JPH01287097A - 抗腫瘍性蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は抗腫瘍作用を有する新規蛋白質に関するもので
ある。

〔従来の技術〕

トキソプラズマ原虫由来の生理活性蛋白質としては、イ
ンターフェロン誘導剤（特開昭５９−２７８３２号公開
公報参照）と抗腫瘍剤（特開昭６２−２４９９２７号公
開公報参照）が知られている。

すなわち１、トキソプラズマ原虫を物理的に破砕し、ｉ
ｏ、ｏｏｏｃ以上で遠心分離することによって得られる
沈渣、および上清をゲル濾過法によって分子量分画して
得た分子量が１００．０００以上の水溶性画分、分子量
が２０．０００〜１００，０００の水溶性画分ならびに
分子量が４　、０００以下の水溶性画分から選択される
インターフェロン誘導剤が開示されている。

そして、抗腫瘍作用を有する蛋白質としては主成分分子
量が１５，０００〜２０，０００のものが開示されてい
る。

〔発明が解決しようとする課題］ 本発明者らはトキソプラズマ原虫を物理的に破砕した水
溶性成分中の生理活性物質について鋭意研究を重ねた結
果、主成分分子量が４，０００〜１５．０００の蛋白質
にも優れた抗腫瘍活性を有することを見い出した。

また、当該蛋白質は逆相液体クロマトグラフィーを用い
ることによって、効率よ（精製することができることを
見出した。

従って、本発明の第１の目的はトキソプラズマ原虫から
抽出しうる抗腫瘍作用を有する新規蛋白質を提供するこ
とである。

本発明の第２の目的は当該新規蛋白質の精製方法を提供
することである。

本発明の第３の目的は新規抗腫瘍剤を提供することであ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は下記の理化学的性質および生物学的性質を有す
る抗腫瘍性蛋白質である。

■　分子＠　：　４．０００〜１５，０００　（セファ
デックスＧ−７５ゲル濾過法） ■　トキソプラズマ原虫の水溶性画分に含まれる。

■　マウス実験１１！１瘍に対し抗［１瘍活性を示す。

また、本発明は逆相液体クロマトグラフィーを用いるこ
とによる前記抗腫瘍性蛋白質の精製方法である。

さらに本発明は前記抗腫瘍性蛋白質を有効成分とする抗
腫瘍剤である。

この明細凹においては、アミノ酸、保護基、活性基、溶
媒等について、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに基づく略号および
、当該分野における情用略号で表示する場合があり、そ
れらを例示すると次の通りである。

アミノ酸残基に対する略号は以下の通りである。

棗号　　ム作 Ａｒｇ　　　Ｌ−アルギニン Ｌｅｕ　　　　Ｌ−ロイシン Ｖａｌ　　　Ｌ−バリン Ｈ４ｓ　　　Ｌ−ヒスチジン Ｔｈｒ　　　Ｌ−スレオニン Ｓｅｒ　　　Ｌ−セリン Ｇｌｕ　　　　Ｌ−グルタミン酸 （、ｙｓ　　　Ｌ−リジン Ｇｌｎ　　　Ｌ−グルタミン ［１ｅ　　　Ｌ−イソロイシン Ａｓｎ　　　Ｌ−アスパラギン Ｔｙｒ　　　Ｌ−チロシン Ａｓｐ　　　Ｌ−アスパラギン酸 Ｇｌｙ　　　グリシン Ａｌａ　　　Ｌ−アラニン Ｐｈｅ　　　Ｌ−フェニルアラニン Ｐｒｏ　　　　Ｌ−プロリン Ｍｅｔ　　　Ｌ−メチオニン Ａ３Ｘ　　　Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アスパラギ
ン Ｇｌｘ　　　Ｌ−グルタミン酸または Ｌ−グルタミン 特に断らない限り、本明細書で接頭辞り無しで命名され
ているアミノ酸残基は天然に生ずる絶対立体配置しに該
当する。

他の略号は次の通りである。

１号　　ム咋 Ｂｏｃ　　　Ｌ−ブチルオキシカルボニルＣＩ−Ｚ　　
　２−クロルベンジルオキシカルボニルＴｏｓ　　　　
ｐ　−トルエンスルホニル０ｃＨｅｘ　　　シクロヘキ
シルエステルＢｚｌ　　　ベンジル Ｃ１ｚ−Ｂｚｌ　　２．　６−ジクロルベンジルＴＦへ
　　　トリフルオロ酢酸 ＤＣＣジシクロへキシルカルボジイミドＤＭＦ　　　ジ
メチルホルムアミド 本発明において、抗Ｉｌ！ＩＩ瘍性蛋白質は前記■〜■
の要件を満足する限り、単一の抗腫瘍性蛋白質よりなる
もの、また上記■〜■の要件を満足する複数の抗腫瘍性
蛋白質よりなるもの（すなわち、抗腫瘍性蛋白質の混合
物の態様）のいずれでもよい。

以下、本発明の抗腫瘍性蛋白質の代表例についてより詳
細に説明する。

☆ＴＬＡ−Ｈ４： （１）色および性状 白色粉末状。

（２）水溶性 易溶性。

（３）分子■ ■　ＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷを用いる高速ゲル濾過法に
より、分子量は約１０．５００である。

指標蛋白として牛血清アルブミン（分子量６７．０００
）　、卵白アルブミン（分子量４３．．０００）　、リ
ボヌクレアーゼＡ（分子ｆｆ１１３，７００）およびブ
タ、インシュリン（分子ｉ５．８００）を用い、溶出緩
衝液としてＭ／１５リン酸緩衝液−Ｍ／１０塩化ナトリ
ウム（ｐＨ６，７）を用いた。指標蛋白はすべてＳｉｇ
ｍａ社製を用いた。

■　非還元下でのＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法によって測定した分子量は約８．５００である。

指標蛋白としてフォスフォリラーゼＢ（分子量９４，０
００）　、牛血清アルブミン（分子量６７．０００）、
卵白アルブミン（分子［４３，０００）、カーボニック
・アンヒドラーゼ（分子ｆｉｔ３０．０００）、大豆ト
リプシンインヒビター（分子！２１．ｏｏＯ）、リゾチ
ーム（分子量１４．４００）および豚インシュリン（分
子量５，８００）を用いた。

