JPH01281079A - 植物ウィルスの弱毒株およびその作成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は植物ウィルスの弱毒株およびそれを効率よく人
為的に作成する方法に関する。

〔従来の技術〕

植物に感染するウィルスの圧倒的大多数はＲＮＡウィル
スである。植物ＲＮＡウィルスには１本のＲＮＡをゲノ
ムとする単粒゛子性のものと２本以上のＲＮＡにゲノム
が分節した多粒子性のものとがあり、それぞれ数多くの
種類がある。代表的な植物ＲＮＡウィルスとして、タバ
コモザイクウィルス（ＴＭＶ）、キュウリモザイクウィ
ルス（ＣＭＶ）　、アルファルファモザイクウィルス（
ＡＩＭＶ）　、ブロムモザイクウィルス（ＢＭＶ）　、
ササゲモザイクウィルス（ＣＰＭＶ）　、ジャガイモウ
ィルスＸ　（ＰＶＸ）、ジャガイモウィルスＹ（ＰＶＹ
）などをあげることができる。

遺伝子構造が解明された植物ＲＮＡウィルスはまだ数少
ないが、ゲノムＲＮＡはウィルスの機能に必要な遺伝子
をコードした部分とタンパク質に翻訳されない部分（非
コード領域）とからなることが知られている。算コード
領域はゲノムＲＮＡの両末端部分にそれぞれ数十から数
百塩基存在し、ウィルスの複製過程において何らかの働
きをしているものと想像されている。ゲノム内部の遺伝
子間にも非コード領域が介在することがある。

ウィルスによる病害は作物に甚大な被害を与えており、
例えば昭和５８年の日本国内におけるウィルスによる被
害額は約８（１０億円と見積られている。

しかしながら現在まだウィルスに対する効果的な治療法
はなく、その防除はもっばらウィルスの感染を防ぐこと
に主眼がおかれている。そのような感染防除に効果をあ
げている技術の一つとして、近縁ウィルス間の干渉作用
を利用した方法があり、いくつかのウィルス病において
実用化されている〔栃原、農業技術４１．４８Ｈ１９８
６））。

干渉作用とは、あるウィルスに感染した植物は近縁のウ
ィルスによる二次感染から保護されるという現象である
。そこで、病害を引き起こすウィルスにごく近縁でそれ
自身は病害を全くあるいはごくわずかしか起こさないよ
うなウィルス株、すなわち弱毒株が得られれば、作物に
あらかじめ弱毒株を感染させておくことにより、病害を
起こすウィルスの感染を抑えることができる。

干渉作用を利用してウィルス防除を行おうとする場合、
最大のポイントは実用に耐える優秀な弱毒株が得られる
かどうかである。現在実用されている弱毒ウィルスには
、自然界から分離されたもの（例えばカンキツトリスブ
ザウィルス（ＣＴ　Ｖ　）の弱毒株）および人工的に作
出されたもの（トマト系タバコモザイクウィルス（ＴＭ
Ｖ）の弱毒株、キュウリ縁座モザイクウィルス（ＣＧＭ
ＭＶ）の弱毒株など）がある０人工的に弱毒株を作出す
る方法として従来用いられてきたのは、野外の強毒株か
ら高温処理や亜硝酸処理などにより弱毒性突然変異株を
誘発して選抜する方法［例えば、後藝・４１本、北海道
農業試験場電報９９．６７（１９７１）；Ｙｅｈａｎｄ
　Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇ
ｙ　７４＋１０８６（１９８４）］であるが、その作出
は偶然に依存しており効率的でない。近年、多粒子性ウ
ィルスでのゲノム成分の交換やサテライトＲＮＡの利用
による弱毒株の作出が試みられている［花田、ＢＩＯＩ
ＮＤｔｌＳＴＲＹ　４゜３５７（１９８７）　］が、ま
だ実用的な弱毒株の作出には至っておらず、また単粒子
性のウィルスあるいはサテライトＲＮＡを持たないウィ
ルスには応用できない。

一方最近になって、いくつかの植物ＲＮＡウィルスにお
いてその完全長ｃＤＮＡからインビトロ転写反応により
感染性のあるウィルスＲＮＡを作成することが可能にな
り［Ａｈｌｑｕｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１．７０６６
（１９８４）；Ｍｅｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．５０４
３（１９８６）　］　、ｃＤＮＡを改変することにより
ウィルスゲノムＲＮＡ上の任意の場所に計画的に突然変
異を導入できるようになった。

