JPH03280883A - Ｒｎａ型ウイルス由来の配列を包含する組換えｄｎａおよびそれを用いる遺伝子操作方法 - Google Patents

Ｒｎａ型ウイルス由来の配列を包含する組換えｄｎａおよびそれを用いる遺伝子操作方法

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JPH03280883A
JPH03280883A JP2266173A JP26617390A JPH03280883A JP H03280883 A JPH03280883 A JP H03280883A JP 2266173 A JP2266173 A JP 2266173A JP 26617390 A JP26617390 A JP 26617390A JP H03280883 A JPH03280883 A JP H03280883A
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Walter Fiers
ヴァルター　フィアス
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野〕 本邦１９１は、組換えＤＮＡ技術による遺伝子工学に関
する。更に詳細には、本発明は、酵母類、真菌類および
特に植物のような真核生物の遺伝子工学に関する。
（以下余白） ［発明が解決しようとする問題点Ｊ 本発明は、特に、１種又は複数種のＲＮＡ型ウィルスに
対する宿主生物の抵抗性を付与する遺伝子−操作方法に
関し、更に、宿主生物をして異種タンパク質類／ペプチ
ド類又はＲＮＡ類の誘導的又は組織特異的製造を可能な
らしめる遺伝子操作方法に関するものである。
［問題を解決するための手段および作用）そのような遺
伝子操作方法のために、ＲＮＡ型ウィルス１１１来の１
つ又は複数の配列を包含する組換えｌ）ＮΔ、更に詳細
には、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ〔即ち、Ｒ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（これはレプリカーゼと
も呼ばれる）Ｊに依イｌして複製されるＲ　Ｎ　Ａウィ
ルス由来の少なくとも１つのヌクレオチド配列を包含す
る組換え１）Ｎ八が用いられる。これ等のＲＮＡウィル
スは、二重＃ｌＩ　ＲＮＡ型ウィルス（即ち、二重鎖Ｒ
ＮＡより成るウィルスのゲノム）のグループ、または陽
ｆ１ス！・ランド（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａ面）Ｒ
ＮＡ型ウィルス（即ち、パセンス″又はメツセンジャー
重鎮ＲＮＡより成るウィルスのゲノム）のグループ、或
いは陰性ストランド（ｎｅｇａｔｖｅ−ｓｔｒａｎｄ）
　ＲＮ　Ａ型ウィルス（即ち、“アンチセンス”−重鎖
ＲＮＡより成るウィルスのゲノム）のグループに属する
。
しかしながら、すべてのＲＮＡ型ウィルスがその複製の
ためにウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して
いるものではない。このことは、特に、ゲノムのＲＮ　
Ａが逆転写酵素によってＯＮＡへ転写された後にＤＮＡ
の複製に依存して増殖されるレトロウィルス科（Ｒｅｔ
ｒｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウィルス類に於いてはそ
うである。
ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して増殖さ
れるＲ　Ｎ　Ａウィルスの例としては、レオウィルス科
（ｌｌｅｏｖｉｒｉｄａｅ）及びビルナーウィルス科（
Ｂｉｒｎａｖｊｒｉｄａｅ）の二重鎖ウィルス；アレナ
ウィルス科（＾ｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ブニャウィ
ルス科（Ｉｌｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミキソ
ウィルス科（Ｏｒｔｌ＋ｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）　
、バラミキソウィルス科（１’Ｒｒａｍｙｘｏｖｉｒｉ
ｄａｅ）およびラブドウィルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒ
ｉｄａｅ）の陰性ストランドウィルス；ならびにｉ−ガ
ウィルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウィル
ス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｃ）、コロナウィルス科
（Ｇｎｒｏｎａｖｉｒｉ市＋ｅ）、ノダウィルス科（Ｎ
ｏｄａｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウィルス科（ｒ”１
ｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）及びカルシビウィルス科（
Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａａ）の陽性ストランドウィルス
を挙げることができる。植物を宿主とする陽性ストラン
ドウィルスの具体的な例としては、タバコモザイク　ウ
ィルス（Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｍｏ５ａｉｃｖｉｒ＋＋Ｓ）
、タバコ壊死ウィルス（Ｔｏｂ８ｃｃｏ　Ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓＶｉｒｕｓ）、ブロムモザイク　ウィルス（Ｉ（ｒ
ｏ＋ｉｅＭｏｓａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ）、キュウリモザイ
ク　ウイル−ス（Ｃｕｃｕｍｂ＋＋ｒ　Ｍｏ５ａｉｃ　
Ｖｉｒｕｓ）、タバコストリークウィルス（１°ｏｂａ
ｃｃｏ　５ｔｒｅａｋ　Ｖｉｒｕｓ）、タバコ茎壊痘つ
ィルス（Ｔｏｂａｃ：ｃｏ　ＲａＬＬＩｅ　Ｖｉｒｕｓ
）、ササゲモザイク　ウィルス（Ｃｏｗｐｅａ　Ｍｏ５
ａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ）、トマト黒色輪点ウィルス（Ｔｏ
ｍａｔｏ　ｌｌｌａｃｋｌｉｉｎｇ　Ｖｉｒｕｓ）、ジ
ャガイモＹウィルス（ｒ’ｏＬａＬｏ　Ｙ　Ｖｉｒｕｓ
）、カブ黄斑モザイク　ウィルス（１’ｕｒｒｉｐ　Ｙ
ｅｌｌｏｗ　Ｍｏ５ａｉｃｖｌ自＋Ｓ）、トマト　プツ
シ−スタンド　ウィルス（’ｔｏｍａｔｏ口ｕｓｌ＋ｙ
　５ｔｕｎｔ　Ｖｉｒｕｓ）、南部インゲンモザイク　
ウィルス（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｅａｎ　Ｍｏ５ａｉｃ
　Ｖｉｒｕｓ）、オオムギ黄色萎縮ウィルス（Ｂａｒｌ
ｅｙ　ＹｅｌｌｏｗＤｗａｒｆ　Ｖｉｒｕｓ）、ジャガ
イモＸウィルス（１’ｏｔａＬ。
Ｖｉｒｕｓ　Ｘ）、テンサイ黄色ウィルス（Ｓｕｇａｒ
　ＩｌｅｅＬＹｅｌｌｏｗ　Ｖｉｒｕｓ）、カーネーシ
ョン潜在ウィルス（Ｃａｒ＋＋＋ｔｔｉｏｎ　Ｌａｖａ
旧Ｖｉｒｕｓ）、カーネーション軸点ウィルス（Ｃａｒ
ｎａｔｉｎ　ＲｉｎｇＳｐｏＬ　Ｖｉｒｕｓ）、ムギ斑
葉モザイク　ウィルス（Ｂａｒｌｅｙ　５ｔｒｉｐｅ　
Ｍｏ５ａｉｃＶｉｒｕｓ）、アルファルファモザイク　
ウィルス（＾Ｉｒ１１１「ａ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉｒｕ
ｓ）、エントウひだ葉干ザイクウィルス（Ｐｅａ　［Ｅ
ｎａＬｉｏｎ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ）及びトマト
　スボッテドウイルト　ウィルス（ＴｏｍａＬ。
５ｐｏＬＬ＋＋ｄ　Ｗｉｌｔ　Ｖｉｒｕｓ）が挙げられ
る。
複製がウィルス性ＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依イｒ
しているＲＮＡ型ウィルスに限定されるという−１−記
の制限により、本発明に使用している”　ＲＮ　Ａ型つ
ィルス′°なる用語は、ウィルス、および複製が池の（
ヘルパー）ウィルスの助けに依存しているウイルソイド
（Ｖｉｒｕｓｏｉｄｓ）を包含するものである。よく知
られているように、ＲＮＡ型ウィルスの感染は、例えば
自身のコー］・　タンパク質を有するサテライト　ウィ
ルス、混合粒子の中に充填されているサテライトＲＮＡ
、およびウイルソイド（混合粒子の中に充填されている
ところの小円形ＲＮＡゲノム）によるコインフェクショ
ン（ｃｏｉｎ「ｅｃｔｉｏ口）を伴うことがある。本発
明で用いられる゛’ＲＮＡ型ウィルス”なる用語は、ま
た。
ウィロイド（ｖｉｒｏｉｄｓ）、即ち、自律的小型線Ｒ
ＮＡ分子をも含むものである。後述する実験の部分にお
ける本発明の詳細な説明は、ＲＮＡサテライト　ウィル
ス、なかでも、サテライト　タバコ壊死ウィルス［５ａ
Ｌｅｌｌｉｔｅ　丁ｏｂａｃｃｏ　Ｎｅｃｏｒｏｓｉｓ
　Ｖｉｒｕｓ（ＳＴＮＶ月、即ち、複製が完全にヘルパ
ータバコ壊死ウィルス［Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓ　Ｖｉｒｕｓ（ＴＮＶ）］に依存している小型植物
ウィルス（１，８５Ｘ　ＩＯ”ＫＤ）　、を例に用いて
行なう。
サテライト　タバコ壊死ウィルス（ＳＴＮＶ）のＲＮＡ
ゲノムは、ｌ　、　２３９　＆Ｊのヌクレオチド配列を
含み、１！３５個のアミノ酸よりなるコート　タンパク
質をコードしている。
本発明は、遺伝Ｔ工学によって遺伝情報を真核生物のゲ
ノムに導入するに際して、該遺伝情報として、そのまま
又はそれに由来する転写生成物によっても、宿主に対し
て負担とならないものであり、しかも該宿主をウィルス
感染から極めて効果的に保護し、あるいはまた、異種タ
ンパク質（またはペプチド）またはＲＮＡを、誘導的ま
たは組織特異的にしかも極めて効率的に生産することを
可能にするようなものを用いることを特徴とするもので
ある０本発明により導入される遺伝情報は、１２〜２５
０塩基対の長さを有する２つの逆方向反復ヌクレオチド
配列を含むところの、宿主を形質転換するための発現カ
セットを包含し、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列
の間に、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存し
て複製されるＲＮＡ型ウィルス由来のヌクレオチド配列
を少なくとも１つ有し、該１１　Ｎ　Ａ型ウィルス由来
の配列は複製のための少なくとも１つのシス因子を有す
るがウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコードする
遺伝子およびウィルスコート　タンパク質をコードする
遺伝子は含まないことを特徴とする。
ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して？ＬＫ
されるｌ＜　Ｎ　Ａ型ウィルスのゲノムとしては、種々
のシス因子（ｅｉｓ　ｅｌｅｍｅｎｔ）、即ち該ウィル
スをコードする核酸のためにのみ機能する因子、例えば
該核酸の構造因子部分、を包含する。複製のためのシス
因子（どの場合にもＲＮ　Ａ　／　ＲＮ　Ａポリメラー
ゼのための結合部位を含む）に加えて、ＲＮ　Ａ　Ｊ（
”７ウィルスのゲノムのほとんどは、輸送のためのシス
因子−（輸送タンパク質の結合部位）、ファージエンベ
ロープ中に核酸を充填してウィルス粒子・を生成するた
めのシス因子、およびメツセンジャーＲＮ　Ａを翻訳し
てタンパク質、殊にコト　タンパク１１、とするための
シス因子・を含んでいる。ＲＮ　Ａ型ウィルスのゲノム
のトランス囚／（ｃｒａｂｓ　ｅｌｅｍｅｎｔＳ）の例
は、コート　タンパク質、輸送タンパク質およびＲＮ　
Ａ　／　ＲＮ　Ａポリメラーゼをコードする遺伝子類で
ある。
本発明の基本的な特徴は、宿主のゲノムに組込まれた発
現カセットが、パンハンドル構造（ｐａｎ−ｌｕｕ＋ｄ
ｌＯｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のメツセンジャーＲＮＡを形
成するようにＲＮＡ型ウィルス由来の配列の転写をもた
らすことである。この転写を調節するところの発現カセ
ットの因子類、例えば、特に転写プロモーター、につい
ては厳格な制限はない。プロモーターは、比較的弱いプ
ロモーターでよく、また多くの場合、それが好ましい。
それにより、この転写および転写によって生成する産生
物は宿主に対して実質的に負担を与えない。適当なプロ
モーターは、多くの生物についてよく知られている。
当然のことながら、この発現カセットは適当なポリアデ
ニル化部位を含むことが必要であり、また−力、発現カ
セットはその両端において、所望宿主のゲノムへの組込
みを可能にするためのいわゆる組込み部位（ｉｎｔｅｇ
ｒａｔｉｏｎ　５ｉｔｅｓ）に隣接している。
種々の実験により、ゲノムに組込まれた遺伝情報の宿主
中での発現を成功させるためには、１２〜２５０塩基対
の長さを有する２つの逆方向反復ヌクレオチド配列であ
って、この２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間にＤ
ＮＡをはさんでいるところの該２つの逆方向反復ヌクレ
オチド配列の存在が不可欠であることが明らかになった
。これらの逆方向反復ヌクレオチド配列は、例えば、ｄ
Ｇ　−ｄＣ塩基対またはｄ　Ｃ−ｄ　Ｇ塩基対よりなる
ことができる。
この逆方向反復ヌクレオチド配列の存在により宿主の感
染細胞中で複製と発現の両方が起きるのは、安定化パン
ハンドル構造（ｓＬａｂｉｌｉｚｉｎｇ　ｐａｎｂａｎ
ｄｌｅｓｔｒｕｃｔｕｒａ）（Ｖａｎ　　ＩＥ＋ｕ＋ｅ
ｌｏ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　１
５ヱ。
＋１１８７４８０−４８７参照）を有するＲ　Ｎ　Ａ分
子が生成するのが理由である。この目的のためには、逆
方向反復ヌクレオチド配列の長さが少なくとも１２塩基
対であることが必要である。しかし、好ましくは、その
配列の長さは少なくとも！５塩基対である。２５０塩基
対を越える長さは極めて非実際的である。
１１ｆましくは、５０塩基対を超えない長さである。
本発明のもう１つの特徴は、ＲＮＡ／ＲＮＡポリメラー
ゼ（即ち、レプリカーゼ）あるいはそれをコードする遺
伝子が存在しないことであり、それによって、転写によ
り宿主細胞に存在するＲＮＡ型ウィルスに特異的なメツ
センジャーＲＮＡの量が更に増加しない。組込まれるＲ
ＮＡ型ウィルス由来の配列が５ＴＮＶのようなサテライ
ト　ウィルスに１１１来する場合には、上記の要件は自
動的に満足される。その理由は、５ＴＮＶゲノムはＲＮ
　Ａ　／　ＲＮＡポリメラーゼを含まないからであり、
この事実は、サテライト　ウィルスがその複製について
はヘルパーウィルス（これが、必要なｆｌＮΔ／ＲＮＡ
ＲＮＡラーゼを与える）に依存していることを如実に示
している。
本ｉ　１ｊ３において更に重要なことは、ウィルスコー
ト　タンパク質が生成されないこととＲＮＡ型ウィルス
由来のヌクレオチド配列がウィルスコート　タンパク質
をコードする遺伝子を含有しないことである。
