JPH01294532A - 高安定性の多孔質酸化ジルコニウム小球体 - Google Patents

高安定性の多孔質酸化ジルコニウム小球体

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JPH01294532A
JPH01294532A JP1024090A JP2409089A JPH01294532A JP H01294532 A JPH01294532 A JP H01294532A JP 1024090 A JP1024090 A JP 1024090A JP 2409089 A JP2409089 A JP 2409089A JP H01294532 A JPH01294532 A JP H01294532A
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ピーター　ダブリュ．カー
Eric F Funkenbusch
エリック　エフ．ファンケンブッシュ
Martin P Rigney
マーチン　ピー．リッグニイ
Patrick L Coleman
パトリック　エル．コールマン
Douglas A Hanggi
ダグラス　エイ．ハンギ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、高安定性の多孔質酸化ジル：ｌニウム小球体
に関するものである。
発明の背景 Ａ、無ｍ酸化物を基剤とするクロマトグラフィ用担体ニ ジリカ（Ｓｉｎ、）またはアルミナ （Ａ１２０３）の粒子を含有してなるクロマトグラフィ
用の公知無機担体はそれぞれ約１−８おにび３−１２の
ｐＨにおいて安定である。このｌ）Ｈ範囲以外のｐｌ＋
においては５ｔＯ２およびＡ１２０３が可溶化し、その
結果これらの担体が劣化し、かつ、クラマドグラフィに
よって分離させた生成物が、珪素含有物質またはアルミ
ニウム含有物質で汚染される。粒子状ＳｉＯ２の表面を
酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）のごときアルカリ安定性
の一層良好な金属酸化物で被覆することによって粒状Ｓ
ｉＯ２のアルカリ安定性を改善する方法が、米国特許節
４．６４８，９７５号および第４．６００．６４６号明
細書に開示されている。この被覆形成によって上記担体
の許容ｐＨの上限値が上がり、これらの担体は充填剤と
してそれぞれｐＨ１１および９．５において使用できる
ようになる。しかしながらこれらの充填剤のアルカリ安
定性はなａ３充分ではなく、たとえば０．ＩＮ＝水酸化
ナトリウム水溶液（Ｎ　ａＯＨ，ｐＨ＝　１３　）中で
洗浄および消毒を行うことは不可能である。
米国特許節４．１３８．３３６号明ｉ出には、薄層クロ
マトグラフィ用のプレートに多孔質の球状ＺｒＯ２粒子
を使用することが開示されている。
多孔質の微細球状ＺｒＯ２粒子の製造方法は米国特許節
４．０１０．２４２号明ｌ８ｍに記載されており、該粒
子をりＯマドグラフィに使用することは米国特許節３，
７８２．０７５号明細書に開示されている。上記の微細
球状粒子は次の方法によって￥Ｊ造され、すなわち、コ
ロイド状の金属酸化物の粒子を重合可能有機物質と混合
し、該有機物質の重合を行うことによって該粒子をコア
セルベート化することからなる製法によって製造される
。
この製法は時間のかかる回分式製法であって、しかも有
機物質の添加が必要である。しかじで該有機物質は熱分
解によって失われてしまう。
米国特許第３．８６２，９０８号明細書にはウラニアお
よび他の金属酸化物の微細球状粒子が記載されているが
、これらの粒子は焼成されて高密度になり、そのために
表面積が小さく、クロマトグラフィの分野での使用に適
さない。
米国特許第３．８９２，５８０号明Ｉｔ害には、ＺｒＯ
２からなる多孔質材料の製造方法が開示されている。該
製法ではバインダを使用して、これを酸化物粒子と反応
させることが必要である。このバインダは其後に熱分解
によって失われる。該製法によって製造される多孔質材
料は球状のものではなく、したがって不均質に充填され
、イの結果コラム圧が増大するであろう。したがってこ
れはクロマトグラフィに適した材料ではない。
米国特許第４，３８９．３８５号明細出には、気相凝縮
法によって作られた無機物質の固体粒子を液中に分散さ
せてゾルを生成させくこのゾルは、−次粒子の凝集物で
あるコロイド粒子を含有するものである）、該ゾルを乾
燥して、７０容量％より大なる空隙率を有する多孔質ゲ
ルを生成させることからなる多孔質のゲルおよびセラミ
ック材料を製造する方法が記載されている。
Ｂ、逆相高圧液体クロマトグラフィ： 高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の分離操作の大
部分はいわゆる逆相モードで実施される。
このモードでは、コラム充填剤は固定相として使用され