（発明が解決しようとする課題〕 本発明者らは、ウィルスによる作物の病害の防除に用い
うる安定な植物ウィルス弱毒株およびこれを計画的に作
出する方法を開発すべく鋭意研究し、トマト系ＴＭＶ−
Ｌ株を用いて種々の突然変異をゲノムＲＮＡ上に導入し
てその効果を研究した結果、驚（べきことにゲノムＲＮ
Ａ上の非コード領域に突然変異を導入することにより弱
毒株が得られることを見いだし、本発明を完成した。

なお、ここで「安定な」弱毒株とは復帰突然変異を起こ
して強毒株に戻ることがないことをいう。

〔課題を解決するための手段］ 本発明は、ゲノムＲＮＡ上の非コード領域に突然変異部
位を持つことからなる植物ＲＮＡウィルスの弱毒株、ゲ
ノムＲＮＡの３′末端部に位置する非コード領域に突然
変異部位を持つ植物ＲＮＡウィルスの弱毒株、ゲノムＲ
ＮＡの３′末端部のトランスファーＲＮＡ様構造部分と
コートタンパク質のコード領域との間にある非コード領
域に突然変異部位を持つ植物ＲＮＡウィルスの弱毒株、
上記各ウィルスがトバモウィルスに属するものからなる
植物ＲＮＡウィルスの弱毒株、上記各突然変異が欠損突
然変異からなる植物ＲＮＡウィルスの弱毒株、並びにこ
れら植物ＲＮＡウィルスの弱毒株の作成法である。

本発明の植物ＲＮＡウィルスとしては、タバコモザイク
ウィルス（ＴＭＶ）、キュウリ縁座モザイクウィルス（
ＣＧＭＭＶ）　、ハイビスカス黄斑ウィルス、オドント
グロッサムリングスポットウィルス、キュウリモザイク
ウィルス（ＣＭＶ）、アルファルファモザイクウィルス
（ＡＩＭＶ）、ブロムモザイクウィルス（ＢＭＶ）、サ
サゲモザイクウィルス（ＣＰＭＶ）、ジャガイモウィル
スｘ（ＰＶＸ）、ジャガイモウィルスＹ（ＰｖＹ）など
が挙げられる。

本発明のウィルス弱毒株はそのゲノム上の非コード領域
に突然変異を導入することにより作出することができる
ものであり、全身感染植物に感染した場合、全くあるい
はごくわずかの病害しか引き起こさないものである。ま
た、本発明のウィルス弱毒株は、必ずしもその全身感染
能を必須としない。すなわち、弱毒ウィルスゲノムＲＮ
ＡのｃＤＮＡを植物染色体中に導入することにより、ウ
ィルス抵抗性植物を作出する技術が開発されており（特
願昭６２−１９４０３８号）、本技術を用いれば、ウィ
ルス弱毒株の全身感染能は必要としない。

次にトバモウィルスの弱毒株作出を例として本発明を具
体的に説明する。

トバモウィルス（Ｔｏｂａｍｏｖｔｒｕｓ）は、単粒子
性の棒状ウィルスであり、タバコ、トマト、ササゲなど
に病害を与えるＴＭＶや、キュウリ、メロンなどに病害
を与えるＣＧＭＭＶ、ハイビスカスに黄斑を生じるハイ
ビスカス黄斑ウィルス、シンビジウム、カドレアなどの
花弁に斑入りを生じるオドントグロソサムリングスポッ
トウィルスなどがこれに属する。ＴＭＶはトバモウィル
スの規範ウィルスであり、植物ウィルス中量も研究の進
んだウィルスの一つである。ＴＭＶには数多くの株（ｓ
　ｔｒａ　ｉｎ）があるが、そのうち標準株の一つであ
るＶｕｌｇａｒｅ　、　　ｌ−マド系強毒株りおよびそ
の弱毒株Ｌ１１Ａについてはゲノム全長、ザサゲ系強毒
株ＣｃおよびＣＧＭＭＶについてはゲノム３′側約１（
１００塩基の一次構造が知られている［　Ｇｏｅｌｅｔ
　ｅｔ　ａｔ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　　
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７９．　５８１８（１９８２）；Ｏ
ｈｎ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９６．１９１５
　（１９８４）；　ＮｉｓＮ１５ｈｉ旧ｅｔ　ａｌ、、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３．５５８
５（１９８５）；Ｍｅｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１８４．２０（１９８１）；Ｍｅ
ｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２７，５４
　（１９８３）　］　＊それによると、ＴＭＶのゲノム
ＲＮＡは約６４（１０塩基であり、５′側から順に１３
０　／１８０にタンパク質、３０にタンパク質、コート
タンパク質の４種類のタンパク質がコードされている。