豚インシュリンはＳｉｇｍａ社製、それ以外の指標蛋白
はＰｈａｒｍａｃｉａ社製。

（４〕Ｎ末端末端アミノ列 配ｅｔ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ− アミノ酸配列はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｗｓ
社製４７０Ａ型プロティン・シーケンサ−を用いてエド
マン分解し、生成したＰＴＨ（フェニルチオヒダントイ
ン）−アミノ酸誘導体を島原社製高速液体クロマ１−グ
ラフィーを用いて同定した。

（５）アミノ酸組成： ＴＬＡ−Ｈ４（１μｇ）に０，１％チオグリコール酸酸
含有定点塩酸０．２−を加え、封管中１１０゛Ｃで２４
時間加水分解してアミノ酸組成を調べた結果は表１に示
す通りである。

☆ＴＬＡ−Ｈ５Ａ： （１）色および性状 白色粉末状。

（２）水溶性 易溶性。

（３）分子量 ■　ＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷを用いる高速ゲル濾過法に
より、分子量は約１０．５００である。

指標蛋白はＴ　Ｌ　Ａ　−Ｈ４の項で記載した前記のも
のと同じである。

■　非還元下での５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法によって測定した分子量は約８．５００である。

指標蛋白はＴＬＡ−Ｈ４の項で記載した前記のものと同
じである。

（４）アミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ４１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖ
ａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ４１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ｒｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ
−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、 （５）アミノ酸組成： ＴＬＡ−Ｈ５Ａ　（２μｇ）に０．１％チオグリコール
酸酸含有定点塩酸０．２ｄを加え、封管中１１０℃で２
４時間加水分解してアミノ酸組成を調べた結果は表１に
示す通りである。

☆ＴＬＡ−Ｈ５Ｃ： （１）　　色および性状 白色粉末状。

（２）水溶性 易溶性。

（３）　　分子量 ■　ＴＳＫ−Ｇ２０００！Ｖを用いる高速ゲル濾過法に
より、分子量は約１０．５００である。

指標蛋白はＴＬＡ−Ｈ４の項で記載した前記のものと同
じである。

■　非還元下での５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法によって測定した分子量は約８，５００である。

指標蛋白はＴＬＡ−Ｈ４の項で記載した前記のものと同
じである。

（４）アミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ　　−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
−３ｅｒ−八５ｐ−Ｔｈｒ−［１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−八１ａ−Ｌｙｓ−Ｈｃ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−［１ｅ−
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＧＩｎ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−３ｅ
ｒ−Ａｓｐ−↑ｙｒ−八５ｎへ１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１！ｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｘ （上記配列においてＸはＡｓｐまたはＧｌｕを表わす）
（５）　　アミノ酸組成： ＴＬＡ−Ｈ５Ｃ（２μｇ）に０．１％チオグリコール酸
酸含有定点塩酸０．２　ｍｌを加え、封管中１１０゛Ｃ
で２４時間加水分解してアミノ酸組成を調べた結果は表
１に示す通りである。

☆ＴＬＡ−Ｈ６： （１）色および性状 白色粉末状。

（２）水溶性 易溶性。

（３）分子量 ■　ＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷを用いる裔速ゲル濾過法に
より、分子量は約１０．５００である。

指標蛋白はＴＬＡ−Ｈ４の項で記載した前記のものと同
しである。

■　非還元下での５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法によって測定した分子量は約８．５００である。

指標蛋白はＴＬＡ−Ｈ４の項で記載した前記のものと同
じである。

（４）　　アミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ　−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−
５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ４１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ４１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−八ｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ （上記配列においてＸはＡｓｐまたはＧｌｕを表わす）
なお、ＴＬＡ−Ｈ６の態様としては、上記配列において
ＸがＡｓｐであるもの、ＸがＧｌｕであるもの、および
これらの混合物であるものがあげられ、以下の記載にお
いては、ＸがＧｌｕであるものを、特にＴＬＡ−Ｈ６Ｅ
と称し、Ｘが＾ｓｐであるものをＴＬＡ−Ｈ６Ｄと称す
る。また、特記しない限り、ＴＬＡ−Ｈ６はＸ　がＡｓ
ｐであるものとＸがＧｌｕであるものとの混合物を指す
ものとする。

（５）アミノ酸組成： ＴＬＡ−Ｈ６（２μｇ）に０．１％チオグリコール酸酸
含有定点塩酸０．２７を加え、封管中１１０°Ｃで２４
時間加水分解してアミノ酸組成を調べた結果は表１に示
す通りである。

☆ＴＬＡ−Ｈ８： （１）色および性状 白色粉末状。

（２）水溶性 易溶性。

（３）分子量 非還元下での５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によって測定した分子量は約１４，０００である。

指標蛋白はＴＬＡ−Ｈ４の項で記載した前記のものと同
じである。

（４）Ｎ末端アミノ酸配列 Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−＾ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｍ
ｅｔ−八Ｉａ−Ｇｌｙ−ＴｙｒへＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−へｓｐ−アミノ酸配置１
ＦＩＪＬ；！Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製４７０Ａ型プロティン・シーケンサ−を用いてエドマ
ン分解し、生成したＰＴＨ（フェニルチオヒダントイン
）−アミノ酸誘導体を品性社製高速液体クロマトグラフ
ィーを用いて同定した。

（５）アミノ酸組成 ＴＬＡ−Ｈ８（０，５μｇ）に０．１％チオグリコール
酸酸含有定点塩酸０．２ｍρを加え、封管中１１０°Ｃ
で２４時間加水分解してアミノ酸組成を調べた結果は表
１に示す通りである。

☆ＴＬＡ−Ｈ： （１）　　色および性状 白色粉末状。

（２）　　　水ン容性 易？容性。

（３）分子量 ■　セファデフクスＧ−７５を用いるゲルｌｌｖ過法に
より、分子量４　、０００〜１５，０００である。

指標蛋白として生血端アルブミン（分子量６７．０００
）　、卵白アルブミン（分子量４３，０００）　、キモ
トリプシノーゲン（分子１２５，０００）およびリボヌ
クレアーゼＡＣ分子ｆｆ１１３，７００）を用い、溶出
緩衝液としてＯ，］　Ｍ酢酸アンモニウム（ρ１１４．
８）を用いた。指標蛋白はずべてＳｉｇｍａ社製を用い
た。

