JPH01180900A - 細胞接着活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フィブロネクチン様の細胞接着活性タンパク
質に関し、更に詳しくは、ヒトフィブロネクチンの細胞
接着活性を有するポリペプチド及びその製造方法に関す
る。

〔従来の技術］ フィブロネクチンは、動物の種々の組織や体液中、また
、培養細胞表面などに広く分布する多機能糖タンパク質
であり、細胞の接着、伸展、移動、分化、増殖、償食作
用などの生理作用を示し、組織修復、組織構築、生体防
御などに関与していることが知られている。

フィブロネクチンは、分子量約２５万のポリペプチドが
Ｃ末端付近でＳ−Ｓ結合で２量体を形成している。分子
内アミノ酸配列に、繰返し構造を有し、■、■、■型に
分けちれる。更に、種々の機能を有するドメイン構造を
有し、細胞接着、コラーゲン、ヘパリン及びフィブリン
等に対する結合活性を示す。これらのドメインのうち、
細胞接着ドメインについては、その生物活性から産業上
の利用が考えられており、例えば、培養基質のコーティ
ング剤として、細胞が付着する基質の調製に使用するこ
とができる。

また、細胞付着の促進剤として、点眼液、ローション、
外傷治療薬等に使用することができる。

フィブロネクチンの細胞接着ドメインの基本構造につい
て汀、その最小必要単位としてＲ−Ｇ−Ｄ−８配列が明
らかにされており〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）第３
０９巻、第６０〜５６頁（１９８４）］、この配列を含
む１０８アミノ酸残基からなる分−Ｆｉｌ、１５万のポ
リペプチドが、細胞接着活性ペプチドとして特表昭５９
−５０１５４８号公報に記載されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、この分子量１．１５万のポリペプチドの
細胞接着活性は、天然のフィブロネクチンに比べて非常
に弱く、前記の用途として用いるには必ずしも実用的と
はいい難い。このことについては、例えばジャーナル　
オン　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、、　Ｏｈｅｍ、　）第２６０巻、第１３２５６〜１５
２６０頁（１９８５）に記載されている。また、本発明
者らは、前記分子ｉ１．ｊ５万のポリペプチドを遺伝子
工学的に製造し、そのＮＲＫ細１＠（ラット腎細胞）に
対する細胞接着活性を、天然のフィブロネクチンと比較
した。その結果、フィブロネクチンは［１１〜１μ？／
ウエルで活性がみられたのに対し、公刊［，１５万のポ
リペプチドでに４０μｍ／ウェルでも活性は認めらｉな
かった。

本発明の目的は、フィブロネクチンの細胞結合ドメイン
ペプチドとして、実質的に細胞接着活性を有するアミノ
酸配列を明らかにし、その製造方法を提供することにあ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はポリペプチ
ドに関する発明であって、フィブロネクチンと実質上同
等の細胞接着活性を有していることを特徴とする。

また、本発明の第２の発明はＤＮＡに関する発明であっ
て、上記第１の発明のポリペプチドをコードすることを
特徴とする。

更に、本発明の第３の発明にポリペプチドの製造方法に
関する発明であって、上記第２の発明のＤＮＡ配列が組
込まれたベクターが導入された大腸菌を培養し、培養物
より前記第１の発明のポリペプチドを採取することを特
徴とする。

前記課題を解決する手段としては、フィブロネクチンの
細胞結合ドメインに相当する種々の鎖長のポリペプチド
全コードするＤＮＡ配列を発現ベクターに接続し、宿主
細胞に導入して、目的とするポリペプチドを生産させ、
それぞれを単離して、細胞接着活性を測定することによ
り解決される。実際、そのような手段により、公刊［１
５万のポリペプチドには、細胞接着活性がほとんどない
こと、しかし、そのＮ末側を延長した２８３アミノ酸残
基から成るポリペプチドには天然のフィブロネクチンと
ほぼ同等の細胞接着活性があることなどが、本発明者ら
によって見出された。本発明は、これらの知見に基づい
て達成された。

以下、ｌ１ｊｉ　’に追って、本発明を具体的に説明す
る。

ヒトフィブロネクチンの全アミノ酸配列及びソノＣＤＮ
Ａ　配列ＩＤ、ジ　エムボ　ジャーナル（Ｔｈｅ　ＥＭ
ＢＯＪｏｕｒｎａｌ　）第４巻、第１７５５〜１７５９
頁（１９８５）に記載されている。その細胞接着ドメイ
ンのアミノ酸配列から、対応するｃＤＮＡ　ｋクローニ
ングする手段は公知であり、例えばヒト肝臓からポリＡ
を含むＲＮＡ画分を調製し、岡山−バーブ法あるいは、
ガブラーーホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ　−Ｈｏｆｆｍａｎ
ｎ　’）法等によりｃＤＮＡライブラリーを作製するこ
とができる。

一方、その様なｃＤＮＡライブラＩＪ　−Ｕ市販されて
お沙、例えばクローンチック社より購入することができ
る。ｃＤＮＡライブラリーから目的のｃＤＮＡクローン
ケ得る方法としては、アミノ酸配列に対応しｆｃＤＮＡ
’ｉプローブとするコロニーハイブリダイゼーションあ
るいはブラークツ１イブリダイゼーシヨンが用いられる
。プローブとハイブリダイズするクローンを選択し、培
養菌体あるいはファージ溶菌液からＤＮＡ’ｉ抽出し、
制限酵素で切断する。電気泳動にかけてインサートの確
認を行う。必要とあれば、サザンプロツテイングにより
、インサートが、プローブとハイブリダイズすることの
確認を行う。最終的にはインサートの塩基配列をダイデ
オキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ　）法等の方法で調べることに
より、目的のクローンを同定することができる。

フィブロネクチンの細胞接着ドメインをコードするｃＤ
ｌｌＡ　ｆｉ（組込んだベクターは必要に応じて宿主内
で増幅され、精製され、更に、制限酵素による切断によ
りｃＤｌｉＡ部分を切出し、電気泳動によりｃＤＮＡ断
片を精製することができる。

このｃＤＮＡ断片を、発現が可能なベクターに読取り）
Ｖ−ムが合うようにＤＮＡリガーゼで接続し、宿主細胞
に導入することにより、ｃＤＮＡの発現が可能となる。

大腸菌？宿主とする発現ベクターとしては、既存のすべ
てのベクターが使用可能であるが、好ましくは、プロモ
ーター活性が強く、誘導発現が可能な宿主−ベクター系
を用いる。そのようなベクターとしては、例えば、λＰ
Ｌプロモーターを組込んだベクター、１ａｃ７’ｃ＋モ
ーターを組込んだベクター、ｔｒｐプ０モーターに組込
んだベクター、ｐｓｔｓプロモーターを組込んだベクタ
ー、１ａｃとｔｒｐの両プロモーターヲ組込んだベクタ
ー、１ｐｐブロモ−ターを組込んだベクター、１ｐｐと
ｌａｃの両プロモーターを組込んだベクター等が知られ
ている（榊　佳之著「ベクターＤＮＡ」、講談社すイエ
ンテイフィク、１９８６年）。

また、発現されたペプチドが分泌可能なように、シグナ
ルペプチド遺伝子の下流に外来遺伝子を挿入できるベク
ターを利用することもできる。

目的のポリペプチドの遺伝子をシグナルペプチド遺伝子
の下流に接続できるような発現ベクター％６るいＵｉ接
発現ベクターを用いてペプチドを発現させる場合、ベク
ターとの接続において、目的ポリペプチドのＮ末にベク
ター由来の数個のアミノ酸配列が含まれる場合がある。

これらの配列が付加することによって、ポリペプチドの
細胞接着活性が本質的に変化することはなく、そのまま
使用することができる。しかし、これらの配列を必要に
応じて遺伝子工学的に除去することもできる。これに、
部位特異的変位導入と呼ばれ、確立された技術である。

