JPH01285117A - 培養苗の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、培養苗の生産方法に関し、さらに詳しくは、
組織培養器内で実質的に無菌的に植物細胞、組織乃至小
植物体を培養して培養苗を生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

植物組織培養苗は、ウィルスなどの病原菌に汚染されて
いない苗の利用による高収量・高品質の実現、あるいは
新品種、難発芽性種子作物、難栄養繁殖植性作物などの
コピー苗（遺伝的に均質な苗）の大量増殖などに有効な
技術であり、今後の農業生産技術の重要な柱の一つにな
ると考えられている。しかし、現在では、組織培養器内
で植物細胞、組織乃至小植物体を培養して植物組織培養
苗を生産するための生産コストが高いために、その普及
はラン、イチゴ、カーネーション、観葉植物などの一部
の高級施設園芸作物に限定されている。前記生産コスト
が高くなる最大の理由は、その生産方法が多分に手工業
的であり、生産コストの６５〜７０％を、人件費が占め
ることによる。その第二の理由は、組織培養期間中にお
ける植物細胞、組織乃至小植物体の生長が遅く、またそ
れによって得られる植物組織培養苗のうち商品価値があ
り、その後の馴化過程において良好に活着ないし生育す
るものの歩留まりが低いことによる。

一方、従来、組織培養中の小植物体は光合成能力をかな
り失い、前記組織培養中の小植物体を一貫して独立栄養
生長せしめ、それにより培養苗を生産するようなことは
実用的には不可能と考えられていた。このような固定観
念が持たれるに至った原因としては、植物の組織培養の
技術が、本質的に従属栄養生長である微生物や動物の細
胞乃至組織の培養技術に準拠して発達したものであるこ
とを挙げることができる。したがって、従来技術におい
ては、小植物体を生長させるには培地中に糖（シー！糖
、グルコース、フラクトースなど）を炭素源として加え
、従属栄養的生長の側面が強い混合栄養生長をさせるの
が一般的な常識となっていた。そ°のため、このような
従来技術において、その生産性を高め、生産コストを小
さくするための研究開発の方向はいずれも従属栄養的な
生長・増殖を極限まで効率化し、かつ、省力化する方向
で推進されてきた。例えば、糖を含む液体培地中に小植
物体のほとん浸漬して、さらにその培養器内に酸素を供
給しつつ培養器を置場または回転させるなどして、糖及
び酸素などの小植物体への吸収速度を高める方法等は、
上記のような方向の研究開発の典型的なものとして挙げ
ることができる。

そして、上記のような従来法においては、その培地中に
多量のＰｉ類を添加するため、培地は培養期間中に外部
から雑菌汚染を受は易く、このため培養期間中に雑菌汚
染により培養中の小植物体が腐死してしまうトラブルが
しばしば発生するので、これを防止するために培養器や
培養室等の培養環境を実質的に無菌状態に維持するよう
厳重な取扱を必要とするものである。しかも、このよう
に従属栄養的な生長・増殖を主体として生産された培養
苗を独立栄養生長条件での馴化過程に移行甘めしること
は、培養苗に環境の激変を与えることとなり、馴化過程
における活着率の低下や生育の遅れの一因をなしている
ものと考えられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解消した、新
規な培養苗の生産方法を提供することにあり、さらに、
具体的には、培養苗の生長を促進でき、馴化時の活着率
や馴化後の植物体の生育が良好であり、また、培養期間
中の雑菌汚染が生起し難く無菌状態の維持のための取扱
を緩和することが可能な、培養苗の生産方法を提供する
ことにある。

〔課題を解決するための手段〕 本発明者は、上記目的を達成すべく研究を進めた結果、
意外にも従来の技術常識に反して、組織培養中の小植物
体等が十分な独立栄養生長の能力を潜在的に保有してお
り、ただ、従来の培養苗の生産方法における従属栄養を
主体とした培養条件では、その潜在的能力が十分に発揮
し得なかったに過ぎないことを見出した。