■　ＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷを用いる高速ゲル濾過法に
より、分子量４，０００〜１５，０００である（第１図
参照）。

指標蛋白として生血端アルブミン（分子量６７．０００
）　、卵白アルブミン（分子量４３，０００）　、リボ
ヌクレアーゼＡ（分子ｆｆ１１３，７００）およびブタ
・インシュリン（分子量５，８００）を用い、シ容出緩
衝液としてＭ／１５リン酸緩衝液−Ｍ／１０塩化ナトリ
ウム（ｐＨ６，７）を用いた。指標蛋白はすべてＳｉｇ
ｍａ社製を用いた。

（４）呈色反応 クーマシー・ブリリアント・ブルー〇Ｌ２５０に対する
反応性は陽性であり、蛋白質であることが確認された。

のアミノ酸組成（モル百分率） 本発明の抗腫瘍性蛋白質は、生物学的に許容される酸付
加塩、たとえば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、コ
ハク酸塩、フマール酸塩などの有機酸塩、塩酸塩、臭化
水素酸塩、硫酸塩などの無機酸塩などの態様であっても
よい。

かかる塩は自体既知の手段によって容易に製造すること
ができる。例えば、酢酸塩の場合は、当該抗！ｆｆｌ瘍
性蛋白質を水に溶かし、必要量の酢酸を加えることによ
って製造される。

〔製造方法］ 本発明の抗腫瘍性蛋白質の製造方法としては、たとえば
次のような方法が例示される。

（ｉ）トキソプラズマ株から抽出・精製し単離する方法
： トキソプラズマ株から抽出・精製し単離する方法では、
製造原料としては、いずれのトキソプラズマ（以下、Ｔ
ｐと略す）株をも使用することができるが、その代表例
としてトキソプラズマ・ボンブイ（Ｔｏｘｏ　Ｉａｓｍ
ａ　　ｏｎｄｉｉ　　ＲＨ株タヒゾイトが挙げられる。

Ｔｐは、通常入手されるものをそのまま用いてもよく、
またこれを常法に従い、動物体内でまたは組繊培養細胞
で増殖させた後単離して用いることもできる。

Ｔｐの物理的破砕は特開昭５９−２７８３２号公報に記
載されているように常法に従い超音波破砕法および凍結
融解法を単独あるいは組み合せて行うことができる。

すなわち、超音波破砕法による場合には、Ｔｐを、例え
ば蒸溜水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、
塩平衡ハンクス液等の適当な緩衝液、好ましくは蒸溜水
を用いて通常１１００ｒｎ／ｍ１（２Ｘ１０９個Ｔｐ／
ｘｉり前後の溶液ないし希釈液とし、これを４〜１５°
Ｃの温度で１〜５分間程度超音波処理を複数回行う。ま
た、凍結融解法による場合には、上記と同様にして調整
したＴｐ含含液液、予め一２０゛Ｃ〜−８０°Ｃで凍結
し、次いで凍結物を約２０〜３７°Ｃで融解する操作を
数回（通常５回程度）繰り返すことにより所望の破砕物
を収得することができる。

次いで、ＴＰ破砕物中の不溶物を所望により遠心（例え
ば、１６，０ＯＯＧ、４°Ｃ１６０分）等により除去し
、変性防止のために塩化ナトリウム溶液等を加え等張と
した後、１００，０００　Ｇ以上の超高速遠心（例えば
、４°Ｃ１１２０分）を行うことによって上清を採集す
る。

この上清を無菌濾過した後、凍結乾燥し粉末状の蛋白質
（トキソプラズマ溶解抗原、以Ｆ、ＴＬＡと略す）を得
る。

上記粉末状の蛋白質ＴＬＡは公知の精製法、例えばゲル
濾過クロマトグラフィー、限外濾過、透析、塩析などを
単独あるいは組み合せて精製することができる。

好ましくは、ＴＬＡを水あるいは生理食塩水に溶解し、
適当なゲル濾適用充填剤、例えばセファデックスＧ−５
０、セファデックスＧ−１００、セファクリルＳ−２０
０、バイオゲルＰ−３０あるいはバイオゲルＰ−６０、
好ましくはセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより分子量分画し、分子！４．００
０〜１５，０００の両分を分取し、凍結乾燥し白色粉末
状の蛋白物質（トキソプラズマ溶解抗原−Ｈ２すなわち
ＴＬＡ−Ｈ）を得る。

かくして得られたＴＬＡ−Ｈは、本発明に含まれる抗腫
瘍性蛋白質の混合物の態様であり、本発明はかかる混合
物態様の抗腫瘍性蛋白質をも包含するものである。

上記ｔＩＬ合物からの任意の各蛋白質の単離は公知の精
製法、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交Ｉ
Ｑクロマトグラフィーあるいは適当な抗体などを用いる
アフィニティークロマトグラフィーを単独あるいは組み
合せて行なうことができる。

好ましくは、ＴＬＡ−Ｈを水あるいはＯ，１％トリフル
オロ酢酸に溶解し、適当な逆相系充填剤、例えば炭素数
１から１８のアルキル基あるいはフェニル基の結合した
シリカゲル担１体を用いる逆相型ｌ反体クロマトグラフ
ィーにより単離する。溶出溶媒としてはトリフルオロ酢
酸、酢酸、ギ酸あるいはリン酸を含むアセトニトリル、
プロパツール、イソプロパツールなどを使用することが
できる。

例えば、バイオラッド社製ＲＰ−３０４カラムを用いる
高速液体クロマトグラフィーにより分画しく第２図参照
）、アセトニトリル濃度３０〜３５％で溶出される百分
を分取し、凍結乾燥し、白色粉末状の蛋白物質（たとえ
ば、トキソプラズマ溶解抗原−Ｈ４、−Ｈ５Ａ、−Ｈ５
Ｃ，−Ｈ６および−Ｈ８、すなわちそれぞれＴＬＡ−Ｈ
４、ＴＬＡ−Ｈ５Ａ、ＴＬＡ−Ｈ５Ｃ，ＴＬＡ−Ｈ６お
よびＴ　Ｌ　Ａ　−Ｈ８）を得る。これは通常、冷暗所
に保存される。