一般的には、異種のペプチドが大腸菌で発現した場合、
異種ペプチドが宿主の生育に有害となることが多いので
、あらかじめ、プロモーター’）　プＶツサ一の存在下
に生育させたのち、リプレッサー全不活化するか、イン
デューサーを添加することにより、異種ペプチドの発現
を誘導する方法がとられるが、異種ペプチドが宿主大腸
菌に有害でない場合は、この限りでにない。

本発明で発現させるポリペプチドは、宿主大腸菌に有害
とはいえないので、必ずしも誘導発現に限定する必要は
ない。

細胞接着ポリペプチドの遺伝子を組込んだベクターを常
法によ）大腸菌に導入し、形質転換大腸菌を、発現に適
した条件下に培養し、目的ポリペプチドを発現させるこ
とができる。目的ポリペプチドの発現の確認には、イム
ノブロッティングの手法を用いることができ、例えば培
養菌体に、１９ＤＩ９を含むバッファーを加えて加熱し
、全タンパク質を可溶化した後、ポリアクリルアミド電
気泳動にかける。泳動パターンをニトロセルロースやナ
イロンのメンプランに移し取り、フィブロネクチンの細
胞接着ドメインに特異的なモノクローナル抗体を作用さ
せ、更に酵素標識第２抗体を結合させる。結合した第２
抗体の酵素活性を、発色基質で発色させることにより、
目的のポリペプチドのバンドを確認することができる。

大腸菌からの細胞接着ポリペプチドの精製は、例えば次
のようにする。集菌した菌体ベレツトをバッファーに懸
濁し、超音波処理により可溶性画分と不溶性画分に分け
、後者は、更に７Ｍ尿素を含むバッファーで可溶化する
。可溶性画分ヲ集めて、イムノブロッティングで用いた
抗体を結合させたモアロース４Ｅカラムにかけ、アフイ
ニテイ精製を行う。溶出に１ｊｐＨ２付近のパンファー
を用いる。イムノブロッティングにより、目的ポリペプ
チド画分を集めることにより、電気泳動的にほぼ単一の
ポリペプチドを得ることができる。必要とちれば、ＦＰ
Ｌ（１！又はＨＰＬ（！で更に精製することができる。

このようにして得られたポリペプチドが細胞接着活性を
有するか否かに例えば次のようにして調べる。

パンファーに溶かしたサンプルを、マイクロタイタープ
レートに吸看させた後、ＩＩＩＲＫ細胞（正常ラント腎
ａ３胞）の懸濁液を添加し、３７℃で１時間培養後、細
胞の形態変化により接着活性の有無を観察する。接着活
性を発現するウェル当りの最少ｆｆｉ’？天然のフィブ
ロネクチンと比較することにより、接着活性の強さを表
すことができる。

このようにして、フィブロネクチンの細胞接着ドメイン
に相当するいくつかのポリペプチドを遺伝子工学的に製
造し、その生物活性を調べることにより、接着活性発現
に必要かつ十分なポリペプチド配列が明らかとなった。

後記表１に得られたポリペプチドの細胞接着活性をフィ
ブロネクチンと比較して示した。この結果からＡ１ａ１
２３５　　Ｍ　θ１，１５１７−２含むポリペプチドは
、実質的にフィブロネクチンと同等の強い細胞接着活性
を有することが明らかとなった。細胞接着活性を有する
ポリペプチドは、そのまま、あるいは、三官能架橋剤を
介して他のペプチドと結合させて使用することができる
。他のペプチドと結合させる方法としては、例えば、ペ
プチドのＣ末端にＣｙｓ残基を付加しておき、Ｏｙｓ残
基全基金架橋剤えば３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを介し
て、他のペプチドのアミノ基と結合させる方法がとられ
る。ペプチドのＣ末端にＣｙｓ残基全基金付加ことは遺
伝子工学的に容易に達成することができ、例えば、目的
のポリペプチド？コードする遺伝子をクローニングする
際に６′末端を０７日に対応するコドンを付加した合成
りＮＡで置き換えればよい。

本発明のポリペプチドの列としては下記のものが挙げら
れる。

すなわち、少なくとも下記一般式■で表されるアミノ酸
配列を含むものがある： −・・〔■〕 また、上記一般式！で表されるアミノ酸配列のＣ末端に
Ｃｙ８残基が付加したものがある。

〔実施例〕

以下、本発明を実施列により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ フィブロネクチンの工１ｅ”０−Ｍｅｔ１５１７（１０
８アミノ酸残基）をコードするｃＤＮＡ断片のクローニ
ング（第１図参照） なお、第１図は、フィブロネクチンの工１ｅ１４１Ｇ−
Ｍθｔ１５１７　ｆ含むポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を組込んだ発現プラスミドの構築の工程を示す図
である。

（１−１）　　ｃＤＮＡ断片の調製 フィブロネクチンの細胞接着ドメインをコードするｃＤ
ＮＡ配列を含む４．１ｋｂのプラスミドｐＬＦ　５　［
バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第
２５巻、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）］１０［
］μりを、制限酵素Ｂａｄ　Ｉ用バッファー及び１００
−１＝ツトのＢａｄ　ｌ　ｆ含む２００　ｐｌの反応液
中、３７℃、２時間インキュベートした。

反応液を、ニュクレオジエン（ｎｕｃｌｅｏｇｅｎ　）
　社製ＨＰＬＯカラムＤＥＡＥ−４０００（６Ｘ　１２
５　ｗｍ　）にかけ、５Ｍ尿素を含む３０　ｍＭ　　リ
ン酸カリウムパンファー（ｐＨ＆５）中でＫＣｔの濃度
勾配で溶出し、イソプロピルアルコール沈殿により、Ｑ
、　７５　ｋｂ　の断片Ｚ５μ？？得た。次に、この断
片を３０ユニツトのＦｏｋ　Ｉで３７℃、１時間処理し
、同様の精製方法で９２　ｂｐと２０５　ｂｐの断片を
それぞれ６０　＋１及び１４０　ｎｆ得た。

（１−２）　　合成りＮＡリンカ−の調製ｃＤＮＡ断片
をベクターに接続するための５′側及び６′側リンカ−
を、次の方法により化学合成した。塩基配列は、第１図
に示しである。５′側リンカ−の上のストランド（鎖長
１１　）ｉ５Ｕ。

下のストランド（鎖長７）ｆｔ５ＩＪ、また５′側リン
カ−の上のストランド（鎖長５ｏ）Ｉｓａ。

下のストランド（鎖長５ｏ）Ｉ３ｈと名付けてそれぞれ
アプライドバイオシステムズ社のＤＮＡ合成機を用いて
合成した。脱保護の後、５Ｕ及び５　Ｌｉｊ（オン交換
ＨＰＬＯ（Ｔ８’にゲルＤＥＡＥ−２０００）で精製ち
、５ｅｐＰａｋ　　（ウォーターズ社）で脱塩し、それ
ぞれ６０μ？、４０μ？を得た。３Ｕ及び５Ｌに７Ｍ尿
素を含む１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、ゲル片から抽出後、同様に脱塩して、それぞれ３２
μ？、２６μＶを得た。塩基配列は、固相マキサム・ギ
ルバート法で確認した。各ストランドは次の方法により
５′末端ｋ　＋）ン酸化し念。すなわち、２５μｍのＤ
ＮＡ１１０μｔの蒸留水に溶かし、ＰＮＫ（ポリヌクレ
オチドキナーゼ）用バッファー（５０ｍＭｌ−リス（Ｔ
ｒｉｅ　）　ＨＣｌ。

ｐＨ７，６，１０ｍＭ　Ｍｇ０Ｌ、、　１０ｍＭＤＴＴ
］、１ｍＭＡＴＰ及び５ユニツトのＰＮＫケ含む２０μ
ｔの溶液中で３７℃、１時間インキュベートし、６５℃
、１０分の処理で反応を停止した。リン酸化の後５Ｕと
５Ｌ、３Ｕと３１．ｚ−それぞれアニーリング操作によ
り、２重鎖とした。

