JPH01285191A - 腫瘍細胞障害因子のｄｎａ配列、発現ベクター、宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本考案は腫瘍細胞に対して障害作用を有する新規な因子
のＤＮＡ配列、及びそれを用いた応用技術に関する。

（従来技術） 人の繊維芽細胞が産生ずる腫瘍細胞障害因子としては特
開昭５９−８８４２３．６１−１８７２１号公報に記載
の物質が知られている。また出願人は細胞培養によって
得られた繊維芽細胞由来について特許を出願した（特願
昭６２−３２２８４３　）。

（発明が解決しようとする課題） 人由来の繊維芽細胞から得られる新規な腫瘍細胞障害因
子のＤＮＡ配列、それを含む発現ベクター及び宿主の提
供にある。得られたＤＮＡ配列、ベクター、宿主を用い
て腫瘍細胞壊死因子を製造し、新規な医薬品を提供し得
る。

（課題を解決するための手段及び作用の説明）本発明は
、少なくとも以下のアミノ酸配列を含む腫瘍細胞障害因
子をコードするＤＮＡ配列であＡｌａ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ
　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　
ＧｌｙＴｈｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ａｌ
ａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＡｌａＡｌａ　Ｐｈｅ　
Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｙｓ　５ｅｒＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ
　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　５ｅｒＳｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ
　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　
Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇ
ｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　１ｌｉｓＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ
　ＡｌａＴｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇ
ｉｎ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＰｒｏ　Ａｓｎ
　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　
Ｌｙｓ　Ｔｈｒｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙ
ｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＴｈｒ　
Ｇｉｎ　Ｖａｌ　　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　
Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａ
ｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｔｙ
ｒＴｈｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　
Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　−ｐ（ＰはＯＨまたはＰｒｏ
） これにより上記課題を解決することができ、具体的な好
ましいＤＮＡ配列としては、第１図中の塩基番号２９８
から８０４または８０７までのＤＮＡ配列で示される。

このようなりＮＡ配列を適当な発現用ベクターに連結す
ることにより、宿主中で該因子を発現する発現ベクター
を作成することができる。又、このような発現ベクター
により形質転換された宿主を提出することができる。

（Ａ）腫瘍細胞障害因子をコードするＤＮＡ配列ヒト胎
児腎由来繊維芽細胞から本発明の腫瘍細胞障害因子をコ
ードしたｍＲＮＡを単離した後、その遺伝子をクローニ
ングし、遺伝子のＤＮＡ配列を決定すると共に、ＤＮＡ
配列がコードするアミノ酸配列を決定した。

（１）　　原料細胞からのポリ（Ａ）”　ＲＮＡの抽出
ウェイマウス（Ｗａｙｍｏｕ　ｔｈ　）培地に０．０５
〜０．２（Ｗ／Ｖ）％のヒト血清アルブミンを添加した
無血清培地を用いて、培養した原料細胞１．２　ＸＩＯ
”個からトータルＲＮＡを調製する。好適には、グアニ
ジンチオシアネート−塩化セシウム法により行なわれる
（バイオケミストリイ、１Ｂ、５２９４゜１９７９）。