（ｉ＋）化学合成による方法： 化学合成による方法では、通常のペプチド化学において
用いられる方法に阜して合成することができる。すなわ
ち、液相法、固相法いずれによっても得ることができる
。

より詳細には、例えば固相合成法を採用する場合、Ｃ末
端アミノ酸（アミン基を保護したもの）をそのカルボキ
シル基によって、まず不溶性担体に結合させる。次いで
、アミン保護基を除去した後、目的ペプチドのアミノ酸
配列に従い、順次アミノ基保護アミノ酸をその反応性ア
ミノ基および反応性カルボキシル基との縮合反応により
結合させ、−段階ずつ合成し、全配列を合成した後、ペ
プチドを不溶性担体からはずすとともに保護基を除去す
ることにより、目的のペプチドを得ることができる。

上記各種方法において、反応性の官能基は保護しておく
ことが好ましい。

アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカ
ルボニル、ｔ−プチルオギシカルボニル、ｐ−メトキシ
ベンジルオキシカルボニル、２−クロルベンジルオキシ
カルボニル、ｐ−トルエンスルホニル、トリフルオロア
セチル、フタリル、ホルミル、０−ニトロフェニルスル
フェニル、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル基などがあげられる。カル
ボキシル基の保護基としては、例えばアルキルエステル
（メチル、エチル、Ｌ−ブチルなどのＣ＋−ａアルキル
エステル）、ベンジルエステル、Ｐ−ニトロベンジルエ
ステル、ｐ−メチルベンジルエステル、シクロヘキシル
エステル、シクロペンチルエステルなどがあげられる。

Ａｒｇのグアニド基の保護基としては、例えばｐ−）ル
エンスルホニル、メシチレン−２−スルホニル、ニトロ
、ベンジルオキシカルボニル基などがあげられる。Ｓｅ
ｒ、Ｔｈ　ｒ、Ｔｙ　ｒの水酸基は、必ずしも保護する
必要はないが、必要であれば、例えば、ペンジル、２．
６−ジクロルベンジル、Ｌ−ブチル、ベンジルオキシカ
ルボニル、アセチル基などで保護することができる。Ｍ
ｅＬは必要であればスルホキシドとして保護することも
可能である。

上記各種方法において、ペプチド結合形成方法としては
、例えばジシクロへキシルカルボジイミド、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
などのカルボジイミド型縮合剤を用いる方法、対称型酸
無水物法、混合酸無水物法、アジド法、活性エステル法
、酸化還元法、ジフェニルホスホリルアジド法、カルボ
ジイミド型槽合剤＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドなど）法など
既知の手段があげられる。

保護基の除去法としては、例えば、トリフルオロ酢酸法
、メタンスルホン酸法、トリフルオロメタンスルホン酸
法、フン化水素法、液体アンモニアナトリウム法など既
知の手段があげられる。

本発明によって製造されるペプチド類の晴製は、例えば
イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマ
トグラフィー、逆相型液体クロマトグラフィーなどのペ
プチド化学の分野で通常用いられる方法を単独にまたは
組み合わせて用いることによって行うことができる。

（ｉ　ｉ　ｉ）酵素的切断による方法：前記の方法で得
られた抗腫瘍性蛋白質または構造のｔｎ偵するユビキチ
ンを適当な酵素、たとえばカルボキシペプチダーゼ、ト
リプシン、Ｖ８プロテアーゼ、リジルエンドペプチダー
ゼ、サーモライシン、ペプシン、プロナーゼなど、好ま
しくはカルボキシペプチダーゼ、リジルエンドペプチダ
ーゼで消化することによって、Ｃ末端側のアミノ酸を、
任意の個数削除することによって製造することができる
。

〔抗腫瘍作用〕 本発明の抗腫瘍性蛋白質は、下記のマウスに対する試験
によって、顕著な抗腫瘍作用を有することが判明した。

試験例Ｉ ＢＡＬＢ／Ｃ７ウス（雄性、５週齢）１群５〜１２匹の
腹側部皮下に、それぞれｓａｒｃｏｍａ　１８０（Ｓ−
１８０）細胞３Ｘ１０’個を移植した。

Ｓ−１８０移植後約１週間で、腫瘍が一定の大きさに達
した後、このＳ−１８０担癌マウスを５〜１２匹ずつの
２群に分け、第１群（１２匹）を対照とし、第２群（５
匹）に対して１週間ごとに、後記の実施例で製造した本
発明の抗腫瘍性蛋白物質Ｔ［、Ａ−ＨＯ，４μｇを３回
筋肉投与した。

これら２群のマウスの腫瘍容積〔（長軸）×（短軸）”
Ｘ＋Ａ）ｎｕｎ３を経時的に測定したところ、表２に示
すように、対照群に比較して、Ｔ　Ｌ　Ａ−Ｈは著しい
腫瘍増殖抑制効果を示した。薬剤の抗腫瘍効果は測定時
点の薬剤投与群の腫瘍増殖率（Ｔ）群の腫瘍増殖率（Ｃ
）に対する割合（Ｔ／Ｃ（％）〕で示した。

〔以下余白〕

試験例２ 試験例１における抗腫瘍性蛋白質ＴＬＡ−８０，４μｇ
の代わりに、それぞれ後記の実施例で製造した本発明の
蛋白物質ＴＬＡ−Ｈ４、ＴＬＡ−Ｈ６およびＴＬＡ−Ｈ
８をそれぞれ０．１８μｇ使用する以外は試験例１と同
様にして試験を行った。その結果は表３に示す通りであ
る。

対照群に比較して、ＴＬＡ−Ｈ４、ＴＬＡ−Ｈ６および
ＴＬＡ−Ｈ８は著しい腫瘍増殖抑制効果を示した。

〔以下余白〕

試験例３ 後記の実施例で製造した抗Ｉｆ！１１瘍性蛋白質の一次
構造と極めてｍ４１１の既知物質としてユビキチンが存
在する（Ｇｏｌｄａｔｅｉｎ、　Ｇ、、５ｃｈｅｉｄ＋
　Ｍ、、ＩＩａｍｍｅｒｌｉｎｇ＋Ｕ、、　　Ｂｏｙｓ
ｅ、　　Ｅ、Ａ、、　　Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　　
Ｄ、　　八、、　　＆　　Ｎ１ａｌｌ。