本発明において更に重要なことは、ＲＮＡ型ウィルス由
来のメツセンジャーＲＮＡがＲＮＡ／ＲＮＡポリメラー
ゼの存在下で複製を可能にする因子を少なくとも含有し
ていることである。換言すれば、複製のためのシス因子
が少なくとも存在していることが必要である。本発明の
目的に従い、ウィルスゲノムの他の因子類も存在してい
ることが望ましい。それ故、特に、ウィルス感染から宿
主を保護する場合には、宿主のゲノムに組込まれた遺伝
情報が輸送のためのシス因子も含有しているのがりｆま
しい。
一方、本発明によれば、ＲＮＡＲＮＡ型ウィルス由来が
センス配向でゲノムが組込まれる必要はない。このこと
は、２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間に位ｊ６す
るところの例えばリボチームをコードする配列のような
他の配列の配向についても同じである。本発明によりセ
ンス配向およびアンチセンス配向の両者が選択できると
いう事実により、正常な非感染下での最高の保護と、感
染された場合の適９」な反応の両者を果たすことが可能
である。
従って、本発明の主たる態様によれば、１２〜２５０塩
基対の長さを有する２つの逆方向反復ヌクレオチド配列
を包含する組換えＤＮＡにして、該２つの逆方向反復ヌ
クレオチド配列の間に、ウイシスＲＮ　Ａ　／　ｆｌ　
Ｎ　Ａポリメラーゼに依存して複製されるＲ　Ｎ　Ａ型
ウィルス由来のヌクレオチド配列を少なくとも１つ有し
、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列は少なくとも複製のた
めのシス因子を有するがウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメ
ラーゼをコードする遺伝子およびウィルスコート　タン
パク質をコードする遺伝子は含まないことを特徴とする
組換えＤＮＡが提供される。
本発明の組換えＤＮＡを用いる際には、該組換えＩ）　
Ｎ　Ａは、宿主細胞を形質転換して宿主内での転写を可
能にするための発現カセットに組込まれ、転写の際にパ
ンハンドル構造を有するＲ　Ｎ　Ａ分子を形成すること
が必要である。
本発明の組換えＤＮＡにおいては、上記のＲＮＡ型ウィ
ルス由来の配列が、複製のためのシス因子および輸送の
ためのシス因子を包含することが好ましい。
更に、本発明は、上記ＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、
コート　タンパク質に充填するためのシス因子を包含す
る組換えＤＮＡ、および」二記該ＲＮＡ型ウィルス由来
の配列が、翻訳のためシス因子・を包含する組換えＩ）
　Ｎ　Ａも含む。しかし、これらの因子の機能の必要の
ない用途においては、これらの因Ｔ・は転写により生成
するＲＮＡの複製効率に悪影響を与えるので、これらの
因子は存在しないのが☆ｆましい、このことは、ウィル
スからの保護の用途の場合には、殊にそうである。これ
が、ウィルスコート　タンパク質をコードする遺伝子を
含んでいてはならない理由の１つである。同様に、ウィ
ルス輸送タンパク質をコードする遺伝子のような他の不
必要なトランス因子（Ｌｒａｎｓａｌｅｍｃ＋＋Ｌ）は
存在しないのが好ましい。
従って、本発明の最も好ましい実施態様においては、」
；記の組換えＤＮＡ中に存在するｒｔＮＡ型ウィルス由
来の配列は、（ヘルパーウィルスによる感染のような）
外からの助けがなければ増幅も宿主中の他の細胞への移
動もできず且つ他のウィルスタンパク質をコードしてい
ない裸のウィルス　レプリコン（ｓＬｒｉｐｐｏｄ　ｖ
ｉｒａｌ　ｒｅｐｌｉｃｏｎ）に対応する。しかし、こ
のような実質的に裸のウィルスレプリコンは、ＲＮＡ／
ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、完全なウィルスゲノム
よりも非常に品い効率で複製を行なう。このことが、不
発リノの組換えＩＪＮΔが宿主をウィルス感染から保護
するのに有用な理由である。かくして、遺伝子的に変性
された宿主のＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを有するＩｔ
　Ｎ　Ａ型ウィルスによる感染が起きる時、既に宿主細
胞に存在するところのＲＮＡ型ウィつスシス由来Ｎ　Ａ
分子の数は非常に急速に増加し、従って、感染ウィルス
の増殖を犠牲にしてＲＮ　Ａ　／　ＲＮＡポリメラーゼ
をどんどん取ってい＜　（ａｐｐｒ。
ｐｒｉＲＬｏシていく）、それ故、実質的に裸のレプリ
コンは、用い得るＲ　Ｎ　Ａ　／　ＲＮ　Ａポリメラー
ゼを取得するための戦いにおいて完全なウィルスゲノム
よりも有利であり、このことは重要なことである。この
有利性は、宿主のゲノムに組込まれたＲＮＡ型ウィルス
由来の配列が輸送のためのシス因子も含んでいるときに
更に増大する。その理由は、宿主の池の細胞への感染の
増大に寄与するところの感染ウィルスの輸送タンパク質
が１組込まれたＩ）Ｎ八に由来するところのＲＮＡ型ウ
ィルス由来１＜　Ｎ　Ａ分子の急激な増加によって取ら
れる（：ＨＨ＋ｒｔＨｒｒｉａｔｅされる）からである
。
宿主をウィルス感染から保護するための用途に関する本
発明のＩｌｆましい実施態様においては、上記の２つの
逆方向反復ヌクレオチド配列の間に、＋＜　Ｎ　Ａ　１
１：ｒウィルス由来の配列に加え、ウィルスＲＮＡまた
はｍ　ＲＮ八を切断することのできるリボチームをコー
ドするヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する組換え
Ｉ）　Ｎ　Ａが用いられる。
問題のＩ？　Ｎ　Ａ　／　ＲＮ　Ａポリメラーゼを供給
するウィルス「以後“両立性ウィルス”　（ｃｏｍｐａ
Ｌｉｂｌθνぽ口Ｓ）と称す〕によるウィルス感染の場
合に、攻撃下の宿主細胞に存在するＲＮＡ型ウィルス由
来のＲＮＡが急速に増幅されるときには、この好ましい
実＆態様においては、感染ウィルスに対して特異性を有
するリボチーム（ｒｉｂｏｚｙ＊ｅ）の量も同時に増大
する。このリボチームが、感染ウィルスのＲＮ　Ａの破
壊を起こす。
リボチームの構造および作用の更なる情報にっいては、
Ｎａｔｕｒｅ　３３４．＋９７頁、１９８８を参照する
ことができる。
実質的に裸のレプリコンの情報および特性については５
次の文献を参照することができる：ｒ’ａｒｒａｕｌｔ
、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、　ａｎｄＩｍｍｕｏｏｌ、９３．　１９８１
．１５２−２０９；　　Ｌａｚｚａｒｉｎｉ　　ｅｔ　
ａｌ、。
（：ａｌｌ　２（ｉ、　＋０８１．　ｔ４５−１５４；
　Ｎ５ｙａｋ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。
Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　　３４．　１９８０．　６Ｈ）
−６４４；　　Ｂａｒｒｅｔｔ　　ａｎｄＤｉｍｓｏｃ
ｋ、　　Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ａｎｄＩｍｍｕｏｏｌ、　１２
８．１９８６．５５−８４；　　“ＲＮＡ　ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ　。
＋９８９．　　Ｅ、　　Ｄｏｍｉｎｇｏ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、、　　Ｅｄｓ、、　　ＣＲＣＰｒｅｓｓ。
Ｒｏｅａ　ｌ１ｕ１．ｏｎ、　Ｆｌｏｒｉ市１；および
５ｔｒａｕｓｓ　ａｎｄＳＬｒｎｕｓｓ、Ｃｕｒｒｏｎ
ｔ　’ｒｏｐｉｃｓ　　ｉ＋＋　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
ａｎｄ１ｍｍ＋ｕｕｎ１．１０５．１ｒＪ８３．　ｌ−
８９，それらの文献においては、」−記の裸レプリコン
は、′欠陥干渉ウィルス／粒子／ＲＮＡ”と呼ばれてい
る。ＲＮ　Ａの高度な欠陥性を持つ欠陥レプリコンは、
例えば、適当な宿主を裸ウィルスＲＮ　Ａで感染し、複
製されたウィルスＲＮ　Ａを単離し、そしてそれを使っ
て次の感染をさせることにより得ることができる。
かくして、コー］・　タンパク質に対する必要性は人工
的に取り除かれ、その結果、コート　タンパク質遺伝子
をもはや含有しない欠失変異株が生成する。この操作を
、毎回このコート　タンパク質欠失変異株のＲＮ　Ａの
少量を加えて、更に繰り返すことにより、ＲＮＡ／　Ｒ
Ｎ　Ａポリメラーゼ遺伝子をもはや含まないＲＮＡも得
ることができる（加えられたＲＮＡは必要なＲＮＡ／　
ＲＮ　Ａポリメラーゼを提供するので、ＲＮ　Ａ　／　
ＲＮ　Ａポリメラーゼの欠失した変異株も複製される）
。しかし、別の調製方法も可能である。その方法として
は、Ｊ１常に高い投与量のウィルス粒子（細胞当り１０
０ケ以−１−）で細胞または組織を感染させ、ＲＮＡ欠
失変異株を単離する方法；サテライト　ウィルスまたは
ウイルソイド（ｖｉｒｕｓｏｉｄｓ）を含むウィルス株
で細胞または組織を感染させ、モしてＲＮＡ欠失変異株
を単離する方法；２分かれ（ムｉｌ＋ａｒｔｉｔｅ）ま
たは３分かれ（ｔｒｉｐａｒｔｉｖｅ）　［もっと一般
的にはポリ分かれ（ｐｏｌｙｐａｒｔｉｔｅ）］のゲノ
ムを有するＲＮＡ型ウィルスからサブゲノムを単離する
方法；適当なＩｔ　Ｎ　Ａ　／　ＲＮ　Ａポリメラーゼ
を生産する細１歳または組織をウィルスＲＮＡ　（時と
しては、既に部分的に欠失したもの）で感染させ、そし
て更に欠失したＲＮＡを単離する方法；または、ウィル
スＲＮＡ、サテライトＲＮＡまたはウイルソイドＲＮＡ
のｃＤＮＡの中で標的遺伝子増幅を行なう方法などを挙
げることができる。
（以下余白） 木Ｑ　Ｉｆｊは、真核宿主生物をウィルス感染から保護
するための従来提案されている種々の方法に比較して優
れている。従来の方法としては、ウィルスメツセンジャ
ーＲＮＡをブロックするためにアンチセンスウィルスＲ
ＮＡを生ｌ戊させる方法（例えば、ＣＩＪＯ７，Ｚ（ｌ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｌｉｏｔｅｃｂｎｏｌｏｇｙ　６
゜！１８８．５４０−５５７参照）、ウィルスコート　
タンパクτＣを７１．成させる方法（例えば、Ｃｌｌ０
７．７．Ｏｒ！Ｌ　８ｔ、。
＋ｕｕｌ　　１ｌｎｔ＋に＋ｉｍａ　　（！１．　　Ｆ
ｌｌ、、　■ｉｏＬｅｅｈｎｏｌｏｇｙ　　−／、　　
　１１８！Ｊ。
２７３−２７０の引用文献参照）あるいは、ウィルスザ
テライトＩＮへを生成さセる方法（１ミ１）−＾−０２
’１２０１Ｇ参ＩＫ！　）を挙げることができる。本発
明の方法は、従来のウィルスからの保護方法に比較して
制限が少ない６例えば５本発明は、サテライ］・　ウィ
ルスが知られているウィルスに限定されないし、また、
“センス″ｌ）　Ｎ　Ａまたは“アンチセンス”　ＤＮ
Ａの組込みに限定されない（転写によって生成されるＲ
　Ｎ　Ａ型つィシス由来ＲＮＡは、センスおよびアンチ
センスのいずれの配向でも、感染ウィルスの複製および
恐らく輸送のためのトランス機能を取る（ａｐｐｒｏｐ
ｒｉａｔｅする）０本発明は、また、１種または複数種
のリボチーム配列の組込みの可能性のような、より大き
な効果を達成する可能性を与えるものである。本発明に
よれば、宿主の負担が最小であり、一方、非感染下では
宿主を最大に保護することができ、しかも、両立性ウィ
ルスで感染されると１ａぐに、宿主をウィルスから保護
する極めて急速にして効果的な反応が必要な場所で起き
る。宿主ゲノムの中に組込まれているので、本発明によ
る保護効果は永久的なものであり、更に、宿」；への負
担が少ないので、保護効果が選択的になることは実質的
にない。数種の異なったウィルスから宿主を同時的に保
護することが本発明によれば可能である。その理１１目
よ、宿主に余分の負担をかけないこと、即ち、宿主がそ
の保護によってエネルギーを使うことの必要が殆どない
ことにある（それは、挿入されたＤＮＡの翻訳はエネル
ギーをほんの少ししか必要としないし、−力、好ましい
実施態様にあってはタンパク質への翻訳はないからであ
る）。本発明によれば、逆方向反復配列は数種の異なっ
たＲＮＡ型ウィルスに特異的な配列（即ち、異なったＲ
ＮＡ型ウィルスの欠陥レプリコン）、及び／又は数種の
異なったりボヂーム配列（第１のウィルスに特異的なリ
ボチーム配列、第２のウィルスに特異的なりボチーム配
列など）を含有することができる。これらの異なった＋
２　Ｎ　Ａ型ウィルスに特異的な配列及びこれらの異な
ったリボチーム配列は、それら自身の２つの逆方向反復
配列の間に組込むこともできるのは当然である。従来の
ウィルスからの保護方法においては、異なった数種のウ
ィルスからの同時的保護を行なうことは殆ど不Ｉ′ｉｆ
能である。それは、従来の方法では、効果的な保護のた
めには保護を与えるものが宿主全体に連続的に生産され
続けていることが必要であり、その量は大量となって宿
主に大きな負担となり、宿主に淘汰的欠点を与えたり及
び／又はその成長発展に有害となるからである。
本発明の組換えＩ）　Ｎ　Ａの」二記の特性は、遺伝子
的に変性された原核生物および殊に真核生物を用いて異
種タンパク質／ペプチドの製造方法に有利に利用するこ
とができる。それには、２つの逆方向反復ヌクレオチド
配列の間に、ＲＮＡ型ウィルス由来の配列に加え、１つ
または複数のＲＮＡをコードする非ウィルスヌクレオチ
ド配列を少なくとも１つ有する組換えＤ　Ｎ　Ａ、そし
て特にそのＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、複製のため
のシス因子及び翻訳のためのシス因子を少なくとも包含
し、更に、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間に
、ＲＮ　Ａ型ウィルス由来の配列に加え、つまたは複数
のタンパク質／ペプチドをコードする非ウィルスヌクレ
オチド配列を有する組換え■〕ＮΔが用いられる。
本発明による組換えｌ）　Ｎ　Ａの」−記の緒特性によ
って、宿主は、ＲＮ　Ａ　／　Ｉ≧ＮＡポリメラーゼの
不存在［ではせいぜい無視できる程度の爪しか外来ＲＮ
　Ａまたはタンパク質／ペプチドを生産しないが、ｒ？
　Ｎ　Ａ　／　ｆｌ　Ｎ　Ａポリメラーゼの存在下では
メツセンジャーＲＮＡの急激な増加が起こり、相当量の
所望タンパク質／ペプチドが生産される。更に、この非
常に強い生産はいつも誘導することができるし、またＲ
　Ｎ　Ａ　／　ＲＮ　Ａポリメラーゼの存在を調節する
ことによって宿主の特異的組織に制限することができる
。
Ｍ　桿的生産は、例えば、遺伝子的に変性された宿１三
（あるいは、例えば、培養細胞中の宿主細胞）を両立ｆ
１ウィルスで感染することによりいつでも行なうことが
できる。しかし、通常は、この方法は、労力を必要とし
、感染の際に殆どの場合に宿主を犠牲にしくその結果、
所望タンパク質が分解される）、及び／又はウィルスを
用いるので危険をイｔうといった理由で、あまり好まし
くない。もう１つのりｆましいやり方は１組織特異的な
生産を行なうために選ばれるところの２重形質転換（ｄ
ｏｕｂｌｅ　Ｌｒａｎｓ「ｏｒｍａＬｊｏｎ）を行なう
方法であって、その方法では、本発明の」−記の組換え
Ｉ）　Ｎ　Ａのみならず８導的または組織特異的発現カ
セット中にウィルス１１ＮΔ／　ＲＮ　Ａポリメラーゼ
またはＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ構築体の遺伝情報を
組込んだ組換えＤＮＡを宿主のゲノムに導入される。
この口約のために、公知の銹導（例えば、熱、紫外線照
射、またはサルチル酸のような薬品による銹導）プロモ
ーター或いは、組織特異的【例えば、ジャガ芋の塊茎中
に発現させるためのパテチン（ｐａｔａｔｉｎ）　］プ
ロモーターを用いることができる。
“ＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ構築体の遺伝情報”とは
、もう１つのＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコードして
いてもしていなくてもよい遺伝子構築体を意味する０例
えば、ＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子
中に起きる内部の条件的ストッコドン（ｉｎｔｅｒａｌ
　ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ　５ｔｏｐｃｏｄｏｎ）を、
変異により、ストップコドンとしてはもう紹識できない
配列と入れ換えた遺伝子構築体がある。更に、別の例は
、内部のストップコドンの変異を用いる上記のやり方で
もって、異なったＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を
融合させることによって得られる遺伝子構築体である。
本発明の更に他の実施態様によれば、遺伝子］−学によ
り本発明の組換えＤＮＡおよび、もし所望ならば、更に
、誘導的または組織特異的発現カセット中にウィルスＲ
Ｎ　Ａ　／　ＲＮ　ＡポリメラーゼまたはＲＮ　Ａ　／
　ＲＮＡポリメラーゼ構築体の遺伝情報を組込んだ組換
えＤＮＡを導入した＾核または原核細胞または生物が提
供される。
本発明の更に他の実施態様によれば、ウィルスＲＮ　Ａ
　／　ＲＮ　Ａポリメラーゼに依存して複製されるＲ　
Ｎ　Ａ型ウィルスから、特に植物、酵母および真菌のよ
うな真核生物を遺伝子操作によって保護する方法にして
、該生物のゲノムの中に、活性な発現カセット中に１２
〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向反復ヌクレ
オチド配列を包含する組換えＩ）　Ｎ　Ａを該生物のゲ
ノムに組込む方法であり、該２つの逆方向反復ヌクレオ
チド配列の間に、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ
に依存して複製されるＲＮＡ型ウィルス由来のヌクレオ
チド配列を少なくとも１つ有し、該ＲＮＡ型ウィルス由
来の配列は少なくとも複製のためのシス因子を有するが
ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝
子およびウィルスコート　タンパク質をコードする遺伝
子は含まないことを特徴とする方法が提供される。
この保護方法においては、上記のＲＮＡ型ウィルス由来
の配列が、複製のためのシス因子および輸送のためのシ
ス因子を包含することが好ましい。
また、上記のＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、更に、コ
ート　タンパク質に充填するためのシス因子および翻訳
のためシス因子を包含することができる。
また、この保護方法においては、２つの逆方向反復ヌク
レオチド配列の間に、ＲＮＡ型ウィルス由来の配列に加
え、ウィルスｒ？　Ｎ　Ａまたはｍ　ＲＮＡを切断する
ことのできるリボチームをコードするヌクレオチド配列
を少なくとも１つ有することが好ましい。
本発明の更に他の態様によれば、１種または複数種のタ
ンパク質／ペプチドを誘導的手法で製造する方法にして
。
原核生物または真核生物、あるいは原核生物または真核
生物の細胞を培養することからなり、該生物には、１２
〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向反復ヌクレ
オチド配列を活性発現カセット中に包含する組換えＤＮ
Ａが遺伝子工学によって組込まれており、該２つの逆方
向反復ヌクレオチド配列の間には、ウィルスＲＮＡ／Ｒ
ＮＡポリメラーゼに依存して複製されるＲ　Ｎ　Ａ型ウ
ィルス由来のヌクレオチド配列を少なくとも１つ有し、
該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列は少なくとも複製のため
のシス因子と翻訳のためのシス因子を有するがウィルス
ＲＮＡ／］くＮΔポリメラーゼをコードする遺伝子およ
びウィルスコート　タンパク質をコードする遺伝子は含
まず、更に、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間
には、ＲＮＡ型ウィルス由来の配列に加えて、１種また
は複数種のタンパク質／ペプチドをコードする非ウィル
スヌクレオチド配列をセンス配向またはアンチセンス配
向で有しており；そして 該生物またはその細胞を該ウィルスで感染させることを
包含する方法が提供される。
本発明の更に好ましい態様によれば５１種または複数種
のタンパク質／ペプチドを誘導的または組織特異的手法
で製造する方法にして。
真植生物を培養することよりなり、該真核生物のゲノム
には、１２〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向
反復ヌクレオチド配列を活性発現カセット中に包含する
組換えＤＮＡが遺伝子工学によって組込まれており、該
２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間には、ウィルス
ＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して複製されるＲＮ
Ａ型ウィルス由来のヌクレオチド配列を少なくとも１つ
有し、該ＲＮ　Ａ型ウィルス由来の配列は少なくとも複
製のためのシス因子と翻訳のためのシス因子を有するが
ウィルスＲＮ　Ａ　／　Ｉｔ　Ｎ　Ａポリメラーゼをコ
ードする遺伝子およびウィルスコート　タンパク質をコ
ードする遺伝子は含まず、更に、該２つの逆方向反復ヌ
クレオチド配列の間には、ＲＮＡ型ウィルスに由来する
配列に加えて、１種または複数種のタンパク質／ペプチ
ドをコードする非ウィルスヌクレオチド配列をセンス配
向またはアンチセンス配向で有しており、かつ該真核生
物のゲノムには、更に、誘導的または組織特異的発現カ
セット中にウィルスＲＮ　Ａ　／　Ｉｔ　Ｎ　Ａポリメ
ラーゼまたはＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ構築体の遺伝
情報を組込んだ組換えＤＮＡが組込まれていることを特
徴とする方法が提供される。
本発明の更に別の態様によれば、１種または複数種の、
リボチームのようなＲＮＡ、アンチセンスＲＮ　Ａまた
は二重鎖ＲＮＡを誘導的手法で製造する方法にして、 原核生物または真植生物、あるいは原核生物または真植
生物の細胞を培養することよりなり。
該生物のゲノムには、１２〜２５０塩基対の長さを有す
る２つの逆方向反復ヌクレオチド配列を活性発現カセッ
ト中に包含する組換えＤＮＡが遺伝子工学によって組込
まれており、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間
には、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して
複製されるＲＮＡ型ウィルス由来のヌクレオチド配列を
少なくとも１つ有し、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列は
少なくとも複製のためのシス因子を有するがウィルスＲ
ＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子およびウ
ィルスコート　タンパク質をコードする遺伝子は含まず
、更に、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間には
、ＲＮＡ型ウィルス由来の配列に加えて、１種または複
数種のタンパク質／ペプチドをコードする非ウィルスヌ
クレオチド配列をセンス配向またはアンチセンス配向で
有しており：そして 該生物またはその細胞を該ウィルスで感染さゼることを
包含する方法が提供される。
本発明の更にｆＩｆましい態様によれば、１種または複
数種の、リボチームのようなＲＮＡ、アンチセンスＲＮ
Ａまたは二重鎖ＲＮ　Ａを誘導的または組織特異的手法
で製造する方法にして、真植生物を培養することよりな
り、該真植生物のゲノムには、１２〜２５０塩基対の長
さを有する２つの逆方向反復ヌクレオチド配列を活性発
現カセット中に包含する組換えＤＮＡが遺伝子工学によ
って組込まれており、該２つの逆方向反復ヌクレオチド
配列の間には、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに
依存して複製されるＲＮＡ型ウィルス由来のヌクレオチ
ド配列を少なくとも１つ有し、該ＲＮＡ型ウィルス由来
の配列は少なくともＰｉ製のためのシス因子を有するが
ウィルスＲＮＡ／　ＲＮ　Ａポリメラーゼをコードする
遺伝子およびウィルスコート　タンパク質をコードする
遺伝子は含まず、更に、該２つの逆方向反復ヌクレオチ
ド配列の間には、ＲＮＡ型ウィルス由来の配列に加えて
、１種または複数種のタンパク質／ペプチドをコードす
る非ウィルスヌクレオチド配列をセンス配向またはアン
チセンス配向で有しており、かつ該真植生物のゲノムに
は、更に、！！を導的または組織特異的発現カセット中
にウィルスＲＮＡ／ＲＮ　ＡポリメラーゼまたはＲＮＡ
／ＲＮＡポリメラーゼ構築体の遺伝情報を組込んだ組換
えＤＮＡが組込まれていることを特徴とする方法が提供
される。
このようにして、本発明によれば、ｌｊ＆核生物または
その細胞において１種または複数種の産物を生産するこ
とができるものであり、その産物の例としては、タンパ
ク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、オ
リゴペプチドおよびポリペプチド、酵素、抗体、抗原性
物質、抗ウィルス化合物、抗腫瘍物質、ホルモン、ビタ
ミン、薬品および医薬、−次代謝産物および二次代謝産
物などが挙げられる。
本発明の更に他の態様によれば、ウィルスＲＮＡ　／　
ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ
構築体をコードするヌクレオチド配列を包含する組換え
ＤＮＡが提供される。
更に詳細には、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを
コードする第４図に示すヌクレオチド配列の１部、ある
いは、それに由来する構築体であって例えば第４図に用
いられた番号で６５６−６５８番の配列ＴＡＧの代りに
配列Ｔ＾■を有する置換変異体またはｍ４図に示す配列
の一部がウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコード
するもう１つの遺伝子対応部分によって置換されている
ａ換変異体のような構築体を包含する組換えＤＮＡが提
供される。
ウィルスＲＮ　Ａ　／　ＲＮ　ＡポリメラーゼまたはＲ
ＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ構築体をコードするヌクレオ
チド配列が誘導的又は組織特異的発現カセットに存在す
る組換えＤＮＡも本発明の更に他の態様である。
（以下余白） 〔実施例Ｊ 以ド、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明の範
囲はこれらの実施例に限定されるものでない。
実施例１は、　５ＴＮＶ由来のレプリコンによる形質転
換によってタバコ植物をＴＮＶ感染から保護する方法を
示したものである。　５ＴＮＶ由来のレプリコンは、タ
ンパク質をコードすることなく、非感染状態ではごく少
量のみ産出される、すなわち、ゲノムに挿入された該Ｄ
ＮＡの転写が非常に弱い極めて欠陥のあるレプリコンで
ある。しかしながら、タバコ植物が、５ＴＮＶ由来のレ
プリコンを増幅することのできる１１ＮＡ／１１ＮＡポ
リメラーゼをコードするＴＮＶに感染した時は、５ＴＮ
Ｖの情報がゲノム中にセンス配向で挿入されているが又
はアンチセンス配向で挿入されているかの如何を問わず
、５ＴＮＶ山来のレプリコンの大量生産が行なわれる。
その結果、タバコ植物は、該ウィルスの感染から保護さ
れる。
ゲノムに組込まれたＤＮＡがＴＮＶコートタンパク質の
ｗＲＮＡに対抗するリボチームの情報を包含する時、」
−記保護はより効果的になる。
実施例２は、ｙ４種タンパク質の誘導的生産を行うたＶ
）の本発明の利用方法を示している。この目的のための
モデルとして、Ｓ１’ＮＶコートタンパク質の開始コド
ンと連結した大腸菌のβ−グルクロニダーゼ逍伝ｒ−を
選んだ。この実施例において、形質（Ｌ’ｌ　ＩＭされ
たタバコ植物をＩ’ＮＮに感染させることにより、発現
が認められた。
実施例３は、’Ｉ’　Ｎ　ＶのＮプレカーゼ遺伝子の単
離とこのＮプレカーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＳ
Ｉ’ＴＮＶｒｃｐ−１の構築を示す。
実施例４は、ＴＮＶＮプレカーゼと接触させてメツセン
ジャー１ｉＮ八を増幅させる発現実験を示す。
このウィルスレプリコンは、外来遺伝子として、Ｓ　’
ｒ　Ｎ　Ｖのウィルスコートタンパク賀をコードする遺
伝子・の一部と大腸菌のクロラムフェニコールアセデル
トランスフェラーゼ（Ｃ＾゛［）遺伝子の融合したもの
を含んでいる。
実施例１ （ａ）組換えブラスミド ファンエメロら（ｖａｎ　Ｅ＋＋ｍｅｌｏ　ｅｔ　ａｌ
）、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１５７巻、４
８０−４８７　（＋９８７）に記載されているプラスミ
ドｐＳＴＮＶ−４１３から出発し、多数の新規な挿入変
異プラスミドを構築した。５ＴＮＶゲノム中で９個の切
断部位を有する出発プラスミドを、１１ＮＡ　Ｉ　７１
ｇ当たり０．１μｇの制限酵素均ミＩと２８℃で１５分
間インキュベー１・することにより線型とした。ファン
エメロら（Ｖａｎ　Ｅ＋ｕ＋ｅｌｏ　ｅＬ　ａｔ）に記
載されたものと同じ！４−ｓｅｔリンカー：５’ＴＣＣ
＾Ｔ（ｉＧＧＡＡＴＴｃＴ　３’　、！：、　（７）連
結の結果、主として、５ＴＮＶゲノムの１６２番日の位
置の５゛末端にＮｃｏ１部位を有するリンカ−を含有す
る挿入変異プラスミドｐＢＲ５ＴＮＶ　Ｎ１（ｉ２を得
た。
この挿入変異プラスミドとファンエメロらが既に記載し
た挿入変異プラスミドｐＢＲＳ’ｒＮＶ　ＮＩｆＪ８、
Ｎ３２２及び［５３１はすべてコートタンパク質をコー
ドする遺伝子中への上記１１１−＋ｍａｒリンカーの挿
入と干渉するリーディングフレームを含有するが、上記
各プラスミドから再生（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）リーディ
ングフレームを有する変異プラスミドを構築した。この
目的のため、上記１４−ｍｅｒｌｉｉ入物を、Ｎｅｏ　
Ｉで切断し、４個のｄＮＴＰの存在下で一本鎖末端をク