５′末端部には約７０塩基、３′末端部には約２（１０
塩基の非コード領域があるが、内部の遺伝子間には非コ
ード領域はないかまたは数塩基しかない。３′末端部の
非コード領域は３′末端から約１（１０塩基のトランス
ファーＲＮＡ様構造部分およびこれとコートタンパク質
のコード領域との間の約１（１０塩基とに分けることが
できるが、後者の部分にはシュードノット（ｐｓｅｕｄ
ｏｋｎｏ　ｔ）構造と呼ばれる三次構造が３つ連続して
存在することが知られている［ｖａｎ　Ｂｅｌｋｕｍｅ
ｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１
３．７６７３　（１９８５）］。

これらの構造のうち、トランスファーＲＮＡ様構造はＣ
ＭＶ、ＢＭＶ、カブ黄化モザイクウィルス（ＴＹＭＶ）
など他の多くのウィルスにも見られる構造である。

発明者らはこのトランスファーＲＮＡ様＋ｌｌ造とコー
トタンパク質コード領域との間の部分に注目し、ここに
突然変異を導入することにより好ましい弱毒株を作出し
た。前記導入する突然変異としては置換突然変異、挿入
突然変異、欠損突然変異がある。このうち特に好ましい
ものは欠損突然変異であるが必ずしもそれに限るもので
はない。欠損突然変異が好ましいというのは、欠損突然
変異は安定であり、弱毒株の使用に当たってしばしば生
じる問題であるところの強毒株への復帰がほとんど起こ
り得ないからである。

第１図にトバモウィルスのトランスファーＲＮＡ様構造
′部分とコートタンパク質コード領域との間の部分（以
下シュードノット領域という）を示す。前記したように
この領域には３つのシュードノット構造がある。以下本
明細書においては、これらを区別するために、５′側（
第１図の左側）より！頓にそれぞれ５′、中央、３′　
シェードノット構造と呼ぶ。

本発明による弱毒株の１つの形態は中央シュードノット
構造に突然変異部位を持つものである。

その例として中央シェードノット構造の一部または全体
を欠損したものがあげられる。

本発明による弱毒株の別の形態は３′　シェードノット
構造に突然変異部位を持つものである。その例として３
′　シェードノット構造の一部を欠損したものがあげら
れる。しかしながら、発明者らの知見によれば、３′　
シュードノット構造はウィルスの複製に重要であり、こ
の部分に大きな変異を導入するとウィルスの増殖が不可
能になる可能性が高く好ましくない。

本発明による弱毒株のさらに別の形態は５′　シュード
ノット構造およびその５′上流部分に突然変異部位を持
つものである。しかしながら、この部分への突然変異の
導入だけではウィルスを弱毒化するには不十分であり、
前記した２種類の突然変異と組み合わせることが必要と
なる。そのような例としてコートタンパク質コード領域
の３′　直下流から中央シュードノット構造までをすべ
て欠損したものがあげられる。このような大きな欠損変
異は前記した中央シュードノット構造部分のみの欠損に
比べてより安定であるという利点を持っている。

本発明による弱毒株の作成法は、ウィルスゲノムＲＮＡ
上に前記したような突然変異を導入することよりなる。

導入に当たっては、本発明にいたる実験の過程において
は、すでに公知であるところの、ウィルスｃＤＮＡから
インビトロ転写反応により感染性のあるウィルスＲＮＡ
を得る実験系を用いた［八ｈｌｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｊ
ａｎｄａ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

４．２８７６（１９８４）；　Ｍｅｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．５０４３（１９８６）　］　、
これは、この実験系が、現時点においてウィルスゲノム
ＲＮＡ上に計画された突然変異を導入する最も効率のよ
い方法と判断されたからである。しかしながら本発明は
、ウィルスゲノムＲＮＡ上に目的とする突然変異を導入
できるのであれば、必ずしもこの実験系を用いなくとも
よいことはいうまでもない。

この実験系を用いて本発明を実施しようとする場合には
、ウィルスｃＤＮＡ上の適当な制限酵素切断サイトを利
用して、目的とする部分のｃＤＮＡに計画された突然変
異部位を導入し、その後この改変されたｃＤＮＡを鋳型
としてインビトロ転写反応を行うことにより、計画され
た変異部位を持つウィルスＲＮＡを得ることができる。

利用する制限酵素切断サイトは目的とするウィルスの塩
基配列に応じて異なるべきものであるが、塩基配列が既
知、であれば、利用すべき制限酵素の選択は、当業者に
とって容易である。

