JPH01291162A - 免疫分析用固相抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法に用
いられる固相抗体に関するものである。

Ｂ１発明の概要 本発明は、固相に抗体を吸着させて成り、抗原抗体反応
により抗体の濃度を測定するための固相抗体において、 固相表面の粗さを表面の最大高さで表示したときに０．
０５μＩＩ〜３００μｍとなるように仕上げることによ
って、 抗体の固相への吸着量を増やして、免疫分析における検
出感度を高めるようにしたものである。

Ｃ１従来の技術 生化学の分野においては、近年、抗原抗体反応を利用し
て微量の抗原物質を精度良く分析測定する免疫分析法、
特に固相抗体を用いる免疫分析法が注目されている。こ
の固相抗体を用いる免疫分析法は固相に抗体を吸着不溶
化させて、これを用いて抗体の濃度を測定する方法であ
り、これには競合法と非競合法とがある。

競合法は一定量の標識抗原と測定すべき抗原とを一定量
の抗体に対して競争的に結合させ、抗体と結合した標識
抗原の量から測定すべき抗原の量を知る方法である。

非競合法の中には種々の測定系があるが、サンドイッチ
測定法がその代表的な方法である。このサンドイッチ測
定法は同相表面に吸着させた抗体に抗原をトラップさせ
、トラップされた抗原に更に酵素標識抗体を結合させ、
結合したこの酵素標識抗体の量から測定すべき抗原の量
を知る方法である。

これらの方法において、今までの固相は表面あらさがほ
とんどないポリスチレン、ガラス、アクリルニトリル−
ブタジェン−スチレン共重合樹脂（ＡＢＳ）などが多く
用いられていた。

Ｄ１発明が解決しようとする課題 非競合法においては、固相への抗体吸着量を増加させる
と検出感度が向上すると考えられているが、上記のよう
な従来の固相抗体では、固相の材質によつて抗体の吸着
量に差はほとんどなく、固相浸漬液の組成、ｐＨ等を検
討しても、抗体の吸着量をこれ以上増大させることがで
きず、従って検出感度をこれ以上高めることができない
という問題点があった。こうした問題点を解決するため
に、同相材料として生体親和性が良いセラミックス、即
ちハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、バイ
オガラス、アルミナ単結晶及び多結晶、部分安定化ジル
コニアといった材料を用い、これらのボールを使用する
ことによって検出感度をある程度向上させることができ
た。

しかしながら実用上はまだ不十分であり、本発明は更に
検出感度を向上させて免疫学的測定の実用価値を高める
ことを目的としている。

９０課題を解決するための手段 本発明は同相への抗体吸着量を増加させるための手段と
して、固相の表面の粗さに着目し、その粗さを適当な大
きさにすることによって、抗体の物理的吸着力を強くし
ようとするものであり、具体的には、固相表面の粗さを
表面の最大高さで表示したときに０．０５μｍ１〜３０
０μ翼となるように仕上げたことを特徴とする。

Ｆ、実施例 以下の実施例においては、固相としてリン酸カルシウム
（Ｃａ３（ＰＯ４）ｔ）ボール　（以下「ＴＣＰボール
」という。）を用い、ボール表面の粗さを第１表に示す
ように４つに分けて各ボールに割り当て、Ｔ−１〜Ｔ−
４の４種類のＴＣＰボールを用意した。

第１表 表面の粗さは万能表面形状測定機により測定し、ＪＩＳ
Ｂ０６５９　　に従って表面の最大高さＲｍａｘで表示
した。ここで最大高さＲｔａａｘとは、第１図に示すよ
うに断面曲線部から基準長さ分抜き取り、この抜き取り
部分の平均線に平行な２直線で当該抜き取り部分を挟み
、その２直線の間隔を断面曲線部の縦倍率の方向に測定
して、その値をミクロン単位で表わしたものである。ま
たＴ−１〜Ｔ−４ボールの各々の表面は、６．５ｘｘφ
の大きさに焼結成形したリン酸カルシウムのボールを、
ＳｔＣの研磨材と共にステンレス製の簡に入れ、これを
回転させることにより仕上げた。

実施例Ｉ　　ＴＣＰボールの抗体吸着量の比較同相に抗
体を被着させて固相抗体を得、これに標識抗原を付着さ
せて標識抗原の吸着ｍを測定することにより、間接的に
抗体の各固相（’ｌ−１〜Ｔ−４）への吸着量を調べた
。