レノー（にｌ０ｎｏｖ）酵素で充填し、プラスミドの再
連結を行うことにより１８−ｍａｒ挿入物に変換した。
すなわち、−１ｘ記の１４−ｍａｒｌｉｉ入物は、Ｎｅ
ｏ　１部位（ＣＣＡＴＧＧ）が胆１部位（＾’Ｉ’ＧＣ
＾１）に置換されている１８−ｍａｒ挿入物、５°’ｒ
ｃｃ＾’Ｉ’ＧＣ＾ＴＧＧＧ＾＾ＴＴＣＴ　３’に変換
された。上記の方法で、理論的に６個のアミノ酸の増加
したコートタンパク質をコードする挿入変異プラスミド
ｐＨＲＳ’ｒＮＶ　Ｎ１６４．Ｎ２００．Ｎ３２４及び
Ｅ５３３が得られた。
マタ、プラスミドｐｎｎ　５ＴＮＶ　Ｎ８４３から５Ｔ
ＮＶゲノム中の０１８番日から９６２番目までの塩基か
ら成る１：、ｅｏｌｌＶ断ハを単離し、それをｐ１１Ｒ
５ＴＮＶ　Ｎｌ６４の対応する１ｉｃｏｌ？Ｖ断片で置
換することにより二重挿入変異プラスミドル口Ｉｆ　５
ＴＮＶ　Ｎｌ６４Ｎ８４３ヲ構築シタ。
」ユ記の１８−ｍａｒ挿入変異プラスミドｐｏｒｔ　５
ＴＮＶＮ１６４とＮ２００から、上記１８−ｍａｒ挿入
物のＮ５ｉ１部位にＮ５ｉｌＦＪｉ片として１８個の塩
基からなる別のリンカ−を挿入することにより変異プラ
スミドｐＢｎ　ＳＴ［１ＶＳ１６４と５２００を構築し
た。
５１６４中：　　５’　　ＴＣＣ＾１’ＧＣ＾＾ＴＣＧ
ＡＧＧＧＴＡＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＧ八＾Ｔ’ｒｃＴ
　３’ ８２００中：　５’ＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＣ
ＣＴＣＧＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧ＾＾ＴＴＣＴ　　３’ これらの変異プラスミドは、塩基数３６の押入物を有し
、理論的には、５１６４の場合にはリーディングフレー
ム変異の結果としてより短いコートタンパク質をコード
し、５２００の場合には、１２個のアミノ酸が追加され
たコートタンパク質をコードする。
上記の１８−ｍａｒ挿入物をコートタンパク質遺伝子（
塩１人６１　：ｌ　）の末端にある固有のＮ５ｉ１部位
に挿入することにより、変異プラスミド１口Ｒ５ＴＮＶ
　５６１３を得た。
１６２番１１に位置する１ｌｓａ１部位に、１４−ｍｅ
ｒリンカ−について上述したのと同様の方法で塩基数３
０のリンカ−を挿入した。形成されるリーディングフレ
ーム中で、このリンカ−は、神経ペプチドブラジキニン
をコードする。
５’　ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（ｉＧＧＴ’ｌ’ＴＡＧＴ
ＣＣＴＴＴＴＡＧＧＴＴ　３＾ｒｇＰｒｏ１’ｒｏＧＩ
ｙｌ’ｌ＋ｃＳｅｒｌ’ｒｏ円＋ｅＡｒｇこの挿入変異
プラスミドは、ｐ１３１１　Ｓ’ｒＮＶ　Ｕｒａｄと命
名する。
プラスミド１＋ｌ１ｌｌ　５ＴＮＶ　Ｎｌ６４から、１
６７番日から６：１１番１１のＮ５ｉＴ断片を欠失させ
ることにより、欠失変異プラスミドｐＢＩｉ　５ＴＮＶ
　ＤＩを得た。この変異プラスミドのゲノムは、野生種
５ＴＮＶの塩基数が２；（９であるに対し、塩基数７９
３である。
大腸菌中での発現研究のため、」１記の種々のＳ１°Ｎ
　Ｖ　＋ｉ＋７築プララプラスミドｌ’１．に２８２０
中にＰｓＬＩ断片としてＩ・ランスクローン（Ｌｒａｎ
ｓｃｌｏ口ｅ）させた。制限酵素１’ｓＬＩは、５ＴＮ
Ｖの５′末端と３°末端に隣接するボ１月；（：９°１
域の末端を正確に切断する。ｐＰＬｃ２８２０の中への
これらの構築物は、まずｐｐＬｃ、次に５ＴＮＶ変異株
の名前を付し、更にＳ　１’　Ｎ　Ｖゲノムの５゛末端
がｐｒ’ｔ、ｃ２８２０（１）１＋ｌ、プロモーターに
接合している時は、１．また３°末端が上記プロモータ
ーに接合している時は、２を付して命名する。従って、
プラスミドｐｌ’ＬｃＳ゛ｌ’ＮＶ　ＮＩ［ｉ４．　Ｉ
　ハ、　５ＴＮＶ変異Ｎ１（ｉ４がｐ　Ｐ　ＬＣ２８２
０中にクローンされ、５ＴＮＶ変異株が蟇）１．による
転写の際、Ｓ’ｌ’ＮＶの陽性ストランドゲノムｌ１Ｎ
Ａの等価物が鳳＋１ＮＡとして作られるように上記プラ
スミド中に挿入されて成るプラスミドである。
１’ｓＬＩ断片としてｐＰＬｃ２８２０中にクローンさ
れた５ＴＮＶ変異株は、５′末端において固有の１３ａ
ａｌ＋　１部位に先行され、３′末端において凪！部位
に後続される。　５ＴＮＶとそれから銹導される変異株
のいずれもＢａｍ１ｌｌ、　５ａｉ１部位を含まないの
で、種々の異なったｆＲｆｊ！！物を１３ａｍｌｌｌ／
Ｓａｔ　を断片として、植物ブロモ−タールＴ旧′の後
の位Ｉｔ　Ｇニー　ｐｌ’ｃＶ５２０ｃ　（第１図参照
）中へトランスクローンすることができる。得られるプ
ラスミドは、ｐＰＣＶ、続いて５ＴＮＶ変異株の名称を
付シ、更ニ、５ＴＮＶ（７）５’末端がプロモーターｐ
ＴＲＩ’の力を向いいる時は、１また３′末端がブロモ
−タールＴ旧′の方を向いている時は、２を付して命名
する。
これらのｐｆ’ｃＶｌｌ導体は、ホエケマら（ｌｌｏｃ
ｋｅｍａ　ｅｔａｌ）、イーエムビーオージャーナル（
開ＢＯＪｏｕｒ＋＋ａｌ）、３．２４８５（＋９８４）
及びデフラモンドら（Ｄａ　Ｆｒａｓ＋ｏｎｄ　ｅｔ　
ａｌ）、モレ、ジーン、ジェネテ。
（Ｍｏｌ　、Ｇｎｎ、ＧｅｎｅＬ、　）、２０２．１２
５（１０８６）に記載の方法に従いタバコ植物の形質転
換を行うため２元素ベクターシステムの一部として用い
られた。　ｐＰＣＶ５２０山来のプラスミドは、■プラ
スミド（すなわち、形質転換により植物のゲノム中に組
込まれるＴ−ＤＮＡを含有するプラスミド）として機能
した。
１：１１Ｉ図はプラスミ自）１ゝにＶ５２０の地図を示
す、このプラスミドのＴ−開＾は太線で示してあり、左
側（１，１（）および右側（１口）の境界配列ではさま
れている。
５ａｉｌど口＋＋５ｌｌｌの固有の制限部位は、植物プ
ロモーターｐ　’ｒ旧°とポリアデニル化シグナルＩ）
八ｇ７との間に断片をクローニングするために用いるこ
とができる。ｆｌＩｌ限部位ＢＢ４１１および埠旦１は
Ｊ）ＪＩ　ＯＳとｐＴｌ？２’との間に断片をクローニ
ングするために用いることができる。カナマイシン耐性
遺伝ＮＩ’Ｔ−１１はｐＴＲ２’およびｉ）＾（ｌ　Ｃ
８によって発現される。オクトビン遺伝子は組織特異的
プロモーター１１ｇ５およびｌ）＾ｏｃｓで発現される
。複製起点（ｏｒｉＶ％ｃｏｌＥＩ）を有するｐ　１１
　ｒコ３２２配列およびアンピシリン耐性（＾ｐＲ）は
Ｔ−ＤＮＡ中に位置している。ｐＲＫ２の複製の起点（
ｏｒｉν）と転移起点（ｏｒｉＴ）、クロラムフェニコ
ール耐性遺伝子（Ｃｍ　Ｒ）およびラムダの接着端（Ｃ
ＯＳ）はＴ−ＤＮＡの外側に位置している。
ｐｌ’ｃＶ５２０（ｍ　１図参照）の最も重要な特性は
下記の通りである。
（１）大腸菌中でのＣｏ１Ｅｌの複製。これにより現在
のすべての大腸菌株中での］−記ブラスミドの使用を☆
ｆ適なものとし、また、このプラスミドを多コピープラ
スミドとすることができる（効率的なりＮ＾Ｗ４製とク
ローン分析が可能となる）。
（２）抗性物質アンピシリン及びクロラムフェニコール
に対するバクテリア耐性。
（３）Ｒに２遺伝子Ｌｒ［ａが発現される限り、ｐＲに
２のト型８１！２起点が大腸菌中及びアグロバクテリウ
ム（＾ｇｒｏｌ＋ａｅＬｅｒｉｕｍ）中で活性である〔
アグロバクテリウム中では、さらに、安定のために選択
が必要である）。
（４）Ｉ）ＲＫ２のｐ−ｙ２転転移点が、ｐＲＫ２遺伝
子のＬｒａｌ。
Ｌｒａ２及びＬｒａ３の発現が生起する株からの該プラ
スミドの効率的転移を可能にする（大腸菌については、
５Ｍｌ０株で」ユ記のことが認められ、アグロバクテリ
ウムについては、プラスミドｐＭＰ９０ＲＫを含有する
株で上記のことが認められる）。
（５）’Ｉ’−１）Ｎへの境界配列（ｂｏｒｄｅｒ　５
ｅｑｕｅｎｃｅｓ）が、植物中の！Ｒ要なベクターのす
べての因子をはさんでる。
（に）Ｎｌ”Ｉ’−Ｉｔカナマイシン耐性遺伝子が、植
物プロモーターｒ）旧？２′のコントロールのもとに、
形質転換された植物の選択を可能にする。
（７）’ｒ−１１ＮＡ中のオクトビンシンターゼ遺伝子
が、カナマイシン耐性植物の形質転換をオクトビン合成
を利用して確認することを可能にする。
（８）構成植物プロモーターである【１旧′と１１１１
ｎｓが、それぞれ、５ａｉ１．口ａｍ１１１の固有ｎｉ
ｌ限ハ１≦位及びｌ１ｇ１ｌＪ、１１（−ｌ　１の固有
制限部位に後続され、更に、それぞれ、’ト１１ＮＡ逍
伝子７のポリアデニル化配列及びｒ−１）Ｎへ遺伝了４
のポリアデニル化配列に後続される。
（９）形質転換された植物からのＴ−ＤＮＡ配列のバッ
ククローニングが、Ｔ−ＤＮＡ中のｐｒｌＲ３２２ｏ口
■及びアンピシリン耐性により簡易化される。
従って、Ｔ−プラスミドｐｌ’ｃＶ５２ｏは、大腸菌と
アグロバクテリウムのいずれでも複製可能である。
本ベクター中への５ＴＮＶ変異株導入のためのクローニ
ング１−程は、大腸菌中で行うことができる。次に、接
合により、上記ベクターを大腸菌５Ｍｌ０から、植物形
質転換のために用いるアグロバクテリウム株ＧＶ３＋０
０Ｃ（ｐＭＩ’９０１ｉに）中に転移させる。プラスミ
ド１１Ｍ＋’００１５に〔第２図：コンクズとシェル（
Ｋｏｎｃｚ　ａｎｄＳｃｌ＋ｅｌｌ］、モル、ジーン、
ゼエネテ、（Ｍｏ１．Ｇｅｎ。
にｅｎｅＬ、）　２０４．１９８６．３８３−３９６参
照］は、毒性プラスミドとして作用する。上記プラスミ
ドは、ツバリンＴ１−プラスミドｐＧＶ３１００から次
のようにして誘導することができる。即ち、まず（１）
、欠失と押入をともに行い変異を誘発させ、Ｔ−ＤＮＡ
の完全な欠失とゲンタマイシン耐性遺伝子の押入を達成
しく得られる構築体は、ｐＭｒ’９０と命名される）、
次に（２）、カナマイシン耐性の遺伝子、Ｐ型プラスミ
ドの転移と複製のためにトランスで作用する遺伝子及び
転移のＰ型起点（ｏｒｉｇｉｎ）　（フィブルスキアン
ドへリンスキ（Ｆｉｇｕｒｓｋｉ　ａｎｄ　ｌ１ａｌｉ
ｎｓｋｉ）、ビーエヌエーエスニーエスエ−（＋）ＮＡ
Ｓ　ＵＳＡ）７６、１６４８（［７９）参照］を有する
Ｐ型プラスミドｐＲに２０１３の断片の挿入を達成する
。
第２図はプラスミドｐＭＰ９０１２にの地図である。　
ｐｃｖ３１００の７１断ハ９および１２が隣り合う位置
で、境界配列を含むＴ−ＤＮＡが欠失している。毒性領
域は完全にそのままであった。交換組換えによって、ゲ
ンタマイシン耐性遺伝子（（’、ｍ　　）とｐＩンに２
０！３の断片（それは転移遺伝子群（ｔｒａｌ、Ｌｒａ
２およびｔｒａ３）、複製遺伝子（Ｌｒｆａ）およびカ
ナマイシン耐性遺伝子（に−）を運んでいるＪが挿入さ
れている。
このプラスミドｐＭＩ’９０ＲＫ（第２図参照）の最も
重要な特性は次の通りである。
（１）アグロバクテリウム中でのみ安定な複製。
（２）ｌ’型ラプラスミドの適合性。
（３）形質転換時、植物ゲノム中へのＴ−１）Ｎ入組込
みのため必要かつ十分なＴｉ−毒性因子のすべてをコー
ドする。
（４）ゲンタマイシン及びカナマイシン耐性遺伝子を遺
伝子標識として含有し、それは選択が容易である。
（５）ｌ＋ＲＫ２遺伝子ｔ、ｒａｌ、　ｔ、ｒａ２、ｔ
ｒａ３、及びＬｒｆａの発現によるＰ種変異体の転移と
複製を補完する。
（６）ｌ’型ｏｒｉＴのため非常に効率的に接合する。
（ｂ）方法 植物（タバコ５ＲＩ）の形質転換は、デブロックら（１
）ｅ旧ｏｃｋ　ｅＬ　ａｌ）、イーエムビーオージャー
ナル（ＩＥＭ１１ＯＪｏｕｒｎａｌ）３，１６８１（＋
９８４）及びホルシュら（Ｉｌｏｒｓｅｂ　ｅｔ　ａｌ
）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２３゜４９６（
目）８１１）に記載された葉セグメント法により行った
。手順は下記の通りである。
（１）タバコ葉を小力で切開し創傷させ、得られる新鮮
創錫葉を形質転換アゲロバクチリアの新鮮成熟培養物の
５０倍希釈液とともに４８時間インキュベートする。こ
のインキュベーションは、液状ＭＳ−植物培地【ムラシ
ゲアンドスクーグ培地（Ｍｕｒａｓｂｉｇｅ　ａＩＲＩ
　Ｓｋｏｏｇ　ｍｅｄｉｕｍ）、ギブ：Ｉ　（Ｇｉｂｃ
ｏ）　］中で行う。
（２）次に、５００μｇ／ｍｌのグラフオラン［グラフ
オラン（ｃｌｕ「ｏｒａｎ）は、バクテリアに対しての
み作用する抗性物質であるＪを添加した液状ＭＳ培地中
で葉断片を１２時間２回洗滌する。
（３）次に、シトキニン【６−ベンジル−アミノプリン
またはビーニービー（口＾Ｐ）、ｌａｇ／Ｉ］　とオー
キシン［ａ−ナフタレン酢酸すなわちＮＡ＾、０．ｌａ
ｇ／Ｉ］を１−記創傷部において茎形成を促進させる比
率で添加し、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を形質
転換茎の選択のため、また、クリフオランを形質転換下
のアゲロバクチリアに対する選択のため添加した固形Ｍ
Ｓ−培地（＋０．８％寒天）」−で」二記葉断片をイン
キュベートする。
（４）４〜１０′Ａ後、形質転換茎が本培地から成育す
る。」、記載は、十分に成育すると、枳が成育し正フ；
ｔな植物に成長することのできる無ホルモン培地に写す
ことができる。
カルス誘導を無菌草葉断ハについて行った。この［１的
のため、シトキニンｎＡＩ）（０，５層ｇ／ｌ）とオー
キシンＮ＾＾（ｉ、（１ｍｇ／ｌ）をカルス成育を促進
させる濃度と比率で添加した固形ＭＳ−培地（＋ｏ、　
８％寒天）上で上記断片をインキュベートした。
オクトビン試験のため、小粒植物組織（約５０ｍｇ）を
１００　ｍＭ　Ｌ−アルギニンと液状ＭＳ−培地に溶解
した５０　ｓＭピルビン酸塩を含む溶液中で一夜インキ
ュベー１−　した。インキュベート後、液を除去し、得
られた植物組織をＭＳ−培地で洗浄した。次に、植物断
片を粉砕し、遠心分離し、抽出液３〜５μｍをペーパー
電気泳動により分離した。電気泳動は、ワラｔ”７ン（
Ｗａ　Ｌ　Ｌｌｌａｎ　）３ＭＭペーパー上、１５％酢
酸１５％蟻酸／８０％水の溶液中でおこなった。上記ペ
ーパー上のオフＩ・ビン斑点は、０５％エタノール中０
．０２％フェナンスレキノン１部と６０％エタノール中
１０％苛性ソーダ１部の新鮮混合物で染色反応を行った
後Ｕｖ九九下１１視可能とした。
５ＴＮＶ変異株の感染力を調べるため、す勺ゲのプラス
ミド感染を実施した。この目的のため、ファンエメロ（
Ｖｏｎ　ｆＥｍａ＋ｅｌｏ）に記載された方法に従って
°ｒＮＶヘルパーウィルスとキメラプラスミドの混合物
をササゲに接種した。
ファンエメロに記載されたのと同様の方法でノーザーン
分析を行なった。形質転換された植物の分析に関し、−
本船及び二本鎖１ｉＮＡは、ゲル電気泳動のためのＬｉ
Ｃｌ沈殿により分離されなかった。
変性グリオキサールアガロースゲルの外に、レフラフら
（１，ａｃｌ＋ｒａｃｂ　ｅＬ　ａｔ）、バイオケミス
トリー（ｌ（ｉｏｃｌｕ＋ｓ＋１ｓｔｒｙ）、Ｉ６．４
７／１３（＋９７７）　；及びマニアテイスら（剛ｌ旧
ａシｉｓ　ｅｔ　ａｌ）、モレキュラークローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ニアラボラト
リ−マニュアル（八Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールドスプリングハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、米国に記載
の変性ホルムアミドアガロースゲルを用いた。この方法
では、まず、１？Ｎ＾サンプルを、５０％ホルムアミド
、１７．５％ホルムアルデヒド、２０ｍＭモルホリノ　
プロパンスルホン酸（Ｍ叶５）（ｐＨ７、Ｏ）、５ｍＭ