すなわち、従来の培養苗の生産方法においても、培養器
内に小植物体を入れて閉栓し、光り照射の下で培養を開
始した当初は、培養器内に炭酸ガスが残存しているため
光合成が行われているが、培養期間の経過とともに培養
器内の炭酸ガス濃度は急速に低下し、実質的に光合成が
殆ど行われない状態になっていることを種々の実験によ
って確認した。しかも、従来の培養苗の生産方法におい
ては前述のように、培地内に多量の糖を添加しているた
め、雑菌汚染が生起し易く、これを防止するため培養器
の栓の部分を可及的に密閉状態にするようにするのが通
常である。そして、このような密閉状態においては、当
然のことながら外部からの炭酸ガスを含有した空気の供
給が遮断されることを意味し、培養器内の光合成が不可
能な状態が一層強化され、このことが、培養苗の生産方
法においては、実質的に独立栄養生長による培養は不可
能であるとの従来の技術常識をさらに強固にしていたも
のと考えられる。

本発明者は上記新知見を敷１行するものとして、小植物
体に至る前の外植片においても、すでに、かなり良好な
光合成能力を保持していることを種々の実験によって確
認した。

本発明者は、ここに至り、組織培養器内で植物細胞、組
織乃至小植物体を培養して培養苗を生産する方法を、−
貫して完全な独立栄養生長条件下で行うことが可能では
ないかと考え、高濃度の炭酸ガス施用、強光照射の下で
上記小植物体等に光独立栄養生長を行わしめることを特
徴とする培養苗の一貫生産を試み、良好な結果が得られ
ることを確認した。

本発明者は、上記知見に基づいてさらに研究を重ねた結
果、従来の培養苗の生産方法においては、大気中の酸素
濃度、すなわち、２０％程度以下とならぬようにしてい
たのを、逆に、酸素濃度を、少なくとも明期中は１０数
％〜１％の範囲に低減することにより、−層小植物体の
生長が促進されることを知り、さらに諸条件の良好な範
囲を確認してここに本発明を完成するに至ったものであ
る。

したがって、本発明の培養苗の生産方法は、組織培養器
内で実質的に無菌的に植物細胞、組織乃至小植物体を培
養して培養苗を生産する方法において、前記培養に用い
る培地として糖濃度１５ｇ／　１以下の低糖濃度培地を
用い、培養期間中、前記組織培養器内の炭酸ガス濃度を
３００〜１，０００　ｐｐｍに保持し、かつ、前記培養
期間中の明期において１５０〜５００　μｍｏｌ　−２
ｓｅｃ　−’の光合成光量子束の光り照射を行うともに
、前記組織培養器内の酸素濃度を１０数％〜１％の範囲
に低減せめした状態に保持することを特徴とするもので
ある。

本発明の培養苗の生産方法の出発材料となる、植物細胞
、組織乃至小植物体としては、特に限定はなく、通常の
培養苗の生産方法において用いられる外植片、カルス、
或いは、これらから得られた小植物体等が挙げられる。

そして、出発材料として外植片を用い、培養苗の生産を
一貫的に行う場合には、培養苗が、組織培養器内で外植
片からカルスを経由することなく直接小植物体を形成す
ることによって生産されるものである場合に、特に有効
である。これは、カルスの光合成能力は、実質的にない
か、あってもかなり低く、カルス培養の時点では本発明
方法を適用するのは不適当ないし困難であることによる
。

本発明方法において使用する糖濃度１５ｇ／　１以下の
低糖濃度培地としては、公知の植物組織培養用培地を基
本培地とし、添加される糖類の濃度を上記所定値とする
ことによって得ることができる。

前記公知の基本培地としては、ムラシゲ・スクーグ、ホ
ワイト、リンスマイヤー・スクーグ、エッチ・ニッチ等
の培地を挙げることができる。

これらの培地に添加する蔗糖、グルコース等の糖類の濃
度は、１５ｇ／　１以下であり、この糖濃度が１５ｇ／
　ｌを超えると、光合成が抑制されるので実用に適さな
い。また、生体重の増加を促進させる点で１０ｇ／　１
以下が特に好ましい。