原料細胞に６Ｍグアニジンチオシアネート、５ｍＭクエ
ン酸ナトリウム、０．５％ザルコシル、０．１Ｍ２−メ
ルカプトエタノール、０．１％アンチホーム−Ａ４００
ｍｆを添加し、ホモゲナイズする。ホモゲナイズ溶液１
０ｍ１に対し、４ｇの塩化セシウムを溶解する。５．７
Ｍ塩化セシウム溶液１０ｍｆをポリアロマ−遠心管に入
れ、その上にホモゲナイズ溶液２４ｍ１をのせ、ベック
マン趙遠機６０Ｔｉ　Ｏ−ターで３５．００Ｏｒ　ｐ　
ｍ２０℃、１６時間超遠心分離を行なう、遠心後、沈渣
を７０％エタノールで２回洗浄し、１０ｍｊ！の１０ｍ
Ｍ　）リス−Ｈ（ｌ緩衝液（ｐＨ７，４）、５ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ溶液で６５℃５分加熱することに
より溶解する。この溶液に等量のクロロホルム・ｎ−ブ
タノール（４：　１．ｖ／ｖ）を加え、撹はん後、遠心
分離により水層を得る。この水層に０．１倍量の３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，２）と２．５倍量のエタノール
を加え、−７０℃で３０分間放置後、遠心し、沈渣を得
る。沈渣は蒸留水に溶解し、トータルＲＮＡ溶液とする
。トータルＲＮＡから、ポリ　（Ａ）　”　ＲＮＡが、
オリゴ（ｄＴ）との親和性を利用したアフィニティーク
ロマト法により精製される。オリゴ（ｄＴ）セルロース
を１０ｍＭｌ−リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）、１
ｍＭＥＤＴＡ、０．５　ＭＮａＣＬｏ、１％ＳＤＳで平
衡化する。平衡化したカラムに、トータルＲＮＡを接触
させ吸着画分をｌＯｍＭ）リス−Ｈ（ｌ緩衝液（ｐ　Ｈ
７，５）　１　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ、　０．０５％ＳＤＳ
緩衝液で溶出させ、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡを得る。ポリ
（Ａ）−ＲＮＡはショ糖密度勾配遠心より、ＲＮＡの大
きさで分画する。

５％〜２５％のショ糖密度勾配緩衝液（１０ｍＭ）リス
−Ｈｅ　ｌ　　ｐ　Ｈ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ、０．１
ＭＮ　ａ　Ｃ１，０，１％５ＤＳ）にポリ（Ａ）”　Ｒ
ＮＡ溶液をのせ、ベックマン超遠心機５０．ＩＴＩロー
タ　２０，００Ｏｒ　ｐ　ｍ、　２０°Ｃ１６時間超遠
心分離を行ない、２４両分に分画した。

（２）オリゴデオキシヌクレオチドの合成所望遺伝子の
クローニングのために、雑種形成法が用いられる。雑種
形成のプローブとして、好適には、合成オリゴデオキシ
ヌクレオチドが用いられる。Ｎ末端アミノ酸配列から推
定される塩基配列と相補性を示すオリゴデオキシヌクレ
オチド（１７塩基）を２種類合成する（第２図）。Ｎ末
端から２番目のアミノ酸Ｍｅｔから７番目のＡｓｎまで
に相当する塩基配列の相補鎖（プローブＡ）１６種類の
混合プローブと１３番目のＣｙｓから１８８番目Ｐｈｅ
までに相当する塩基配列の相補鎖（プローブＢ）４８種
類の混合プローブをＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍ＋　３８１　Ａ型）により合成する。

合成プローブは（ｒ−”Ｐ）ＡＴＰ　（八ａ＋ｅｒｓｈ
ａｍ）を用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅ＠
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）により５′末端を標
識して用い（３）ポリ（Ａ）ゞＲＮＡの検索 （１）で精製したポリ（Ａ）”　ＲＮＡのどのサイズの
両分に所望蛋白の核酸が存在するかをノーサンプロット
雑種形成法により検査した。ポリ（Ａ）・ＲＮＡを変性
させる。好適にはホルムアルデヒド法が用いられる。５
０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、６％（Ｖ　／　Ｖ　）ホ
ルムアルデヒド、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
　Ｈ６，８）、０．２ｍＭＥＤＴＡ。

１０％グリセリン、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＰＢ溶液に
ＲＮＡをとかし、６５°Ｃで５分間変性させる。変性し
たＲＮＡをホルムアルデヒド・アガロースゲルによる電
気泳動する。泳動したＲＮＡは、ゲルからゼータプロー
ブプロッテイングメンブランス（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）に毛
管法により移動させる。メンプランに吸着したＲＮＡと
（２）で標識したプローブにより、雑種形成反応を行な
う。メンプランを６ＸＳＳＣ（０，９ＭＮａＣｆｆｉ、
９０ｍＭクエン酸ナトリウム）　、２０ｍＭリン酸ナト
リウム（ｐＨ６，８）、７％Ｓ　Ｄ　Ｓ、　１ＯＸＤｅ
ｎｈａｒｄｔ’ｓ（０，２％（Ｗ／Ｖ）フィコール、０
．２％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドン、０．２％（Ｗ
／Ｖ）ウシ血清アルブミン）、１０％（Ｗ／Ｖ）デキス
トラン硫酸、１００μｇ／ｍｌ！酵母由来のｔＲＮＡＳ
”Ｐ−末端標識プローブ溶液中で３７°Ｃ１−夜雑種形
成させ、３ＸＳＳＣ，ｌ０ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　
５％ＳＤＳ、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ７，５
）緩衝液で３５°Ｃ１３０分間２回洗浄する。