　ＮａＡｃ及びＩｍＭ　ＩＥＤＴ＾（ｐＨ８，０）を含
有する混合物中で５５℃Ｉ５分間加熱し変性する。ゲル
電気泳動は、２０＋ｉＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７，０）、５
ｍＭ　ＮａＡｃ及び１昂門１４１）ＴＡ（１＋Ｉ１８．
０）を含有する輸送緩衝液を用イテ１．２％アガロース
ゲル中で行なった。上記サンプルのプロット形成とハイ
ブリダイゼーションのための処理は、ファンエメロ（Ｖ
ａｎ　ＩＥ＋＋ｕｓｅｌｏ）に記載の方法により行なっ
た。
’Ｉ’ＮＶ及び５ＴＮＶコートタンパク質を検出するた
めのウェスターン分析は、次の方法により行なった。
感染葉を２［］後に採集し、１００　ｌｉ　ｇ　７ｍ　
ＱのＰＭＳＦを含有する１）ＢＳ（ＰｒｌＳ＝０．　＋
３Ｍ　ＮａＣｌ、　ＩＯｄリン酸ナトリウム緩挿Ｉ油、
ｐｌ＋７．４）　Ｉ容量部り弓℃で針を用いて粉砕した
。細胞残渣は、遠心分離で除去し、タンパク質を三塩化
酢酸（ＴＣ＾、最終濃度１ｏｚ）で沈殿させた。沈殿物
を、エタノール、エタノールエーテル（Ｉ：Ｉ）、エー
テルで洗滌し、乾燥し、１ｘレムリ（１，ａｅｍｍ　Ｉ
　ｉ　）緩衝液［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　２２
７６８０−６８５．１９７０＃照］中に１１ｊ懸濁させ
た。懸濁液を電気泳動にかけ１０χＩ”ＡＧＪｚに分画
を得た。上記分ｊｊｊを０．５へ〇θ分の電気転移によ
り転移緩？Ｉｉ液１２０％エタノール中１　ｍＭ酢酸ソ
ーダ、５ｍＭ　ＭＯｒ’Ｓ（１＋ｌＩ７，５月中でポー
ルバイオダインフィルター（Ｐａｌｌ−ｂｉｏｄｙｎｅ
　ｆｉｌｔｅｒ）に転移させた。このフィルターを、１
０％低脂肪粉末ミルクを含有する円３Ｓ中で一夜ブロッ
クさせ、次に、２ｚ低脂肪粉末ミルクを含有する内応で
２００倍に希釈したウサギの抗−５ＴＮＶコー］・タン
パク１１１１清と室温下１時間インキュベートシた。上
記フィルターを、Ｏ８Ｉ％　ＴｒｉＬｏｎ−Ｘ−１００
を含有する円（Ｓで４回洗肝し、２ｚ低脂肋粉末ミルク
を含有する円（Ｓで２５０倍に希釈したヤギ由来の抗−
ウサギアルカリ性ホスファターゼ標識抗体とともにイン
キュベ−１・させた。非結合抗体を洗滌除去後、メーカ
ー〔プロメガバイオチック（Ｐｒｏ＋ｏｅｇａ１＋１ｏ
ＬＯｃ）］指示の条件下、二トロブルーテトラゾリニー
ム（ＮｉＬｒｏ　１１１１１０　ＴｅＬｒａｙ、ｏｌｉ
ｕｍ、　Ｎ１１Ｔ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリルホスフェ−１−（ｎｃ１１＋）を用いて染色反
応を行なった。
（（ニ）実験と結果 （（二ｌ）人１揚菌ＮＦＩ中での発現研究センス配向の
変性Ｓ’ｌ°ＮＶゲノム（，１構築物）およびプラスミ
ドｐｌ’１．ｃ　Ｓ１’ＮＶ　Ｎｌ６４，２とＩ（ｒａ
ｄ、２（アンチセンス配向）を有する多種類の１）円、
ＣＳ１’ＮＶプラスミドを用いて大腸菌Ｎ口を形質転換
させた。この大腸菌株は、ｐＩ、中の０１抑制遺伝子由
来の＋、ｓ（温度−感受性）変異体を有し、これにより
、２８℃でバクテリアを培養する際Ｉ）！４プロモータ
ーの抑制が生起する。
温度４２℃では、レプレッサーは不安定であり、プロモ
ーターはｆ）！、転写を行う。
ウェスターンブロッティングを用いて、コートタンパク
質の合成を調べた。即ち、コートタンバグ質の存在、不
在および種々の５ＴＮＶ変異株によりコードされたタン
パク質のサイズの差違について調べた。結果を第１表に
示す。次のことが知見された。
（１）リーディングフレームの変異（塩基数：＋１４ま
たは＋３６）シた５ＴＮＶ変異株は、短いコー］・　タ
ンパク’ＩＴを産生し、コートタンパク質の鎖長は押入
物が３゛末端の方向に位置するにつれて増大する。
（２）修復（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）リーディング７Ｌ／
−ム（塩基数：＋１８、＋３０または＋３６）を有する
挿入変異体は、野生型より長いコート　タンパク質を産
生ずる。一方、相互易動度（＋１８＞＋３０＞＋３６）
は分子量の大小に関係し、添加アミノ酸数（＋６、＋１
０および＋１２）に基づき予測される６ （３）プロモーターに対し、１配向状態で変異５ＴＮＶ
を挿入したプラスミドのみがコート　タンパク質を産生
ずる。
（Ｃ２）プラスミド感染 特に指定しない限りは、プラスミド感染はｐＢＲ３１’
ＮＶプラスミドを用いた。種々実験の相関関係を示すた
め、感染の陽性対照例としてプラスミドｐＳＴＮＶ　４
１３を用いた。陰性対照例としては、０；１に複製欠陥
の認められたｐＢＲ５ＴＮＶ　Ｎ８４３を用いた。
−次感染後のシグナルが非常に弱いか無のときは、より
明確なＲＮＡ及びタンパク質のシグナルを得るためＲＮ
Ａ抽出物による二次感染を実施した。
接種された葉物質の分析時、コート　タンパク質の合成
はウェスターンプロット法によりＩＶｆ価し、ＲＮ　Ａ
の合成はノーサンプロット法により評価した。Ｉ’？　
Ｎ　Ａに関しては、−重鎖ＲＮＡと二本鎖ＲＮＡを分離
し、それらの存在は別々に確認した。結果を第１表に纏
める。次の知見が得られた。
（Ｉ）ｄｓＲＮ＾（二本鎖ＲＮＡ）は、コート　タンパ
ク質遺伝了・中に挿入物を有する全ての変異体中に存在
し、第８４３番日の位置に挿入物を有する変異体でのみ
無である。
（２）コートタンパク質と通常量の５ｓＲＮ＾（−重鎖
ＲＮ　Ａ　）は、変異体Ｎｌ６４、Ｎ２００および１３
ｒａｄ中にのみ認められる。
（３）コート　タンパク質の認められない挿入変異体で
は、植物もまた、非常に少量の５ｓＲＮ＾を含有する。
（４）植物中および大腸菌ＮＦＩ中で変異体Ｎ１６４、
Ｎ２００およびＢｒａｄについて産出されるコート　タ
ンパク質は同じ鎖長を有する。
ストランド特異性プローブ（ＳＴＮＶのｓｐ６　ＲＮ＾
転写物、または１種々変異体に適した一重鎖リンカー）
とめハイブリダイゼーションにより、種々感染の際単離
された５ｓＲＮ＾は陽性ストランドあり、従って、ゲノ
ムＩｉＮへに対応することが確認された（コート　タン
パク質と粒子のいずれも存在せず、５ｓＲＮ＾の量が極
めて少量の場合にも）。
」−記の種々ｐｒ３ｒｌ　５ＴＮＶプラスミドの外に、
変異体Ｎ１６４．１、Ｎｌ６４．２、Ｒｒａｄ、Ｉおよ
びＢｒａｄ、２に対しても、ｐ　Ｐ　Ｌにおよびｐｒ’
ｃｖプラスミドを用いてプラスミド感染を行ない、同様
の結果を得た。
（Ｃ３）ＳＴＮＶ変異株の形質変換植物中での発現タバ
コＳＲＩの形質転換を下記のＴ−プラスミドを用いて実
施した。
ｐｌ’ｃＶ　５２０ ｐｌ’ｃＶ　５ＴＮＶ　Ｎｌ６４．　Ｉおよび、２ｐｌ
’ｃＶ　５ＴＮＶ　Ｎ１６４Ｎ８４３．　Ｉおよび、２
ｐｌ’ｃＶ　Ｓ１’ＮＶ　１ｌｒａｄ、　Ｉおよび、２
（以下余白） （註）“ａ、ａ”はアミノ酸を表わし、“短″は短縮さ
れたコートタンパク質を表わす、コートタンパク質の存
在とサイズはウェスターンブロッティングにより調べた
。ＲＮＡは１゛Ｉ）で標識された５ＴＮＶ−ＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズされた。
（以下余白） ｐＰｃＶ５２０を用いた形質転換は形質転換実験自体の
チエツクのために行った。コートタンパク？ｒ遺伝子に
リンカ−が押入されている感染性５ＴＮｖ変異体Ｎ１６
４を用いると、実験結果の分析の際に、変異株のコート
タンパク質（１６個のアミノ酸）と野生型のＲＮＡ（特
異的リンカ−とのハイブリダイズによる）との両者の識
別が可能になる。変異体Ｎ＋６／ｌＮ８４３は複製欠陥
ゲノムとして選ばれた。この変異体においては、挿入物
のＮ１６４はコート　タンパク質の同定と。
野生型からの識別のためのものであり、一方、挿入され
た２つのリンカ−はＲＮ　Ａの同定を可能にする。変異
体Ｓ’ｒＮＶ　　１３　ｒ　ａ　ｄを形質転換に用いた
のは、形質転換体をヘルパーウィルス′１゛ＮＶで感染
させるとＳ　’ｒＮ　Ｖコート　タンパク質とブラジキ
ニンとの融合タンパク質の発現が促進されるかどうかを
確認するためである。形質転換された植物の命名は、ま
ずｒｓＲｌ」をつけ、次に、相当する５ＴＮｖ変異体の
名をつけ、さらに、同じ変異体による形質転換体のそれ
ぞれを表わすための番シ）をつけた。
カナマイシン含有でホルモン非含有の培地に移した後通
常に枳を出したカナマイシン耐性の植物を、増殖させて
更に調べた。カナマイシン耐性植物への形質転換をオク
トビンテストにより確認するために、これらの植物につ
いても、カルス＜（：ｒ＋　ｌ　ｌ　！ｌ　Ｓ　）培養
物を作成した。ｐｌ’ｃＶ５２０の’ｒ−ＤＮ＾中のオ
“りトビン合成遺伝子（ｏｃＬｏｐｉｎｅ　５ｙｎｔ、
ｌ＋ａｓｅ　ｇｅｎｅ）は、草断片とカルス組織でしか
発現しない組織特異的プロモーターである１’−ＤＮＡ
遺伝子５でコントロールされるが、茎断片における該プ
ロモーターの発現がＪ１常に弱いため、オクトビンテス
トはカルス組織を用いて行なうのがａｔましい。確認の
結果、カナマイシン耐性植物のうち９０％以上のものが
実際に形質転換体であることが分かった。
形質転換植物は無菌の成長条件下で得た。　ＴＮＶ感染
感染物植物小さな若木にまず試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏ）で根を出させ、次に鉢入りの土に移してから温室条
外下で成長させた。この植物が十分に成長してから、　
ＴＮＶを感染させた。機械的感染はタバコＳ旧から単離
した新鮮なＴＮＶ接種原を用いて行なった。接種した葉
を７２時間後に摘み取り、液体窒素で凍結してから一７
２℃で保存した。また、同じ植物体から未感染の葉を摘
み地番ハ分析した。
様々な試料中の５ＴＮＶ　ＲＮＡとコート　タンパク質
の存在は、それぞれ、ノーサンブロッティング法及びウ
ェスタンブロッティング法で確認した。
結果を第２表にまとめて示す。
（註）形質転換された植物のうち、５ＴＮＶ変異株につ
き、数種の独立に単離された植物を検査した。
！１ＴＮＶコートタンパク質（＋６、ロ０アミノ酸）は
ウェスターンブロッティング法により、　ＲＮＡは９°
■）で標識された５ＴＮＶ−ＤＮＡでのノーザンハイブ
リダイゼーションにより調べた。同一変異体ゲノムによ
るそれぞれの形質転換体は、（÷）の数で表示されてい
る異なった強度の信号を示した。ウェスターン及びノー
ザンブロツテングでは、サンプル毎にＩ　Ｏｍｇの葉材
が用いられた０種々のリンカ−（１４−１＋８−１：ｌ
Ｏ−ｍａｒ）ハイブリダイゼーションにより５ＴＮＶゲ
ノムであるとの確認を行なった。
第２表からは以下のことが分かる。
（１）構成植物プロモーターによりコントロールされ、
且つ、逆方向ポリ−〇Ｃ−領域にはさまれた５ＴＮＶに
よって形質転換された植物にＴＮＶを感染させると、　
５ＴＮＶゲノムの複製と発現及び５ＴＮＶ粒子の形成に
至る。
（２）複製欠陥という特徴を持つ変異体Ｎｌ６４Ｎ８４
３は、形質転換植物内で通常に複製する。
（３）コート　タンパク質遺伝子とブラジキニン遺伝子
との融合を伴っている５ＴＮＶ構造は、ＴＮＶ感染後、
ｍ１ｌＮ＾の複製を生じ、また、融合タンパク質の合成
を促進する。
（４）様々なリンカ−とのハイブリダイズによって検出
された５ＴＮＶ　ＲＮＡは、植物の形質転換に用いた変
異体ゲノムに対応する。
（５）、２配向のＳ　’ｌ’Ｎ　Ｖゲノムを有する植物
、即ちアンチセンスｓｌ？Ｎ＾を産生ずる植物もまた、
ＴＮＶ感染後にＳ’ｒＮＶの複製と発現を生じ、その際
１．１配向のゲノ゛ムを有する植物との差は見うけられ
ない。
（（ｉ）　ＲＮＡ及びタンパク質のシグナルの強度の差
は、変異体５ＴＮＶゲノムのタイプや配向とは無関係で
あり、同一のゲノムを有するがそれぞれ独立した別々の
形質転換体の個々の性質によるものである。
肝価に用いた植物体の量は１０■だけだったので、ＴＮ
Ｖ感染前の形質転換体からはＲＮＡもコートタンパク質
も検出されなかった。
追試を繰り返したところ、全てが定性的、定量的に同様
の結果となった。有意な差が見うけられたのは１’ＮＶ
感染の効率のみで、この効率は、感染された植物の年齢
と分化度、接種原の品質、気温、７１１１１度など様々
な要因に依存している。ＴＮＶによる感染が強すぎると
、弱いＲＮＡシグナルが得られたのみで、タンパク質シ
グナルは得られなかった。
一方、適切なＴＮＶ感染を行なうと、５ＴＮＶシグナル
はプラスミドによる感染の場合よりもずっと強くなった
。ウェスタンブロッティング法による分析で得たシグナ
ルの強度に基づいて、コート　タンパク質の爪は、ｌ０
ｍｇの葉から作成した試料あたり約１００Ｂと算定され
た。Ｓ１’ＮＶコート　タンパク質が合成されるのが、
葉全体のたった約５ｚに相当し、また、１’ＮＶも存在
する壊死損傷部分に限定されることを考えると、５ＴＮ
Ｖシグナルは葉の全湿潤重量の約０．０２％、乾燥重量
の約０．５χに相当することが算定できる。この比較的
大量のタンパク質は、’ｒＮＶ感染による発現銹導後、
たった３　１Ｅ　ｎｌｊで形成されるものである。
５ＴＮＶ　Ｎｌ６４変異体及び５ＴＮＶ　Ｂｒａｄ変異
体から得た結果から、Ｉ８塩基化合体（１８−ｍｅｒ）
の挿入及びブラジキニンとの融合は、５ＴＮＶ−ＲＮＡ
の複製性と発現には影響しないことが分かる。このこと
は、コート　タンパク質の全部又は一部を、ＳＴＮシー
ＲＮＡの複製性と発現に悪影響を与えずに置き換えるこ
とができることを証明している。このことについては、
後述する実施例２も参照されたい。
変異体Ｎ１６４Ｎ８４３は、プラスミドでの感染の場合
と異なり、形質転換植物内で正常に複製することが全く
意外にも明らかとなった（リンカ−のハイブリダイズに
より、Ｎ８４３の位置における１４−ｍＣｒ挿入物は、
検出、複製されたＲＮＡ中に実際に存在することが証明
された）、　５ＴＮＶ８４３によるプラスミド感染体に
おいて５ｓＲＮＡとｄｓＲＮ＾が存在しなかったのは、
明らかに、複製欠陥の結果ではない。また、５ＴＮＶ−
ＲＮＡ　（Ｆ）複製は５ＴＮＶ：＋　−１−’Ａ　ンバ
ク質や５ＴＮＶ粒子が存在するか否かには依存していな
いと思われる。これらの変異株においては細胞から細胞
へのＳ’ｒＮＶ感染の伝播が正常に起きるため、ウィル
スＲＮＡ（−重鎮又は二重鎖）のみが５ＴＮＶ−ＲＮＡ
の複製に関１ｊすることができる。しかしながら、変異
体Ｎ８Ｃ１の、プラスミド感染体内と形質転換植物内と
ての挙動の違いは、この変異が、ＲＮＡによるＳ　’ｌ
’　Ｎ　Ｖ感染の細胞から細胞への通常の伝播を防ぐと
考えることにより説明することができる。プラスミド感
染体内では、この変異体は感染性をもたない。しかし形
質転換植物内では、５ＴＮＶ−ｓＲＮ＾は全細胞で形成
されるので、細胞から細胞への伝播が無くとも正常な複
製を達成できる。従って、複製のための構造的因子に加
えて、５ＴＮＶ−ＲＮＡはさらに細胞から細胞への輸送
のために必要な因子−を有している。おそら＜、ＴＮＶ
にコードされるタンパク質が活発な役割を演じているの
であろう。
Ｓ　’Ｉ’　Ｎ　Ｖが植物プロモータに対して、２の配
向で押入された形質転換体においては、アンチセンスす
なわちネガティブストランドＲＮ　Ａがメッセンジャー
ＲＮＡとして形成される。５Ｐ−６転写物を用いてネガ
ティブストランドＲＮＡによるＳ　’ｒ　Ｎ　Ｖ感染を
引き起こそうとした以Ｏ；ｊの試みは失敗している。
しかし、形質転換体においては銹導後にこれが可能であ
り、効率も５ＴＮＶ、　Ｉ形質転換体を用いるのと同じ
くらい高いと思われる。従って、一つのタンパク質のア