すなわち、５Ｕと５Ｌを等量混ぜて、６０℃に１０分間
保持した後徐々に室温に戻し、更に１５℃まで冷却した
。３Ｕと６Ｌについても同様に処理した。

（１−３）　　ｃＤＮＡ断片とリンカ−の結合（１−２
）で調製した２種のリンカ−及び（１−１）で調製した
２種のＩＩＮＡ断片（９２ｂｐ及び２ｏ３ｂｐ）ｋ用い
て、ライゲーション反応に供した。すなわちｃＤＮＡ断
片各１１５　ｐｍｏｌｅ、！Ｊ　ｙ　ｙｂ　−各５　ｐ
ｍｏｌｅを、ライゲーションバッファ　−（６６ｍＭ　
　　ト　リ　ス　ＨＣｌ、　　　ｐＨ７，６、６，６ｍ
ＭＭｇＯＬ、　）、α５ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＤＴ
Ｔ及ヒ２．８ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む２０
μｔの溶液中で１６℃、−夜インキユベートした。反応
液を６５℃、１０分処理した後２倍量の冷エタノールを
加えて、−７０℃に３０分保持した後遠心によりＤＮＡ
’ｉ沈殿として回収した。これｋ、ＥｃｏＲエバツファ
ー、７．５ユニツトのＥｃｏＲ工ｆ含む２０μｔの反応
液中、３７℃、３０分インキュベートした後、ポリアク
リルアミド電気泳動にかけて５３６　’ｂｐの断片を切
出シ、ゲル溶出バッファー（１５Ｍ酢酸アンモニウム、
［ｌＬ０１Ｍ酢酸マグネシウム、１ｍＭＥＤＴＡ　）で
３７℃、１０時間抽出しエタノール沈殿により、ＤＮＡ
１回収した。これヲ２０μｔのＴＥ（１０ｍＭトリスＨ
Ｃ６，１ｍＭＥＤＴム、ｐＨａｏ）に溶かした。

（１−４）　　リンカ−を結合したｃＤＮＡ断片とベク
ターの結合 １μｍの分泌型発現ベクターｐＩＮ　Ｉｌｌ−ｏｍｐＡ
ｌ〔ジ　エムボ　ジャーナル、第６巻、第２４３７〜２
４４２頁（１９８４）〕？制限酵素ＥｃｏＲＩ用パンフ
ァー中５ユニットのＥｃｏＲ工と共に５７℃、１時間イ
ンキユベートシ、次いテ０．５ユニットのアルカリホス
ファターゼを加え、更に１時間インキユベートシ念。反
応液をフェノール処理（２回）した後、エタノール沈殿
により、Ｑ、５μ７のＤＮＡ’ｉ回収した。ＥｃｏＲ工
で切断し、脱リン酸したｐＩＮ　ｉｌｌ　ｏｍｐ　Ａ１
　　ベクター０．１ｐ？　　と（１−ｓ’）で得たＤＮ
Ａ断片の１０μｔをＴ４ＤＮＡリガーゼ用パンファー、
α５ｍＭＡＴＰ。

１０ｍＭＤＴＴ及び２．８−Ｌ二７トのＴ４ＤＮＡリガ
〜ゼを含む６０μｔの反応液中、１６℃、−夜インキユ
ペートした。この反応液１５μｔを大腸菌の形質転換に
使用した。

（１−５）　　大腸菌の形質転換 大腸菌Ｓ　Ｂ　２２１　［ジ　ェムボ　ジャーナル、第
３巻、第２４３７〜２４４２頁（１９８４）］を５＋ｄ
（ＤＬ−グロス（バクトドリプトン、１゜１／１．酵母
エキス５　？　／　Ｌ、　１Ｎａｃ！ｔ５　？　／　Ｌ
。

ｐＨ７，２）を含む２０ｍ容試験管で３７℃、−夜振と
う培養した。その［１０５ｓａ／ｉ５ｗ／の新しいＬ−
グロスに接種し、６００　ｎｍの吸光度が０．６になる
まで振とり培養した。これを氷冷し、４℃、５　Ｄ　０
０　ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。これにあ
らかじめ氷冷したＱ、１ＭＭ　ｇ　ＯＬ、を２．５ｄ加
え混合した後、同様に遠心分離して上清を除去した。更
に、氷冷した０、１ＭＣａ　Ｏｌ、を１．２５−加え、
穏やかに混合し氷水中に３０分間保持した。遠心分離に
より上清を除去した後、氷冷したＣＬ　Ｉ　Ｍ　　０ａ
Ｃ４ｆ　Ｏ，１−加え穏やかに懸濁した。これに、（１
−４）で得た反応液１０μｔ’（加え、氷水中に３０分
間保持した。次に、４２℃で２分間加熱処理を行った。

更に、３７℃に加温したＬ培地を１−加え、３７℃で３
０分間インキュベートした。更に　３７℃で１時間振と
り培養した。培養液を、５０μ２２場のアンピシリンを
含むＬ寒天培地に塗布し、６７℃で一夜培養し生育する
コロニーを分離した。その結果、約２００のコロニーが
得られ、そのうちの１４コロニーにつき、ブラスミドの
分析を行った。

（１−６）　　プラスミドの分析（ラピッド法）１４糧
の形質転換体を５０μｆ／−のアンピンリンを含むｉ、
　５　Ｎｔの一−ブロスで一夜振とり培養した後、遠心
分離により菌体ペレット全回収した。菌体を１００μｔ
の溶液Ａ　（５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ、２５ｍＭ　　トリスＨＣ４％ｐＨａｏ、２ｍＩ／−
リゾチーム）で懸濁し、室温に５分保持した後、２００
μｔの溶液Ｂ（α２　Ｎ　　ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ　）
ｅ加え、容器を５回穏やかに転倒させ、０℃に１０分保
持した、１５０μｔの５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５，０）
を加えた後、２倍量の冷エタノールを加え、−７０℃で
３０分保持した後、遠心分離によりＤＮＡ’ｉ回収した
。これを８０％エタノールで洗浄し、真空ポンプでエタ
ノール水を除去し、少量のＴＥに溶かした。その一部（
ａ１μ１）ｉＥｃｏＲ工用バッファーと５ユニツトのＢ
ｅ　ｏＲＩを含む１０μｔの反応液中３７℃で１時間反
応させた後、アガロース電気泳動で分離し、エチジラム
ブロマイド染色で予想されるＤＢＩＡのバンド（ｃＬ３
３ｋｂ）　　の生成を調べた。その結果、９クローンに
目的のバンドが認められた。これら９クローンについて
更にＰｖｕ　ＩＩとＨｌｎｄＩｌｌ（Ｚ）２重消化を行
い、挿入断片の方向性？調べたところ、８クローンが正
しい方向に挿入されていた。これらのうちの５クローン
についてプラスミドからＸｂａ　ＩとＦｉｎｄ　ｍ　　
の２重消化で挿入断片を含むＤＮＡ；ｊｚ切出し、ファ
ージＭ１３ｍｐ１８及びｍｐ１９に組込んで、ダイデオ
キシ法による塩基配列分析を行ったところ、３クローン
が目的の配列を含むことを確認した。このようにして得
られた組換え体プラスミドｆ　ｐＴＦｌｏｌと命名した
。

（１−７）　　プラスミドの精製 前記（１−６）で得られたｐＴＦ　１０１を導入した大
腸菌（ＳＢ　２２１　／　ｐＴＦ　１０１　）　　を５
ｄのＬ−グロスに接種し、３７℃、−夜振とう培養した
。