洗浄したメンプランをＸ線フィルムで数日間感光する。

感光したフィルムを現像し、標識プローブと雑種形成さ
れたポリ（Ａ）＋ＲＮＡのサイズを検索する。その結果
ＡとＢ両方の合成プローブとも、２．７ｋｂのサイズに
バンドが出現した。

（４）　　ｃＤＮＡの合成 ＡとＢ両方のプローブで雑種形成された２、７ｋｂのサ
イズのポリ（Ａ）“ＲＮＡを含む両分からｃＤＮＡを合
成する。ｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成システム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｎ）が用いられ、プロトコールにしたがっ
ておこなわれた。ポリ（Ａ）９ＲＮＡ５μｇから３．ａ
ｕｇの２本鎖ｃＤＮＡが得られた。２本鎖ｃＤＮＡから
ｃＤＮＡライブラリ−を作成する。好適にはλｇｔｌＯ
がＤＮＡのベクターとして用いられる。λｇｔｌｏは比
較的大きなサイズのプラークを形成し、組み換え体の収
率が良い。ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカ−を連結する前
に、ｃＤＮＡ内部のＥｃｏＲ１部位を保護するためにＥ
ｃｏＲＩメチラーゼによりメチル化する。

２本鎖ｃ　ＤＮＡ１．５　ａ　ｇを０．１ＭＮａＣｊ！
、０．１Ｍトリス−ＨＣＩｌ（Ｐ　Ｈ８，０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ。

８０μＭＳ−アデノシルメチオニン溶液に溶解し、Ｅｃ
ｏＲＩメチラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ旧ｏ１ａｂ
ｓ）３０単位を加えて３７°Ｃ６０分間反応し、フェノ
ール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりｃ　Ｄ
ＮＡを回収する。回収したｃＤＮＡは６６ｍＭ）リス−
ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１，ｚ
　、１０ｍＭジチオスレイトール、０．１　ｍＭＡＴＰ
、　１．５　ｔｔ　ｇＥｃ　ｏＲＩリンカ−（ｄＧＧＡ
ＡＴＴｃｃ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）
を含む溶液中で、２０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）により１５°Ｃ
−夜反応する。ＥｃｏＲＩリンカ−が連結したｃＤＮＡ
は、１５０単位のＥｃｏＲＩ　（タカラ酒造）により消
化する。ＥｃｏＲＩ消化したｃＤＮＡは、Ｂｉｏｇｅｌ
Ａ５０ｍカラムクロマトグラフィーにより、過剰のリン
カ−と分離する。１．５μｇの２本積ｃＤＮＡから、Ｅ
ｃｏＲＩリンカ−が付いた二本鎖ｃＤＮＡが４６５ｎｇ
得られた。２本積ｃＤＮＡ　１１００ｎとλｇむ１０Ｅ
ｃｏＲＩア一ム１μｇを６６ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐ
　Ｈ７，５）６．６　ｍＭＭｇＣｌｚ　、５ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭＡＴＰ、２．８単位の７４ＤＮＡ
リガーゼ（タカラ酒造）を含む反応液５μｌ中で１５°
Ｃ−夜反応し、λｇＬ１０とｃＤＮＡの組み換えＤＮＡ
を作製する。

組み換えＤＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング法
により組み換え体ファージを作製する。好適にはガイガ
バックゴールド（ストラタジーン）のｉｎ　ｖｉｔｒ。