■固相抗体の調製 先ずＡＦＰを投入した動物の血清から免疫グロブリン（
以下ｒ１ｇＧＪという。）を得、これをＴＣＰボール（
Ｔ−１−Ｔ−４）に被着させて同相抗体を得た。ここで
ＡＦＰとは、α−フェトプロティンの略語であり、主に
肝癌の診断に用いられている抗原物質である。また同相
抗体は次のようにしテ調製した。即ち、０　、　１　ｍ
９７ｘＱ（Ｄ　Ｉ　ｇ　Ｇを含む０．１ｍｏ１２／（！
、ｐＨ７，５のリン酸緩衝液（以下「Ａ液」という。）
にＴＣＰボールを浸漬して温度４℃で１晩静置した。そ
の後ＴＣＰボールをＡ液で３回洗浄し、続いて０．Ｉｍ
ｏ＆／ＣのＮａＣ（！、０．１％ＢＳＡ（０，１％ウシ
血清アルブミン）及び０．１％Ｎ　ａ　Ｎ　３を含む０
．０１＋＋ｏ＆／ｅリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）（以下
「Ｂ液」という。）で３回洗浄した後、ＴＣＰボールを
当該混合液に浸漬して温度４℃で保存する。こうしてＴ
ｇＧによりコーティングされたＴＣＰボール、即ち固相
抗体が得られる。

■標識抗原吸着量の測定 抗原物質であるＡＦＰの固相抗体への吸着量を測定する
ために、標識である１ｆｆｉＪ　　をＡＦＰに結合して
Ｉ″Ｊ−ＡＦＰ　を得、これを標識抗原として用いた。

モして固相抗体を、約２　Ｘ　１０　”’ｃｐａ＋の”
５ｌ−ＡＦＰ　　１００μ１２と０〜１０００ｒ＋ｙ／
ｊｃの範囲から選ばれた濃度のＡＦＰ　１００μＱと上
記のＢ液１００μｇとの混合液中に１晩浸漬し、洗浄液
γ−ウェルカウンタで放射線量を計数した。ＡＰＩ）６
度（ｎ９／ＩＩＱ）と放射線１（ａｐｅ）との関係は第
２図に示すようであった。第２図中実線（１）〜（４）
は夫々ＴＣＰボールＴ−１〜Ｔ−４を用いた実験に対応
している。

■抗体吸着量の評価 第２図は評価抗原の同相抗体への吸着量を示した結果で
あるが、抗体（ＩｇＧ）の固相（ＴＣＰボール）への吸
着量と標識抗原の同相抗体への吸着量とは対応関係にあ
ることから、第２図は抗体の固相への吸着量を示した結
果といえる。この結果から抗体吸着量は’ｒ−２．Ｔ−
３の固相の方がＴ−１，１−４の固相よりも多いことが
わかる。

その理由については、Ｔ−２，Ｔ−３の表面の粗さが適
度であるため物理的な吸着力が強いことに起因している
と考えられる。

実施例２　標識抗体の非特異的吸着率の比較標識抗体と
して実施例１の（１）項で得たＩＫＧにＣＯＤ　（グル
コースオキシダーゼ）を結合したＩ　ｇＧ−ＣＯＤを用
い、これの同相抗体への非特異的吸着率を以下のように
して調べた。

■マレイミドＣＯＤの調製 ０　、　１　ｒａｏ（１／Ｑのリン酸緩衝液を０．３ｘ
（ｌずつ入れた試験管を４本用意し、各々にＣＯＤを約
３１１９ずつ入れ、更にサクシニミジル−４−マレイミ
ドブチレイト（ＧＭＢＳ）を、ＣＯＤとＣＭＢＳのモル
比が１＝５０となるように添加する。こうして得られた
溶液を、０　、　１　ｔａｏＱ／Ｑのリン酸緩衝液で平
衡化した商品名セファデックスＧ２５のカラム（１ｘ３
０ｃｍ、ファルマシア製）にｌ　２　ｘｆｆ／ｈｏｕｒ
の速度で通して脱塩処理し、その溶出液を試験管に１ｘ
Ｑずつ分取してマレイミドＣＯＤを得る。

■ＳＨ−１ｇＧの調製 実施例１の（１）項で得たＩｇＧを０．００５ｓｏ（１
／（ｌのＥＤＴＡを含む０　、　１５ｏ１２／　（ｌの
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）２ｘσに加え、この液とＳ
−アセチルメルカプトこはく酸とＩｇＧとがモル比で３
００　：　ｌとなるようにＤ　Ｍ　Ｐ　（Ｎ　−ｄｉｍ
ｅｔｙｌｆｏｒｍａｓｉｉｄｅ）に添加して溶解し、室
温で３０分間撹拌する。次いでこの溶液を０　、　　Ｉ
　ｍｏＩ２／（ｌのトリス−塩酸（ｐＨ７，０）　０．
　１ｘ（１，Ｏ，ＩｔａｏＱ／Ｑ）ＥＤＴＡ　（ｐ１４
７．０）０．０２ｘＱ、及び１ｎｏ（／？７）ヒドロキ
シアミン水溶液（ｐＨ７，０）０．１χＱの混合液に添
加して温度３０℃で４分間反応させ、ソノ後コノ反応液
を、０．　Ｏ０５ｎｏ（！／（！ＥＤＴＡを含む０　、
　　ｌ　ｍｏＱ、／　（ｌのリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６、
０）で平衡化した商品名セファデックスＧ２５のカラム
（Ｉ　Ｘ　３０ｃｍ、ファルマシア製）に１２　ｚ（１
／　ｈｏｕｒの速度で通すことにより脱塩処理を行い、
溶出液を試験管にＬｘ（ｌずつ分取することによりＳ　
Ｈ基の結合したＩＫＧを得、これを集めて水冷中のコロ
ジオンバックで濃縮し、こうしてＳＨ−Ｉ　ｇＧを得る
。