これを、５００ｄの同培地に移して培養を続け、６６０
　ｎｍの吸光度がα６になった時点で１７０μｍ／ゴの
クロラムフエニコールヲ添加し、更に１０〜１２時間培
養した。５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、菌体２ｓＴ
Ｅ（１０ｍＭ　　トリスＨＣ！ｔ、　ｐＨ８，１００ｍ
Ｍ　　Ｎａ１ｌ、　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）で洗浄し
、同様に遠心分離でペレット’１回収した。１０ｍの溶
液ＡＫ懸濁し、室温に５分保持し、史に２０−の溶液Ｐ
を加え穏やかにかくはんし、０℃に５分間保持した。１
５Ｎ１．の３Ｍ酢酸カリウムを加え穏やかにかくはんし
た後、０℃に１０分保持した。８ＤＯＯｒｐｍ、６０分
遠心して４５−の上清を得、これに２７−（α６倍量）
のイノプロピルアルコールを加えて室温に１５分保持し
た。遠心分離で沈殿を回収し、８０％エタノールで洗浄
した。残存エタノール水を真空ポンプで除いて乾燥した
。これを、４−のＴＥに溶かし、４．７５１の塩化セシ
ウムを加え、更に５■／−のエチジウムブロマイドを４
２０μを加え０℃に６０分保持した。８０００ｒｐｍ、
１０分間遠心し、不溶物を除去した上清をペックマン社
クイックシールチューブに入れ、５５０００回転で一夜
超遠心分離を行った。紫外線照射下にプラスミドのバン
ドを注射器で抜取った。等量のイソプロピルアルコール
で７回抽出してエチジウムブロマイドを除去した後、エ
タノール沈殿を２回、更１１１ｃ８０％エタノールで洗
浄して、真空乾燥後、適量のＴＲに溶かした（収量７６
０μ？）。

実施例２ フィブロネクチンのＡｌａ”ｓ−Ｍｅｔ１５’　　（２
Ｂ　５アミノ酸残基）をコードするｃＤＮＡのクローニ
ング（第２図参照） なお、第２図に、フィブロネクチンのＡ　１　ａ　１２
３５−　Ｍ　ｅｔ１５１７　　を含むポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を組込んだ発現プラスミドの構築の
工程を示す図である。

５０μノのプラスミドｐＬＦ　５　Ｑ　ＢｃｏＲエメチ
ラーゼバソファ−（１００ｍＭ　　トリスＨＯｔ、１）
”８０１２ｍＭ　　ＤＴＴ、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、８
０μＭＳ−アデノシルメチオニン）及び２００ユニツト
のＥｃｏＲエメチラーゼを含む反応液２００μを中で、
６７℃、６０分インキュベートしＥｃｏＲエサイトに保
護した。６５℃、２０分の処理で反応を停止した後、Ｐ
ｖｕ　１１パンフアー及び９６ユニツトのｐｖｕ　ｎを
加え、反応液６００μｔとして６７℃、６０分間インキ
ュベートした。

これを、アガロース電気泳動にかけ、０．６０ｋｂの断
片を切出した。これを溶出バッファー（５ｍＭトリス酢
酸バッファー、ｐＨａＯｌｌ　ｍＭＥＤＴＡ）を含む透
析チューブに入れ、同ノくソファ−中で電気泳動溶出を
行ってＤＮＡ’ｉ抽出した。抽出液に対し２回のフェノ
ール抽出を行った後、ｉ／１ｏ容量の６Ｍ酢酸ナトＩＪ
ウムを加え、史に、２倍量のエタノールを加えて、エタ
ノール沈殿を２回行った。８０％エタノールで洗浄後乾
燥し、少量のＴＥに溶かした（収量１．２μ７）。

一方、実施例１で得たプラスミドｐＴＦ　１０１の１４
０１’ｋ、１４４ユ＝ツトのＰｖｕ　Ｉ［ｋ含む２００
μｔの反応液で３７℃、６０分インキュベートした後、
１５０ユニツトの１ｃｏＲ工を加えて、２４０μｔの反
応液とし、３７℃、６０分インキュベートした。ポリア
クリルアミド電気泳動にかけ、０．２５　ｋｂ　の断片
を切出した。ゲル片から前述の方法でＤＮＡ’！ｉ抽出
し、エタノール沈殿によｆｉＤＮＡ＋ｉ回収した（収量
ｃＬ４μ？）。先に得たａ　６　ｋｂの断片１．２５μ
ｍ　とα２５　ｋ’ｂ　の断片Ｑ、４μ？　を２．８ユ
ニツトのＴ４　　ＤＮＡリガーゼ、０．５ｍＭＡＴＰ及
び１０ｍＭＤＴＴ’ｉ含む５０μｔのリガーゼバッファ
ー中で、１６℃、６０分インキュベートした。

反応液に９２　ｐｍｏｌｅのリン酸化リンカ−（Ｉ）Ｃ
ＯＧＡＡＴＴＧＧ　）及び１．４ユニツトのＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼを加え、液量７０μｔ　として１０℃で一夜
インキユベートした。６５℃、１０分の処理で反応を止
め、バッファーｆ　ＥｃｏＲ工至適条件ＫＬ、３０ユニ
ツトのＥｃ　ｏＲ工を加工て、３７℃、６０分間反応さ
せた。反応液をアガロース電気泳動にかけ、１８６　ｋ
ｌ）のバンドを切出し、前述の方法でＤＩＪＡを回収し
た（約２　ｓ　ｔｌ　）。

［１８６ｋｂ　断片２０ｎＰと、ＥｃｏＲ工で切断し、
脱リン酸したベクターｐ工Ｎ−ｍ−ｏｍｐＡ１　　の０
．１μＦヲ２．８ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ、１５
ｍＭＡＴＰ及び１０ｍＭＤＴＴｉ含む２０μｔのリガー
ゼバッファー中、１６℃、１０時間インキュベートした
後、反応液の捧ヲ用いて、前述の方法で大腸菌５Ｂ２２
１を形質転換させた。得られた形質転換体のうちの４８
クローンについて前述の方法でプラスミド分析を行い、
６クローンに目的断片を含むプラスミドが検出された。

更に、これらのプラスミドｆ　Ｂａｍ　Ｈ１消化して、
生成する断片を分析した結果、５クローンが正方向に挿
入された目的断片を含んでいた。更に、そのうちの３ク
ローンについて塩基配列を調べたところ、１つのクロー
ンが正しい塩基配列を持つことを確認した。この組換体
プラスミドを、ｐＴＦ　３０１と命名し、このプラスミ
ドを保持する大腸菌５Ｂ２２１’ｉ、エシェリヒア・コ
ーリ５Ｂ２２１　／　ｐＴＦ　３０１と命名した。次に
、ｐＴＦ　３０１　ｉｓら、ｔ　８　ｋｂ　　のＥｃｏ
ＲニーＳａｌ　ｌ断片を切出し、これ１ｉｐＵｃ１８　
　のＢｃ　ｏＲニーＳａｄ　Ｉサイトに接続して得られ
た組換え体プラスミドをｐＴｌｉ　１４０９と命名し、
そのプラスミドを保持する大腸菌ＨＢ　１０１　　ｆ　
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ　１０１　／　
ｐＴＦ１４０９　　と命名して、表示し、工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第９７１６
号（ＦＥＲＭ　Ｐ　９７１６）］。

実施例６ フイプロネクチ７　ｃＤ　Ｇａｙ””−Ｍｅｔ”１７（
５０４アミノ酸残基）？コードするｃＤＮＡのクローニ
ング（第３図参照） なお、第３図は、フィブロネクチンの（３１ｙ　１０１
４Ｍ　ｅ　ｔ１５１７　２含むポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を組込んだ発現プラスミドの構築の工程を
示す図である。

（３−１）　　ブライマー伸長法によるＣＤＮＡ合成フ
ィブロネクチンｍＲＮＡに相補的な配列を有する１７塩
基合成ブライマー（”　ｐＧＴＣＴｃｃｃＡＣＴＧＡＡ
ＧＴＧＣ６′）　　＋ｉ前述の方法に従って調製した。

