JPH01281094A - 酵素炭素‐炭素結合形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素炭素−炭素結合の形成に関し、更に詳細に
はＡＴＰ　（アデノシン三リン酸）を必要とすることな
く温和な条件下で有機分子における酵素によって触媒さ
れる炭素−炭素結合の形成法に関する。本発明による炭
素−炭素結合の形成によって２個の分子を１個の大きな
分子へ生体内変化（ｂｉｏｔｒａｎｓｆ’ｏｒｍａｔｉ
ｏｎ）することによって、立体特異的生成物を得ること
ができる。

シアン化物は多数の微生物および高等植物による二次的
代謝物として生成する［例えば、クノウレス・シー・ジ
エイ（Ｋｎｏｖｌｅｓ、　Ｃ，Ｊ、）およびブンチ・エ
イ・ダブリュ（Ｂｕｎｃｈ、＾Ｊ、）　、Ａｄｖａｎｃ
ｅｓＩｎ　Ｍｌｃｒｏｂｉａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
　、　２７巻、（１９８６年）、７３頁を参照されたい
コ。次いで、シアン化物は無毒化されて多数の生成物と
なる。細菌および植物による無毒化の一経路は、β−シ
アノ−し−アラニンの生成である。シアン化物の生体内
変化ではＬ−システインが消費されて、Ｈ２Ｓを放出す
る。

Ｌ−システイン＋ＨＣＮ→ β−シアノ−Ｌ−アラニン＋Ｈ２Ｓ この生体内変化を触媒する酵素β−シアノ−Ｌ−アラニ
ンシンターゼ［Ｅ、Ｃ，４，４，１，９］は、ピリドキ
サールリン酸を結合した酵素であり、β−置換によって
作用する。β−シアノ−Ｌ−アラニンシンターゼはシア
ン生成植物によって生成されることが知られている［例
えば、ヘンドリクソン・エイチ・アール（ｌｌｅｎｄｒ
ｉｃｋｓｏｎ、　Ｈ，Ｒ，）およびコーン・イー・イー
（Ｃｏｎｎ、　ｌＥ、Ｅ、）、Ｊ、　Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅ
ｔ２４４巻、（１９６９年）　、２６３２頁を参照され
たい〕。

シアン化物の生成とその後のβ−シアノ−し−アラニン
への生体内転換は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖ
ｌｏｌａｃｃｕ−で広汎に研究されている［例えば、マ
カダム・エイ・エム（Ｍａｃａｄａｓ、　Ａ、Ｍ、）お
よびクノウレス・シーージエイ（Ｋｎｏｖｌｃｓ、　Ｃ
，Ｊ、）、Ｂｌｏｃｈｌｍｉｃａ　ａｔ　Ｂｌｏｐｈｙ
ｓｌｃａ　Ａｃｔａ　％　７８６巻、（１９８４年）、
６８頁を参照されたい］。シアン化物は、この細菌中で
グリシンから二次的代謝物として生成される。シアン化
物形成の期間中または後に、この細菌によって大量に形
成される酵素β−シアノーＬ−アラニンシンターゼによ
ってβ−シアノ−し−アラニンへの転換が起こる（シア
ン発生）。Ｃ，ｖｆｏｌａｃｅｕｍからの酵素はかなり
精製されている（前記引用文献）。最も興味あることは
、Ｃ，ｖｉｏｌａｃｅｕ−のβ−シアノ−Ｌ−アラニン
シンターゼは、完全には基譬特異性ではないことである
。アミノ基質であるし一システィンは、〇−アセチルー
Ｌ−セリンにより或いは極めて低活性ではあるがＬ−セ
リンで置換することができる。

Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン＋ＨＣＮ→ β−シアノ−し一アラニン＋アセテートＬ−セリン＋Ｈ
ＣＮ→ β−シアノ−Ｌ−アラニン＋Ｈ２０ また、シアン化物補基質は炭素−硫黄結合を含む硫黄置
換生成物を生成する多数の３硫化合物によって置換する
こともできる。シアン化物補基質を容易に置換すること
ができる３硫化合物には、硫化水素、エタンチオール、
メルカプトエタノール、シスタミンおよびジチオスレイ
トールがある。

意外なことには、シアン化物または硫黄補基質は親核性
炭素酸または中性有機化合物によって置換することがで
きることが見出だされた。注目すべきことには、本発明
の方法は炭素−炭素結合の生成による炭素鎖の伸長によ
って２個の小さな有機分子から大きな有機分子を生成す
る。