上記の場合において、導入しようとする突然変異が欠損
突然変異である場合には、−例としてＢａｔ　３１ヌク
レアーゼを用いることが可能である。

Ｂａｔ　３１ヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡに作用して末
端からほぼ一定の速度でＤＮＡを短くしていく酵素であ
るので、適当な制限酵素で切断した後Ｂａ１３１を適当
な時間作用させることにより、はぼ目的とする欠損変異
を導入することができる。Ｂａｌ　３１ヌクレアーゼの
反応条件等は一般の実験書に記載されている［例えばＭ
ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｊｎｇ　”　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９Ｂ２）　］
。

以下にＴＭＶ−Ｌを用いた実施例をあげ本発明をさらに
詳細に説明する。

本発明はこの実施例に限定されるものではなく、本発明
の技術分野において通常なされる変更および改良を含む
と共に、他のウィルスにも応用できるものである。

実施例−１ 本実施例においてＤＮＡのクローニングには大腸菌８８
１０１株（全酒造■製、Ｃａ　ｔ、　ｋｇ０５１）を用
いた。また、本実施例中特に反応条件等を明記していな
い工程は、一般の実験書［例えばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅ
ｔａｌ、、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”、
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ（１９８２）　］を参考にすれば当業者には容
易に実施できる工程である。

なお、以下の説明においては特に断わらない限りＴＭＶ
ゲノムＲＮＡおよびそのｃＤＮＡは５′末端より順に番
号をつけて表した。

１）シュードノット領域に欠損突然変異をもつ転写ベク
ターの作成 ＴＭＶ−Ｌの全長ｃＤＮＡを組み込んだ転写ベクタープ
ラスミドｐＬＦＷ　３はすでに公知であり、Ｍｅｓｈｉ
　ｅｔ　ａｌ、　［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３゜５０４３（１９８６）　］
の方法に従って作成した。このベクターでは、ＲＮＡへ
の転写がウィルスｃＤＮＡの５′末端から始まるように
なっており、さらにｃＤＮＡの３′末端直下流に制限酵
素旧ｕｌ　（全酒造■製、Ｃａｔ、Ｎｏ、１０７１Ａ）
の切断サイトを持っている。そこでこのベクタープラス
ミドを旧ｕＩで切断したものを鋳型としてインビトロ転
写反応を行うことにより、感染性のあるＴＭＶ−Ｌ　　
ＲＮＡを得ることができる。

シュードノット領域に欠損を導入する作業を容易にする
ため、ｐＬＦ賀３をにρｎｌ　（全酒造■製、Ｃａｔ。

Ｎｏ、　１０６８Ａ）とＢａｗｔｌｌ（全酒造■製、Ｃ
ａｔ、Ｎｏ、１０１ＯＡ）とで切断してシュードノット
領域を含むＴＭＶｃＤＮＡの３′側２ｋｂを分取し、こ
れをｐＵｃｌＢ（全酒造■製、Ｃａｔ、Ｎｏ、３２１８
）にクローニングして作業用プラスミドｐＵｃ３Ｌ−１
を得た。これにより、次の工程で用いる制限酵素Ｎ５ｉ
ｌの切断サイトがプラスミド上に１つになるので、以下
の工程が容易になる。

ＴＭＶ−ＬｃＤＮＡには６１８３番にＮ５ｉＩサイトが
あるが、これはコートタンパク質コード領域（６１８２
番まで）の３′直下流にあたる。そこでシュードノット
領域に欠損を導入するにあたり、二〇Ｎ５ｉｌサイトを
欠損の開始点として利用した。

ｐ［１ｃ３Ｌ−１をＮ５ｉｌ（ＮＥＢＳｆｆ１２７）で
切断して線状化した後、その５Ｕｇに反応液１（１０７
７１　（０，６Ｍ　ＮａＣ１゜２０＋ｏＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　ｐＨ８，０（２５°Ｃ）　、１２ｍＭ　ＭｇＣ
１ｇ、１２ｍＭ　ＣａＣ１ｚ）中２．３ＵのＢａｌ　３
１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ　Ｃａｔ。