る。最もよく使用される固定相の特徴は、シロキサン結
合（Ｓｉ−０−８ｉ）に介して多孔質シリカ粒子に共有
結合によって無極性リガンド（たとえばオクタンまたは
オクタデカン）を結合させて該シリカ粒子の表面を疎水
性にしたものであることである。このシリカ系の加工粒
子からなる相は、種々の分野における逆相１４　Ｐ　Ｌ
　Ｃにおいて非常に有利に使用できるものであるが、ｐ
Ｈが２−８の範囲内に厳密に制限されている。なぜなら
ば、無極性の活性基をつなぎとめるために用いられるシ
ロキサン結合とシリカ担体粒子との両者が前記以外のｐ
ｌ＋では不安定であって、加水分解するおそれがあるか
らである。したがって、ｌ）Ｈ安定性を有する逆相用担
体の製造のために、１３　Ｉｌｌされた空隙率を有しか
つ大なる表面積を有する安定な担体材料を開発し、さら
にまた、該表面を永久に疎水性化する方法を開発するこ
とが必要である。
溶離剤は移動相（ｓ＋ｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ）とも称
され、モして溶離剤は、前記の固定相から種々の成分を
溶離するために使用される。該溶離剤は極性を有する液
であって、その例には水性ａｍ液、および水と有機溶媒
との混合物（たとえば水性アルコール）があげられる。
その極性は、当該移動相中の低極性液の濃度を高めるこ
とによって変えることができるが、これは当業界で公知
の技術である。
ＺｒＯ２を被覆したＳ　ｉ　Ｏ２の使用適性に関し、高
度の安定性を有する逆相用担体の製造操作は、シリカを
別の無機物質たとえばアルミナで置換する工程を含むで
あろう。シリカをアルミナで置換することによってｐＨ
安定性が多少向上するが、周知のごとくアルミナは、或
特定のｐＨ範ｔ）Ｉｆ（ｐ）ｌ＜２およびｐＨ＞　１２
　）においては室温でも溶解するものである。
既述のごとく、安定な逆相の形成のためには、ｐｔ＋安
定性を有する担体材料の使用の他に、該担体材料の表面
を安定な疎水性表面に変性する操作を行うこともまた必
要である。シリカ粒子を変性して逆相用の疎水性担体を
生成させるための変性方法として、シリル化方法が最も
広く利用されている。シリカ以外の無機物質（たとえば
アルミナ、チタニア、ジルコニア等）のシリル化方法は
米国特許第３．９５６．１７９号明細書に記載されてい
る。しかしながら、担体の表面に共有結合が実際に生ず
るかどうかについては、明らかにされていない。シロキ
サン結合が加水分解され易く不安定であることは周知で
ある。したがって、３ｉ−〇−金属結合は水中で一層不
安定で加水分解され易いと考えられる。なぜならばこれ
は極性の一層大なる結合であるからである。
前記のシリル化方法とは別の、無機物質の表面極性の変
改方法は、ＳｉＯまたはＡｌ２Ｏ３系担体物質の表面に
所定の極性／官能性を有する重合体を収着させ、次いで
個々の重合鎖を相互に架橋させて当該被覆の安定性を改
善することである。
この方法によって製造された逆相用担体は、シリル化方
法によって製造されたものよりもｐｌ＋安定性がはるか
に良好である。担体表面上に安定な架橋重合体層を形成
させた場合でも、該担体自体は安定な無機担体でなけれ
ばならないことに注目されたい。なぜならば無機担体の
表面全体に被覆を施すことが不可能であるからである。
担体に被覆された前記重合体の交叉結合は、その下側の
無機担体が溶解したときでさえ該重合体を適所に保つこ
とができるものであるけれども、担体の溶解は確実に該
担体の機械的強度の低下をもたらすであろう。既に知ら
れているように、無機担体が溶解した結果として該無機
担体が移動相に移り、コラムおよび他の機器の中を移動
し、そのためにコラムの逆圧が上昇するという厄介な問
題が起る。
シリカ系の逆相用担体を使用したときに起る別の問題は
、アミンおよび他の塩基性溶質のクロマトグラフィ操作
が困難であることである。この問題は、シリカの表面に
酸性のシラノール基（ＳｉＯＨ）が存在するために起る
問題である。
ｉ！！ｌ性溶質はシラノール基と非常に強く反応し、こ
れによってカチオン交換反応または水素結合形成反応等
が起るが、これらの反応は移動相のｐＨに左右される。
この問題は重大であって、そのためにシリカ充填コラム
では２＜ｐｌｌ＜８という条件下に操作を行わなければ
ならない。なぜならば大抵のアミンは上記の範囲内のｐ
Ｈにおいてプロトン化し、このプロトン化アミンが容易
にシリカの表面に結合し得るからである。アミンのクロ
マトグラフィを改善する方法として先ず思いつくことは
、アミンの電離定数よりもかなり高い水素イオン濃度を
保つことによってアミンを非プロトン化状態にしてクロ
マトグラフィ操作を行うことである。
しかしながらシリカ系のコラムを使用する場合には、こ
のようなｐＨ範囲でクロマトグラフィ操作を行うことは
不可能である。
さらに、前記の酸性シラノール基が存在する場合には、
シリカ系の逆相用担体中に種々の種類の有機分子が不可