本発明方法における組織培養器内の炭酸ガス濃度は、３
００〜１　、　ｏｏｏｐｐｍであることが必要で、３０
０ｐｐｍ未満では、光合成が抑制される点で不適当であ
り、ｌ　、　０ＯＯｐｐｆｆｌを超えると葉の老化が進
み光合成能力が経時的に低下する点で不適当である。ま
た前記葉の老化を避は長期的に光合成を促進させる点で
特に６００〜７００　ｐｐｌｌが好ましい。

本発明方法において、組織培養器内の炭酸ガスを上記の
濃度に保持する手段としては、培養器が通気性の高いも
のである場合には、培養室内の炭酸ガス濃度を所要程度
高めた状態に保持すればよく、また、外部から培養器内
に所要濃度の炭酸ガスを連続的に通気するようにしても
よい。

本発明方法における培養期間中の明期の光り照射強度は
、１５０〜５００　μｍｏｌ　−２ｓｅｃ　−’の光合
成光量子束であることが必要で、この光合成光量子束が
１５０　μｍｏｌ　−”５ｅｃ−’未満であると、光量
不足により光合成が抑制される点で不適当であり、５０
０μｍｏｌ　−”５ｅｃ−’を超えると、光利用効率が
低下し、また、培養室の冷房負荷が増大する点で不適当
である。また、光合成を長期的に促進し、光利用効率を
高く維持できる点で、　２００〜４００μｍｏｌ　−”
５ｅｃ−’が特に好ましい。

本発明方法における前記明期中の組織培養器内の酸素濃
度は、１０数％、すなわち、約１４乃至１６％〜１％の
範囲であることが必要で、１４乃至１６％程度を超える
と光呼吸の抑制が不十分となる点で不適当であり、また
、１％未満では暗呼吸の代謝に障害が生ずるので不適当
である。さらに、光呼吸をほぼ完全に抑制する点で、前
記酸素濃度が約２％であることが特に好ましい。

また、本発明方法の培養期間中の暗期における酸素濃度
は、暗呼吸を正常に行わせる点で、１０数％、すなわち
、約１４乃至１６％〜２１％の範囲に増加せしめること
が好ましい。

〔作　用〕

本発明方法によれば、所定の低ｔＦｉＪ度培地を用い、
所定の炭酸ガス濃度を保持した培地中で、明期において
所定強度の光り照射を行いつつ、植物細胞、組織乃至小
植物体の培養を行うため、前記小植物体等は、培養期間
中、培養器内で良好に光合成を行い、独立栄養生長をす
る。しかも、この培養期間中の明期において、培養器内
の酸素濃度を所定範囲に低減することにより、前記小植
物体等の生長が促進される。さらに、培地として低糖濃
度培地を使用すること、及び、培養器内の酸素濃度を所
定範囲に低減することにより雑菌汚染が著しく抑制され
る。

さらに、本発明方法によって得られた培養菌は、光独立
栄養生長を行って生長したものであるから、これを、次
ぎの光独立栄養生長下での馴化過程への移行が生育環境
の激変を伴わず無理なく行われ、結果として、馴化過程
の活着率及びその後の生育が良好となる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例に基づいて、本発明方法を具体的
に説明する。

実施例１゜ 継代培養されたＰｒｉｍｕｌａ　　ｍａｌａｃｏｉｄｅ
ｓ　ｃｖ。

Ｆｕｊｉｚａｋｕｒａ（Ｃ３Ｐｌａｎｔ）の茎葉部を裁
断することよって得られた実質的に根を有しない外植片
であって、長さが約３ｃｍ、重さが後記実験区分におけ
る蔗糖３％の区分に使用するものが、新鮮型１．０２ｇ
、乾物重０．１２ｇ　、蔗ｔＩ！０％の区分に使用する
ものが、新鮮型０．５６ｇ：、０．０９ｇの重さの外植
片を、各閉栓容器内の３％の蔗糖を含有する半分の濃度
の正培地（０，８％寒天）上に３個づつ置床し、クリー
ンベンチ内で２０日間培養した。他の培養条件は次ぎの
とおりであった。すなわち、蛍光灯、光合成光量子束（
ＰＰＦ）の光量子束密度、　１１０　μｍｏｌ　ｍ−”
ｓ−’；明期、　１４ｈ／ｄ；気温、明期中２５°Ｃ９
暗期中２０°Ｃ。