パッケージングキットが用いられる。ｃＤＮＡライブラ
リーのタイターを大腸菌ｃ６００を指示菌として、調べ
たところ、３．９　ＸＩＯ”個のプラークが得られた。

（５）　　ｃＤＮＡのスクリーニング （４）で得られたｃＤＮＡライブラリーから、３１ｐ末
端ラベルしたプローブを用いて、プラーク雑種形成法に
より、所望ｃＤＮＡのスクリーニングを行なう、好適に
は、フィルター上でのファージ増幅法がおこなわれる（
メソードインエンザイモロジ−６８，３８９，１９７９
）。２．４　ＸＩＯ’個の組み換えファージを大腸菌ｃ
６００に感染させ、ＴＢ寒天上にプラークを形成させ４
°Ｃに保存する。

大腸菌ｃ６００の懸濁液にコロニープラークスクリーン
フィルター（ＮＥＮ）を浸し、フィルターに菌を吸着さ
せたあと、フィルターを室温で乾燥する。フィルターを
プラークの形成したＴＢ寒天上に置き、数分間接触させ
る。フィルターをはがし、新しいＴＢ寒天上にのせ、−
夜、３７°Ｃで培養する。培養後、フィルターをはがし
、０．５ＭＮａＯＨ％１．５　ＭＮａＣｌに５分浸し、
０．５Ｍトリス−ＨＣｆ　（ｐＨ８，０）、１．５ＭＮ
ａＣ１でさらに５分２回浸した後、２ＸＳＳＰＥ　（０
，３６ＭＮａ（１゜２０ｍＭＮ　ａ　ｔ　ＨＰ　Ｏｓ　
、２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　ＴＡ）に浸し、室温で乾燥後、８
０°Ｃ，１時間、真空下で焼き固める。（３）で用いた
ＡとＢの３１１ｐ−末端標識オリゴデオキシヌクレオチ
ドフラグメントを雑種形成プローブとして用いる。フィ
ルターを６　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，９ＭＮａＣｆ、９０
ｍＭクエン酸ナトリウム）　、２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ６，８）、１０ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ。

７％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１００μｇ／ｍ
！の酵母由来のｔＲＮＡ、９μｍｏｌ”Ｐ−末端標識プ
ローブ（比活性５Ｘ１０”ｃｐｍ／ｐｍｏ　ｌ）を含む
溶液にひたし、３７°Ｃ１−夜インキユベートし、雑種
形成反応を行なう。その後、フィルターを５ｘＳＳＣで
２回洗浄し、３　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，１０ＸＤｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ、　５％ＳＤＳ、２５ｍＭリン酸ナトリウム（
ｐ　Ｈ７，４）洗浄液で、３５°Ｃ１３０分間、３回洗
浄し、乾燥後、オートラジオグラフを行なう。プローブ
ＡとＢで共通の位置に表われたシグナルに相当する寒天
プレート上のプラークをかきとり、０．ＩＭＮａＣｆｆ
ｉ、８．１　ｍＭＭｇｓｏ、　、０．０１％ゼラチン、
５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）溶液に懸濁す
る。

懸濁液のプラーク形成反応を再度行ない、陽性の単一組
み換え体ファージが１５種類得られた。このうち、ｃＤ
ＮＡのサイズが２．７Ｋｂｐのファージから、ＤＮＡを
抽出し、ｃＤＮＡを大腸菌の増殖ベクター、好適にはｐ
ＵｃＩＢに導入する。

（６）　　ｃＤＮＡの塩基配列分析 ジデオキシ鎖末端法（サイエンス、又土工。

１２０５．１９８１）とＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの
化学的分解法（メソードインエンザイモロジー、旦亙。

４９９．１９８０）により所望蛋白の構造蛋白とシグナ
ルペプチドをコードすると思われるＤＮＡ配列が配列化
された。塩基配列と塩基配列から推定される所望ポリペ
プチドのアミノ酸配列を第１図に示す。翻訳開始信号Ａ
ＴＧから停止信号ＴＡＧまで１２５４塩基からなり、ア
ミノ酸に翻訳すると４１７個のアミノ酸配列になる。２
９番目のＡｌａから４９番目のＡｌａまでの２０個のア
ミノ酸配列が、該ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸配列
と完全に一致している。１番目のＭｅｔから２８番目の
Ａｔａまでのアミノ酸配列は細胞膜を通過する際に必要
なシグナル配列であると思われる。塩基配列から推定さ
れる構造ポリペプチドは３８９個のアミノ酸からなり、
Ｎ−グルコシド結合ＩＪ！鎖構造（Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ
／Ｔｈｒ）が１８カ所存在する。