Ｎｏ、８０１９５Ａ）を作用させた。反応は３０°Ｃで
行い、反応時間１分から１０分まで１分毎に反応液の一
部を取り出してＥＧＴＡを加えて反応を止めることによ
り、Ｎ５ｉｌサイトからさまざまな長さに削られたＤＮ
Ａを得た。これらの反応時間の異なる反応液を混合して
ｐＵＣ由来のＢａｍ１ｌｌサイトで切断した後、ウィル
スｃＤＮＡ３’　末端を含むさまざまな長さのフラグメ
ント混合物を分取してｐｕｃｉａのＢａｍＨＬ　と旧ｎ
ｃｌＴ　（東洋紡■製、Ｃｏｄｅ、Ｎｏ、１ｌＮＣ−２
０１）の間にクローニングし、ｐ　ｔＬ３ＮＣプラスミ
ドシリーズを得た。

以上の工程を第２図に模式的に示す。

制限酵素マツピングにより適当な長さに削られたクロー
ンを選び、ＤＮＡシークエンシングによって欠損の終点
を決定した［　Ｌｕｃｋｏｗ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５．４１７（１９８７
）］−以下得られた各クローンを欠損の終点Ｘにしたが
ってｐ　ｔＬ３ＮＧ−Ｘと呼ぶ。ｐｔＬ３ＮＣ−）’／
リーズをＭｌｕｌとｐＵｃ由来のＰｓｔｌ　（全酒造■
製、Ｃａｔ、Ｎｏ、１０７３Ａ）とで切断してウィルス
ｃＤＮＡ３’　末端を含むフラグメントを得、これを以
下の欠損変異ウィルス転写ベクターの構築に用いた。こ
のフラグメントにはｐＵＣのポリリンカーに由来するｒ
　ＧＧＴＣＪが挿入されているはずのところ、実際には
クローンごとに挿入されている塩基が異なっていた。す
なわち、ｐｔＬ３ＮＣ−６２０７、−６２０９、−６２
３３には’ＧＪ　、−６１８９、−６２４６、−６２５
３、−６２６３にはｒＧＧＪ　、−６２７５にはｒ　Ｇ
ＧＴ　Ｊ、−６２０４、−６２３９にはｒ　ＧＧＴＣＪ
がそれぞれ挿入されていた。これはおそらく本実施例で
用いた制限酵素１１ｉｎｃＩＩにエクソヌクレアーゼ活
性が混入していたためと考えられる。

ｐＬＬ３Ｎｃ−Ｘ／Ｍｌｕｌ　−Ｐｓロフラグメントで
ｐＬＦＷ　３のＮ５ｉｌ　（６１８３番）−Ｍｌｕｌフ
ラグメントを置き換えることにより、コートタンパク質
コード領域のすぐ３′側からさまざまな長さの欠損部位
を持った変異つィルス転写ベクターｐＬＤ３Ｎ−Ｘシリ
ーズを作成した。

コノシリーズには、５′　シュードノット構造の５′上
流部分のごく一部のみを欠損したもの（ｐＬＤ３Ｎ−６
１８９）から、シュードノット領域はぼ全体を欠損する
もの（ｐＬ０３Ｎ−６２７５）までが含まれている。

次にｐｔＬ３ＮＣ−ＸをＰｓｔｌで切断して大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ■ラージフラグメント　（宝酒造■製、
Ｃａｔ、Ｎｏ、２１４ＯＡ）により末端を平滑化した後
、旧ｕ■で切断してウィルスｃＤＮＡ３’　末端を含む
フラグメントを得、これでｐＬＦＷ　３の５ｎａＢＩ（
ＮＥＢ　１１３０）（６２３１番）−Ｍｌｕｌフラグメ
ントを置き換えることにより、中央シェードノット構造
から３′　シュードノット構造にかけて欠損を持った変
異ウィルス転写ベクターｐＬＤ３Ｓ−Ｘ　シリーズを作
成した。ｐＬＤ３Ｓ−Ｘにおいては結合部分に５ｎａＢ
Ｉに由来する配列ｒ　ＴＡＣＪを含むべきところ、実際
にはｐＬＤ３Ｓ−６２３９、−６２５３、−６２６３に
おいてはｒＡＣＪ　、−６２’７５においてはｒＴＡＣ
Ｊがそれぞれ失われていた。これはおそらく本実施例で
用いた制限酵素５ｎａＢＩにエクソヌクレアーゼ活性が
混入していたためと考えられる。