逆的に吸着されることがあり得るが、この問題は既に当
業者によく知られている。
この不可逆吸着は、蛋白質の逆相ＨＰＬＣの場合に特に
厄介な問題である。極端な場合には、該吸着によって担
体の性質が変化し、担体が破壊することがあり得る。
逆相ＨＰＬＣは生物学的処理操作の分野において段々広
く利用されるようになった。なぜならばこの種のＨＰＬ
Ｇは物質の分離および精製のときに大なる効果を奏する
からである。ｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃを精製工程において実
施する場合には、分析の場合には考えられないような種
々の独特な条件を考慮に入れて実施しな番プればならな
い。その−例について述べれば、大または伯の生物が使
用する生成物の精製の場合には、精製操作の実施前にク
ロマトグラフィのコラムを消毒することが必要である。
発明の目的 したがって本発明の目的は、広いｐＨ範囲にわたって安
定であり、かつ水性媒質中で溶解し難いクロマトグラフ
ィのコラム用の担体材料を提供することである。
本発明の別の目的は、無極性の表面を有し、イオン交換
および逆相り０マドグラフイの両者による分離操作に使
用できる担体材料を提供することである。前記のイオン
交換および逆相クロマトグラフィの２つのプロセスの相
対的割合は、移動相の状態の調節によって簡単に調整で
きる。
本発明のさらに別の目的は、再生操作の可能な担体材料
を提供することである。再生操作は、不可逆的に吸着さ
れていた生物学的残留物や有機残留物を高ｐＨ下の処理
によって除去することによって実施できる。
本発明のさらに別の目的は、発酵操作等の生物工学的操
作によって作られる大量の生成物の分離操作のごとき大
規模な分離操作に使用でき、しかも、高ｐＨ下の熱処理
を包含する伝統的な滅菌操作にも堪え得る担体材料を提
供することである。
ｌ且立旦羞 本発明は、酸化ジルコニウム（別名：ジルコニア；Ｚｒ
０２）の多孔質小球体からなり、そして高速液体クロマ
トグラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）において固定相として使用
づるに適しｌ、：担体材料に関するものである。この小
球体は１−１４のｐＨの水性媒質中で非常に＾い物理的
安定性を有する。好ましいＺｒＯ２小球体は、直径約０
．５−５００μ（最も好ましくは約１−２０μ）、表面
積約１−１−２Ｏ０／ｇ＜最も好ましくは約４０４０−
１５Ｏ／９）、細孔直径約０．５−５００人（最も好ま
しくは約１００−３００人）のものである。
本発明のＺｒＯ２小球体は実質的に次の製法によって製
造され、すなわち０分散したゾルから水分を抽出し得る
性質を有する液体媒質中に、コロイド状ＺｒＯ２粒子を
含有する水性ゾルを分散させてゲル化ＺｒＯ２小球体を
生成させ、０該ゲル化小球体を前記媒質から回収し、そ
して（ｃ）該ゲル化小球体を加熱して固体状の多孔質Ｚ
ｒＯ２小球体を生成させることを特徴とする製法によっ
て製造される。この製法によって、実質的に球状の多孔
質ＺｒＯ２粒子が製造できる。これを床の形に作った場
合には、前記小球体はすぐれた移動床流動特性を有し、
すなわち前記特性は、不ｊＪ１１１１な形、ぎざぎざを
有する幹部をもつ立体の形または角ばった形の粒子の移
動相流動特性よりもはるかに良好である。
前記製法の好ましい具体例では、コロイド状のＺｒＯ２
のゾルに遠心分離操作を行い、上澄液をケイシャによっ
て除去し、残留物を大体等容量の水中に再分散させる。
上記の操作は数回（２−５回）繰返すのが好ましい。本
発明方法に従った場合には、上記の再分散ＺｒＯ２から
比較的大なる細孔直径および比較的大なる細孔容積を有
する小球体が得られる。
この小球体は床の形に形成でき、そしてクロマトグラフ
ィによる分離操作のときに固定相として使用できる。し
たがって該小球体は、剛壁を有するまたは有しない軸方
向流路を備えた普通のクロマトグラフィコラムにおいて
固定相として使用できる。たとえば、ＺｒＯ２小球体は
ｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　ＣのコラムのごときりＯマドグラフィ
コラムの中に充填でき、コラム中で該充填剤はクロマト
グラフィ操作の実施中に固定相として働く。このクロマ
トグラフィはイオン交換Ｊ３よび粒度選別（ＳｉＺｅｅ
ｘｃｌｕｓｉｏｎ　）プロセスによって行われるもので
ある。また、該小球体は半径方向の流路を有するコラム
で使用でき、あるいはｉ！ｌｌ床の形で使用でき、しか
して該流動床は一段式または多段式吸収塔と共に使用で
きる。小球体から床を作り、これを固定化酵素反応器ま
たは他の型の生化学的反応各に入れて使用することも可
能である。
ＨＰ　Ｌ　Ｃの主な実施方法は逆相モードを利用するも
のであって、すなわち、この場合の充填剤（固定相）は
無極性のものであり、移動相は極性のものである。した