クリーンベンチにおける培養開始２０日後、上記閉栓容
器のキャップを取り外し、小植物体を含む容器を特別に
設計された、ガスの流入口及び流出口を含む三日のカバ
ー及び円筒のフラスコ部からなる１、０００ＩＩ１１の
透明ガラスジャー（■池田理化製）中に置いた。ついで
、明期、蛍光灯、ＰＰＰの光量子束密度１１０　μｍｏ
ｌ　ｔａ−”ｓ−’の１６時間、暗期８時間の光り条件
、及び、培養器内温度２５°Ｃの温度条件下において、
供給ガスの区分を３６６　ｐｐｍのＣＯｚ及び１，１０
又は２１％の０□（残りはＮ２）からなる湿潤ガスの３
区分とし、ガス流量の区分を流１５０ｎ＋１！、ノｗｉ
ｎ、　　１００　　ｒａｇ７ｍｉｎ、　　１５０　　ａ
＋２７ｍ１ｎ及び２００　ｍｊ”ｍｉｎの４区分とし、
さらに、培地の蔗糖濃度を３％と０％の２区分として、
上記供給ガスの３区分、ガス流量の４区分及び蔗糖濃度
の２区分の組み合わせ、３Ｘ４Ｘ２＝２４組みについて
実験を行った。

小植物体毎の見かけの光合成速度はガスの流量、前記ガ
スの入口及び出口間のＣＯｚ　６度の差異及び転換係数
を乗じることによって計算した。

その結果を、第１表、第１図及び第２図に示す。

（本頁以下余白） 第１表　プリムラ 上記表又は図における記号の意味は、次ぎの通りである
。

Ｃｉｎ　：上記透明ガラスジャーのガスの流入口におけ
るガスのＣｏ２？ｌＡ度、すなわち、３６６　ｐｐｍＣ
ｏｕ　：上記透明ガラスジャーのガスの流出口において
計測したガスのＣＯ□濃度 ΔＣ（ｈ　　：　Ｃｔ−Ｃｏｕ Ｖ：液量（ｍ　ｌ　／ｈ） ｋ：換算係数（０，１５Ｘ１０６） Ｐｎ：見かけの光合成速度、Ｃｏｔ　ｍｇ／本／ｈ、下
式によって求められる。

Ｐｎ＝に−ｖ−ΔＣＯ７ 第１表、第１図及び第２図に示す結果から、ｏ２２度が
１．１０及び２１％の各区分において、ｏ２２度が低い
程、見かけの光合成速度が高く、実質的に小植物体の生
長が促進されていることがわかる。

さらに、前記、低０２濃度による見かけの光合成速度増
大の程度を、第３図について分析すると、ＣＯＯを一定
の値、例えば、Ｃ６，を２００　ｐｐ＋ｍとした場合、
０．濃度、１，１０及び２１％の各区分におけるＰｎは
、それぞれ、５．７．１０．６及び１６．２となってお
り、・・・であることが認められる。

実施例２゜ 実施例りのＰｒｉｍｕｌａ　　ｍａｌａｃｏｉｄｅｓ　
ｃｖ、Ｆｕｊｉｚａｋｕｒａのかわりに、Ｃｈｒ　ｓａ
ｎｔｈｅｍｕｍ　　ｏ＋ｏｒｉｆｏｌｉｕｍＲａｍａｔ
　ｃｖ、　５ｈｕｈｏ−ｎｏ−ｃｈｉｋａｒａを用い、
外植片の長さが、長さが約５ｃｍ、重さが実験区分にお
ける蔗糖３％の区分に使用するものが、新鮮重１．２６
ｇ、乾物重０．１２ｇ　、蔗糖θ％の区分に使用するも
のが、新鮮重０．５５ｇ：、０．０６ｇである以外は、
実施例１゜と同様にして、実験を行った。