さらに３′　シュードノット構造のみに欠損を持った変
異ウィルス転写ベクターｐＬＤ３Ｐ−Ｘシリーズを以下
のようにして構築した。この場合にはＴＭＶｃＤＮＡ上
に適当な制限酵素サイトがないため、まずＮ５ｉＩ　（
６１８３番）と６２４９番の間のフラグメントをほぼｌ
ｌｏｎｇ　［Ｂｔｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　
１，２４３（１９８１）］の方法にしたがって作成した
。ｐＬＦＷ３の５ａｕ３ＡＩ−ＥｃｏＲＩ　（５９３４
−６３５４）フラグメントをＭｌ、３ｍｐ９　（宝酒造
■製、Ｃａ　ｔ、Ｎｏ、３１１８）ファージＤＮＡのＢ
ａｍＨｒの切断部位とＥｃｏＲＩの切断部位との間にク
ローニングした後、このファージからＴＭＶＲＮＡと同
じ配列を含む１本３１　Ｄ　Ｎ　Ａを得た。この１末鎖
Ｄ　Ｎ　ＡにＴＭＶＲＮＡの６２３５番から６２４９番
に相補的な配列を持つ１５ｍｅｒの合成りＮＡをアニー
ルし、これをブライマーとして大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩラージフラグメントによりファーストストランド合
成ヲ行った。次いでＭｌ３　リバースシーフェンシング
ブライマーを利用してセカンドストランドを合成した後
、得られた２本鎖ＤＮＡをＮ５ｉＩで切断して目的とす
る６１８３−６２４９フラグメントを分取した。このフ
ラグメントとｐｔＬ３Ｎｃ−Ｘ／旧ｕＬ　Ｐｓｔｒ（末
端平滑化）フラグメントとを組み合わせて、これらでｐ
ＬＦＷ３のＮ５ｉＩ−旧ｕｌ　フラグメントを置き換え
ることにより、ｐＬＤ３Ｐ−Ｘシリーズを作成した。

以上説明したｐＬ０３Ｎ−Ｘ、　ｐＬＤ３ｓ−Ｘおよび
ｐＬＤ３Ｐ−Ｘシリーズの欠損部位の構造を第３図に示
す。

２）欠損突然変異ウィルスの感染性 前項のようにして作成した欠損変異ウィルス転写ベクタ
ーをウィルスｃＤＮＡ３’　末端にある旧ｕｌサイトで
切断し、これを鋳型として大腸菌ＲＮＡポリメラーゼに
よるインビトロ転写反応を行った。

反応はｍ’ＧｐｐｐＧ　（ＲＮＡ　ｃａｐ　ａｎａｌｏ
ｇｕｅ＋ファルマシア２７−４６３５−０１）存在下、
公知の方法［Ａｈｌｑｕｉｓｔ　ｅｔａｌ、　、　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１．７
０６６（１９８４）］により行った。反応に用いたＲＮ
ＡポリメラーゼはＢｕｒｇｅｓｓ　ａｎｔｉ　Ｊｅｎｄ
ｒｉｓａｋ　　［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４＋４
６３４（１９７５）］の方法によって大腸菌Ａ１９株よ
り精製した。本反応に用いるＲＮＡポリメラーゼとして
は、ＮＥＩＩ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ社より
市販されているＲＮＡ　ＰｏＩｙｍｅｒａｓｅ　（Ｈｏ
ｌｏｅｎｚｙｍｅ、Ｅ、ｃｏｌｉ）１１２０８も使用で
きる。

得られた転写ＲＮＡを、精製したＴＭＶ−０Ｍ株のコー
トタンパク質（４■／ｍ）とｏ、ｉＭのリン酸緩衝液中
で２０°Ｃ１１６時間インキュベートすることにより、
ウィルス粒子の再構成を行った。再構成した粒子は裸の
ＲＮＡに比べてその感染性が１（１０倍以上に高められ
ていた。

再構成した欠損変異ウィルスＲＮＡ　（以下簡便の為欠
損変異ウィルスという）をカーボンランダムと共に擦り
つけることによりタバコの葉に接種した。まず局部病斑
（ｌｏｃａｌ　Ｉｅｓｉｏｎ）形成タバコ（品種Ｘａｎ
ｔｈｉ　ｎｃ）に接種して、局部病斑形成の有無により
欠損変異ウィルスの増殖能を調べ、次いで全身感染タバ
コ　（品種Ｓａｍｓｕｎ）に接種して欠損変異ウィルス
が全身に広がって病気を引き起こすかどうかを調べた。

局部病斑形成タバコへの接種に際しては、ウィルス濃度
を転写ベクターＤＮＡに換算して４　ｎ’ｇ／μＰに調
整し、単葉あたりその２０−３０μ２を接種した。全身
感染タバコへの接種に際しては、ウィルス液２０−６０
μ！を接種した。