１１、Ｄ、（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾６ユ１１−１５．およ
びＨａｒｒｉｓ　Ｂｕｓｃｈ（１９８４）、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、、　ｌ！Ｑ５．２３８−
２６２．）。

そこで、ユビキチンと本発明における蛋白質との抗腫瘍
活性比較を行った。

試験例１における抗腫瘍性蛋白質ＴＬＡ−Ｈ０，４μｇ
の代わりに、それぞれ後記の実施例で製造した本発明の
抗腫瘍性蛍白質、即ちＴＬＡ−Ｈ５Ａ、ＴＬＡ−Ｈ６お
よびＴＬＡ−Ｈ６Ｅをそれぞれ０．８３μｇ、０．１７
μｇＳ０．３４μｇまた、ユビキチン（Ｓｉｇａ＋ａ社
製）を０．１７　ｕ　ｇ、５μｇ使用する以外は試験例
１と同様にして試験を行った。

その結果は表４に示す通りである。

対照群に比較して、ユビキチンは抗腫瘍活性を実質的に
示さなかったのに対し、ＴＬＡ−８５Ａ、ＴＬＡ＝Ｈ６
およびＴＬＡ−Ｈ６Ｅは著しい腫瘍増殖抑制効果を示し
た。

〔以下余白〕

［抗１１！！！瘍剤への適用〕 本発明の抗ｌｌ！￥！瘍性蛋白質は、哺乳動物に対して
抗１１ｆｆｉ！活性を有し、抗ｍｕｍ剤として有用であ
る。

すなわち、本発明の抗腫瘍性蛋白質は、例えばマウス実
験１１ｆｆｉ瘍（例えばＳａｒｃｏｍａ　１８０細胞移
植マウス、Ｍｅｔｈ　Ａなと）やラット実験腫瘍（メチ
ルコラントレン誘発癌）に対して優れた抗腫瘍活性を示
すものである。

本発明でいう抗＋１！ＴＩ瘍活性とは、実質的に抗１１
瘍剤として使用しうる程度の活性を有するものをいい、
例えば、マウス実験腫瘍Ｓａｒｃｏｍａ　１８０で対照
群に対して統計的に有為な（ｐ＜０．０５．ｔ−検定）
抗１１１！活性を有するものをいう。

本発明の抗腫瘍性蛋白質は、通常単独で水溶液あるいは
生理食塩水溶液として腫瘍細胞の増殖阻止、転移抑制の
目的に使用することができる。

また、必要に応じて一般的に用いられているアジュバン
トや各種の添加剤、例えば溶解補助剤、軽質鉱物油等の
乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を添加
した配合剤として使用することもできる。

本発明の抗腫瘍性蛋白質を投与される動物は特に制限さ
れず、ヒトのみならず、例えばマウス、ラット、イヌ、
ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ等の各種哺乳
動物が対象となる。

これらの動物およびヒトへの投与は通常の投与経路、例
えば筋肉内、皮下、皮肉、腹腔内、静脈内投与により行
うことができる。

抗Ｉｌｌ瘍性蛋白質の投与量および投与回数は動物種、
投与経路、投与目的（治療目的）等に応じて各口約１　
ｎｇ／ｋｇ〜５■八ｇの範囲となへように適宜選択され
て、１日１〜数回投与される。

［実　施　例］ 実施例Ｉ ＴＬＡ−Ｈ４、ＴＬＡ−Ｈ５Ａ、ＴＬＡ−Ｈ６およびＴ
ＬＡ−）１Ｂの単離： （１）ＴｐＲｌ（株感染２日目のマウス腹腔内をハンク
ス緩衝液で洗浄し、その中に含まれるＴｐを７５０Ｇ、
４”Ｃで１０分間遠心分離した。沈渣には腹腔細胞など
の夾雑物が含まれているので、ナイロンメツシュカラム
を用いて濾過し、可及的に除去した。得られたＴｐ虫体
懸濁液をＨＢＳＳ液で３回遠心洗浄（７５０Ｇ、４°Ｃ
で１０分間）した、沈渣のＴｐ虫体を１　ｎｉｌ当たり
２ＸＩＯ’個程度になるように滅凹蒸留水を混和し、攪
拌後、−７０°Ｃの冷凍機を用いて凍結融解を３回繰り
返した。ついで、和研薬社製Ｗ−２２０Ｆ型細胞破壊装
置を用いて４０Ｗで１分間の超音波処理を５回行い、虫
体を破砕した。この抽出溶解抗原を１６．０００　Ｇ、
４℃で６０分間遠心し、不溶物を除去し、得られた上滑
に等量の１゜７％塩化ナトリウム溶液を加え等張とした
。この尖うに調整された等張液を１４４，０ＯＯＧ。

４°Ｃで１２０分間超高速遠心して上清を採集し、濾過
滅菌を行った後、真空乾燥して蛋白物質ＴＬＡ−１４４
を得、これを冷暗所に保存した。

（２）　　ＴＬＡ−１４４（４５ｍｇ）を２．３１ｄの
水にン容解し、予め０゜１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（
ρｒ＋４．８）で平衡化させたファルマシア社製ゲル濾
適用充填剤セファデックスＧ−７５を充填したカラム（
１，６φＸ９６ｃｍ）に注入し、同上の緩衝液を用い、
流速７成／時間で溶出した。）容土液をＡ２８０ｎｍで
モニターしながら３０分毎に３．５　ｄずつ分画した。