これらの知見から、本発明の腫瘍細胞障害因子をコード
するＤＮＡ配列は以下のアミノ酸配列をコードすること
が強く支持された。

＄２０ Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｙｓ　Ａ
ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒＳｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ
　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　
ｓｅｒ＊ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　ｌｉｅ　　Ａｌａ　　
Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　ＨｉｓＴｈ
ｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ
　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＶａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈ
ｅ本１００ Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒネ １１ｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｃ
ｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ
　Ｈｉｓ、　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ
　ＶａｔＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔ
ｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ＴｙｒＴｈｒ　Ａｒｇ
　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　
Ｓｅｒ　−ｐ（ＰはＯＨまたはＰｒｏ） （Ｂ）本発明物質の発現組換えＤＮＡ　（発現用ベクタ
ー）の調製 本発明物質のｃＤＮＡが大腸菌クローニングベクターｐ
Ｕｃ１ＢのＥｃｏＲＩサイトに挿入されているプラスミ
ドｐＦ−１から、ｃＤＮＡの５′側の非翻訳領域、シグ
ナル配列、翻訳領域及び３″側の非翻訳領域の一部を含
む１．７Ｋｂ断片を動物細胞発現ベクターｐｓＶＧｚの
ＥｃｏＲＩサイトに正方向に挿入したプラスミドｐＳＶ
−Ｆｌを作製した（第３図）。

ｐｓＶＧｚはＳＶ４０ウィルスのエンハンサ−、プロモ
ーター、スプライシング・ジャンクション、ポリＡシグ
ナルを有し、動物細胞で有用物質を発現させるのに必要
な要素を含んでいる（特開昭６２−２３６４９３）。ｐ
ＳＶ−Ｇ、をＥｃｏＲＩ消化し、さらに牛小腸由来アル
カリフォスファターゼにより、５′末端を脱リン酸化し
た後、１％低融点ゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを回収し
た。本発明物質のｃＤＮＡ全体を含むｐＦ−１を５ｓｐ
ｌにより消化し、１％低融点ゲル電気泳動により、２．
３Ｋ　ｂ断片を回収した。回収したＤＮＡにＥｃ　ｏＲ
Ｉリンカ−（ｄ（ｐＧＧＡＡＴＴＣＣ）、　Ｎｅ１ｖｔ
！ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｂａｂｓ）を接続した。回収し
た２、３Ｋｂ断片とＥｃｏＲＩリンカ−をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（タカラ酒造）により反応させ、さらにＥｃｏＲ
１消化を行ない、１％低融点ゲル電気泳動により１．７
Ｋ　ｂ断片を回収した。　１．７Ｋｂ断片とＥｃ。

Ｒ１消化したｐｓｖ−ｃ２をＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカ
ラ酒造）により反応させ、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
し、アンピシリン耐性形質転換体を得る。形質転換体の
なかから、１．７Ｋｂフラグメントが正方向に入ったｐ
ＳＶ−Ｆｌを得た。

天然の本発明物質はＮ末のＡｌａからＣ末が１４９Ｓｅ
ｔ、あるいはｌ’１ｏｐｒｏまでのペプチドからなるこ
とより、各々ｌ＆？ｓｅｒとｌ’１ｌｉｐ、ｏまで翻訳
可能な発現プラスミドｐＳＶ−Ｆ２．ｐｓＶ−Ｆ３を作
製した（第４図）。ｐＦ−１をＡＧＧＣＣＴ（１４りＡ
ｒｇ　””Ｐｒｏ）で切断する５ｔｕｌで消化し、さら
に牛小腸由来アルカリフォスファターゼで５′末端脱リ
ン酸化し、１％低融点ゲル電気泳動により、ＤＮＡを回
収した。回収したＤＮＡのＳｔｕ■サイトに合成オリゴ
ヌクレオチドを接続した。