この合成プライマーを用いてヒト肝臓由来ポリ（４）＋
ＲＮＡ　　（クローンチック社）から、ｃＤＮＡを合成
した。

ｃＤＮＡ合成には、アマジャム社１”’　ＣＤＮＡ合成
システム」に含まれる試薬を用いた。すなわち、５×フ
ア一ストストランド合成パンファー４μｔ、　ピロリン
酸ナトリウム溶液１μｔ１　リボヌクレアーゼインピヒ
タ−１μｔ　（２０ユニツト）、デオキシ三リン酸混液
（１０ｍｌｌ）２μｔ５　合成りＮＡプライマー１μｔ
　（ｌ１１μ？）、〔α−”２ｐ〕ｃｌｃＴＰ　５μＯ
１及びポリ（Ａ）ＲＮＡ　１μｔ（１μ？）ヲ水冷下エ
ツペシドルフチューブに順次加え、静かに混和した。２
０ユニツト（１μ？）の逆転写酵素と蒸留水を加えて全
量を２０μｔとし静かに混和した後、４２℃で５０分間
インキュベートした。これを水浴に戻し、セカンドスト
ランド合成用バッファー３７．５μｍ、　　［α−”ｐ
、］　ａｃＴＰ　５０μＣ１（５μｔ）、　大腸菌リボ
ヌクンアーゼＨ（１，８ユニツト（１μｔ）、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼ１の２３ユニツト（３，５μｔ）及び
水６３μｔを順次加え静かに混和した。１２℃、６０分
、次いで２２℃、６０分、史に７０℃、１０分インキュ
ベートし、水浴に戻し、２．０ユニツト（［１５μｔ）
のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加えた。静かに混和後、３
７℃、１０分間インキュベートした。１０μｔノ［Ｌ２
５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨａｎ　）及び１ｏｐｔの１０
％５ＤＳｉ加えて反応を停止させた。フェノール抽出を
２回行った後、等量の４Ｍ酢酸アンモニウムを加え、更
に、２倍量の冷エタノールを加えてドライアイス中に１
５分保持後、室温に戻して、１０分間遠心し上清を除い
た。

ペンットを５０μｔのＴＥに溶かし、もう−度エタノー
ル沈殿を行い、更に沈殿を２００μｔの冷エタノールで
洗浄し、乾燥した後、少！のＴＥに溶かした。

ｉ−２’）　　（！ＤＮＡのλｇｔ１０　　ファージベ
クターへの接続と、インヒドロパンケージ ング 前項（ｓ−１’）で得られたｃＤＮＡ　、　　［１５ｆ
ｉ？　のＥｃｏＲニリンカー（ｄ［ｐＧＧＡＡＴＴＣ！
（！、］　）　　リガーゼバッファー及び２．８ユニツ
トのＴ４　　ＩＩＮＡリガ−ゼを含む反応液１６．６μ
ｔ　ｉｌ　５℃−夜インキユペートした後、７０℃、１
０分の処理で反応を停止させた。パンファー’ｆ（Ｅｃ
ｏＲＩの至適条件にした後、５０ユニツトのＥｃ　ｏＲ
Ｉを加え、液量’１１００μｔとして３７℃、２時間イ
ンキュベートした後、７０℃、１０分の処理で反応を止
めた。この全ｊｔｋセファデンクスＧ−５０のカラム（
１ｉ）にかけてＳＴＢバッファー（１００ｍＭＮａＣ２
、１０ｍＭ　　　　）　　リ　ス　ＨＣｌ　、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１）Ｈａｏ　）で溶出し、遊離のリンカ−に除
去した後、ｃＤＮＡフラクションを、１０ｍＭ　　　ト
　リ　ス　ＨＣ！ｔ　（ｐＨＥＬＯ）　　、　　１１　
１　　ｍＭ　　　ＥＤＴＡに対して透析し、凍結乾燥し
た。これに３６３ｍＭ　ＮａＯ４，１０ｍＭ　ＭｇＣ４
ｆ加えて４．５ｐｌとし、２μ？　１０　／　ＥｃｏＲ
Ｉ　アーム（アマジャム社）［１５μｔ　（ＩｌｌＬ２
５μ？）を加え、更に、５μｔのＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造）Ｂｉを加え、２６℃、１０分インキユ
ベートシ、７０℃、１０分で反応を停止した。これを、
インビトロパンケージング反応に供した。すなわち、反
応液４μｔ２．２種のパンケージングエキストラクト（
ストラテジーン社）と静かに混和し、２２℃、２時間イ
ンキュベートしてファージ粒子を形成させ、５００μｔ
の８Ｍバッファー（１００ｍＭ　Ｎａ０ｔ、　８　ｍＭ
　Ｍｇ５Ｏ，，５０ｍＭ）リスＨＣ！ｔ、　ｐＨ７，５
，０，０１％ゼラチン）及び２０μｔのクロロホルムを
加え、４℃に保存した。

（５−５）　　プラークハイブリダイゼー７ヨンファー
ジ液の１００μｔｋあらかじめＬ−グロス＋［１４％マ
ルトースの培地で一夜培養し＆大腸菌Ｎ　Ｍ　５１４の
２００μｔに加え、３７℃、１５分インキュベートし、
４２℃に加温した４−ＯＬ−軟寒天培地（Ｌ−グロス＋
［１８％寒天）に加え、あらかじめ調製した２Ｏ−ＯＬ
−寒天プレート上に重層した。３７℃で一夜インキユベ
ートして得られ念プレート上にナイロンフィルター（ア
マジャム社、ハイボンドＮ）ｉ５０秒接触させた後、変
性溶液（［１５Ｍ　ＲＡＣｌ、１．５Ｍ　Ｎａ０６’）
　　で飽和した厚手の戸紙上に５分間量き、更に中和溶
液（０，５ＭトリスＨＣ６，ｐＨ７，０。

１５　Ｍ　Ｎａ０６）　　で飽和した戸紙上に５分間静
置した。次に、２　Ｘ　８８Ｃ（ｃＬ３　Ｍ　ＮａＣ！
ｔ、３０　ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）でフ
ィルターを洗浄し風乾した後、５００　ｎｍのＵＶ照射
（５分間）により固定し、レプリカフィルターとした。

一方、ハイブリダイゼーションニ用いるプローブを調製
した。すなわち、プラスミドｐＬＦ５の４μ？を、１２
ユニツトのＰｖｕ　ＩＩ、次いで１５ユニツトのＥｃｏ
ＲＩで分解し、アガロース電気泳動で０．４３　ｋｂ　
の断片１００ｎ？　を回収した。これを、アマジャム社
［マルチプライムＤＮＡラベリングシステム、」ヲ用い
て３２ｐでラベルした。方法は添付のプロトコールに従
った。

得られた標識プローブは、６０μｔで５．５Ｘ１０’ｃ
ｐｍであった。前述のレプリカフィルターを、６×５Ｓ
Ｃ１５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒａｔ　）（ＢＳＡ、
ポリビニルピロリドン、フィコール各Ｑ、１％）、［１
１，５％ＳＤＳ、８０μ？／−サケ精子ＤＢ＋Ａｉ含む
１５ｍｊの溶液中で６５℃、４時間インキュベートシ、
フレハイブリダイゼーションを行った。次に熱変性処理
した標識プローブ（２，７５Ｘ１０’　ｃｐｍ）（（加
え、同条件で一夜ハイブリダイゼーションを行った。フ
ィルター’１ｉ２Ｘｓｓｃ、ｃＬ１％ＳＤＳの洗液で６
５℃、１５分のインキュベートを２回、次いでＱ、　２
　Ｘ　ＳＳＯ。

ＣＬ１％ＳＤ８の洗液で６５℃、１５分のインキュベー
トを２回行った後２　Ｘ　ＳＳＯで軽くリンスし、オー
トラジオグラフィーを行った。その結果、４Ｘ１０”の
プラーク中に２５０のポジティブシグナルが認められた
。

（３−４）　　ファージＤＮＡの調製と挿入断片の分析 ポジティブシグナルを与えたファージクローンを１−０
８Ｍパンファーに懸濁し、その２５０μｔ２、あら力）
しめ−夜培養した大腸菌ＮＭ５１４の０．５ｔｆに加え
、３７℃、１５分インキュベートして、ファージを吸着
させ、１０ｍＭＭｇ、Ｃ！　４を含むＬ−グロス５ｄを
加え、３７℃、４．５時間振とう培養した。５０μｔの
クロロホルムを加え、更に１０分損色うした後、遠心分
離により上清（ファージ溶菌液）を得た。溶菌液に２０
μｍのＤＮａｓｅ　Ｉ　、　１０　ｐ？　のＲＮａｅｅ
　Ａを加え、３７℃、３０分インキュベートした。