がって本発明はまた、疎水性重合体層を被覆した多孔質
ＺｒＯ２小球体を含有してなる担体材料にも関する。こ
の被覆小球体は次の方法によって製造できる。小球体の
表面上に重合可能単倒体またはオリゴマーを吸着させ、
次いでこれを架橋する。この架橋反応は、たとえば被吸
着物質を遊離基重合開始剤と反応させることによって実
施でき、または光線照射によって実施できる。該重合体
型被覆によってＺｒＯ２粒子が疎水性になり、しかも該
粒子の好適な物理的および機械的性質は実質的に変化し
ない。また、イオン交換性担体材料の形成のために、Ｚ
ｒＯ２小球体に親水性の架橋重合体を被覆することも可
能である。
また、被覆小球体に適当なバインダを混合し、この混合
物をガラスまたはプラスチック製の基体に被覆すること
によって薄層クロマトグラフィ用プレートを製作するこ
とも可能である。
したがって本発明の別の好ましい具体例によれば、架橋
重合体で被覆された多孔質ＺｒＯ２小球体を含有してな
るクロマトグラフィ用担体材料が提供され、この被覆小
球体は疎水性であり、細孔寸法は約２０−５００人、平
均直径は約０．５−５００μである。
この担体材料は広いｐＨ範囲にわたって高度の安定性を
有するから、これはクロマトグラフィによる化合物の最
適ｐＨ条件下における分離操作のために有利に使用でき
る。たとえば、前記の製法によって製造された被覆担体
材料は、種々のｌ）Ｈ条件における種々の移動層の使用
によるアミンの分離操作のために使用できる。この分離
操作では、逆相維持モード、カチオン交換モードまたは
これらの２つのモードの組合わせたモードで所望化合物
が分離できる。たとえば高ｐＨ条件（ｐｌ＋＝　１２　
’）ではアミンはプロトン化しないから、これは逆相モ
ードで完全に分離される。低いｐＨにおいてイオン強度
の低い燐１１１を塩緩衝剤を存在させ、そして有機溶媒
に富む移動相を使用した場合には、分離操作はイオン交
換モードで実施できる。移動層の使用条件の３ｊ節によ
って、選択性（５ｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　）が確実に調
整できる。
本発明のＺｒＯ２小球体は、触媒用、分析用、アフィニ
ティークロマトグラフィ用、合成のための変換反応用等
の種々の使用目的のために生物学的活性物質を固定する
操作のために使用できる。
生物学的活性物質は未被ＩＺｒｏ２小球体または重合体
を被覆したＺｒＯ２小球体の外面および内面に強く収着
でき、しかも該活性物質は当初の生物学的活性の大部分
をそのまま維持し得る。有用な生物学的物質の例には酵
素や抗体のごとき蛋白質があげられる。
さらに、不可逆的に吸着された有機残留物または生物学
的残留物は、被覆小球体または未被覆小球体を充填した
汚染コラム（すなわちクロマトグラフィ操作が終った後
の汚れたコラム″）から次の方法によって除去できる。
この除去方法は、高ｐｌ＋において移動相を用いて該コ
ラムにフラッシング操作を行うことからなり、あるいは
高ｐｔ＋の移動相からなる脈＠　（ｐｕｌｓｅ　）を注
入することからなるものである。用語″不可逆的吸着″
は、吸着性の物質の表面に蛋白質、生化学的重合体およ
びその類似物が強く吸着される傾向を有し、通常の溶離
条件下では溶離せずに吸着されたまま残り、すな移動相
の状態が変化して被吸着物が充分に脱着されるようにな
るまで、被吸着物が吸着されたまま残るような吸着現象
を意味する。
したがって、イムノグロブリン等の蛋白質や酵素のごと
き生物学的活性物質を含有する無被覆または被覆された
ＺｒＯ２小球体を１１１にども可能である。生物学的活
性が失われた侵の酵素または他の蛋白質は、当該小球体
を高１）Ｈ条件下に水性Ｗ質で処理することによって、
たとえば該小球体をアルカリ金属水酸化物の溶液で洗浄
することによって、該小球体から除去できる。生物学的
物質を除去した侵の小球体は、其後に緩衝液で処理して
生理学的＋３Ｈ値に戻し、次いで前記の生物学的活性物
質と同種または異種の活性物質を再び吸着させることが
できる。
ＺｒＯ２小球体は公知の消毒条ｆ↑下でその場で消毒で
き、たとえば充填剤であるＺｒＯ２小球体、または充填
剤含有コラムを高ｐＨ条件下に加熱することによって消
毒でき、しかも小球球体は実質的に劣化しない。
本発明の別の好ましい具体例によれば、無被覆または被
覆されたＺｒＯ２小球体の表面が、有効量の有機ホスホ
ネートによる処理によって脱活性または変性でき、そし
てこの処理は疎水性重合体の被１１萌または被覆優に実
施できる。有機ホスホネートは重合体型被覆の有機マト
リックス中に侵入すると思われる。
発明の詳細な記述 １、Ｍ化ジルコニウム： 本発明の実施の場合には、所望小球体の製造原料として
使用される酸化ジルコニウム（７ｒＯ２）の一部または
好ましくは大部分がゾル状態のものであることが有利で
あり、すなわちＺｒＯ２粒子のコロイド分散物であるこ