ＣＣＴ　Ｔ　ＣＣ（’　”Ｐｒｏ　’　”５ｅｔ）に翻
訳停止コドンＴＣＡ、ＥｃｏＲＩサイトをもつ２６塩基
の合成オリゴヌクレオチド（５’　ＣＣＴＴＣＣＴＧＡ
ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧ３’　）とＣＣＴ
ＴＣＣＣＣＡ（””Ｐｒｏ　”’Ｓｅｔ　”’Ｐｒｏ）
に翻訳停止コドンＴＧＡ、ＥｃｏＲＩサイトをもつ３２
塩基の合成オリゴヌクレオチド（５’　ＣＣＴＴＣＣＣ
ＣＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧ
　３　’　）を自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により合成した。２６ｍｅｒ
および３２ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドの５′末端
をポリヌクレオチドキナーゼ（タカラ酒造）によりリン
酸化し、Ｓｔｕ！消化ｐＦ−１断片と７４ＤＮＡリガー
ゼ（タカラ酒造）により接続し、さらにＥｃｏＲＩと５
ａｃｌにより消化し、４％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行ない、０．２Ｋｂ断片を回収した。回収したＳ
ａ　ｃ　Ｉ−Ｅｃ　ｏＲＩ断片をクローニングベクター
ｐＵｃ１８のＳａ　ｃ　Ｉ−Ｅｃ　ｏＲ１サイトにＴ４
ＤＮＡリガーゼ（タカラ酒造）により接続し、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に形質転換した。形質転換体のプラスミドの挿
入断片をジデオキシ法により塩基配列を決定し、所望の
塩基配列であることを確認した。上該プラスミドを５ａ
ｃｌ、ＥｃｏＲＩで消化し、４％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行ない、０．２Ｋｂ断片を回収した。

一方、ｐＦ−１をＥｃｏＲＩと５ａｃｌで消化し、ｃＤ
ＮＡの５′非翻訳領域、シグナル配列。

５′側の翻訳領域の一部を含む０．６１Ｋｂ断片を回収
した。回収したＥｃ　ｏＲＩ、　　Ｓａ　ｃ　ＩＯ，６
１Ｋｂ断片と合成オリゴヌクレオチドを接続した０、２
Ｋｂ断片をＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＳＶ−
Ｇ、にＴ４ＤＮＡリガーゼにより接続し、大腸菌ＪＭ１
０９に形質転換した。形質転換体から、所望の方向に接
続された発現用プラスミドｐｓＶ−Ｆ２．ｐＳＶ−Ｆ３
を得た。

（Ｃ）形質転換細胞の調製 宿主細胞としては、好適にはチャイニーズハムスター卵
巣細胞（ＣＨＯ−に、）が用いられる。

培養液は好適には１０％胎仔牛血清を含むハムのＦ−１
２培地を用いる。組換えＤＮＡの細胞への導入方法はリ
ン酸カルシウム沈殿法（ストレインら、Ｂｉｏｃｈｅ＋
ｓ、　Ｊｏ、　２１８．４７５−４８２．１９８４）が
行われる。本発現物質が発現している細胞を選択するた
めには、同時に薬剤耐性遺伝子を導入して、薬剤耐性株
を選択する方法が用いられる（スブラマン＾ｎａ１．　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３５．　１−１５．１９８３）
　。本発明では、動物細胞内でＧ−４１８に耐性を示す
Ｎｅｏ’遺伝子（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　３　
’　−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ■）を
ｐｓｖ−ｃ、に接続したｐｓＶ−ＮＥＯを用いた（特開
昭６２−２３６４９３）（第５図）。

