。

このような条件で好気的に培養を行う。これらの条件を
外れて培養した場合には本細菌の生育、増殖は低下する
が、これらの条件を外して培養することを妨げない。

この様にして培養した細菌を一般式で示されるＤ　Ｌ−
α−アミノ酸アミドに作用させるには液体ｆ、：Ｌ、地
に微生物を培養して／ＩＩられた１７″１養液、この培
養液から分離した菌体、菌体破砕物、または培養液もし
くは菌体から分離した酵素（Ｌ−７ミダーゼ）の粗製酵
素、精製酵素、酵素含有抽出物あるいはその濃縮物（以
下菌体以外の物を″菌体処理物″と記すこともある）な
どの状態で作用させる。また、菌体および酵素のそれぞ
れを担体で固定化して使用に供することもできる（以下
にこの固定化物も″菌体処理物″と記すこともある）。

なお、この固定化は常法によることができるすなわち、
この固定化に使用される担体としては、たとえばアルギ
ン酸、カラギーナン、コラーゲン、セルロース、アセチ
ルセルロース、寒天、コンニヤクツセロファン、コロジ
オンなどの天然物、またはポリアクリルアマイド、ポリ
スチレン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレング
リコール、ポリウレタン、ポリブタジェンなどの合成高
分子物質などのような通常使用される担体を使用して、
アミダーゼ活性を損なうことのない条件下で行オ）れる
。

本発明において、−形式で示されるＩ）［、〜α−アミ
ノ酸アミドに、ミコプラナｂｔまたはプロタミノバクタ
−属に属する細菌の菌体あるいは菌体処理物を作用させ
て不斉加水分解する反応条件は、使用する微生物の種類
、菌体量および基質の種類などによって異なり、−概に
は特定しえないが、一般に反応温度は１０〜９０℃、好
ましくは２０〜７０℃であり、反応ｐｌ＋は５〜Ｉ３、
好ましくは６〜１２である。反応時間は、通常は０．５
〜３６時間程時間遅当であり、１〜２４時間程度が好適
である。反応温度が前記の範囲で高い程、また、菌体ま
たは菌体処理物の使用量が多い程、反応時間が短縮され
る。

本発明において、微生物の使用量は、基質であるＤＬ−
α−アミノ酸アミドに対し、乾燥菌体として重量比で０
．００１〜１０の範囲、好ましくは０．０１〜１の範囲
である。菌体処理物を使用する場合には、乾燥菌体の重
量に換算してその使用量を決定すれば良い。

基質である１月、−α−アミノ酸アミドの使用濃度は、
Ｊｊ＋Ｃ料として使用したＩ）　Ｉ、−α−アミノ酸ア
ミドの飽和濃度以下であれば一般に制限はないが、好ま
しくは１〜２０　ｗｔ％である。

本発明では、■、−（χ−アミノ酸アミドの加水分解反
応がほぼ終了した時点で、可及的速やかに反応を停止さ
せた後、反応生成液から目的物質であるＬ−α−アミノ
酸と未反応のＤ−α−アミノ酸アミドとをそれぞれ分離
２回収する。

この分離は、分別晶析、溶媒抽出、イオン交換、その他
公知の方法により容易に行うことができる。

なお、前記の不斉加水分解の操作において、基質中のＤ
−α−アミノ酸アミドは、菌体または処理物の作用を受
けにくいが、反応時間が過度に長くなると、菌体または
菌体処理物の作用を受けて、Ｄ−α−アミノ酸を生成す
ることがあるので、Ｌ−α−アミノ酸アミドの加水分解
が終了した時点で反応を速やかに停止させ、Ｄ−α−ア
ミノ酸を極力生成させないことが必要であろ、。

反応を停止１−させるには、たとえば反応生成液から菌
体および処理物を除去する、反応生成液から１）−α−
アミノ酸アミドを除去する、反応生成液のｐｌ＋を変化
させるおよび／または反応生成液の温度を変化させるな
どの常法によることができる。

また、未反応のＤ−α−アミノ酸アミドは、公知の方法
、たとえば酸あるいはアルカリで加水分解することによ
り対応するＤ−α−アミノ酸を得ることができる。また
、Ｄ−α−アミノ酸アミドをラセミ化した後、反応系へ
循環することにより、ＤＬ−α−アミノ酸アミドを全量
り一α−アミノ酸とすることもできる。

［実施例］ 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されるものではない。　　　
　　　　　　　（以下余白）実施例　Ｉ グルコース　ｌｏｇ、ボリベプ１〜ン　、＋、　ＯＫ、
酵母エキス　１０ｇ　を純水ｔＱに溶解し、ｐ　Ｈを７
．０に調整した培地１００　ｍＱを１Ｑ容三角フラスコ
に入れ、ｌ　ｋｇ　／　ａｉ　Ｇで２０分間殺菌した培
地に、同培地で前培養したミコプラナ属およびプロタミ
ノバクタ−属の各菌株の培養液をＬｔｎＱずつ植菌し、
３０℃で６５時間振どう培養を行い、培養液を１８００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体を得た。