■Ｉ　ｇＧ−ＣＯＤの調製 上記の■、■項で夫々得られたマレイミドＣＯＤとＳＨ
−Ｉ　ｇＧとを等モルずつ混合して、温度３０℃で１時
間静置後、温度４℃で１晩放置する。

そしてこの溶液を、０　、００５ｎｏＱ／ＱのＥＤＴＡ
を含む０　、　１　ＩａｏＱ／（ｌのリン酸緩衝液（ｐ
　ｆ（６、５）で平衡化した商品名セファクリル３００
のカラム（Ｉ　Ｘ　９０　ｃｔｓｓ　ファルマシア製）
に６　ｘ（１／　ｈｏｕｒの速度で通して溶出させ、そ
の溶出液を試験管に１峠ずつ分取してＩ　ｇＧ−ＣＯＤ
標識抗体を集める。

そしてこの標識抗体に０．１％のＮ　ａ　Ｎ　ｓ、０．
１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）となるように添加
し、温度４℃で保存する。

■非特異的吸着率の判定 先ず標識抗体を上記のＣ液で１００倍に希釈した液を０
．１ｘＱ採取し、これにＣ液を０．２ｘ（ｌ加えた溶液
に固相抗体を浸漬して、室温で１晩静置する。その後固
相抗体を取り出して蒸留水により３回洗浄し、新しい試
験管に移し変える。次いでこの試験管に０．５ｎｏＱ／
（ｌのグルコースを含む０　、　Ｏｆ　ｔａｏ（１／（
ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５，１）を０．３ｘＱ添加して温
度３７℃で２時間静置する。

しかる後にこの溶液の０．１ｘＱをサンプリングし、’
ｌ　ｘ　ｌ　Ｏ−’ａ＋ｏｆ２／　１２のルミノールを
含む０．２ｍｏｆ２／ぐの炭酸緩衝液（ｐ　Ｈ９、８）
を０．５ｚ１２加え、更に６　ｘ　１０−”ｍｏＱ／（
ｌのフェリシアン化カリ水溶液０．５ｘＱを添加して１
５秒待った後３０秒間の発光量を積算する。この発光量
は固相抗体に非特異的吸着された標識抗体の量ＸＩに対
応する。−方標識抗体の総量Ｘ、は、標識抗体をＣ液で
１００倍に希釈した液（０，１，ｎ）について同様にし
て発光量を求めることにより知ることができる。

従って非特異的吸着率は（ｘ＋／ｘｔ）　Ｘ　ｌ　００
として算出され、その結果は第２表に示す通りであった
。

第２表 ■非特異的吸着率の評価 非特異的吸着率はサンドイッチ測定法の感度を左右する
主な要因の１つであるが、第２表かられかるようにＴＣ
Ｐボール（Ｔ−１−Ｔ−４）の間では差がない。これは
抗体が同相へ吸着した後、牛血清アルブミンによるブロ
ックが、各ＴＣＰボールの固相に対して同程度に有効で
あるためと考えられる。

実施例３　標識抗体の非特異的吸着率 固相抗体としては、ＣＥＡを投入した動物の血清から得
たＩｇＧをＴＣＰボール（Ｔ−１−Ｔ−４）に被着させ
たものを用い、また標識抗体としては、ＣＥＡを投入し
た動物の血清から得たＩｇＧにＣＯＤを結合したものを
用い、実施例２と同様にして非特異的吸着率を調べた。

結果は第３表に示す通りである。なおＣＥＡは癌胎児性
抗原の略語であり、大腸癌の診断に用いられている物質
である。

第３表 第３表かられかるように抗原物質としてＣＥＡを用いた
場合にも非特異的吸着率は固相表面の粗さに左右されな
いといえる。

実施例４　測定範囲、検出限界の比較 ■比較実験 固相抗体としては実施例１と同様のものを用い、標識抗
体としては実施例２と同様のものを用いて、ＡＦＰ濃度
（ｎｙ／ｘ（１）と化学発光強度（ｃｐａ＋）との関係
を示す検量線を求める実験を次のようにして行った。