そのウィルス液は、５０−１（１０個の局部病斑を形成
するようにウィルス量が調整されたものである。

ｐＬＤ３Ｎ−Ｘシリーズに由来する欠損変異ウィルス（
以下Ｎ−Ｘと表す）では、Ｎ−６２５３およびそれより
欠損部分の小さい欠損変異ウィルスは局部病斑を作った
が、Ｎ−６２６３およびＮ−６２７５は局部病斑を作ら
ず、これら２つの欠損変異ウィルスが増殖能を失ってい
ることを示した。一方全身感染タバコにおいては、Ｎ−
６２０９ウイルスおよびそれより欠損部分の小さいウィ
ルスはタバコの全身に典型的なモザイク症状を引き起こ
したが、Ｎ−６２３３，Ｎ−６２３９，Ｎ−６２４６お
よびＮ−６２５３はモザイク症状を引き起こさなかった
。これら４種の欠損変異ウィルスを接種した全身感染タ
バコについて、接種２週間後に接種葉よりも上部の葉へ
のウィルスの移行を調べた。

その結果、Ｎ−６２５３は上葉からは検出されなかった
が接種葉から該ウィルスが検出され、Ｎ−６２５３か弱
毒株になっていることがわかった。一方、Ｎ−６２３３
、Ｎ−６２３９、Ｎ−６２４６は上葉でも野生型ウィル
スの１１５から１７１０程度の濃度でウィルスが検出さ
れた。これは、少なくともＮ−６２３３、Ｎ−６２３９
、Ｎ−６２４６は全身に広がるが病気を引き起こさない
、すなわち全身感染能を有する弱毒株になっていること
を示している。なお、ウィルス検出は局部病斑検定およ
びゲル電気泳動によるコートタンパク質の検出により行
った。

以上をまとめると、Ｎ−Ｘシリーズの欠損変異ウィルス
では、Ｎ−６２３３からＮ−６２５３までか弱毒株にな
っており、これらよりも欠損部分が小さいものは野性株
とほとんど変わらず、これらよりも欠損部分が大きいも
のは増殖能を失っていた。

ｐＬＤ３Ｓ−Ｘシリーズに由来する欠損変異ウィルス（
以下Ｓ−Ｘと表す）では、Ｓ−６２３９、Ｓ−６２４６
およびＳ−６２５３は局部病斑を作ったが、Ｓ−６２６
３およびＳ−６２７５は局部病斑を作らず、これら２つ
の欠損変異ウィルスが増殖できなくなっていることを示
した。

全身感染タバコにおいては、Ｓ−６２３９、Ｓ−２６４
６およびＳ−６２５３はすべてモザイク症状を引き起こ
さなかったが、Ｓ−６２４６とＳ−６２５３では上葉か
らウィルスが検出され、これら２つの欠損変異ウィルス
が全身感染能を有する弱毒株になっていることがわかっ
た。また、Ｓ−６２３９については、上葉からはウィル
スが検出されなかったが、接種葉からはウィルスが検出
されたことから、Ｓ−６２３９も弱毒株になっているこ
とがわかった。

ｐＬ０３Ｐ−Ｘシリーズに由来する欠損変異ウィルス（
以下Ｐ−Ｘと表す）では、Ｐ−６２５３のみが局部病斑
を作り、Ｐ−６２６３とＰ−６２７５は増殖能を失って
いた。

Ｐ−６２５３は全身感染タバコではモザイク症状を起こ
さなかったが、上葉からウィルスが検出され、全身感染
能を有する弱毒株になっていることがわかった。

以上説明した欠損変異ウィルスの感染性試験の結果を第
３図の右側に示した。Ｌ、Ｓはそれぞれ局部病斑タバコ
、全身感染タバコへの接種試験の結果であり、病斑形成
または病徴の有無を示す。

以上の結果をまとめると、本実施例において作成された
欠損変異ウィルスの中で弱毒株であったのは、Ｎ−６２
３３、Ｎ−６２３９、Ｎ−６２４６、Ｎ−６２５３、Ｓ
−６２３９、Ｓ−６２４６、Ｓ−６２５３およびＰ−６
２５３であった。特に、これらのうち、Ｎ−６２５３お
よびＮ−６２３９を除いたものについては、全身感染能
を有する弱毒株であることが確認された。シュードノッ
ト領域のうち、３′シユードノツト構造を大きく欠損し
たウィルスには増殖能がなく、逆に５′　シェードノッ
ト構造の一部およびその５′上流部分を欠損しただけで
は、顕著な弱毒性は示さなかった。