ＤＬ−バリンアミドを５ｇ含む純水１００艷に、市記の
菌体を乾燥菌体重量換算で０．５ｇ加え、ｐ　Ｈを９に
調整したのち、４０℃で６０分間振とうしつつ反応を行
った。反応終了後、反応生成液を１８０００　ｒｐｍで
１０分間遠心し、上澄液を得た。この−上澄液を高速液
体クロマトグラフィで分析し、生成したＬ−バリンの収
率および光学純度を求めた。

なお、得られたＬ−バリンの比旋光度を測定したところ
、［α］に’＝＋２７．８〜２８．２　であった１、　
結果を人Ｉにボす、。

表１ ９　基質中に含まれているＬ−バリンアミドに対するモ
ル収率（以下の実施例でもこれに準する）。

Ｉ　生成されたバリンのＬ体と０体のモル比（以下の実
施例でもこれに準する）。

実施例　２ ｊご地を次の組成しこした以夕１・ば実施例１と同様に
して行った。

グルコース　　　　　　　１０　　　　ｇベグ１−ン　
　　　　　　　５ｇ 肉エキス　　　　　　　　１ｇ 酵母エキス　　　　　　　５ｇ ＫＨ２ＰＯ４１ｇ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，４ｇ ＦｅＳ０４・７ＨｚＯＯ−０１ｇ ＭｎＣ１ｚ’４ＨｚＯＯ，Ｏｌｇ ＤＬ−バリンアミド　　　５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　ＩＱ ｐＨ７ 結果を表２に示す。

（以下余白） 表２ ］９ 実施例　：３ クリセロール　Ｉ　（Ｊ　ｇ　、肉エキス　５ｇ−Ｍｇ
ＳＯ２・７１１，０　０．　、＋　ｒζ、　Ｉ’　（！
　Ｓ　Ｏイ・７　）１２００−０１．＋τ、Ｍ　ｎ　Ｓ
　Ｏ，・４　Ｈ，００、０，１ｇ、Ｃ，ａ　ＣＩ　２・
２Ｈ，、ＯＯ，０，１，Ｈ，７，ｎ５Ｏ４−７０，００
−００１ｇ−ＤＩ、　７　工Ｚ　）Ｌ／　／ラニンアミ
ド　２．５ｇを純水１Ｑに溶解し、ρＴ−Ｉを７．０に
調整した培地１００−を１Ｑ三角フラスコに入れ、１ｋ
ｇ／ｃＪＧ　　で２０分間殺菌した培地に、同培地で前
培養したミコプラナ・デイモルファ　ＡＴＣＣ４２７９
の培養液１７！を植菌し、３０℃で４８時間振どう培養
を行い、培養液を１８００Ｏｒｐｍ　　で１０分間遠心
分離し、菌体を得た。

ＤＬ−フェニルアラニンアミド０．５ｇを純水１００−
に溶解した水溶液に前記の菌体を乾燥菌体重量換算で０
．０１ｇを加え、Ｐ　Ｈを９，０に調整した反応液Δ、
Ｂ、Ｃをそれぞれ準備した。

反応液Δ２反応液Ｂおよび反応液Ｃを用い、それぞれ４
０℃、３０℃および２０℃で振とうしつつ反応を行い、
１時間、　：ｕ１１間、６時間後におけるＩ、−フェニ
ルアラニンの収；トを求めた。また、６時間後の反応−
Ｌ澄液の■４体体重）体（モル比）をｄｌり定した。

結果を表３に示す。

表３ 実施例　４ 反応「）１１を７とした以外は、実施例２と同様にして
反応を行−）だ、、　結果を表４に示す。

表４ 実施例　５ 反応原料にＩ）　！、−ロイシンアミドを使用した以外
は実施例２と同様にして、ミコプラナ属およびプロタミ
ノバクタ−属の各菌株について反応を行った。　結果を
表５に示す。

（以下余白） 表５ 実施例　６ プロタミノバクタ−・アルボフラバス　Δ’Ｉ’　ＣＣ
８’１５８　　を用い、反応Ｊｊ：〔料に各種１）Ｉ、
−α−アミノ酸アミドを使用した以外は、実施例２と同
様に行った。　　結果を表６に示す。

表６ 実施例　７ ミコープラナーデイモルファ　八’ｌ’ｃｃ　　４２７
９　を用い、反応ノア；ｊ料に各種１）　［、−ｔｙ−
アミノ酸アミドを使用した以外は、実施例２と同様に行
った。　　結果を表７に示す。

表７ ［発明の効果］ 本発明方法によって、１）Ｌ−α−アミノ酸アミドから
多くの有用な［、−α−アミノ酸を容易に、しかも効率
よく製造することが可能となった。

特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社 代表者　長野和書 代理人　　弁理士　　小　堀　貞　文

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式が▲数式、化学式、表等があります▼（ただし、 式中Ｒは低級アルキル基、置換低級アルキル基、フェニ
   ル基、置換フェニル基、フリル基、ピリジル基、チアゾ
   リル基、イミダゾリル基、およびインドリル基を示す）
   で示されるＤＬ−α−アミノ酸アミドに、ミコブラナ属
   またはプロタミノバクター属に属する細菌の菌体あるい
   は菌体処理物を作用させ、対応するＬ−α−アミノ酸を
   得ることを特徴とするＬ−α−アミノ酸の製造法。