固相抗体（Ｔ−１−Ｔ−４）の各々を、上記のＢ液で希
釈したＡＦＰの標準液０．１ｘＱにＢ液０．２ｘＱを添
加した溶液中に浸漬し、室温で６時間静置する。その後
固相抗体を取り出して蒸留水により３回洗浄し、標識抗
体をＢ液で最適希釈倍率に希釈した溶液０．１ｘ（ｌと
Ｂ液０．２ｄとの混合液に、洗浄後の固相抗体を浸漬し
て室温で１晩静置する。そして固相抗体を蒸留水で３回
洗浄してから新しい試験管に移し変え、この試験管に０
．５ｉ（！／１２のグルコースを含む０　、０１　ｔａ
ｏＱ、／（１の酢酸緩衝液（ｐＨ５，１）を０．３１添
加して温度３７℃で２時間静置する。しかる後にこの溶
液の０，１ｚＱをサンプリングし、２　Ｘ　１０−’＋
ｏｆ２／ｌのルミノールを含む０．２ｍｏＮ／ｆｆの炭
酸緩衝液（ｐＨ９，８）を０　、５　ｙｔＱ加え、更に
６Ｘ１０−’ｍｏＱ／（ｌのフェリシアン化カリ水溶液
０．５ｘ（ｌを添加して１５秒待った後３０秒間の発光
量をｈｔｕし、化学発光強度（ｃｏｕｎｔ／　３０５ｅ
ｃ）を求めた。この化学発光強度とＡＦＰとの関係は第
３図に示す通りである。

■測定範囲、検出限界の評価 第３図のグラフかられかるように、低濃度域では、Ｔ−
２，Ｔ−３ボールを用いた測定の方がＴ−１，Ｔ−４ボ
ールを用いた測定よりも高い発光強度を示しており、従
って前者の方が後者よりも測定範囲、検出限界が広い。

この理由は実施例１の結果にて示されるように、’ｒ−
２．Ｔ−３ボールの表面の粗さが抗体吸着に適している
ため、同相への抗体吸着量が多くなったことによるもの
である。

実施例５　測定範囲、検出限界の比較 同相抗体としては、ＣＥＡを投入した動物の血清から得
たＩｇＧをＴＣＰボール（１−１−Ｔ−４）に被着させ
たものを用い、また標識抗体としては、ＣＥＡを投入し
た動物の血清から得たＩｇＧにＣＯＤを結合したものを
用い、ＣＥＡ濃度（ｒ＋９／ｘＩ２）と化学発光強度と
の関係を示す検量線を求める実験を実施例４と同様にし
て行った。結果は第４図に示す通りであり、実施例４と
同様にＴ−１，Ｔ−３ボールを用いた測定の方がＴ−１
゜Ｔ−４ボールを用いた測定よりも測定範囲、検出限界
が広い。

ここで固相材料としてＣａ　ａ（Ｐ　Ｏ４）：ｉを用い
る代わりに他の材料例えばハイドロキシアパタイト、ア
ルミナ、バイオガラス、部分安定化ジルコニアあるいは
アルミナ単結量を使用して上記実施例と同様な実験を行
ったところ同様な結果が得られた。

Ｇ２発明の効果 本発明は固相抗体の固相材料表面の粗さを、表面の最大
高さが０．０５μｊＩ〜３００μ真となるように仕上げ
ているため、実施例から裏付けられるように抗体の固相
への吸着量が多く、従って免疫分析における検出感度を
高めることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は固相表面の粗さを示す説明図、第２図は抗体吸
着量を比較して示すグラフ、第３図及び第４図は各々抗
原の濃度測定範囲を示すグラフである。 稼１年７□４Ｂ 昭和６３年特許願第１２１１２１号 ２、発明の名称 免疫分析用同相抗体 ３　補正をする者 事件との関係　　出願人 （６１０）　　株式会社明　電　舎 ４、代理人〒１０４ 東京都中央区明石町１番２９号　液済会ビル外２名 ５、補正の対象 （１）明細書の特許請求の範囲の欄。 （２）明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）明細書第２頁第２行の「抗体の濃度」を「抗原の
濃度」と訂正する。 別　　紙 特許請求の範囲 （１）固相に抗体を吸着させて成り、抗原抗体定するた
めの固相抗体において、 固相表面の粗さが表面の最大高さで表示したときに０．
０５μＩＩ〜３００μ肩であることを特徴とずろ免疫分
析用固相抗体。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）固相に抗体を吸着させて成り、抗原抗体反応によ
   り抗体の濃度を測定するための固相抗体において、 固相表面の粗さが表面の最大高さで表示したときに０．
   ０５μｍ〜３００μｍであることを特徴とする免疫分析
   用固相抗体。