分子１４，０００〜１５．０００の百分を分取し、凍結
乾燥し、白色粉末状の抗腫瘍性蛋白ＴＬＡ−Ｈ約０．２
１■を得た。

（３）　　このＴＬＡ−Ｈ約０．２■を予め０．１％ト
リフルオロ酢酸で平衡化させたバイオ・ランド社製逆相
系充填剤ＲＰ−３０４カラム（４，６φ×２５０闘）に
注入し、カラムを０．１％トリフルオロ酢酸で洗浄後、
アセトニトリル濃度を５７％まで増加させ、流速１゜Ｏ
ｄ／分で溶出した。溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターし
た。アセトニトリル濃度３２．０％、３２．５％、３４
．０％および３８．０％で？容土される百分を集め、そ
れぞれの両分についてリクロマトを繰り返し、ＴＬＡ−
Ｈ４（０，０１ｍｇ）　、ＴＬＡ〜Ｈ５Ａ　（０，０６
ｍｇ）　、ＴＬＡ−Ｈ６（０，０５ｍｇ）およびＴＬＡ
−Ｈ８（０，０１■〕を単離した（第２図参照）。

実施例２ Ｔ　Ｌ　Ａ　−Ｈ４、ＴＬＡ−Ｈ５Ａ、ＴＬＡ−Ｈ２Ｏ
およびＴ　Ｌ　Ａ　−Ｈ６の単離： ＴＬＡ−１４４（９３■）を２．３ｄの０．８５％塩化
ナトリウム溶液に溶解し、予め０．１　Ｍ酢酸アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ４，８）で平衡化させたファルマシア
社製ゲル濾適用充填剤セファデックスＧ−７５を充填し
たカラム（１，６φＸ９６ｍｍ）に注入し、同上の緩衝
液を用い、流速７．４ｍｌ！／時間で溶出した。溶出液
をＡ２８０ｎｍでモニターしながら３０分毎に３．７成
ずつ分画した。分子１５０００〜１５０００の両分を分
取し、凍結乾燥し白色粉末状の抗腫瘍性蛋白ＴＬＡ−Ｈ
約０．７４　ｍｇを得た。

このＴＬＡ−Ｈ約０．７０■を予め０．１％トリフルオ
ロ酢酸で平衡化させたバイオ・ランド社製逆相系充填剤
ＲＰ−３０４カラム（４，６φ×２５０配）に注入し、
カラムを０．１％ＴＦＡで洗浄後、アセトニトリル濃度
を５７％まで増加させ、流速！、Ｏｄ／分で溶出した。

溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターした。アセトニトリル
濃度３２．０％、３２．５％、３３．０％および３４．
０％で溶出される両分を集め、それぞれの画分について
リクロマトを繰り返し、ＴＬＡ−Ｈ４（０，ＯｔＩ！ｇ
）　、ＴＬＡ−Ｈ５Ａ　（０，１３ｍｇ）　、ＴＬＡ−
Ｈ２Ｏ（０，０７■）およびＴＬＡ−Ｈ６（０，０４■
）を単離した。

実施例３ ＴＬＡ−Ｈ５Ａの構造解析： ３０μｇのＴＬＡ−Ｈ５Ａを０．１成の０．０５　Ｍト
リス・塩酸（ｐＨ９，２）に溶解し、１．５ｄｇリシル
・エンドペプチダーゼＣを加え、３７゛Ｃで１５時間イ
ンキュベートしペプチド断片化した。

断片化したペプチドを予め０．１％トリフルオロ酢酸で
平衡化させた逆相系充填剤ＲＰ−３０４カラム（４，６
φＸ２５０ｍ）に注入し、アセトニトリル濃度を９５％
まで増加させ、流速１．０　ｍｌ　／分で分離溶出した
。溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターした。アセトニトリ
ル濃度Ｏ％〜４０％で分離溶出された８種類のペプチド
について、０．１％チオグリコール酸を含む６Ｎ塩酸で
２０時間加水分解し日立８３５型アミノ酸分析装置を用
いてアミノ酸組成を分析した。また、アプライド・バイ
オシステムダ４フ０Ａ型プロティン・シーケンサ−を用
いて自動エドマン分解し、生成したフェニルチオヒダン
トイン誘導化アミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸）をアプライ
ド・バイオシステムズ１−２０　Ａ型ＰＴＨアナライザ
ーを用いて分析しアミノ酸配列を解析した。

ＴＬＡ−Ｈ５Ａのアミノ酸組成分析結果（表１参照）、
Ｎ末端アミノ酸配列分析結果および８種類の構成ペプチ
ドのアミノ酸組成分析結果、アミノ酸配列分析結果から
決定したＴＬＡ−Ｈ５Ａの一次構造を次に示す。

Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−＋１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−１，ｙｓ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−＋
１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ−５ｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ
−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｎ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−１１
ｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈ４ｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ 実施例４ ＴＬＡ−Ｈ２Ｏの構造解析： ２０、ｇのＴＬＡ−Ｈ５Ｃを０．１　ｍの０．０５　Ｍ
トリス・塩酸（ｐＨ９，２）に溶解し、１．０μｇのリ
シル・エンドペプチダーゼＣを加え、３７゛Ｃで１５時
間インキュベートしペプチド断片化した。

断片化したペプチドを予め０．１％トリフルオロ酢酸で
平衡化させた逆相系充填剤ＲＰ−３０４カラム（４，６
φＸ２５０ｍｍ）に注入し、アセトニトリル濃度を９５
％まで増加させ、流速１．０ｄ／分で分離溶出した。溶
出液をＡ２２０ｎｍでモニターした。アセトニトリル濃
度０％〜４０％で分Ｍ溶出された８種類のペプチドにつ
いて、０．１％チオグリコール酸を含む６Ｎ塩酸で２０
時間加水分解し日立８３５型アミノ酸分析装置を用いて
アミノ酸組成を分析した。また、アプライド・バイオシ
ステムダ４フ０Ａ型プロティン・シーケンサ−を用いて
自動エドマン分解し、生成したＰＴＨ−アミノ酸をアプ
ライド・バイオシステムズ１２０Ａ型ＰＴＨアナライザ
ーを用いて分析しアミノ酸配列を解析した。

ＴＬＡ−Ｈ５Ｃのアミノ酸組成分析結果（表１参照）、
Ｎ末端アミノ酸配列分析結果および８種類の構成ペプチ
ドのアミノ酸組成分析結果、アミノ酸配列分析結果から
決定したＴＬＡ−Ｈ５Ｃの一次構造を次に示す。

Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ　−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖ
ａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｎ−八ｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−５ｅ
ｒ−八ｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｘ （上記配列においてＸはＡｓｐまたはＧｌｕを表わす〕
実施例５ ＴＬＡ−Ｈ６の構造解析： １５μｇのＴＬＡ−Ｈ６を０．１　ｄの０．０５　Ｍ　
トリス・塩酸（ρＩ＋　９．２　）に溶解し、０．７５
μｇのリシル・エンドペプチダーゼＣを加え、３７゛Ｃ
で１５時間インキュベートしペプチド断片化した。

断片化したペプチドを予め０．１％トリフルオロ酢酸で
平衡化させた逆相系充填剤ＲＰ−３０４カラム（４，６
φＸ２５０ａ＋ｏ＋）に注入し、アセトニトリル濃度を
９５％まで増加させ、流速１．０７１分で分Ｍ溶出した
。ｉ９出液をＡ２２０ｎｍでモニターした。アセトニト
リル濃度Ｏ％〜４０％で分離溶出された８種類のペプチ
ドについて、０．１％チオグリコール酸を含む６Ｎ塩酸
で２０時間加水分解し日立８３５型アミノ酸分析装置を
用いてアミノ酸組成を分析した。また、アプライド・バ
イオシステムダ４フ０Ａ型プロティン・シーケンサ−を
用いて自動エドマン分解し、生成したＰＴＨ−アミノ酸
をアプライド・バイオシステムズ１２０Ａ型ＰＴＨアナ
ライザーを用いて分析しアミノ酸配列を解析した。

ＴＬＡ−Ｈ６のアミノ酸組成分析結果（表１参照）、Ｎ
末端アミノ酸配列分析結果および８種類の構成ペプチド
のアミノ酸組成分析結果、アミノ酸配列分析結果から決
定したＴＬＡ−Ｈ６の一次構造を次に示す。

Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ　　−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｔ−Δ５ｐ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−＾ｓｎ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＧＩｙ＝ＩＩｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ４１ｅ−
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−５ｅ
ｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−八５ｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−↑ｈｒ−Ｌｅｕ−ｔｌｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｌａｕ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ （上記配列においてＸはＡｓｐまたはＧｌｕを表わす）
実施例６ ＴＬＡ−Ｈ６Ｄの合成： 使用した樹脂は粒径１００−２００メツシユのクロロメ
チル化されたポリスチレンビニルベンゼン樹脂である（
１％ジビニルベンゼンで架橋、樹脂１ｇ当たり０．６４
ミリモルのクロライドを含有）。

ポリペプチドを合成するに当たり２１ミリモルのＢｏｃ
−Ｌｅｕ−ＯＨをエチルアルコール２０ｄ１水６　ｍｌ
へ溶解し、炭酸セシウム水溶液にてｐ＋＋７とし、減圧
濃縮し、乾燥させた。これにＤＭＦ１２６ｄを加え、１
２．８ミリモルのクロロメチル化樹脂を加え、５０°Ｃ
にて２４時間処理し、エステル化した、得られた結合ア
ミノ酸樹脂を濾過し、９０％ＤＭＦ、ＤＭＦ、エチルア
ルコールにて順次洗浄し、かつ乾燥した。

この結合アミノ酸樹脂６ｇを固相合成反応容器に入れ下
記スケジュール１に従って Ｂｏｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）−〇Ｈ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｖａ　ｌ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ
，、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏ　ｃ−Ｌ
　ｅ　ｕ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−３ｅｒ　
（Ｂｚ　ｌ）　−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯｃＨｅｘ
）−０Ｈ，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（ＣＩ−Ｚ）−ＯＨ１Ｂｏ
ｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ，Ｂｏｃ−１ｉｅ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ，、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｃ１２−
Ｂｚ　ｌ）　−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（ＯｃＨｅｘ）
−ＯＨ２ Ｂｏｃ−Ｓｅｒ　（ＢＺＩ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　（Ｂｚ　Ｉ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−
Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）−ＯＨ１ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（ＯｃＨｅｘ
）−ＯＨ１Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ，Ｂ
ｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　　（ＣＩ　−
Ｚ）　−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨＳ　Ｂｏｃ　−Ａ
ｌａ−○Ｈ，，Ｂｏａ−Ｐｈｅ−０１（、Ｂｏｃ−ＩＩ
ｅ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ｌｅ’ｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）
−ＯＨ，、Ｂｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨ，、Ｂｏｃ−Ｃ；Ｉｎ
−０ＨＳ　Ｂｏｃ−Ａｓｐ　　（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ１
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−１１ｅ−ＯＨ１Ｂ　ｏ　ｃ−Ｇ　Ｉ　ｙ−ＯＨ
。

Ｂｏｃ−Ｇｌｕ、（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ１Ｂｏｃ−Ｌｙ
ｓ　　（ＣＩ−Ｚ）−ＯＨ，Ｂｏｃ　−Ａｓｐ　（Ｏｃ
Ｈｅｘ）　−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｃｒｌｎ−ＯＨ，Ｂｏｃ−
Ｔｉｅ−〇ＴＬ　Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（ＣＩ−Ｚ）−ＯＨ
１ Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　　（ＣＩ　−
Ｚ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｖａ　１−ＯＨ，Ｂｏｃ　−Ａｓ
ｎ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　　（ＯｃＨｅｘ）−０Ｈ２ Ｂｏｃ−１１ｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　ｌ
）−〇Ｈ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ　　（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ。

Ｂｏａ−３ｅｒ　　（Ｂｚｌ）−ＯＨ１Ｂｏｃ−Ｐｒｏ
−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　　（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ，Ｂ
ｏｃ−Ｖａ　１−ＯＨ，Ｂｏｃ　−Ａｓｐ　　（ＯｃＨ
ｅｘ）−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨＳ　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　
Ｉ）−〇Ｈ，Ｂｏ　ｃ−１１ｅ−ＯＨ，Ｂｏ　ｃ−Ｔｈ
　ｒ（Ｂｚ　ｌ）　−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　　（ＣＩ
　−Ｚ）−ＯＨ２ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，ＢｏＣ−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　１
）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−○Ｈ，Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂ
ｚ　１）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌ３’Ｓ　　（ＣＩ　−Ｚ）
−〇■］、 Ｂｏｃ−Ｖａ　ｌ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ１Ｂｏ
ｃ−１１ｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−ＧＩｎ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ。