２倍濃度のヘベス緩衝液（２ＸＨＢＳ）ｌｏｇ／ｉ、ヘ
ペス（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸）６ｇ／１ＮａＣ１ｐＨ７，１
に調製２．５ｄ、　７０ｍＭＮａＨｚＰＯｎと７０ｍＭ
ＮａＨ，ＰＯ，の水溶液５０ｕ　Ｉ！、　　１　ｕ　ｇ
／ｍサケ精子ＤＮＡ１００μ！２組み換えＤＮＡ　（ｐ
ＳＶ−Ｆ　１（ｐＳＶ−Ｆ２．ｐｓＶ−Ｆ３）１０μｇ
、　　ｐＳＶ−ＮＥＯ（第５図）０．１ｇｇ）１００μ
ｌをチューブに加え、滅菌水で全Ｎ４．７−にしたＢ液
を調製した。このＢ液にＡ液（２Ｍ　ＣａＣ１ｇ）　３
００　ａ　ｌを加えた。Ｂ液に空気を送りながら撹拌し
、Ａ液をゆっくり滴下した。Ａ液を加え終った後、１〜
２分空気を送りつづけ、均質な沈澱を形成させ、１０分
間静置した。ＣＨＯ細胞は、トランスフェクションの前
日に、１００■シヤーレに５Ｘ１０’個まき、２４時間
ＣＯ□インキュベーターで培養した。培養液は１０％胎
仔牛血清を含むハムのＦ−１２培地を用いた。この培養
シャーレに、微小沈澱液１ｍｉを滴下し、均一に拡散さ
せた。１０分間の静置により、ＤＮＡ−リン酸カルシウ
ム微小沈澱を細胞に吸着させた後、再びＣＯ２インキュ
ベーターで培養した。トランスフェクションの１８時間
後に、培地交換を行い、さらに４８時間後Ｇ−４１８含
有培地と交換した。Ｇ−４１８の濃度は４００μｇ　／
　ｄである。Ｇ−４１８含有培地で生育した集落をシリ
ンダー法で分離し、Ｇ−４１８耐性形質転換細胞を得た
。

宿主細胞としては、その他、ヒト由来の培地株化繊維芽
細胞が利用される。

【図面の簡単な説明】

本発明の腫瘍細胞障害因子ｃＤＮＡの塩基配列と塩基配
列から推定されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 ※印はＮ−グルコシド結合Ｉ！鎖構造を示す。 第２図 本発明の腫瘍細胞障害因子遺伝子の検索にもちいられた
合成オリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。 第３図は、ｐＳＶ−Ｆｌの作成を説明する図、第４図は
、ｐＳＶ−Ｆ２．ｐＳＶ−Ｆ３の作成を説明する図、第
５図は、コトランスフエクションに用いた選択プラスミ
ドｐＳＶ−ＮＥＯを説明する図。 符号の説明 １、Ａｐ’−アンピシリン耐性遺伝子 ２、ＣＩＰ＝牛小腸由来アルカリホスファターゼ ３．３−Ｊ＝スプライシングジャンクション４、Ｎｅｏ
’＝ネオマイシン耐性遺伝子５．５Ｖ４０ｐｏｌｙ−Ａ
＝ＳＶ４０のポリＡ付加シグナル Ｈｚ図 ＧＧ 第　　Ｉ ＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧ　ＣＡＧＣ
ＴＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡ　ＣＴ廿ＣＴＧＧＣ
Ａ　ＡＡＣＧＴＴＴＣＴＣＧＴＧＣＣＧＣＴＧＴ　ＣＴ
ＣＴＧＡＧＧＧＧ　ＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴ
ＣＡＴＴ　ＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴ　ＧＡＴＡＡＴＴＴｒ
Ｔ図　ζＣノ ロ００ 第２図 ｐｒｏｂｅ　Ａ ｐｒｏｂｅ　Ｂ Ｓ’−ＡＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＡＴＡＣＡ−３’ＧＴ
　　　　　ＡＧ 第　　５　　図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも以下のアミノ酸配列を含む腫瘍細胞障
   害因子をコードするＤＮＡ配列。【遺伝子配列がありま
   す】 （ＰはＯＨまたはＰｒｏ）
2. （２）腫瘍細胞障害因子をコードするＤＮＡが第１図中
   の塩基番号２９８から８０４または８０７までのＤＮＡ
   配列で示される請求項１のＤＮＡ配列。
3. （３）請求項１のＤＮＡ配列を適当な宿主中で発現する
   ことのできる発現ベクター。
4. （４）請求項３のベクターで形質転換された宿主。