更に０．２９　？のＲｈＣ１，［Ｌ５５ｒのＰＦｉＧ　
６０００を加えて、水中で２時間インキュベートした。

遠心でべＶットヲ回収し、４Ｃ１ＯμｔのＴＥに懸濁し
た。フェノール抽出を２回、フェノール／クロロホルム
抽出を１回、クロロホルム抽１ｆｉ−１回行った後、エ
タノール沈殿により、ファージＤＮＡを回収した。これ
を２０μｔのＴＥに溶かし、２０ユニツトのＥｃｏＲＩ
ヲ含む６０μｔの反応液中で６７℃、２時間インキュベ
ートし、アガロース電気泳動により、挿入断片の分析を
行った。その結果、２４クローン中、１クローンに１．
１ｋｂの挿入断片が認められた。この１．１ｋｌ）断片
をプラスミドｐＵＣ！１１８にサブクローニングし、得
られた組換え体プラスミドをｐＵＦＮ　７４と命名した
。これを用いて挿入断片の塩基配列をダイデオキシ法で
決定したところ、この断片はフィブロネクチンＣＤ１ｉ
Ａ　Ｃジ　エムボ　ジャーナル、第４巻、第１７５５〜
１７５９頁（１９８５）］の２２９９０番のＧから、４
１０５番目のＡまでを含むことが判明した。

但し、５０１８０１８番目、５０６５０６５番目３２１
６番目のＣにそれぞれＡ、Ａ、Ｔに置換していたが、ア
ミノ酸コードに変化になかった。

（３−５）　　ｐＵＦＮ　７４のＥｃｏＯ１０９−Ｂａ
ｍＨｌ　　断片の調製 ４０μｉのｐＵＦＮ　７４に対し、２００ユニツトのＥ
ｃｏｏ　１０９　　を加え、４００μｔの反応液中、６
７℃、２時間インキュベートした。エタノール沈殿によ
り、ＤＮＡを回収し、そのＶｔを７ｍＭトリ、ｚ、ＨＣ
Ｉ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ。

２０　ｍＭ　　ＮａＣ１，７ｍＭ　　Ｍｇ、Ｃ１ｌ　２
０　μＭ　　ｄＡＴＰ。

ｃＬＧＴＰ、　ｄｃ！ＴＰ、　ｄＴＴＰ　　及び２ユニ
ツトのりＶノウ酵素を含む２００μｔの反応液中、室温
、２０分インキュベートした。６５℃、１０分で反応を
止め、反応液をライゲーションバッファーの組成とし、
２．５　ｎｍｏｌｅのＥｃ　ｏＲニリンカー（ａ［ｐｃ
ｃａＡＡＴＴＯＧａ］　）　　及び２．８ユニツトのＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、１３℃、−夜インキユベート
した。加熱により反応を止め、６ｏユニツトのＢａｍＨ
ｌ、５０ユニツトのＥｃｏＲＴを含む４００μｔ　の反
応液中、３７℃、２時間インキュベー　トした。アガロ
ース電気泳動により１．　Ｏｋｂの断片０．２μｍを得
た。

（３−６）　　ｐＴＦ　３０１のＥａｍＨｌ　−Ｈ１ｎ
ｄ　ｉｎ　断片の調製 ５０μ？のｐＴＦ　３０１に２００ユニントのＥｃｏＲ
エメチラーゼを加え、２００μｔの反応液とし、３７℃
、１時間インキュベートした。

６５℃、２０分の処理後、６ｏユニツトのＢａｎＨｌ、
６Ｏ−Ｌ−：：、／トのＨ１ｎｃｌｌ’Ｔｈ含む４００
μｔの反応液とし、３７℃、２時間インキユベートシた
。アガロース電気泳動によりａ　５　ｋｂの断片０．１
μｉ　を得た。

（３−７）　　Ｇ１ｙｌＯ１４−Ｍｅｔ１５’？　（５
０４アミノ酸残基）？コードするｃＤＮＡ断片の構築 とクローニング （３−５）で得た１、Ｏｋｂ断片［Ｌ２μ？、（５−６
）で得た０、　５　ｋ’ｂ　断片α１μノ　を１００μ
１（Ｄ−ｙイゲー７ヨンバノファー中、２．８ユニツト
のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１６℃、−夜インキユベ
ートし、７０℃、１０分の処理で反応を止めた。反応液
ｆ　Ｈ１ｎｄ　Ｉｌｌ　　用バッファーとし、１２ユニ
ツトのＨ１ｎｄｌｌｌ’に含む１００μｔの反応液を３
７℃、２時間インキュベートした。気に、パンファー１
ＥｃｏＲＩ用の組成とし、１０ユニツトのＥｃｏＲ工ｆ
加えて、３７℃、２時間インキュベートし、加熱により
反応を止めた。

この反応液２０μｔをあらかじめＥｃｏＲニーＨ１ｎｄ
　Ｉｌｌ処理して脱リン酸したプラスミドル工Ｎ　ｍ　
−ｏｍｐＡｌの［１１６μ？を２．８ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ全含む６０μｔの反応液中、１６℃、−夜
インキユベートした。反応液のＡ量を用いて大腸菌ＨＥ
１０１　　を形質転換した。得らｆ′した形質転換体の
１２クローンにつき挿入断片を調べたところ、５クロー
ンに１．５　ｋｂ　の断片が認められた。その塩基配列
をダイチオキン法で決定し、フィブロネクチンノＧ１ｙ
’°１４からＭｆｌｊｔ１５”ｔ　”−ドするＣＤ１１
Ａ　’ｉ含むプラスミドを得た。このプラスミドｆ　ｐ
ＴＦ　１１０１　　と命名した。

実施例４ 部位特異的変異による付加配列の除去（第４図参照） なお、第４−１図に、ｐＴＦ　１０１における不要ＤＮ
Ａ配列及びアミノ酸配列と、それを除去した後のＤＮＡ
配列及びアミノ酸配列を示す図であり、第４−２図μ、
部位特異的変異によるｐＴＦ　１０１　力＞らの不要Ｄ
ＮＡ配列の除去の工程を示す図である。

ｐＴＦ　１０１やｐＴＦ　３０１に挿入されているｃＤ
ＮＡ断片を発現させると、シグナルペプチド以外にＮ末
にベクター由来の６アミノ酸が付加したペプチドが生成
される。シグナルペプチドは、宿主のシグナルペプチダ
ーゼにより除去されうるが、Ｎ末側に付加したアミノ酸
はそのままでに除去されない。そこで、この余分の３ア
ミノ酸？−一ドする９　ｂｐ　の配列を部位特異的変異
により除去すること？試みた。方法は井上らの方法〔ゾ
ロシーデイングス　オン　ナショナルアカデミ−オン　
サイエンス　オン　ザＵ、　Ｓ、Ａ、　（Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕ、　Ｓ、　Ａ
、　）第７９巻、第６４６８〜３４４１頁（１９８２）
］に準じて行った（第４−１図、第４−２図）。

５μ？　のｐＴＦＩＤｌを、Ｐ日ｔｌで切断した後、ク
ンノウ酵素を作用させ、粘着末端を平滑末端とし念。こ
れをエタノール沈殿により回収して４０μｔのＴＥに溶
かした（フラグメント１）。

一方、５　ｐ？　のｐＴＦ　１０１　ｆ　Ｘｂａ　ｌ　
−Ｈｌｎｄ　Ｉｌｌ　で切断し、挿入断片を含む領域を
除去し念断片を５％アクリルアミド電気泳動により回収
し、４０μｔのＴＥに溶かした（フラグメント２）。