を順次、当量のＤＣＣを用いてカップリングさせた。各
カップリング反応後、少量の樹脂をニンヒドリンで試験
し、陽性青色となった場合には、カップリング不完全で
あるとして同一の保護形アミノ酸を用い反応を繰り返し
た。この際、添加剤としてＮ−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールまたはｐ−ニトロフェノールを加えた。その結果
、中間体ＴＬＡ−Ｈ６Ｄペプチド樹脂が得られた。

このＴＬＡ−Ｈ６Ｄペプチド樹脂０．５ｇにアニソール
３ｄ、無水フッ化水素２０ｄを加え、−２０°Ｃ６０分
間、０°Ｃ６０分間反応させ、減圧濃縮しジエチルエー
テル３００！ｎｌ加え３０分間攪拌し、濾過しジエチル
エーテル２００ｄで洗浄し、５％酢酸２００ｄにて抽出
し、樹脂を濾過し、水１００ｄで洗浄した。濾塊液を逆
相カラムクロマトグラフィー、ＹＭＣ−ＡＭ３２４０Ｄ
Ｓ　　１ｃｍＸ２５ｃｍＢＩＯ−ＲＡＤ　　ＲＰ−３０
４４，６ｍｍＸ２５ｃｍにて２回精製し、ポリペプチド
を得た。得られたポリペプチドはＨＰＬＣによる重ね打
ちにより実施例１で得られたＴＬＡ−８６と一致し、そ
のアミノ酸分析値は理論値と一致した。

アミノ酸分析 加水分解二６Ｎ塩酸−１％フェノール、１１０°Ｃ２４
時間 分析方法：　Ｐ　ｒ　Ｃｏ−ＴＡＧ　（逆相−ＰＴＣア
ミノ酸） ＊基準アミノ酸　　（）内理論値 Ａｓｐニア、６　（８）、Ｇｌｕ：１１．４　（１１）
。

Ｓｅｒ：２．９　（３）、Ｇｌｙ：４．３　（４）。

Ｈｉ　ｓ　：０．９　（１）、　Ａｒｇ　：３．Ｏ（３
）。

Ｔｈｒ　：６．５　（７）、　Ａｌａ　：２．１　（２
）。

Ｐｒｏ　：３．１　（３）、　Ｔｙｒ　：　１．０　（
１）。

Ｖａ　ｌ　：３．８　（４）、　Ｍｅ　ｔ　：０．９　
（１）。

１１ｅ：６．９　（７）、＊Ｌｅｕ：９．０　（９）。

Ｐｈｅ　：　１．８　（２）、　　Ｌｙｓ　：６．８　
（７）〔以下余白］ Ｘ　　　　〜　　　　　　　　　　　　　　　　　へ　
　　　　　　　　　へ全 但し、工程ｌＯでＢｏａ−Ｇｉｎ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓ
ｎ−ＯＨの場合は全て添加剤を用い、Ｂ’。

ｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ
，、Ｂｏｃ−１１ｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ，、
Ｂ　ｏ　ｃ　−Ｇ　Ｉ　ｎ−ＯＨの場合は塩化メチレン
の代わりに３０％ＤＭＦ−７０％塩化メチレン（Ｖ／Ｖ
）を用い、２回目以降のカップリングの場合は塩化メチ
レンの代わりにＤＭＦ、ジメチルスルホキシド、ｌ−メ
チル−２−ピロジノン、または塩化メチレンとの混合溶
媒を用い、反応時間を最大１０時間まで延長した。

実施例７ ユビキチン（Ｓｊｇｍａ社製）５■を０．０５　Ｍ酢酸
緩衝液０．８　ｄに溶解し、カルボキシペプチダーゼＰ
１７μｇを加え３７°Ｃで１５時間インキュベートした
。

反応液を予め０．１％ＴＦＡで平衡化させた逆相系充填
剤ＲＰ−３０４カラム（４，６φＸ２５０ｍ＋ｎ）に注
入し、アセトニトリル濃度を４３％まで増加させ、流速
１．０　ｍｆｌ　７分で溶出した。溶出液をＡ２２０ｎ
ｓでモニターした。アセトニトリル濃度３３％〜３４％
で溶出される両分を分取し、更に同一カラムで繰り返し
精製し、ＴＬＡ−Ｈ３Ｐ（２，６■）を単離した。

ＴＬＡ−Ｈ３Ｐのアミノ酸分析値は、ユビキチンのＣ末
端アミノ酸３残基が欠落した誘導体の理論値と一致した
。

ＴＬＡ−Ｈ３Ｐのアミノ酸組成： Ａｓｘ　７，２　（７）、　Ｔｈｒ　６．８　（７）、
　Ｓｅｒ　２．７　（３）。

Ｇｌｘ　１３．０　（１２）、　Ｐｒｏ　３．２　（３
）、　Ｇｌｙ　４．０　（４）。

Ａｌａ　２．０　（２）、　Ｖａｌ　４．０　（４）、
　Ｎｅｔ　１．０　（１）。

１１ｅ　７．０　（７）、　Ｌｅｕ　９．３　（９）、
　Ｔｙｒ　１．０　（１）。

Ｐｈｅ　２．０　（２）、　Ｌｙｓ　７．３　（７）、
　Ｈｉｓ　１．０　（１）。

Ａｒｇ　３．１　（３）

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性蛋白質ＴＬＡ−ＨのＴＳＫ−Ｇ２００
Ｏ５−を用いた高速ゲル濾過法による分析結果を示した
図である。 第２図は抗腫瘍性蛋白質ＴＬＡ−Ｈの逆相系充填剤ＲＰ
−３０４を用いた高速液体クロマトグラフィー法による
精製結果を示した図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質および生物学的性質を有する
   抗腫瘍性蛋白質。 ［１］分子量：４，０００〜１５，０００（セファデッ
   クスＧ−７５ゲル濾過法） ［２］トキソプラズマ原虫の水溶性画分に含まれる。 ［３］マウス実験腫瘍に対し抗腫瘍活性を示す。
2. （２）逆相液体クロマトグラフィーを用いることを特徴
   とする請求項（１）記載の抗腫瘍性蛋白質の精製方法。
3. （３）請求項（１）記載の蛋白質を有効成分とする抗腫
   瘍剤。