とが有利である。この状態は、シリカのエアロゲルの単
純な水中分散液とは物理的性質が明らかに異なるもので
ある。後者の分散液は容易に沈澱する。なぜならば粒子
径が比較的大きく、かつ水中に安定化用の対イＡ゛ンが
存在しないからである。これとは反対に、無機粒子が水
性液中に存在する構造のコロイドゾルは、一般に肉眼で
見えないような微粒子である。
ゾル粒子の粒度は１ミクロンより小さく、大抵の常用濾
紙を通過してしまう。水中のゾル粒子は凝集しない。な
ぜならば表面にゼータ電位と称される安定化電荷が存在
するからである。水分が除去されると、ゾル粒子は水素
結合またはファンデルワールス力によって相Ｈに強く作
用し、凝集ゾル粒子が生ずる。本発明の小球体の製造原
料として適した酸化ジルコニウムのコロイド分散液は市
場で入手でき、たとえば「ナイアコル」　（登録商標）
なる商品名で米国マサシュセツツ州アシュランドのナイ
アコル社から販売されている。この分散液はＺｒＯ２を
約２０蛋吊％含有し、このＺｒＯ２の平均直径はたとえ
ば約１１０−２５０ａである。たとえば、［ナイアコル
ーＺｒ−９５／２０Ｊは、コロイド状ＺｒＯ２粒子を２
０重量％含有する水性分散液であって、該粒子の大部分
は直径約９５ｎｍのものである。
前記の小球体の製造原料として使用されるコロイド状ｚ
ｒｏ、、粒子の他に、非コロイド状のＺｒＯ２形成性原
料も使用できる。たとえばジルコニウムの塩化物、硝Ｍ
塩、硫酸塩、酢酸塩、蟻酸塩もしくは他の無機塩または
有機塩（たとえばオキシ塩やアルコキシド）をｚｒｏ、
、ゾルと混合し、この混合物を用いて小球体が製造でき
る。
ＺｒＯ２の全存在量の大部分をコロイド状のＺｒＯ２粒
子が占めるような混合物が好ましい。
小球体の製造原料として使用される前記のＺｒＯ２プレ
カーサに有機化合物が添加できる。
この有機物質は小球体の焼成工程において逸失するであ
ろう。たとえばポリビニルピロリドン、ポリエチレング
リコール、ポリエチレンオキサイド等の水溶性重合体ま
たはラテックスの粒子が、小球体の製造原料である液状
混合物に配合できる。
これらの焼失性原料は、フレカーサ液のレオロジー的性
質および焼成小球体の細孔構造の変改のために添加し得
るものである。
ＺｒＯ２のプレカーサと共に他種金属酸化物のプレカー
サを使用して、ＺｒＯ２の結晶相を安定化させ、かつ焼
成小球体の粒子生長を遅らせることができ、この操作も
本発明の範囲に入る。たとえばイツトリウム、マグネシ
ウム、カルシウム、セリウム、アルミニウム等の塩また
はゾルを約〇−２０モル％配合できる。他の酸化物添加
剤を含まない原料を空気中または酸化雰囲気中で焼成し
、室温に冷却することによって得られたＺｒＯ２小球体
は、単斜晶系、正方晶系または偽立方晶系の結晶ｌｉｔ
造を有する。焼成温度が比較的高くかつ焼成時間が比較
的長い場合には、単斜晶系のＺｒＯ２の生成量が増大す
る。他種の金属酸化物を添加した場合には、単斜晶系、
正方晶系または立方晶系の結晶構造を有する小球体が生
成する。
ＺｒＯ２の上記の性質は当業界で公知であって、たとえ
ば［アン、イントロダクション、ツウ、ジルコニア」、
マグネシウム、エレクトロン社（英国ツウイケンハム）
発行（第２阪；マグネシウム、エレクトロン社出版物番
号第１１３号、１９８６年７月発行）に記載されている
。
ｎ、ＺｒＯ２小球体の製造： 本発明のＺｒＯ２小球体すなわち球状ＺｒＯ２の製造の
ために、ＺｒＯ２粒子のコロイド状分散物を含有する水
性ゾルを媒質中に分散させる。この媒質は、小滴の形の
分散ゾルから水分を抽出し得る媒質であるべきである。
水分の一部または全部を除去した結果として、ゾル粒子
の凝集物からなるゲル化固体の小球体が生じる。使用で
きる媒質の例には、米国特許筒４．１３８．３３６号明
細書に記載の２−エチル−１−ヘキサノールがあげられ
る。安全でありかつ処理し易いという長所を有する好適
な媒質は落花生油であって、これは約８０−１００℃の
温度において使用するのが有利である。最も好ましい媒
質は落花生油とオレイルアルコールとを約１：１の混合
比で混合してなる混合物であって、これは約８０−１０
０℃の温度において使用するのが右利である。オレイル
アルコールは落花生油よりも大なる抽出容量を有し、し
たがって前記２成分の混合比の変改によって上記混合物
型媒質の抽出容量を調節できる。ゾルと抽出媒質との比
に応じて、抽出時間を約１−６０分間の範囲内で適宜調
節することによって、ＺｒＯ２粒子を充分にゲル化し得
る。ゲル化小球体は濾過操作等によって抽出媒質から有
利に分離できる。
ＺｒＯ２粒子を前記の方法によって小球体に凝集させた
後に、熱処理を約１００−１５００℃、好ましくは約４
００−８００℃の焼成温度において行う。かくして得ら
れた焼成小球体の直径は約１−５０Ｃ１であり、表面積
は１−１−２Ｏ０／９、細孔直径は約２０−５００人で
あり得る。この粒子は高い機械的強度を有し、かつ、約