更に、変異導入用オリゴヌクレオチドブライマー　（ｄ
ＧＴＡＧＯＧｃＡＧＧｃｉｃ！ＡＴＴＧ（［０ＡＡＣ！
ＡＡ　）を合成し、２０　ｐｍｏ’ｌｅ　／　μｍのＴ
Ｅ浴溶液した。その２５μｔ　２．５ユニツトのＰＮＫ
とα０３ｍＭＡＴＰを含む５０μｔのキナーゼバッファ
ー中、３７℃、６０分インキュベートし５′末端をリン
酸化した。α３μ？の７ラグメント１．０．２８μ？の
７ラグメント２及び７５　ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオ
チドブライマーを、ポリメラーゼ−リガーゼバッファ＝
（１００ｍＭＮａｃｔ、　　＆５ｍＭ　　トリス１８０
ｔ、　ｐＨ７，５，８ｍＭ　ＭｇＣ１，，１ｍＭメルカ
プトエタノール）を含む６５μｔの反応液中で３分間煮
沸した後、３０℃で３０分インキユヘートシ、更に４℃
で３０分インキユペートシた。一部をアガロース電気泳
動にかけ、ペテロ二重鎖が形成されたことを確認した。

次に反応液の１ｏｐｔ’ｘ、各々ｌ　５　ｍＭのａＡＴ
Ｐ、　ｄＧＴＰ。

ｄｃＴＰＸｄＴＴＰ、　　１　ｍＭ　　ＡＴＰ、フレノ
ウ酵素２ユニット及び１ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ
を含む２０μｔの溶液中で１２℃、−夜インキユベート
した。反応液を用いて大腸菌ＩＨＢ１０１　　を形質転
換した。得られｆＣ２００コロニーのうち、１００コロ
ニーにつき、ラピッド法でプラスミドを調製し、Ｐｓｔ
ニーＥｃｏＲＩ　　断片の生成を調べ、２つのＥｃ　ｏ
ＲＩサイトのうちの一方のサイトｔ４つているクローン
を選択した。その結果、５クローンが目的のクローンで
あつ友。そのうちの１クローンについて、プラスミド１
ＸｂａニーＨｉｍｄ　ｌ［ｌ　　で切断し、Ｍ１３ｍｐ
１８及びＭｌ　３ｍｐ１９に組込んでダイデオキシ法で
塩基配列分析を行い、ベクター由来の９　ｂｐ　が除去
されていることを確認した。このようにして得られたプ
ラスミドを、ｐＴＦ　２０１と命名した。ｐＴＦ　３０
１についても全く同様にして、ベクター由来の９ｂｐ’
ｉ除去し、得られたプラスミドｆ　ｐＴＦ　９０１と命
名した。

実施例５ フィブロネクチンの工１ｅ１４１Ｇ　　Ｂｅ上１６１５
　（１Ｑ　１３アミノ酸残基ポリペプチド）の生産と精
製プラスミドｐＴＦ　２０１　ｆ組込んだ大腸菌ＨＥ１
０１／　ｐＴＦ　２０１ケ５０μｍ／−のアンピシリン
を添加した５−のＬ−グロスを含む試験管２本に接種し
、３７℃、−夜振とう培養した。これを、５００−の同
培地を含む２ｔの三角フラスコにそれぞれ接種して、培
養を続け、６６　Ｄ　ｎｍ　の吸光度がα６となったと
ころで２　ｍＭの工ＰＴＧ（イソプロピルβ−チオガラ
クトシド）を添加し、２時間後に集菌した。菌体の一部
を用いて、イムノプロッティングを行った。すなわち、
全菌体タンパク質を、ＢＤＳ−ＰＡＧＥ　　（ＥＩＤＥ
−ポリアクアルアミド電気泳動）で分離し、泳動パター
ンをニトロセルロースメンプランに転写した後、フィブ
ロネクチンの細胞接着ドメインを特異的に認識する抗フ
ィブロネクチンモノクローナル抗体ＦＮ−ｎｏ（宝酒造
）を作用させ、次いで、パーオキシダーゼ標識第２抗体
を作用させた。結合した標識第２抗体？、過酸化水素と
Ｑ〜フェニンンジアミンの存在下で発色させることによ
り、目的のポリペプチドが生産されていることを確認し
た。次に、全菌体ペレットｉ、１０ｍＭ）　　リ　ス　
’Ｈｃｔ　　（ｐＨ７，５）　　、　　５　　ｍＭ　　
ＥＤＴＡ　　。

５ｍＭメルカプトエタノールを含む溶液に懸濁して、超
音波処理を行って、１２０００ｒｐｍ。

３０分遠心して、上清２０−を得た。これを、２０ｍＭ
　トリスＨＣ４（ｐＨ７，５）バッファーに対シて透析
し、抗フィブロネクチンモノクロ−ス４Ｅのカラム（８
ＩＩＥ７りに通した。カラムを洗浄バッファーＡ（２０
ｍＭ　　トリスＨＯ６，ｐＨ＆０、ｌ　１５　Ｍ　ＫＣ
ｌ）で洗浄し、史に洗浄バッファーＢ（２０ｍＭ　　ト
リスＨＯ４，ｐＨ＆４、ｏ、１ｓＭｘｃｚ）で洗浄した
。最後に溶出パンファー（５０ｍＭ　グリシン−’ＨＣ
６，ｐＨ２，３，０、２０Ｍ　Ｋｃｔ　）で溶出した。

溶出液のイムノブロッティングを行い、目的ポリペプチ
ドの画分を集めた。更にモノ（Ｍｏｎｏ）Ｓ　ＨＲ５１
５（ファルマシア）カラムにかけて２０　ｍＭ酢酸バッ
ファー（ｐＨ４，０）中のＮａ０６　　の濃度勾配によ
り溶出し、電気泳動的にほぼ単一なポリペプチド４ｍ９
に得た。得られたポリペプチドのＮ末端側の１０アミノ
酸残基の配列を決定したところ、フィブロネクチンの工
１ｅ１４１０からＶａｌ　１４１９の配列に一致した。

また、アミノ酸組成の分析結果も理論値に一致した。但
し、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　　では、目的のバンドは分子
量約１４ｋＤ付近に検出され、予想される分子量１１．
５　ｋＤ　　よりも高い値を示した。これば、ペプチド
中のプロリン（ｐｒｏ　）の含量が高い（１０８残基中
９残基）ためであると推定される。事実、タンパク室中
のプロリンの含量が多い場合には、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ
　　での分子量に予想よりも高い値を示すことが知られ
ている〔モレキュラー　アンド　セルラー　バイオロジ
ー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　
Ｅｉｏｌｏｇｙ　）第４巻、第２４８６頁＜１９８４）
、：ｌ。

実施例６ フィブロネクチン（Ｄ　Ａｈａ”５−Ｍｅｔ”　（２８
ろアミノ酸残基ポリペプチド）を含むペプチドの生産と
精製 プラスミドｐＴＦ　９０１　ｆ導入した大腸菌ＨＥ１ｏ
１／　１）ＴＦ　９０１を実施例５と同様の方法で培養
し、同様の方法で精製して２ｔの培養液から、電気泳動
的にほぼ単一なペプチドとして約４００μ′？ヲ得た。

本ポリペプチドのＮ末側アミノ酸配列を調べたところ、
目的のポリペプチドのＮ末にベクター由来のシグナルペ
プチドの一部（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ−Ｇｕｎ−Ａｌａ　）が付加した構造を有す
ることが分った。

次に、プラスミドｐＴＦ　１４０９　　ｆ導入した大腸
菌ＨＢ　１０１　／　ｐＴＦ　１４０９も同様に培養、
精製し、２ｔの培養液から、約６００μ？■ポリペプチ
ドを得た。本ポリペプチドのＲ末側のアミノ酸配列を調
べたところ、目的ポリペプチドのＮ末にベクター由来の
アミノ酸配列（Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−工１ｅ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｎ−８θｒ）が付加した構造を有することが分
った。