ンチセンスメツセンジャーＲＮ　Ａのみが産生されるこ
とにより、植物成長の全段階において一つの遺伝子の発
現を完全に抑制することができ、また、複製のためのヘ
ルパー因子・が存在する期間に発現を限定することがで
きると同時に、アンチセンスからコード化センスＲＮ　
Ａへの複製と増幅によって短時間に強い発現を得ること
ができる。特に毒性物質の合成に関しては、植物の成長
期にその発現を完全に抑制して、植物の成長への悪影響
をＩＳｈぐことは非２：りに重要なことであろう。
（以下余白） （［：４）Ｉｎ　ｖｉｖｏ欠失変異 Ｓ　１’　Ｎ　Ｖの野生株と変異株によるプラスミド感
染に際し、変異株の分析においてＲＮＡとタンパク質の
より明確なシグナルを得るためしばしば、２次感染を行
った。これらの２次感染は、これら植物からの全１１Ｎ
Ａ　（ｄｓとｓｓ）を用いて行い、　５ＴＮＶ及びＴＮ
Ｖによる両感染が伝達された。同様の感染を３回から４
回と連続的に縁り返すことによって、５ＴＮＶの欠失変
異株を単離することが由来た。ノーザンプロット方法に
より、これらの変異株のＲＮＡは明確で迅速な泳動識別
バンドとして分離する事が由来た。
異なった感染系に於いては、異なった変異株が独立的に
形成され、複製ＲＮ＾の長さは約６００〜９００塩基で
あった。感染系に於いて５ＴＮＶの欠失変異株が生成し
た時、オリジナルな野生株のゲノムは１回または２回の
感染によって消失することが分かった。また、在存し且
つ可成り大きなな欠失変異株に於いては、付加的欠失に
よってより小さな派生株を生成することができた。その
様な感染系を継続した場合には、より大型の変異株は消
失した。
一般に、これらの感染を十分に繰返すと、約６００塩基
のゲノムを持つ５ＴＮＶ欠失株を産生することが分かっ
た。ウェスタンプロット法により、Ｓ’ｒＮＶ欠失変異
株は最早コート　タンパク質をコードしていない事が分
かった。５ＴＮＶゲノムの異なった断片でハイブリダイ
ゼーションすることによって、ゲノムの５゛エンドに欠
失があることが分かった。
これらの欠失変異株の形成に役割を担うと考えられる因
子としては： （１）コート　タンパク質の欠失。その結果、変異株が
コート　タンパク質で包み込まれることなく、感染した
細胞中の全ての陽性ストランドＲＮＡは複製が可能な状
態を保持し、またおそらく感染の拡大を可能とする状態
を保持する。
（２）より広範囲に亘る欠失（コート　タンパク質遺伝
子なしに）はより小さなゲノムへと発展するために、変
異株の複製は早められ、その小型化につれてより効率的
な感染を蒙ることとなるものと考えられる（常に野生株
植物のそれよりも多量のＳ１’ＮＶ−ＲＮＡが欠失変異
株植物に見出され、その５ＴＮＶＩｆＮＡの歌は同変異
株の小型化に比例して増加する）。
これらの欠失変異株の挙動」二最も注目すべきは。
１’ＮＶヘルパーウィルスに対する強い干渉である。
ＲＮＡ感染系において５ＴＮＶ欠失変異株が形成された
場合、’ｒＮＶの量は顕著に減少する。このＴＮＶ量の
減少は１回ないし２回の感染後に顕著であり、その結果
、ＲＮ＾接種原に対する新鮮なＴＮＶまたはＴＮＶ−Ｆ
ＩＮ＾ＲＮＡくしては新規な感染は不可能となる。従っ
て、非自然的なＲＮＡ接種によって形成された５ＴＮＶ
変異株は、非常に効果的に１’ＮＶ感染の抑制を行うも
のと考えられる。
比較のために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで構築した欠失変異株
５ＴＮＶ旧をプラスミド感染によりササゲに感染させた
。この変異株をムロｖｉｖｏ欠失に従いＩ？Ｎ＾接種に
よって繁殖させた場合、原Ｎ１６４変異株の複製よりも
一層効果的な複製が行なわれた。Ｉｎ　ｖｉｖｏで形成
される変異株と同様、Ｓ’ｒＮＶ　ＤＩはＴＮＶ複製を
抑制する。この事は、これらの植物からのＲＮ＾接ｌｌ
ｌ１原の僅かな感染力により明白である。
Ｉｎｖｉ去四で構築した欠失変異株５ＴＮＶ　ＤＩの゛
Ｉ’ＮＶ複製への影響によって、ＴＮＶ感染から形質転
換植物の保護が可能になるかどうかを調べるために、上
記変ｙ４株を用いてタバコＳＲＩを形質転換させた。
５ＴＮＶ欠失株のＲＮＡの発現がＴＮＶ感染の発生と進
行にどのような影響を持つかについて調べるために、対
照として、以下の植物を由来る限り同じ条件Ｆで生γｆ
させ、感染させ、観察を行った。
（りＳ旧 （２）ＳＲＩ　５ＴＮＶ　Ｎ１６４Ｎ８４３，１／ｌ／
２　ｎｉｉ者ハｓ１’ＮＶ（７）強い発現を示し後者は
弱い発現を示すものである。
（３）Ｓ旧５ＴＮＶ　０１．１／１ これらの植物の各々につき、よく似た発生と分化を示し
た４枚の葉を感染させた。感染は、ＴＮＶ感染のササゲ
より調製した新鮮な接種原と感染したタバコから得た凍
結接種原を用いて行なった。固接Ｍ＃；ｔは、Ｉ／Ｉに
希釈したものを各々接種ｊｊ（＋　、接ｍに（３と命名
し、また１０倍に希釈したものを各々接種原２、接種原
４と命名した。各植物の４枚の葉を半分ずつ上記４種の
接種原の各々を用いて同場所で感染させた。これらの葉
は、下から上に順次ａ、ｂ、ｃ、ｔ＋と命名した。この
様にして以下の様な組合せをｆう二った。即ち、ａｌと
ａ２、ｂ３どｂ４、ｃ２とｃ４、そして（１１とｄ３゜ 接種から７２時間、９６時間、１７０時間経過後、感染
の発展状況を観察し、写真に記録した。また、接種から
９６時間経過後、各々の葉より粒を採取しＵＶ光のもと
て写真撮影を行ない植物の過敏性反応を調べた。９６時
間後、最も病変の著しかった（ｂ３）各植物の１５葉を
採取した。半葉の一部を凍結し、後に１１ＮＡ及びタン
パク質組成を分析するため保存した。その他の葉の部分
は、ササゲの葉を感染するための接種原の調製用として
用いた。上記タバコ植物の各々につき、４枚のササゲの
葉を下記接種原により感染させた。
（１）１個の単一病巣からの抽出物（１枚の葉）（２）
２００１１ｇの葉組織からの抽出物（２枚の葉）（３）
］ユ記の５倍希釈物（１枚の葉）写真判定の結果、種々
のタバコ植物のＴＮＶ感染の発展に大きな差がある事が
明白となった。最も重要な差違は下記の通りである。
（１）種々の葉の病巣の数は用いられた接種原によって
）′４なった（３＞４＞１＞２）。しかし、植物間の差
違は僅少であった（ＳＲＩ＞ＳＲＩ　Ｎ１６４Ｎ８４３
．Ｉ／ｌとｌ／２＞ＳＲＩ　ＤＩ、ｌ／Ｉ）。
（２）Ｓ［？Ｉ　Ｄｌ、Ｉ／ｌの病巣は明らかに他の植
物のそれよりも小さく、タバコＳＲＩとＮ１６／ｌＮ８
４３．　ｌ／Ｉは顕著に異なっており、Ｎ１６４Ｎ８４
３．　ｌ／２はその中間的様相を示す。同一植物の隣巣
の大きさの差違は、葉に依存しており（ａ＞ｂ＞ｃ＞ｄ
）　、その差違は正常なものであって葉の発育段階と関
係している。
（３）特に、１７０時間後においては、ＳＲＩとＳ旧Ｎ
１６４Ｎ８４３．　ｌ／ｌの感染葉の相当大きな部分が
完全に壊死化するに対し、ＤＩ／ｌの対応する葉は病変
を示すが正常な緑色を維持する。
＜４）ｕＶＩＮ射により植物の過敏性反応の結果である
蛍光リングとスティンが目視される。この反応によって
、植物の感染部分は、これらの部分を枯死させる組織の
リングとして単離される。５ＲＩＤＩ、　ｌハの場合、
これらの部分は他の植物のものよすもずっと小さい。こ
の事は、葉の感染が小程度であった事を示している。
９６時間後、各植物の！ｒ葉ｂ３の一部を用いて、サリ
ゲの葉を感染させるための接種原を調製した。
７２時間後、ササゲの葉の感染の程度に１９１白な差違
が観察された。欠失様植物より調製された接種原で感染
させた植物は局部病斑を示したが、各々の葉は依然緑色
を呈した。７２時１８ｊ後、他の植物（欠失様植物より
の接種原で接種されていない植物）の壊死化は急速に進
み、いくつかの葉は色があせて殆ど落葉する程であった
。
種々の植物中のＴＮＶ−１１Ｎへの量を比較するため、
１ζＬ１３「で染色したアガロースゲル中のＴＮＶｄｓ
と５ｓＲＮへの存在をｊｉＦ明しようと試みた。ＴＮＶ
−コートタンパク質の量はウェスタンプロティング法で
１１Ｎ定した。
ソ（７）　＆’ｉ　果、ＳＲＩ　０１．１／Ｉ（７）１
°ＮＶ−１１Ｎへの量は、他の植物のものよりも少ない
ことがわがった。ＳＲＩ　０１．１７１中のコートタン
パク質の量は、タバコＳＲＩ中のものよりも約２０倍は
ど少なく、他方、ＳＲＩ　Ｎ＋６４Ｎ８１１３．１／ｌ
と１／２中のコートタンパク質の量は、その２つの値の
中間値登示した。第２次感染されたササゲの葉でもＴＮ
Ｖ−ＲＮＡの有無を調べたが、タバコ植物でのそれと同
様の結果を示した。
植物またはその部分の大規模感染において、５ＴＮＶ欠
失変異株のＩ？Ｎ＾の存在は、壊死の無発生、減少、も
しくは遅延をもたらし、感染部分の消失をもたらす。感
染したが保護されている植物では、ＴＮＶの産生が少な
く、それは他の植物への感染の伝播を抑制する効果をも
つ。全体的な保護効果は、はとんど無視される位の量の
１１ＮＡの合成により達成される。感染が現実におこっ
た時のみ、ウィルス的にコードされた複製因子・が高濃
度で保護可能な濃度の欠失−１１８＾を産生ずる。更に
、これは感染した細１皺の中でのみ起こり、植物のエネ
ルギー負担は無視できる。
（以下余白） 実施例２ ここに記載する実験では、Ｅ、　ｃｏｌｉのグルクロニ
ダーゼ遺伝子を使用した。その理由は、グルクロニダー
ゼ酵素は融合タンパク質としてその活性を維持し、植物
グルクロニダーゼ活性は知られていないし、この酵素活
性は定量的に且つ高感度で検出できるからである。種々
の構築に使用されたグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子
（ｕｉｄ＾）は、ＰＮＡｓ　８３゜１３１４７−８４５
１　（１０８６）にＪｅｒｒｅｒｓｏｎらによって記載
された方法で、プラスミドｐＲＡＪ２５５からＰｓｔ、
Ｉ−ＥｃｏＲ１断片として単離されたものである。　Ｃ
ＵＳ遺伝子が５ＴＮＶ−ｃＤＮ＾の中の所望の位置にそ
して適切なリーディングフレームに挿入されるように次
に示す調整を行なった。
（１）まず、プラスミドｐｌ’ｌ、Ｃ３２１の１５４９
　ｂｐ　５ｃａｌ−Ｎｄｅ　ｌ断Ｊ１を、プラスミドｐ
ｐｔ、ｃ　２８２０の相当する断片で置換（アンピシリ
ン遺伝子中のＰｓＬ１部位が欠失される）することによ
ってプラスミドｐＰＬＣ３２２を構築した。
（２）次に、 ＣＡＴＧＧ（、ＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧ＾＾ＴＴＣ
ＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＴＴ＾
＾ＧＴＡＣＧＴＡＧＧＴＡＣの構造の合成リンカ−をｐ
ｌ’Ｌｃ　３２２の唯一つの黒辺１部位に挿入すること
によって、プラスミドｐＰＬｃ３２３が得られた。
（３）そして、ｌ＋ＲＡＪ　２５５からのＧＵＳ遺伝子
を包含するＩ’５ＬＩ−Ｉシｃｏ旧断片をｐｒ’ｔ、ｃ
　３２３の中へクローニングすることによって、プラス
ミド［）円、ＣＧ１１ＳＩが得られた（このプラスミド
ではＧＵＳ遺伝子の両端は２つのＮｅｏ　Ｉ切断部位に
より隣接されている）。
（４）このｐｒ’１．ｃ　Ｇｕｓｔにおいては、ＧＵＳ
遺伝子をコードする部分の直ぐｆｌｉＪに咋−つの均匹
１切断部位が位置している。このプラスミドをｌ’ｓＬ
ｌで切断し、そしてＴ４−ポリメラーゼによって４塩基
長の３゛−突出末端を取り除くことによって、まだ２つ
のＮｅｏ　１部位を含むプラスミドｐＰＬＣＧＵＳ　ｄ
ｌ’ｓｔｌ、　ｌが得られた。
ＧＵＳ　ＪＩｌ伝子の押入は以下の５ＴＮＶプラスミド
に対して行なわれた。
（５）　１６０番口に！４ｂｐリンカー挿入物を備えた
完全Ｓ　’Ｉ’　Ｎ　Ｖゲノムを有すルｐｌ’ＬＣ５Ｔ
ＮＶ　Ｎｌ６０．１及び、２（コれらは、それぞれ、１
）Ｉ、プロモーターに対してセンス及びアンチセンス配
向になっている）を用いた。
挿入されたリンカ−は唯一つのＮｅｏ　Ｉ切断部位を包
む。
（（ｉ）ＳＴＮＶゲノムの２８番目におけるリンカ−に
よる変異によって、塩基＾は塩基Ｃによって置換された
が、この置換はコート　タンパク質遺伝子の開始コドン
と重複するＮｃｏｌ切断部位の形成に至る。
Ｓｌ“ＮＶ　Ｎ１（ｉｏへのこの変異の導入によってグ
ラスミ１１円４（シ５ＴＮＶ　Ｎ１６０Ｎｃｏ１．Ｉ及
び、２が得られた。　Ｎｃｏｌで切断し、連結すると、
これらのプラスミドの１３４−Ｉｌｌｌ　４％のＮｅｏ
　Ｉ断片が除去でき、それによってプラスミド１円、Ｃ
５ＴＮＶ　ｄＮｃｏｌ、Ｉ及び、２が得られる。
ＧＵＳ遺伝子の５ＴＮＶへの押入は次のように行なわれ
た。
（１）（用Ｓ遺伝子はｐＰＬＣＧｕｓｔからのＮｅｏ　
Ｉ断片としテｐＰＬＣ５ＴＮＶ　Ｎｌ６０．　ｌ及び、
２（７）中”７　ロー＝ンクサれた。適切な配向で押入
を行ない、５ＴＮＶコートタンパク質の５゛部分を有す
る適切なリーディングフレームの中にＧＵＳ遺伝子が融
合されたプラスミドｐＩ”１．ｃ　５ＴＮＶ　ＧＵＳ、
　ｌ及び、２が得られた。融合タンパク質の翻訳はＧＵ
Ｓ遺伝子の終止コドンの位置で停止し、コート　タンパ
ク質の３゛部分は翻ルくされない、実際に、これらの構
築物はＳ１’ＮＶへのＧＵＳ遺伝子の純粋な押入を意味
する。
（２）Ｇ１１Ｓ遺伝子はｐｌ’Ｌｃ　５ＴＮＶ　（ＩＮ
ＣＯｌ、ｌ及び、２のＮｃｏｌ切断部位の中へｐｌ’Ｌ
ｃ　ＧＵＳ　ｄｐｓｔｌ、ＩからのＮｅｏ　ｌ断ハとし
てクローニングされ、それによってプラスミド１）円、
Ｃ５ＴＮＶ　Ｇ１１Ｓ　ｄＮｃｏｌ、　ｌ及び、２を得
た。挿入は、合成リンカ−からの７つのコドンが後につ
づき、適切なリーディングフレームの中でＧＵＳ遺伝子
の開始コドンに隣接して５ＴＮＶのＡＵＧ開始コドンが
１持されるように行なわれた。翻訳は同様にＧＵＳ遺伝
子の終止コドンの位置で停止し、こうしてアミノ末端に
８個の付加アミノ酸を有するグルクロニダーゼが得られ
る。
プラスミ！’ｐＰＬＣ５ＴＮＶ　ＧＵＳ、　Ｉ　ト、　
２及びｐｌ’Ｌｃ　５ＴＮＶＧＵＳ　ｄＮｃ（１１，１
と、２はＮｓｉ！　（この制限酵素はＧＵＳ遺伝子の真
後ろと、コート　タンパク質遺伝子の末端とを１ツノ断
する）で切断されそして連結された。こうして４［１８
１１ｐのＮ５ｉｌ断片は除去されて、プラスミＦｐｔ１
．Ｃ５ＴＮＶ　ＧＵＳ　ｄＮｓｉｌ、ｌと、２及びＩ）
ＰＬＣ５ＴＧＵＳ、　１と、２がそれぞれ得られた。最
後の２つのプラスミド１＋ＰＬＣＳ１’ＧＩＪＳ、　ｌ
及び、２は、コート　タンパク質遺伝子が（用Ｓ遺伝子
によって完全に置換されている構造を包含する。
Ｉ）円、Ｃプラスミドから出発して、５ＴＮＶ　ＧＵＳ
、！ｌ：５ＴＧＵＳ（１１築物は植物べ’）　夕ｐｒ’
ｃＶ　５２０（７）中（７）ｐＴＩ’ｌ！’プロモータ
ーの後ろにＩｌａｍｌｌｌ−≦ｔｌｌ断片としてトラン
スクローニング（ｔｒａｎｓｃｌｏｎｅ）された。その
過程でプロモーターに対する位置が逆転して、たとえば
プラスミド１＋ｌ”ＣＶ　５ＴＧＵＳ、２がｐＩ”Ｌｃ
　５ＴＧＵＳ、　Ｉ　カラ形成される。
種々のＳ　’Ｉ’ＮシーＧＬＪＳ構築物を用いたササゲ
のプラスミド感染により、植物における発現を試験した
。
その目的のために、プラスミドｐｒ’Ｌｃ　５ＴＮＶ　
ＧＵＳ、　１と、２及び１＋Ｉ’ＣＶ　５ＴＮＶ　ＧＵ
Ｓ、　Ｉ　ト、２を用いた。ササゲの葉をプラスミドと
ヘルパーウィルスで感染させて、接種の３［１後に摘み
取った。摘みたでの菓を２鯛間のＸ−Ｇｌｕｃ（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルーβ−Ｄ−グルグロ
ン酸）と４０１１Ｍのリン酸塩４１衝液からなる溶液（
ｐＨ７，４，３７℃）中で一夜培養した。