１−１４のｐＨの水溶中で非常に高い安定性を右す゛る
。
該粒子はＨＰ　Ｌ　Ｃコラムに充填でき、そして、イオ
ン交換およびふるい分けによるＨＰＬＣクロマトグラフ
ィ分離操作に使用できる。ＨＰＬＣの技術および装置の
一般的解説は、「レミントンズ、ファーマセウチカル、
サイエンシズ」、Ａ、オソル編、マツク出版社（米国ペ
ンシルバニア州イーストン）、第１６版、１９８０年発
行、第５７５−５７６頁に記載されている。
■１重合体の被覆を施したＺｒＯ２小球体：ＨＰＬＣの
実施方法の大部分はいわゆる逆相モードで行われるもの
であり、すなわちこの場合のコラム充填剤（固定相）は
無極性のものであり、溶離剤（移動相）は極性のもので
ある。したがつて、ＺｒＯ２小球体の表面に疎水性被覆
を施すのが好ましい。この被覆は約１−１４のｐＨの水
溶液中で安定なものであることが好ましい。また、親水
性重合体の被覆を施し、これを架橋してＺｒＯ２小球体
を変性することによってイオン交換性担体を形成するこ
とも可能である。親水性重合体からなる被覆は、スルホ
ン酸基、カルボン酸基、アミノ基または第４級アンモニ
ウム基のごとき極性基を有する単量体またはオリゴマー
から形成できる。このような被覆の好ましい：ｇ１１方
法は、小球体の表面に重合可能小母体またはオリゴマー
を収着させ、次いで該単量体またはオリゴマーを架ｔｉ
ｔ　＝ｉることである。これについては、Ｇ、ションバ
ーグの論文［ｒＬＣ−ＧＣＪ　、旦、３６（１９８８）
］を参照されたい。
Ａ０重合可能単量体またはオリゴマー：多孔質のＺｒＯ
２小球体にｌＩＩ覆を施すために、種々の種類の架橋可
能有機物質が使用でき、該有機物質は単量体、オリゴマ
ーまたは重合体であってよい。該物質の例にはポリブタ
ジェン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル
ピロリドン（ＰＶＰ）　、ポリオルガノシロキサン、ポ
リエチレン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸
および多官能性シランがあげられる。
逆相用の担体材料の好ましい製造原料はポリブタジェン
のオリゴマーである。カチオン交換性担体の製造のため
にＺｒＯ２小球体を変性させるときに有利に使用できる
変性剤は、ポリアスパラギン酸である。立体的排除（５
ｔｅｒｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）用水性クロマトグラ
フィに適した担体の製造のために有利に使用できる物質
は、トリーまたはジ−アルコキシ−ガンマ−グリシドキ
シシランである。
Ｂ、架橋剤： 本発明を実施する場合には、周知の￥１１１基形成剤が
前記架橋剤として使用でき、その例には過酸化ジクミル
や過酸化ベンゾイルのごとき有機過酸化物、および２，
２′−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）のごと
きジアゾ化合物があげられる。市場で入手できる有用な
パーオキシエステルの例には、パーオキシカルボン酸の
アルキルエステル、モノパーオキシジカルボン酸のアル
キルエステル、シバ−オキシジカルボン酸のジアルキル
エステル、モノパーオキシ炭酸のアルキルエステル、パ
ーオキシカルボン酸のアルキレンジエステルがあげられ
る。これらのパーオキシエステルの具体例には過オクタ
ンＢｔ−ブチル（１−ｂｕｔｙｌ　ｐｅｒｏｃｔｏａｔ
ｅ）　、過安息香１ｔ−ブチル、パーオキシネオデカン
Ｓｔ−ブチルおよびパーオキシマレインｅｔ−ブチルが
あげられる。これらの化合物はベンワルト、ケミカルズ
社（米国ニューヨーク州バッフアロ）から市販されてい
る。重合反応の触媒としての遊離基反応開始剤の所要量
は、当該開始剤の分子量およびその熱安定性に左右され
て種々変わるであろう。オリゴマーはまた、熱処理、Ｕ
■光線またはガンマ線の照射、または高エネルギー電子
照射によって重合させることもできる。
Ｃ９被覆／架槙方法： 炭素負荷（ｃａｒｂｏｎ　１ｏａｄ　）が小、大または
中程度である担体材料の製造のために、酸化ジルコニラ
ムは種々の方法で変性できる。好ましくは、ＺｒＯ２小
球体に最初に表面水和を行い（５ｕｒｆａｃｅ−ｈｙｄ
ｒａｔｅｄ　）　、次いで真空乾燥する。所望負荷値に
応じて、ポリブタジェンのごときオリゴマーを５−２５
０１ｇ含有するペンタン溶液１５　５０ａｆ　＜ｌ　ｒ
　０２小球体１ｇ当り）に乾燥ＺｒＯ２小球体を添加す
る。その結果得られたスラリーを超音波浴に入れ、真空
をかけて脱気することによって、前記Ａリボマー溶液を
確実にすべての細孔内に浸透させる。次いで、過酸化ジ
クミルのごとき遊離基反応開始剤を２−２０％（Ｗ／Ｗ
）（重合体の使用量基準）添加する。具模に溶媒を蒸発
または濾過操作によって除去するが、この除去操作は所
望炭素負荷量の考慮下に行う。このようにして処理した