３）欠損変異ウィルス弱毒株の干渉効果前項で説明した
欠損変異ウィルス弱毒株のうちＮ−６２３９とＮ−６２
４６についてその干渉効果を調べた。

試験には、再構成した欠損変異ウィルスＲＮＡ（インビ
トロ転写反応産物）を接種した全身感染タバコの上葉か
ら回収、精製したウィルス粒子を用いた。

全身感染タバコ　（品種Ｓａｍｓｕｎ）の幼苗（本葉４
−６枚）に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にｇ
：ＩＡしたＮ−６２３９またはＮ−６２４６（５μｇ／
−）を接種した。

対照実験としては緩衝液のみを接種した。２５°Ｃに１
５日おいた後、新しく展開してきた上部の葉に強毒株Ｔ
ＭＶ−Ｌ　（１μｇ／ｒｎｌ）を接種し、２５°Ｃにお
いて観察した。

強毒株接種１カ月後には、弱毒株を接種していないタバ
コはすべてモザイク症状を示したが、Ｎ−６２３９を接
種したタバコでは４氷中１本、Ｎ−６２４６を接種した
タバコでは４氷中３本が磨機を示さなかった。その後、
強毒株接種７週間後まで観察を続けたが、変化はなかっ
た。７週間目に各植物の最上部の葉を採取し、局部病斑
検定によってウィルスの有無を調べたところ、磨機を示
していない植物にも、磨機を示している植物あるいは強
毒株のみを接種した植物のｌ／１０から１１５０のウィ
ルスが検出された。この結果は磨機を示していない植物
でも弱毒株が増殖していることを強く示唆し、これらの
植物は弱毒株の干渉作用によって病気から保゛護されて
いると考えられる。またこの結果はＮ−６２３９および
Ｎ−６２４６の弱毒性をさらにはっきりと示すものであ
る。

〔発明の効果〕

本発明により植物ウィルス病防除に有効なウィルス弱毒
株を、従来の方法に比べてはるかに効率よく計画的に短
時間で人為的に作出することが可能になった。また従来
の方法により作出された弱毒株がほとんどの場合におい
て塩基置換突然変異株であるのに対し［例えばＴＭＶ−
Ｌの弱毒株Ｌ１１Ａ　；　ＮｉｓｈｉＮ１５ｈｉ　ｅｔ
　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１３．５５８５（１９８５）　］　、本発明により作出
されるウィルス弱毒株には欠損突然変異のようなより安
定な変異を導入でき、従来弱毒性の使用に当たってしは
しば問題となった強毒株への復帰の欠点を解決すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図の囚はシュードノット領域における相互作用のモ
デルを、■は各種のトバモウィルスのＲＮＡの配列を示
したものである。第２図はシュードノットＳＮ域に欠損
突然変異部位を導入するために用いるｐ　ｔＬ３ＮＣプ
ラスミドシリーズの調製法を示し、第３図は、ｐＬＤ３
Ｎ−Ｘ、　ｐＬＤ３ｓ−ＸおよびｐＬＤ３Ｐ−Ｘシリー
ズの欠損部位の構造を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ゲノムＲＮＡ上の非コード領域に突然変異部位を
   持つことからなる植物ＲＮＡウィルスの弱毒株。
2. （２）非コード領域が、ゲノムＲＮＡの３′末端部に位
   置する非コード領域である請求項１記載の弱毒株。
3. （３）ゲノムＲＮＡの３′末端部にある非コード領域が
   ゲノムＲＮＡの３′末端部のトランスファーＲＮＡ様構
   造部分とコートタンパク質のコード領域との間にある非
   コード領域である請求項２記載の弱毒株。
4. （４）ウィルスがトバモウィルスに属するウィルスであ
   る請求項１乃至３のいずれかの項記載の弱毒株。
5. （５）突然変異が欠損突然変異である請求項１乃至４の
   いずれかの項記載の弱毒株。
6. （６）ゲノムＲＮＡ上の非コード領域に突然変異部位を
   導入することよりなる植物ＲＮＡウィルスの弱毒株作成
   法。
7. （７）非コード領域がゲノムＲＮＡの３′末端部にある
   非コード領域である請求項６記載の弱毒株作成法。
8. （８）ゲノムＲＮＡの３′末端部にある非コード領域が
   ゲノムＲＮＡの３′末端のトランスファーＲＮＡ様構造
   部分とコートタンパク質のコード領域との間にある非コ
   ード領域である弱毒株作成法。
9. （９）ウィルスがトバモウィルスに属するウィルスであ
   る請求項６乃至８のいずれかの項記載の弱毒株作成法。
10. （１０）突然変異が欠損突然変異である請求項６乃至９
    のいずれかの項記載の弱毒株作成法。