本発明は、２個の小さな分子の間に炭素−炭素結合を形
成することによる有機化合物の製造法であって、β−シ
アノ−アラニンシンターゼおよび／またはシスティンシ
ンターゼ活性を有してＡＴＰを必要とすることなく反応
を触媒するピリドキサールリン酸を結合した酵素を用い
ることを特徴とする方法を提供する。

一般的には、本発明の方法はβ−置換反応である。本発
明によれば、植物または微生物源から得られるβ−シア
ノ−Ｌ−アラニンシンターゼおよび／または動物、植物
または微生物源から得られるシスティンシンターゼが用
いられる。Ｃ，ｖｌｏ−Ｉ　ａｃｅｕｍのβ−シアノ−
Ｌ−アラニンシンターゼおよび／またはＩＥ、　ｃｏｌ
ｔのシスティンシンターゼを用いるのが好ましい。

例えば、本発明の方法の基質はＬ−システイン、Ｌ−セ
リンまたはＯ−アセチル−し−セリンであってもよく、
共基質は親核性炭素酸または中性炭素種でもよい。本発
明の一つの好ましい態様では、Ｃ，ＶＩＯｌａｅＯｕｌ
から得られるβ−シアノ−Ｌ−アラニンシンターゼを用
いてＬ−システインまたはＯ−アセチル−し−セリンと
ニトロメタン、マロノニＩ・リル、メチルシアノアセテ
ートまたはインドールとの結合を触媒する。本発明のも
う一つの好ましい態様では、Ｅ、　ｃｏｌｌから得られ
るシスティンシンターゼを用いてＬ−システインまたは
〇−アセチルーＬ−セリンとマロノニトリル、インドー
ルまたは５，５−ジメチルシクロヘキサン−１゜３−ジ
オン（ジメドン）との結合を触媒する。

本発明の方法はＡＴＰを必要とせず、立体特異的合成も
可能である。例えば、酵素β−シアノ−Ｌ−アラニンシ
ンターゼはＬ−システインまたは他のし一アミノ酸との
反応を触媒するが対応するＤ−異性体との反応は触媒し
ないので、生成する生成物はＬ−配置の立体特異的アミ
ノ酸である。

また、当業者には理解されるように、本発明に一般的に
は固ａの立体特異性はアミノ酸基質のラセミ混合物の分
割に関して可能性を開く。

上記のように、Ｃ，ｖｌｏｌａｃｅｕｍから得られるβ
−シアノ−Ｌ−アラニンシンターゼ活性を示す酵素が本
発明の目的に好ましい。もう一つのβ−置換ビリドキサ
ールリン酸を結合した酵素であるシスティンシンターゼ
［Ｅ、Ｃ，４，２，９９，８］で分って、その主な活性
が Ｏ−アセチル−し−セリン＋Ｈ２Ｓ→ Ｌ−システイン＋アセテート であるものは、幾らかのβ−シアノ−Ｌ−アラニンシン
ターゼ活性も示すし例えば、ダンニル・ビー・エム（Ｄ
ｕｎ口目＋、　Ｐ、Ｍ、）およびフオウデン・エル（Ｐ
ｏｗｄｅｎ、　Ｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ、　２０８巻、（
１９６５年）１２０６頁；カストリック・ビー・エイ（
Ｃａｓｔｒｌｃ、　Ｐ、Ａ、）およびコーン・イー・イ
ー（Ｃｏｎｎ、　Ｅ、Ｅ、）、Ｂａｃｔｅｒｌｏｌｏｇ
ｙ、　１０８巻（１９７１年）］］３２頁；ヤナセーｘ
イチＹａｎａｓｅ、　Ｉｌ、）ら、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ　ａｎｄ　１３１ｏ１ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｓｌ
ｓｔｒｙ　ｓ　４７巻（１９８２年）２９２５頁を参照
されたい］。

Ｌ−システイン＋ＨＣＮ→ β−シアノ−し−アラニン＋Ｈ２Ｓ 意外なことには、補基質（Ｈ２Ｓ）のアルキルチオール
による置換［クノウレス（Ｋｎｏｖｌｅｓ）およびブン
チ（Ｂｕｎｃｈ）　、前記引用文献］と共に、親核性炭
素酸または中性種はシスティンシンターゼ酵素の別の補
基質どして作用して、炭素−炭素結合のＩＩＪ成によっ
て拡大された有機化合物を生成することも示された。

以下に、本発明を説明する。

Ｃ，ｖｉｏｌａｃｅｕｍ細胞の製造 Ｃ，ｖｉｏｌａｅｅｕｍの細胞を、３０℃で最少塩培地
で好気条件下回分培養によって成長させた。培地に、単
一の炭素および窒素源として２０ｍＭグルタメートを追
加した。２０時間後に、細胞を遠心分離によって回収し
、２回洗浄して、最少容積のトリス緩衝液（ｐＨ８，５
，５０ｍＭ）に再懸濁した。