ＺｒＯ２小球体を真空下（１０−２０ｍｍ１ｌ（１）に
６０−７０℃に加熱して残存溶媒を除去する。兵法に被
覆ＺｒＯ２小球体をチューブ炉に入れ窒素流のもとで１
７５−２００℃に２−４時間加熱することによって架橋
反応を行う。
これによって得られた被覆小球体を其後にたとえば寸法
５Ｘ０．４６ｎのＨＰ　Ｌ　Ｃコラムに充填する。充填
操作は、粒径に応じて乾式充填または上背スラリー撹拌
充填方法によって実施できる。
アミンの混合モードクロマトグラフィは、種々の量の有
機溶媒、燐酸塩緩衝剤およびイオン強度調節用中性塩を
含む種々のｐｌ＋の水性／有機移動相を用いて実施でき
る。
多量の物質の反復注入によって、コラム特性が著しく変
わる程汚れたコラムには、不可逆的に吸着された物質の
除去操作が実施できる。コラムにＩＭ−ＮａＯＨ１００
μｊ！を注入して脈動運動（ＤＬＩＩＳｉｎ！ＩＩ　）
を行うかまたはアルカリ金属水酸化物の水溶液たとえば
０．１Ｍ−ＮａＯＨ溶液を用いてコラムにフラツシグ操
作を約０．５−１０時間行うことによって、元通りのコ
ラム特性を有するコラムに回復できる。
滅菌条件下の重合体被覆ＺｒＯ２小球体または無被覆Ｚ
ｒＯ２小球体の安定性は、所定の特性を有するコラムを
、１Ｍ−ＮａＯＨ溶液をポンプ送給しながら１００℃に
１２−２４時間加熱することによって確認できる。再び
与えられたコラム特性は、コラム特性の重大な変化また
は無極性物質の保持量低下が全く起らないことで確認で
きる。
■ｖ、生物学的活性物質： 種々の公知技術を用いて、無被覆または重合体被覆小球
体に種々の生物学的物質が結合できる。
この結合によって、生物学的物質が有する生物学的活性
が長時間保持され、すなわち安定化され、その安定度は
非結合状態の生物学的活性物質の安定度より大である。
たとえば、脱気した小球体と抗体または酵素とを緩衝液
中に含んでなる水性混合物を常温常圧下にたどえば約０
．１−５時間撹ＩＹすることににつで、無被覆小球体に
抗体または酵素を結合させることができる。共有結合ま
たは非共有結合による種々の酵素結合方法は、Ｒ，Ａ。
メツシングの米国特許第３．８５０．７５１号明細書に
記載されている。
既述の方法によって結合できかつ安定化できる酵素とし
て、種々の種類の酵素があげられ、これらの′Ｍ素は次
の６種、すなわち、氷解酵素、レドックス酵素、トラン
スファラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼに大
別できる。第１番目の種類の酵素すなわち氷解酵素の例
には、蛋白を加水分解する酵素である蛋白分解酵素（た
とえばパパイン、フィシン、ペプシン、トリプシン、キ
モトリプシン、ブロメリン、ケラチナーゼ）：炭水化物
を加水分解する酵素であるカルボヒドラーゼ（たとえば
セルラーゼ、グルクロニダーゼ、アミラーゼ、マルター
ゼ、ペクチナーゼ、キチナーゼ）；エステルを加水分解
する酵素であるニスｊラーピ（たとえばリパーゼ、コリ
ネステラーゼ、レシヂナーゼ、ホスファターゼ）；核酸
を加水分解する酵素であるヌクレアーゼ（たとえばリボ
ヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ）；アミンを
加水分解する酵素であるアミダーゼ（たとえばアルギナ
ーゼ、アスパラギナーゼ、グルタミナーぜ、ウレアーゼ
）があげられる。第２番目の種類の酵素は、酸化または
還元反応において触媒として働くレドックス酵素であっ
て、その例にはグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、
パーオキシダーゼ、リポキシダーゼ、チトク［ｌムがあ
げられる。第３番目の種類のＮ素は、化学基を成分子か
ら別の分子に移す作用を有するトランスファラーゼ酵素
であって、その例にはグルタミツクービルビック（ｇｌ
ｕｔａｍｉｃ−ｐｙｒｕｖｉｃ）　トランスアミナーゼ
、グルタミツクーオキサルアセチツクトランスアミナー
ぜ、トランスメブーラーゼ、ホスホビルビックトランス
ホスホリラーゼ、デヒドロゲナーゼがあげられる。第４
番目の種類の酵素は、ｃ−ｃ、ｃ−ｏ、Ｃ−Ｎおよび他
の結合を分解して二重結合を残づ反応、または二重結合
に基を付加する反応に触媒として働くリアーゼ酵索であ
って、その例にはビレベートデカルボキシラーゼ、アミ
ノ酸デカルボキシラーゼ、アルドラーゼ、フマレートヒ
ドラターぜ、アコニテートヒドラダーゼ、アンモニアリ
アーゼがあげられる。第５番目の種類のｗＰ素は、アミ
ノ酸および糖類の脱水素反応およびエビモル化反応に触
媒として働くイソメラーゼＶｆ素であって、その例には
ホスホグルコムターゼがあげられる。第６番目の種類の
酵素は、２個の分子を結合させかつ同時にΔＴＰを分解
する反応に触媒として働くリガーゼ酵素であって、その
例にはアミノアシル−ｔ−ＲＮＡシン廿ターゼおよびビ
オグーニル依存性−カルボキシラーゼがあげられる。