実施例７ フィブロネクチンのＧｌｙ１０１’−Ｍｅｔ１５１７（
５０４アミノ酸残基ポリペプチド）？含むポリペプチド
の生産と精製 プラスミドｐＴＦ　１１０１　　ｆ導入した大腸菌ＨＥ
１０１　／　ｐＴＦ　１１０１　　を用いて、実施例５
と同様な方法で１６の培養を行い、菌体を超音波破砕し
た後、透析後、抗体を結合したセファロース４Ｂのカラ
ムにかけ、電気泳動的に単一なポリペプチドを６００μ
？得た。本ポリペプチドのＮ末側アミノ酸配列？調べた
ところ、目的ポリペプチドのｂ末にベクター由来のシグ
ナルペプチド配列とＡｌａ−Ａｓｎ−ｅｅｒ配列が付加
した構造を有することがわかった。

実施例８ 細胞接着活性の測定 前記実施例５〜７で得られた各ポリペプチドを用いて、
細胞接着活性を測定した。方法は、ルオスラーテイ（Ｒ
ｕｏｓ’１ａｈｔｉ　’）らの方法〔メンツズ　イン　
エンジモロシ（Ｍｅｔｈｏｄθ１ｎＫｎＺ７ｍＯＩＯｇ
７　’）第８２巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）〕
に準じて行った。また、ポジティブコントロールとして
は、ヒトのフィブロネクチンを用いた。すなわち、試料
を、Ｑ、ＩＭＮａＨＯＯ，で段階的に希釈し、その５０
μｔを９６穴マイクロプレートに分注し、３７’Ｃ１１
時間インキュベートして、試料をプレートに付着させた
。次にＰ　Ｂ　Ｓ　（ＩＪン酸緩衝化生理食塩水）でプ
レートを２回洗浄し、１％ＥＳＡ’１１００μを加え、
３７℃、１時間インキュベートして、プレートをブロッ
クした。プレートをＰＢＳで２回洗浄した後、あらかじ
め、イーグルの最小培地（ＭＥＭ）に１０６細胞／ＷＩ
ｌとなるように懸濁させたラット腎細胞（ＮＨＫ−４９
Ｆ）を１００μｔ／ウエルＯ割合で分注し、３７℃で２
〜３時間インキュベートした。顕微ｆｉ下で細胞の形態
変化を観察し、細胞接着活性を示す最少量を決定した。

その結果を下記表１に示す。

表　　　１ 工ｌｅ”１０−Ｍｅｔ１５’　　）５００４４００）Ａ
−Ｌａ１２３６　Ｍｏ上１５１７　　　α１９（＆１’
）Ｇｌｙ””−Ｍｅｔ”’　　　　　　　　　ＣＬ１６
　（２，８）フィブロネクチン　　　　　　　１．５０
　（！１７５）実施例９ Ｃ末にＣｙｓ残基を付加したポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡのクローニングと発現（第５図参照） なお、第５図は、Ｃ末にＣｙ８残基全基金付加ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を組込んだ発現プラスミド
の構築の工程を示す図である。

実施例４で得られたプラスミドｐＴＦ　２０１からＸｂ
ａニーＨ１ｎｄ　ｍ断片（α４４ｋｂ　）ｆｔ切出し、
これｆ　Ｆｏｋ工　で切断して、ＸｂａニーＦｏｋ工断
片（１７５ｂｐ　）　　とＦｏｋニーＦｏｋ工断片（’
２０３ｂｐ）ｅ得た。

一方、Ｃ末側のＦｏｋニーＥｃｏＲ工　断片のストップ
コドンの前にＣｙｓのコドン（ＴＧ　（！　）ｉ付加し
た合成りＮＡｉ調裏し、リン酸化後二重鎖とした。この
ようにして得られた、ＸｂａニーＦｏｋ工断片、Ｆｏｋ
ニーＦｏｋＩ断片及びＦｏｋニーＥｃｏＲ工　断片を、
あらかじめｐＴＦ　２０１からＸｂａニーＥｃｏＲ工　
断片を除いたベクターとＤＮＡ！Ｊガーゼで接続し、大
腸菌ＨＢ　１０１　’ｚ　形質転換した。得られた形質
転換体から、プラスミドを精製し、Ｍｌ　３ｍｐ１８に
サブクローニングして、ダイデオキシ法で塩基配列を調
べ、３′末端にＯｙｓに対応するＴｑＣの配列が付加し
ていることを確認した。このようにして工１ｅ１４１０
−Ｍ　ｅ　ｔ　１５１７のＣ末にＣｙｓ残基が付加した
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを組込んだプラスミ
ドを得、ｐＴＦ　１２０１　　と命名した。

次に、ｐＴＦ　１２０１　　からＰｖｕｎ−Ｈｉｎｄｌ
ｌ［断片を、また、実施例４で得られたｐＴＦ　９０１
からＸｂａニーＰｖｕｎ　　断片をそれぞれ切出して、
精製した。これらを、あらかじめ、ｐＴＦ　９０１から
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄｌＩ［＠片を除いたベクターと、Ｄ
ＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＨＢ１０１（ｒ形質転換
した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、挿
入断片ｆ　Ｍｌ　３ｍｐ１８にサブクローニングして、
ダイデオキシ法により、塩基配列を調べ、３′末端にＣ
ｙＳに対応するＴＧＣ配列が付加していることを確認し
た。このようにしてＡｌ　ａ１２３５−　Ｍｅ　ｔ　ｔ
ｓｔ’ｒＯＣ末ｉＣＣ！ｙｓ残基が付加したポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡ　ｆ組込んだプラスミドを得、
ｐＴＦ１５０１　　と命名した。ｐＴＦ　１５０１　　
ｆ実施例５と同様の方法で培養、精製を行って、１ｔの
培養液から、５００μ？の精製ポリペプチドを得た。

本ポリペプチドのアミノ酸組成分析を行った結果、分子
中のＣｙ８残基の数に１と計算され、理論値と一致した
。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明により、フィブロネ
クチンと実質上同等の細胞接着活性を有するポリペプチ
ド、及びその遺伝子工学的な製造方法が提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図はフィブロネクチンの工１θ１４１Ｇ　−Ｍｅ　
ｔ　１５１７を含むポリペプチドをコードするＤｌＩＡ
配列を組込んだ発現プラスミドの構築の工程を示す図、
第２図にフイブロネクチｙ　Ｃ）　Ａ］−ａ　”５−　
Ｍｅｔ　ｌｓ’　ｆ含むポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を組込んだ発現プラスミドの構築の工程を示す図
、第３図ｉフィブロネクチンの（３１ｙ　１ｏ１４−Ｍ
ｅ　ｔ　１５１７　ｆ含むポリペプチドをコードするＤ
ＢｉＡ配列？組込んだ発現プラスミドの構築の工程を示
す図、第４−１図ＩＱ　ｐＴＦ　１０１　ｉｃおける不
要Ｉ）ＮＡ配列及びアミノ酸配列とそｎｌ除去した後の
ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図、第４−２１１ｉ
部位特異的変異によるｐＴＦ　１０１からの不用Ｄ１１
１Ａ配列の除去の工程を示す図、第５図はＣ末にＣｙｓ
残基を付加したポリペプチドをコードするＤＩＩＩＡ配
列ｌ！ｉ−組込んだ発現プラスミドの構築の工程を示す
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フィブロネクチンと実質上同等の細胞接着活性を有
   していることを特徴とするポリペプチド。 ２、該ポリペプチドが、少なくとも下記一般式 I で表
   されるアミノ酸配列を含むものである請求項１記載のポ
   リペプチド。 【遺伝子配列があります】・・・〔 I 〕 ３、該ポリペプチドが、請求項２記載の一般式 I で表
   されるアミノ酸配列のＣ末端にＣｙｓ残基が付加したも
   のである請求項１又は２記載のポリペプチド。 ４、請求項１記載のポリペプチドをコードすることを特
   徴とするＤＮＡ。 ５、請求項４記載のＤＮＡ配列が組込まれたベクターが
   導入された大腸菌を培養し、培養物より請求項１記載の
   ポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチド
   の製造方法。 ６、該大腸菌がエシエリヒアコーリＨＢ１０１／ｐＴＦ
   １４０９である請求項５記載のポリペプチドの製造方法
   。