その結果を、第２表及び第３図に示す。

（本頁以下余白） 第２表　キ　り 第３図に示す結果から、０□濃度が１．１０及び２１％
の各区分において、０□濃度が低い程、見かけの光合成
速度が高く、実質的に小植物体の生長が促進されている
ことがわかる。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば、培養器内の小植物体等は、培養期
間中、良好に光合成を行い、独立栄養生長をする。しか
も、この培養期間中の明期において、培養器内の酸素濃
度を所定値以下に低減することにより、前記小植物体等
の生長が促進される。さらに、培地として低Ｉ！濃度培
地を使用すること、及び、培養器内の酸素濃度を所定値
以下に低減することにより雑菌汚染が著しく抑制される
。

また、本発明方法によって得られた培養菌は、馴化過程
の活着率及びその後の生育がきわめて良好となる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、小植物体として、Ｐｒｉｍｕｌａ
ｍａｌａｃｏｉｄｅｓ　ｃｖ、Ｆｕｊｉｚａｋｕｒａの
小植物体を用いた場合における培養器内のＣＯ，濃度、
光合成速度及び０□濃度の相関関係を示す図、第３図は
、小植物体として、Ｃｈｒ　ｓａｎｔｈｅｍｕｍ　　ｍ
ｏｒｉｆｏｌｉｕｍ　Ｒａｍａｔｃｖ、　５ｈｕｈｏ−
ｎｏ−ｃｈｉｋａｒａを用いた場合における培養器内の
ＣＯ２４度、光合成速度及びｏ２２度の相関関係を示す
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組織培養器内で実質的に無菌的に植物細胞、組織乃
   至小植物体を培養して培養苗を生産する方法において、
   前記培養に用いる培地として糖濃度１５ｇ／ｌ以下の低
   糖濃度培地を用い、培養期間中、前記組織培養器内の炭
   酸ガス濃度を３００〜１，０００ｐｐｍに保持し、かつ
   、前記培養期間中の明期において１５０〜５００μｍｏ
   ｌ＾−＾２ｓｅｃ＾−＾１の光合成光量子束の光り照射
   を行うともに、前記組織培養器内の酸素濃度を１０数％
   〜１％の範囲に低減せめした状態に保持することを特徴
   とする培養苗の生産方法。 ２、糖濃度が、１０ｇ／ｌ以下であることを特徴とする
   請求項１記載の培養苗の生産方法。 ３、組織培養器内の炭酸ガス濃度が、６００〜７００ｐ
   ｐｍであることを特徴とする請求項１又は２記載の培養
   苗の生産方法。 ４、組織培養器内の所定の炭酸ガス濃度の保持を、所要
   濃度の炭酸ガスを含有する気体を外部から組織培養器内
   へ連続的に通気することにより行うことを特徴とする請
   求項１乃至３のいずれかの項記載の培養苗の生産方法。 ５、明期における光合成光量子束が、２００〜４００μ
   ｍｏｌ＾−＾２ｓｅｃ＾−＾１であることを特徴とする
   請求項１乃至４のいずれかの項記載の培養苗の生産方法
   。 ６、組織培養器内の酸素濃度が約２％であることを特徴
   とする請求項１乃至５のいずれかの項記載の培養苗の生
   産方法。 ７、前記培養期間中の暗期において組織培養器内の酸素
   濃度を１０数％〜２１％の範囲に増加せめした状態に保
   持することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかの項
   記載の培養苗の生産方法。 ８、培養苗が、組織培養器内で外植片からカルスを経由
   することなく直接小植物体を形成することによって生産
   されるものであることを特徴とする請求項１乃至７のい
   ずれかの項記載の培養苗の生産方法。