次いで葉をグルタルアルデヒド中で６時間固定してから
３０％から９５％の一連のエタノールで脱色した。
Ｘ−Ｇｂ＋ｃがグルクロニダーゼで変化して不溶性の青
色沈殿物が生成してくる。
上記の４種類のプラスミドで４種類の独立した感染試験
系列をササゲについて行なったところ、このうち２つの
場合で、培養された葉に局部的な青色反応が観察された
。ｐＰＬｃ　５ＴＮＶ　ＧＵＳ、Ｉの場合では病斑局部
に青色の緑が観察された。固定化した試料を顕微鏡で調
べたところ、病斑の端に位置する植物細胞に染色反応が
集中していることが１１ラカニなッｔ：、　ｐｒ”Ｌｃ
　５ＴＮＶ　ＧＵＳ、２（７）場合ハ０．３ｍ（７）染
色の形で反応が観察された。植物細胞は拭質培養中に細
菌汚染からの感染による損傷がひどすぎるため、ｉｌＩ
′ｌ微鏡検査によっても反応が１１Ｉ胞内で生じたもの
かどうかを明らかにすることはできなかった。しかしな
がら、固定化・脱色・包埋・切断を通じて青色はずっと
残るので、反応は植物固有のものであることがかなり高
い確実性で推測できる。
サラニ、１−プラスミドｐＰｃＶ　５ＴＮＶ　ＧＵＳ、
ｌ　ト、　２を使って、タバコの形質転換も行なった。
両構築物について形質転換体を得た。成長した形質転換
体の’ｌ’ＮＶ感染Ｏ：ｊ後にＧ［ＪＳ検査を行なった
結果は予想通りのものであった。
実施例３ タバコ壊死ウィルスのレプリカーゼ遺伝ｒの分屋 出発材料として用いられたのはサテライト　タバコ壊死
ウィ／Ｌ、ス（ｓ’ｒＮＶ）ＳＶ−１（ＳＶ−＾５ｅｒ
ｏｔｙｐｃ）を増殖することができるタバコ壊死ウィル
ス（ＴＮＶ）カサニス株＾°血清型＾（Ｋａｓｓａｎｉ
ｓ　５Ｌｒａｉｎ　Ａ　ａｎｄｓｅｒｏｔｙｐａ＾）で
ある、この株はオランタ国、バーンの植物病理学研究所
のヴイエリンガブランッ傅士（＋）ｒ、　Ｗｉｏｒｉｎ
ｇａ　［１ｒａｎＬｓ、　ＰｂｙＬｏｐｌ＋ａＬｂｏｌ
ｏｇｉＣ１、ａｂｏｒ＋＋Ｌ、ｏｒｙ、　Ｂａａｒｏ、
　　ｔｂｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より入手した。
Ｓ’ｒＮＶを含んでいないＴＮＶはＶａｎ　［Ｅ＋ｕ＊
ｅｌｏらがＶｉｒｏｌｏｇｙ　１５７．４８０−４８７
（１９８７）に記載している方法で得た。
１’ＮＶウィルスはインゲンマメ科植物の葉（■２凹型
…匪国９、ササゲ）中で、該ウィルスとカーボランダム
による感染によって増殖した。ゲノムＲＮＡは精製した
ＴＮＶ粒子から調製し、ランダムプライマーを用いて＾
削進転写酵素（Ｉｌｏｃｂｒｉｎｇｃｒ社）でｃｌ）Ｎ
Ａに転換された。第２鎖合成はＥ、ｃｏｌｉ　Ｉ）Ｎ＾
ポリメラーゼＩ　（にｌｃｎｏｗ断片）とＲＮ八へ−ゼ
（Ｉｌｎ＋ｂｒｉｎｇｃｒ社）を用いてＧｕｂｌｅｒと
Ｉｌｏｒｒｍａｎ（Ｇｅｎｅ２５、２（ｉ３−２６０．
１９８３）の方法で行なった。次いで１４１）Ｎ＾ポリ
メラーゼを加えて末端を平滑にした。
Ｓ＋＋；ｔｌで切断すると同時にホスファターゼで両端
を処理したプラスミドｐＳＰ６４　（ｌ”ｒｏｍｅｇａ
社）の中にクロニングした後に、りａ−ンはＥ、ｃｏＩ
ｉ　ＭＣＩ（１６１に形質転換により導入された。そし
てコロニーを断片化された１″Ｐ　ｄｓ　ＴＮＶ　ＲＮ
Ａを用いたコロニーハイブリダイズ法で試験した。
ＴＮＶに感染させたインゲンマメの葉から調製したサブ
ゲノム５ｓＲＮ＾は選択したＴＮＶコロニーとの）−ザ
ンハイプリダイズのために用いた。これら勺ブゲノムＲ
ＮＡ５の長さは各々１．２５ｋｂ、１，５ｋｂ及び３．
８ｋｂであった。アガロースゲルを用いての電気泳動の
後、サブゲノムＩｉＮ＾はナイロン製の膜フイルタ−（
Ｉ’ａｌｌ　１ｌｉｏｄｙｎｅ社）に固定化し、”Ｐで
ラベルしたクローンＤＮＡとのハイブリダイズを行なっ
た。２つの３′サブゲノムＴＮＶ　ｌ？Ｎ＾とハイブリ
ダイズし、ＴＮＶ　１１ＮＡ　（７）＋９００７’ｌｌ
　ラ２３００番目ノ間ｉ、−位ａする断片を含むクロー
ン（ｐｓｌ’ＴＮＶＩ２７）が選ばれた。
制限酵素を用いての分析により、この１９００から２：
ｉ００番［１の間にある断片はＴＮＶ　ＲＮＡの５°末
端に位置するＮプレカーゼ遺伝子のｃＤＮ＾合成川のプ
用イマーとして使用できる内部Ｈｐ３１１断片を含んで
いることが分かった。しかし、予備的なｃＤＮ＾クロー
ニングのためには、ｐｓｌｌＴＮＶ　＋　２１）の配列
、すなわち５゛に１０１丁に゛ｒに＾Ｇ′ｒＡＴＣ＾３
′山来の合成オリゴ、ｉ由来７Ｌ／オチドが用いられた
。この配列はゲノムＲＮＡに対して相補的である。
ｃｌ）Ｎ＾の合成は上記の方法で行なったが、その際、
開＾の複製を容易にするためにメチル水銀ヒドロキシド
を用いた（ＬｅｎｓＬｒａら、Ｇｅｎ、＾ｎａ１．　Ｔ
ｅｃｌ＋ｒ＋。
５、５７−６１．１９８８を参照）。コノヨうニシテ、
ＴＮＶ　（７）Ｎプレカーゼ遺伝子の領域に対応する２
、　２ｋｂのストランドが得られた。ｐＳＰ６４の中へ
クローニングした後に、　１５００個のクローンから、
５Ｐ（ｉプロモーターに対してセンス配向で２．２ｋｂ
断片を含む３個のクローンが選ばれた。
５ｌ）６ボ’、１メ−７−ゼを用い、’７　Ｄ　−：／
ｐｓＰ１’ＮＶ９４を出発材料としてＩ？ＮＡを得たが
、このＲＮＡは、小麦麦芽の抽出物の中で、とりわけ、
７３ｋｌ）（ＴＮＶＮブレカーゼの推定分子量）タンパ
ク質の合成に至る。
この実験においては、″Ｓメチオニンをタンパク質の合
成過程で使用し、７３ｋＤタンパク質は５ＤＳＰ八ＧＥ
を用いての電気泳動及びオ゛−トラジオグラフィーによ
って検出された。
ｐｓＩ’ＴＮＶ９４　（７）配列は、断片をｐＵｃＩ８
プラスミドの中にクローニングした後に、Ｓａｎｇｅｒ
らのジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ　ａｔ　ａｌ、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。
ＩＪ、Ｓ、Ａ、　７４．５４６３−５４６７、＋９７７
）によって決定した。
ヌクレオチド配列を決定する為の方式を第３図に、そし
て配列を第４図に示す。
第３図は、　ＴＮＶＮプレカーゼ遺伝子の領域の制限地
図、および配列を決めるために用いた断片を示す概略図
である。断片は、ｐＵｃ＋８中へクローニングの後、サ
ンガーのジデオキシ法によって両方向へ、即ち２回、分
析してヌクレオチド配列を決めた。
第４１ＷＩ（ａ　）　〜４　（ｅ　）図は、　ＴＮＶの
レプリカーゼ逍伝ｆ・の完全配列を示す。アミノ酸配列
はＣａｒＭＶ（Ｃａｒｎｎｔｉｏｎ　Ｍｏｔｔｌｅ　Ｖ
ｉｒｕｓ）およびｒｕＣＶ　（ＴｕｒｎｉｐＣｒｉｎｋ
ｌｏＶｉｒｕｓ）のそれぞれのＮプレカーゼ遺伝子との
相同性を示す。６５６番口の位置にあるアンバー終Ｊｌ
コドンは天然のゲノム中に存在する。更なる用途のため
に、この終止コドンは、アミノ酸゛ｒｙｒをコードする
１°ＡＴで置換した。開始コドンおよび終止コドンはそ
れぞれムおよびマで示す。アミノ酸配列はヌクレオチド
位Ｗ１５０番目から始まり、２２２１番１１で終る。
ｐｓｌ”ｒＮＶＩ２７中の断片はＮプレカーゼ遺伝子の
３゛末端を含んでいるようである。ＴＮＶのＮプレカー
ゼ遺伝子の完全なりローンを得るために、ｐｓＩ’ＴＮ
Ｖ９４とｐｓｉ”ｒＮＶＩ２７（７）唯一ツノＸｍａ１
部位及びポリリンカーｐｓＰ６’ｌの唯一つのＳａｃ　
１部位を用いた。ｐｓＩ’■ＮＶＩ２７の小さなＸｍａ
ｌ−３ａｃｌ断片を、Ｘｍａ　Ｉ末端及びＳａｃ　１末
端を有する大きなｐｓＰＴＮＶ９４断片中に連結してｐ
ＳＰ１’ＮＶｒａｐ−ｌを得た。コノクローンは２２３
Ｇ塩基長であり、５０番目の塩基から２２２１番１］の
塩基の間（一番１１の塩基に対しての絶対的なリーディ
ングフレーム：２）の間に見られる最も長いオーブンリ
ーディングフレームで、６５６番口に内ｆｌｉ＋終止コ
ドンを持つ。ｕ？Ｊ＜及び６５６番口の塩基と６５８番
口の塩基の間にあるサプレッサーＬＲＮ＾を使用した後
、このオープンリーディングフレームは７２４個のアミ
ノ酸からなるＮプレカーゼをコードする。後の使用のた
めに、内部終止コドンＴＡＧは特異的突然変異誘発によ
って、Ｔｙｒ（チロシン）をコードするコドンＴ＾■に
変化させた。
プラスミドｐＳＰ１’ＮＶｒｅｐ−Ｉを含むＥ、　ｃｏ
ｌｉ　ＭＣ１０６１株（ｐＳＩ’ＴＮＶｒｅｐ−１）は
１９９０年７月２６日にオランダ国、ＢａａｒｎのＣｅ
ｎｔｒａａｌ　　［！ｕｒｅａｕ　　ｖｏｏｒ　　Ｓｃ
ｌ＋ｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｃｎ（ＣＢＳ）にＣｌ５Ｓ
３３．６ｆ）Ｏの番号で寄託された。
実施例４ １　、Ｓｉ’ＮＶコート　タンパク質遺伝子の一部がク
ロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ遺
伝子と融合しているＤＮＡ配列の構築ニブラスミドｐＳ
ＰＳＴＮＶ　Ｃ＾゛１゛１およびプラスミドｐｓＩ’５
ＴＮＶ　ＣＡＴ　２の構築を第５図に図式的に示す。
即ち、次の手順で構築を行なった。
プラスミドｐＳＴＮＶ　Ｎｌり８はＶａｎ　Ｅｍｍｅｌ
ｏらによって記載されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５
７．４８０−４８７．１９８７を参照）、このプラスミ
ドは５ＴＮＶのコート　タンパク質遺伝子のＥｃｏＲＶ
部位に＋４ｂｐ　Ｎｃｏｌリンカ−を含んでいる。Ｎｃ
ｏｌにより切断し、末端をＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼで
充填・平滑化し、さらに再連結することによって下記の
リーディングフレームを再生した： ＾５ｐ（５（ｉ）／Ｓｅｒ−ＭｅＬ−１１ｉｓ−Ｇｌｙ
−＾５ｎ−３ｅｒ／１ｌｅ（５７）得られたプラスミド
は、インゲンマメ （Ｐｂａｓｏｏｌｕｓ）　（對ｌ四７、ササゲ（ｃｏｗ
ｐｅａ）　］の葉にＴＮＶと共に感染させると感染性の
５ＴＮＶ粒子の形成を生じる。このプラスミドをｐＳＴ
ＮＶ　Ｎ２Ｏ２ト名付けた。　Ｐｓｔｌ断片（ＳＴＮＶ
　ｃＤＮＡＮ２０２を含む）はｐＳＰ６５（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）へクローン化挿入（Ｌｒａｎｓｃｌｏｎｅ）　Ｌ
／た。得られたプラスミドをｐＳＰＳＴＮＶ　Ｎ２Ｏ２
と名付けた（第５図参照）。ｐ［１Ｒ３２５よりクロラ
ムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子
（ＣＡＴ遺伝子）をｎ咀１断片として得て、その末端を
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ（にｌｅｎｏｗ断片
）で平滑化した。ｐｓｌ’５ＴＮＶ　Ｎ２Ｏ２をＮ５ｊ
ｌで切断してから、末端を平漬にした。次に珈１断片を
、履１で切断したｐＳＰＳＴＮＶ　Ｎ２Ｏ２プラスミド
にクローニングした。
ＳＰ６プロモーターに対してセンス配向のものを１１ｓ
Ｐｓ　ＴＮＶ　ＣＡＴ　Ｌと名付け、ナンセンス配向の
ものをｐＳＰＳ　ＴＮＶ　ＣＡＴ　２と名付けた（第５
図参照）。
２、ＴＮＶウィルスを用いた、インゲンマメ（１’ｂａ
Ｓｅｏｌｕｓ）　（９凪堕幻刀丑垣堕）の葉におけるキ
メラＣ＾］遺伝了の発現： ササゲ（ｃｏｗｐｅａ）の葉を゛ｒＮＶ−３ＴＮＶプラ
スミド又！、ｔ’ｌ’ＮＶ−ｐＳＩ’５ＴＮＶ　ＣＡＴ
　ｌノイずれかによッテ感染させた。接種から４０時間
後にこれらの葉を１１１１Ｓバッフｙ−（０，１％　Ｔ
ｒｊｔｏｎ　ｘ　１００）で抽出し、抽出液を抗Ｓ１’
ＮＶコート　タンパク質血清で処理した。さらに、タン
パク質Ａ−セファロースで免疫沈降を行なった後、洗浄
を繰り返した。
こうして得た錯体につきクロラムフェニコールアセチル
−トランスフェラーゼの活性を１−１０−アセチル−コ
エンチーム＾とクロラムフェニコールを用い、Ｇｏｒｕ
ｘａｎら（Ｍｏｌｅｃ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｒ２Ｏ３，２，
１０４４−１０８１、１０８２）及びＤｃＢｌｏｃｋら
（ＥＭＩ３０　Ｊ、３．１６８１−１６８０、７０８４
）の方法に従って測定した。
ＣＡＴ活性を示したツバ丁ＮＶ−ｐｓＩ’ｓＴＮシＣＡ
ＴＩテ感染させた葉から得て、５ＴＮＶ抗血清で処理し
たものだけだった。
３．５ＴＮＶ−（１：ＡＴ　１１ＮＡ（７ｌ増Ｍ：ササ
ゲの葉？、：ＴＮＶ−ｐＳＰＳＴＮＶ　ＣＡＴ　Ｉ　Ｄ
ＮＡを接種して、２日後に葉を摘んで核酸画分を単離し
た。ＤＮＡをＲＮＡａｓｅ非含有ＤＮＡａｓｅで除去し
、得られたｒ（Ｎ　Ａを、ＣＡＴ特異的で°°Ｐで標課
したＤＮＡ（ｐＢＲ３２５山来のＴ！！Ｊ１１画分）を
用い、ノーサンハイブリダイズ法で分析した。５ｓＲＮ
Ａ画分とｄｓＲＮ＾両分の両者において、約１７５０個
のヌクレオチドのバンドが検出された。このことは明ら
かに、ｐＳＰＳＴＮＶＣＡＴ　ＩブラスミＦＤＮＡがＴ
ＮＶＧ：　、Ｊｌ、　ッ”Ｃ−重鎖５ＴＮＶＣ＾１’　
１１ＮＡ及び二重鎖５ＴＮＶ　ＣＡＴ　Ｉ　ＲＮＡへ変
換されることを示している。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドＩ）ＰＣＶ５２０の地図を示す。第
２図はプラスミドｐＭｒ’９０１ζにの地図である。第
３図は、　ＴＮＶＮプレカーゼ遺伝子の領域の制限地図
、および配列を決めるために用いた断片を示す概略図で
ある。第４図（ａ）　〜４（ｅ）図は、ＴＮＢのＮプレ
カーゼ遺伝子の完全配列を示す。第５図は、プ５　スミ
トｌ１ｓＩ’５ＴＮＶ　ＣＡＴ　ｌおよびプラスミドｐ
ｓＰｓＴＮＶＣＡＴ　２の構築を図式的に示したもので
ある（この構築の詳細は実施例４に記載されている）。 特訂出願人 アヴ工ヴエ クロヴイス ソルヴエイ アノニム エフ。ブイ。 マトンエフ。ブイ。 ニジ−３，ソシェテ 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５ 手続補正書 （指令） 平成３年７月 ３日 １゜ 事件の表示 平成２年特許願第２６６１７３号 ２゜ 発明の名称 ＲＮＡ型ウィルス由来の配列を包含する組換えＤＮＡお
よびそれを用いる遺伝子操作方法３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　ベルギー国、ビー−３０００リューベン、ミン
ダーブローダーストラート　６ 名称　アヴ工ヴエエヌ、ブイ。 代表者　　イーエル、エル、ファンデンヘーフエル 国籍　ベルギー国 ５、補正命令の日付 平成３年１月２２日（発送口） 補正の対象 （１）明細書の「図面の簡単な説明」の欄（２）図面 ７゜ 補正の内容 （１）明細書の「図面の簡単な説明」の欄の第１０２頁
、下から第５行目「第４図（ａ）〜４（ｅ）図」を［第
４（１）図〜第４（８）図Ｊと補正する。 （２）図面は別紙の通り。（多３１ｆｆｉ−４ダｌ錨）
但し内容において変更はありません。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、１２〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向反
    復ヌクレオチド配列を包含する組換えＤＮＡにして、該
    ２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間に、ウィルスＲ
    ＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して複製されるＲＮＡ