無細胞酵素の製造 回収して再懸濁したＣ、　ｖｉｏｔａｃｅｕｍ懸濁液を
音波処理して細胞を破壊した後、遠心分離（１０，００
０ｘｇ。

１０分間）して、無細胞抽出液を調製した。粒状タンパ
ク質不含高速上澄液を調製するため、無細胞抽出液を１
５０．０００ｘｇで５時間遠心分離した。生成する上澄
液を傾瀉して高速上澄液（Ｈ８Ｓ）として保存した。

ＨＳＳの精製 硫酸プロタミンをＨ８Ｓに加えて、−最終濃度を１ｍｇ
　／　６　ｍｇタンパク質とした。沈澱を取り除いて、
上澄液を限外濾過によって濃縮した。次いで、上澄液を
ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０陰イオン交換カラム
を流下させ、トリス緩衝液（ｐＨ８，５，３００ｍＭ）
中０〜２００ｍＭＮ　ａ　Ｃ１グラデイエンドで溶出し
た。β−シアノ−Ｌ−アラニンシンターゼ活性ピークを
集めて、セファデックスＧ−１５０ゲル濾過カラムに適
用した。β−シアノ−Ｌ−アラニンシンターゼは単一ピ
ークとして出現した。この精製法によって、無細胞抽出
液を９９倍に精製した。

Ｅ、　ｃｏｌｔ細胞の製造 Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ、２の細胞を３７℃で最少塩培地で
好気条件下回分培養によって成長させた。この最少培地
に窒素源として５ｍＭ塩化アンモニウムおよび炭素源と
して２０ｍＭグルコースを追加した。

２４時間後遠心分離によって回収した細胞を２回洗浄し
、最少容積のトリス緩衝液（ｐＨ８，５）巾に再懸濁し
た。

無細胞酵素の製造 回収して再懸濁したＥ、　ｃｏｌｊ細胞を音波処理して
細胞を破壊した後、遠心分Ｒ１（１０，０００ｘｇ、　
１０分間）して無細胞抽出液を調製した。

酵素分析 反応 Ｌ−システイン十ＨＣＮ→ β−シアノ−し−アラニン＋Ｈ２Ｓ によるＨ２Ｓの製造速度によって、酵素活性を測定した
。

Ｈ２Ｓは、等容積（０、５ｍｌ　）のシアン化物（５ｍ
Ｍ）、Ｌ−システイン（１０ｍＭ）、酢酸鉛（０、８ｍ
　Ｍ　）および酵素上澄液を含む反応混合物中での硫化
鉛の形成によって比色法によって検出した。シアン化物
とＬ−システインとはトリス緩衝液（ｐＨ８，５，５０
ｍＭ）中で毎日調製し、ｐＨを８．５に調整した。酵素
活性は、１分力たりの硫化鉛の形成速度を記録すること
によって測定した。反応は、ＨＰＬＣ［７カダム（Ｍａ
ｃａｄａｍ）及びクノウレス（Ｋｎｏｗｌｃｓ）　、上
記引用、文献〕を用いるβ−シアノ−し−アラニンまた
は他の生成物の形成によって検定した。

β−シアノ−Ｌ−アラニンシンターゼを含む高速上澄液
を、Ｌ−システインおよびＯ−アセチル−Ｌ−セリンお
よび補基質としてシアン化物を有するＤ−システインに
ついての活性を検討した。

この研究では、Ｌ−システインおよびＯ−アセチル−し
−セリンは共に酵素の好適なアミノ酸基質であることが
示されたが、Ｄ−システインはアミノ酸基質として作用
することは出来なかった。

実験の結果、補基質シアン化物はインドールによって置
換することができることが明らかになった。高速上澄液
および精製β−シアノ−Ｌ−アラニンシンターゼは共に
触媒として用いられ、それぞれの場合、生成物の１じ成
速度は主な基質であるシアン化物に関する速度の２〜９
％であった。

主反応： Ｌ−システイン＋ＨＣＮ→ β−シアノ−Ｌ−アラニン＋Ｈ，Ｓ 副反応： Ｌ−システイン＋インドール→ Ｌ−トリプトファン＋Ｈ２Ｓ ＴＬＣおよびＨＰＬＣ法を用いて、トリプトファン形成
を検出することが可能であり、これによりトリプトファ
ンは反応の予期される化学量論的量（すなわち、１：１
　トリプトファン：Ｈ２Ｓ）にしたがってＨ２Ｓと共に
生成することが示された。３ｍＭインドールとの反応混
合物では、９５％がトリプトファンに転換した。更に実
験を行ったところ、シアン化物補基質を親核性炭素酸ま
たは中性の炭素化合物で置換することが可能であること
も示された。

例えば、ニトロメタンとの反応 Ｌ−システイン＋Ｎｏ　　−Ｃ−Ｈ→ ″″　Ｉ ＨＨ ＨＨＮＨ２ ４−ニトロ−２−アミノ−ブタン酸 を高速上澄液で試験すると、主な基質での反応速度の１
０〜１２％の反応速度を得た。

マロノニトリルは好ましいもう一つの補基質であった。

Ｌ−システイン十ＮＣ−Ｃ−Ｈ→ Ｃ ＨＨＨ ４，４−ジシアノ−２−アミノ−ブタン酸この反応は主
反応の１０〜２７％の速度で進行した。

Ｃ，ｖｉｏｌａｅｅｕ慣のβ−シアノ−Ｌ−アラニンシ
ンターゼも、下記のメチル−シアノアセテートの反応を
シアン化物での反応の４〜１６％の速度で触媒すること
ができた。

ＨＨ ＨＨＨＮＨ２ ０−（シアノアセチル）セリン 注目すべきことは、この別の補基質の速度は主反応の速
度よりも遅いが、総ての場合に反応の完了時点では生成
物であるアミノ酸が少なくとも９５％の収率で形成され
たことである。

Ｅ、　ｃｏｌｔのシスティンシンターゼによって触媒さ
れる反応 酵素システィンシンターゼを含むＥ、　ｃｏｉｌ　Ｋ１
２からの上澄液は、下記の反応 Ｌ−システイン＋ＨＣＮ呻 β−シアノ−Ｌ−アラニン＋Ｈ２Ｓ において活性を示し、Ｐ、、　ｃｏｌｉのシステ、イン
シンターゼがβ−シアノ−Ｌ−アラニンシンターゼ活性
をＨすることを示していた。この酵素を次に下記の反応
を触媒する活性についてチエツクした。

（１）　　Ｌ−システイン＋マロノニトリル→Ｈ２Ｓ＋
４．４−ジシアノ−２−アミツブクン酸 （２）Ｌ−システインシンターゼ→ Ｈ２Ｓ＋Ｌ−トリプトファン （３）Ｌ−システイン士ジメドン→ Ｈ２Ｓ＋２−　（２’　−アミノ−２′−力ルボキシエ
チル）−５，５−ジメチ ルシクロヘキサンー１．３−ジオ ン。

反応（１）　、（２）および（３）の活性は、Ｌ−シス
テインおよびシアン化物での反応と比較して、それぞれ
２．６．１．６および１．１であった。Ｄ−システイン
は、如何なる反応についてもアミノ基質とはならなかっ
た。

出願人代理人　　佐　　藤　　−雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、２個の小さな分子の間に炭素−炭素結合を形成する
   ことによる有機化合物の製造法であって、β−シアノ−
   Ｌ−アラニンシンターゼおよび／またはシステインシン
   ターゼ活性を有してＡＴＰを必要とすることなく反応を
   触媒するピリドキサールリン酸を結合した酵素を用いる
   ことを特徴とする方法。 ２、β−置換反応である、請求項１に記載の方法。 ３、植物または微生物源から得られるβ−シアノ−Ｌ−
   アラニンシンターゼおよび／または動物、植物または微
   生物源から得られるシステインシンターゼを用いる、請
   求項１または２に記載の方法。 ４、Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍのβ−シアノ−Ｌ−アラニ
   ンシンターゼおよび／またはＥ．ｃｏｌｉのシステイン
   シンターゼを用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記
   載の方法。５、Ｌ−システイン、Ｌ−セリンまたはＯ−
   アセチル−Ｌ−セリンを親核性炭素酸または中性炭素種
   と反応させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方
   法。 ６、Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍから得られるβ−シアノ−
   Ｌ−アラニンシンターゼを用いてＬ−システインまたは
   Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとニトロメタン、マロノニト
   リル、メチル−シアノアセテートまたはインドールとの
   結合を触媒する、請求項１〜５のいずれか↓項に記載の
   方法。 ７、Ｅ．ｃｏｌｉから得られるシステインシンターゼを
   用いてＬ−システインまたはＯ−アセチル−Ｌ−セリン
   とマロノニトリル、インドールまたはジメドンとの結合
   を触媒する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法
   。