    型ウィルス由来のヌクレオチド配列を少なくとも１つ有
    し、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列は少なくとも複製の
    ためのシス因子を有するがウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリ
    メラーゼをコードする遺伝子およびウィルスコートタン
    パク質をコードする遺伝子は含まないことを特徴とする
    組換えＤＮＡ。 ２、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、複製のためのシ
    ス因子および輸送のためのシス因子を包含することを特
    徴とする請求項１の組換えＤＮＡ。 ３、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、コートタンパク
    質に充填するためのシス因子を包含する請求項１または
    ２の組換えＤＮＡ。 ４、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、翻訳のためシス
    因子を包含する請求項１〜３のいずれかの組換えＤＮＡ
    。 ５、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間に、ＲＮ
    Ａ型ウィルス由来の配列に加え、ウィルスＲＮＡまたは
    ｍＲＮＡを切断することのできるリボチームをコードす
    るヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する請求項１〜
    ４のいずれかの組換えＤＮＡ。 ６、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間に、ＲＮ
    Ａ型ウィルス由来の配列に加え、１つまたは複数のＲＮ
    Ａをコードする非ウィルスヌクレオチド配列を少なくと
    も１つ有する請求項１の組換えＤＮＡ。 ７、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、複製のためのシ
    ス因子及び翻訳のためのシス因子を少なくとも包含し、
    更に、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間に、Ｒ
    ＮＡ型ウィルス由来の配列に加え、１つまたは複数のタ
    ンパク質／ペプチドをコードする非ウィルスヌクレオチ
    ド配列を有する請求項６の組換えＤＮＡ。 ８、宿主細胞を形質転換して宿主内での転写を可能にす
    るための発現カセットに組込まれ、パンハンドル構造を
    有するＲＮＡ分子を形成するようになっている請求項１
    〜７のいずれかの組換えＤＮＡ。 ９、遺伝子工学により請求項８の組換えＤＮＡを導入し
    た真核または原核細胞または生物。 １０、更に、誘導的または組織特異的発現カセット中に
    、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ／
    ＲＮＡポリメラーゼ構築体の遺伝情報を組込んだ組換え
    ＤＮＡを遺伝子工学により導入した請求項９の真核また
    は原核細胞または生物。 １１、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して
    複製されるＲＮＡ型ウィルスから、特に植物、酵母およ
    び真菌のような真核生物を遺伝子操作によって保護する
    方法にして、該生物のゲノムの中に、活性発現カセット
    中に１２〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向反
    復ヌクレオチド配列を包含する組換えＤＮＡを該生物の
    ゲノムに組込むことよりなり、該２つの逆方向反復ヌク
    レオチド配列の間に、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラ
    ーゼに依存して複製されるＲＮＡ型ウィルス由来のヌク
    レオチド配列を少なくとも１つ有し、該ＲＮＡ型ウィル
    ス由来の配列は少なくとも複製のためのシス因子を有す
    るがウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコードする
    遺伝子およびウィルスコートタンパク質をコードする遺
    伝子は含まないことを特徴とする方法。 １２、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、複製のための
    シス因子および輸送のためのシス因子を包含することを
    特徴とする請求項１１の方法。 １３、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、コートタンパ
    ク質に充填するためのシス因子を包含する請求項１１ま
    たは１２の方法。 １４、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列が、翻訳のためシ
    ス因子を包含する請求項１１〜１３のいずれかの方法。 １５、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間に、Ｒ
    ＮＡ型ウィルス由来の配列に加え、ウィルスＲＮＡまた
    はｍＲＮＡを切断することのできるリボチームをコード
    するヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する請求項１
    １〜１４のいずれかの方法。 １６、１種または複数種のタンパク質／ペプチドを誘導
    的手法で製造する方法にして、 原核生物または真核生物、あるいは原核生物または真核
    生物の細胞を培養することよりなり、該生物には、１２
    〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向反復ヌクレ
    オチド配列を活性発現カセット中に包含する組換えＤＮ
    Ａが遺伝子工学によって組込まれており、該２つの逆方
    向反復ヌクレオチド配列の間には、ウィルスＲＮＡ／Ｒ
    ＮＡポリメラーゼに依存して複製されるＲＮＡ型ウィル
    ス由来のヌクレオチド配列を少なくとも１つ有し、該Ｒ
    ＮＡ型ウィルス由来の配列は少なくとも複製のためのシ
    ス因子と翻訳のためのシス因子を有するがウィルスＲＮ
    Ａ／ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子・およびウ
    ィルスコートタンパク質をコードする遺伝子は含まず、
    更に、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間には、
    ＲＮＡ型ウィルス由来の配列に加えて、１種または複数
    種のタンパク質／ペプチドをコードする非ウィルスヌク
    レオチド配列をセンス配向またはアンチセンス配向で有
    しており；そして 該生物またはその細胞を該ウィルスで感染させることを
    包含する方法。 １７、１種または複数種のタンパク質／ペプチドを誘導
    的または組織特異的手法で製造する方法にして、 真核生物を培養することよりなり、該真核生物のゲノム
    には、１２〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向
    反復ヌクレオチド配列を活性発現カセット中に包含する
    組換えＤＮＡが遺伝子工学によって組込まれており、該
    ２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間には、ウィルス
    ＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して複製されるＲＮ
    Ａ型ウィルス由来のヌクレオチド配列を少なくとも１つ
    有し、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列は少なくとも複製
    のためのシス因子と翻訳のためのシス因子を有するがウ
    ィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子
    およびウィルスコートタンパク質をコードする遺伝子は
    含まず、更に、該２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の
    間には、ＲＮＡ型ウィルスに由来する配列に加えて、１
    種または複数種のタンパク質／ペプチドをコードする非
    ウィルスヌクレオチド配列をセンス配向またはアンチセ
    ンス配向で有しており、かつ該真核生物のゲノムには、
    更に、誘導的または組織特異的発現カセット中にウィル
    スＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ／ＲＮＡポ
    リメラーゼ構築体の遺伝情報を組込んだ組換えＤＮＡが
    組込まれていることを特徴とする方法。 １８、１種または複数種の、リボチームのようなＲＮＡ
    、アンチセンスＲＮＡまたは二重鎖ＲＮＡを誘導的手法
    で製造する方法にして、 原核生物または真核生物、あるいは原核生物または真核
    生物の細胞を培養することよりなり、該生物のゲノムに
    は、１２〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向反
    復ヌクレオチド配列を活性発現カセット中に包含する組
    換えＤＮＡが遺伝子工学によって組込まれており、該２
    つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間には、ウィルスＲ
    ＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して複製されるＲＮＡ
    型ウィルス由来のヌクレオチド配列を少なくとも１つ有
    し、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列は少なくとも複製の
    ためのシス因子を有するがウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリ
    メラーゼをコードする遺伝子およびウィルスコートタン
    パク質をコードする遺伝子は含まず、更に、該２つの逆
    方向反復ヌクレオチド配列の間には、ＲＮＡ型ウィルス
    由来の配列に加えて、１種または複数種のタンパク質／
    ペプチドをコードする非ウィルスヌクレオチド配列をセ
    ンス配向またはアンチセンス配向で有しており；そして 該生物またはその細胞を該ウィルスで感染させることを
    包含する方法。 １９、１種または複数種の、リボチームのようなＲＮＡ
    、アンチセンスＲＮＡまたは二重鎖ＲＮＡを誘導的また
    は組織特異的手法で製造する方法にして、 真核生物を培養することよりなり、該真核生物のゲノム
    には、１２〜２５０塩基対の長さを有する２つの逆方向
    反復ヌクレオチド配列を活性発現カセット中に包含する
    組換えＤＮＡが遺伝子工学によって組込まれており、該
    ２つの逆方向反復ヌクレオチド配列の間には、ウィルス
    ＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに依存して複製されるＲＮ
    Ａ型ウィルス由来のヌクレオチド配列を少なくとも１つ
    有し、該ＲＮＡ型ウィルス由来の配列は少なくとも複製
    のためのシス因子を有するがウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポ
    リメラーゼをコードする遺伝子およびウィルスコートタ
    ンパク質をコードする遺伝子は含まず、更に、該２つの
    逆方向反復ヌクレオチド配列の間には、ＲＮＡ型ウィル
    ス由来の配列に加えて、１種または複数種のタンパク質
    ／ペプチドをコードする非ウィルスヌクレオチド配列を
    センス配向またはアンチセンス配向で有しており、かつ
    該真核生物のゲノムには、更に、誘導的または組織特異
    的発現カセット中にウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラー
    ゼまたはＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ構築体の遺伝情報
    を組込んだ組換えＤＮＡが組込まれていることを特徴と
    する方法。 ２０、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮ
    Ａ／ＲＮＡポリメラーゼ構築体をコードするヌクレオチ
    ド配列を包含する組換えＤＮＡ。 ２１、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコードす
    る第４図に示すヌクレオチド配列の１部を包含するか、
    あるいは、それに由来する構築体であって例えば第４図
    に用いられた番号で６５６−６５８番の配列ＴＡＧの代
    りに配列ＴＡＴを有する置換変異体または第４図に示す
    配列の一部がウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをコ
    ードするもう１つの遺伝子対応部分によって置換されて
    いる置換変異体のような構築体を包含する請求項２０の
    組換えＤＮＡ。 ２２、ウィルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮ
    Ａ／ＲＮＡポリメラーゼ構築体をコードするヌクレオチ
    ド配列が誘導的又は組織特異的発現カセットに存在する
    請求項２０または２１の組換えＤＮＡ。
JP2266173A 1989-10-03 1990-10-03 Ｒｎａ型ウイルス由来の配列を包含する組換えｄｎａおよびそれを用いる遺伝子操作方法 Pending JPH03280883A (ja)

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NL8902452A NL8902452A (nl) 1989-10-03 1989-10-03 Genetische manipulaties met recombinant dna, dat rna-virus-specifieke sequenties omvat.
NL9001711 1990-07-27
NL9001711A NL9001711A (nl) 1989-10-03 1990-07-27 Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat.

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