既述の方法によって結合できかつ安定化できろ別の蛋白
質の例にはＣｏｎ−Ｊ、、プロティン−へ、プラズマイ
ムノグロブリン、モノクロナール抗体、生物学的活性を
有するポリペプチド（たとえば血清蛋白質）、イムノモ
ジュレータ（たとえばリンパキン）等があげられる。本
発明の小球体に結合し得る蛋白質の別の例は、復配実施
例中に記載されている。
■、燐酸塩変性： 無被覆または重合体被覆ＺｒＯ２小球体の表面は、無機
燐酸塩水溶液による処理によって容易かつ顕著に変性で
き、クロマトグラフィ操作に適したちのになる。重合体
ｍ覆ＺｒＯ２と燐酸塩との反応によって、カチＡン交換
性と逆相適性との両者を有する混合モード用の固定相が
形成できる。
この場合には、移動相のｐＨ、イオン強度、おにび逆相
溶離強度（すなわら、助剤である有機溶媒の容積分率）
を適切に調節することによって、−群の塩基性溶質に対
する本発明の担体材料の選択性が調節できる。
有用な無機燐酸塩水溶液の例にはＨ３ＰＯ４またはアル
カリ金属燐酸性（たとえばオルト燐酸塩、ピロ燐酸塩、
メタ慎酸塩、トリポリ燐酸塩等）の約０．０１−１．０
Ｍ溶液があげられる。
■、有機燐化合物による変性： 或種の利用分野では、無被覆または重合体被覆７ｒＯ２
小球体の表面をさらに不活性化または変性するのが好ま
しい。この操作によって、アミンやカルボン酸のごとき
極性化合物に対する小球体の分ＩＩＩ！能力をさらに８
めることができ、あるいは保持能力を変改できる。不活
性化は、無被覆ＺｒＯ２小球体をＦｆＩｔｓ中で有機燐
化合物で処理することによって実施できる。使用される
溶媒は、＠機燐化合物のために適した溶媒である。有用
な有機燐化合物の例にｔまアリルホスホネート、オクチ
ルホスホネート、フェニルホスホン酸、ナブチルボスホ
ン酸、フェニルホスフィン酸、フェニル１！ｌｌＩ！お
よびジアリルホスホレ−１〜があげられる。
好ましい有Ｉｌ！燐化合物の具体例には不飽和有機ホス
ホン酸およびその水溶性塩があげられる。
Ｏ１１燐化合物のための有用な溶媒の例には、水と（Ｃ
−０５）アルカノールとの混液のごとき水性アルコール
があげられる。好ましくは、右寂燐化合物の溶液の中に
ＺｒＯ２小球体を入れて撹拌することによってＺｒＯ２
小球体を被覆する。
有機燐化合物と小球体との重量比は、好ましくは約０．
２５：１ないし１：１である。処理小球体を処理液から
分離し、乾燥し、そして既）本の架橋用合体の被覆を施
す。
本発明をさらに具体的に例示するために、次（こ実施例
を示す。
九−ユ 落花生油３リツトルを、４リツトル容量のビーカーに入
れて９０℃に加熱した。機械的撹拌機を挿入し落花生油
を烈しく撹拌した。コロイド状ＺｒＯ２’Ｉｔ剤［ナイ
アコル社製の市販品；商品名［ナイア］ル（ｃ）録商標
）−Ｚｒ９５／２０Ｊ　：これはＺｒＯ２を２０重量％
含有し、大部分の粒子の粒度は約９５ｎｍである１１０
０Ｊを、エアロゾルアトマイザ−を通じて前記落化生油
に噴霧した。約３０分後に、得られた混合物をウオット
マンＮｏ　５４　濾過器で濾過した。固体的１７ｆｆが
回収されたが、これは大体小球状の粒子からなり、粒子
径は３０μ未満であった。
例　　２ 落花生油６００９とオレイルアルコール６００Ｕとを混
合し、約９０℃に加熱した。烈しい撹拌下に、落花牛油
／オレイルアルコール渥合物に例１記載の方法に従って
ＺｒＯ２製剤しナイアコル（ｃ）録商標）−Ｚｒ９５／
２０］　１０（ｌを噴霧した。（１られた混合物を約３
０分後に濾過し、粒子を集めた。粒子の大部分（約７０
％）は小球体であって、粒径はく５０μであった。
例１　ａ３よび例２の製法によって製造された小球体を
一連の温度条件下に熱処理し、表面積、平均細孔直径お
よび細孔容積を、カンタソーブ表面積アナライザで得ら
れた等温窒素吸着データから求めた。測定械果を第１表
に示す。
本６時間 第１表のデータから明らかなように、焼成温度を４００
℃から９００℃に上げると平均細孔直径が大きくなる傾
向がある。表面積および細孔容積は焼成温度の上昇に伴
って小さくなる。ＺｒＯ２小球体のクロマトグラフィ活
性は、小球体の表面積、平均細孔直径および細孔容積の
値に２ｒｉ右されるものである。したがって上記のデー
タによって適切な焼成温度が選択できる。
例　　３ 例２の方法に従って、ＺｒＯ２製剤［「ナイアコル（ｃ
）録商標）−Ｚｒ５０／２０Ｊ　：ナイアコル社製のコ
ロイド状Ｚ「０２製剤；コロイド状ＺｒＯの寸法５Ｑｎ
Ｉｌ］をＺｒＯ２供給源として用いて小球体をＩＵ　Ｍ
した。
例　　４ 例２の方法に従って、ＺｒＯ２製剤［「ブイアコル（ｃ
）録商１）−Ｚｒ１５０／２０Ｊ　：ナイアコル社製の
コロイド状ＺｒＯ２！ｉＩ剤：コロイド状ＺｒＯ２の寸
法１５０ｎｍ］をＺｒＯ２供給源として用いし小球体を
製造した。
第■表は、例２−４の方法によって製造され、６００℃
において６時間焼成された小球体の表面積、平均細孔直
径および細孔容積を示した表である。
第　　■　　表 Ｚｒ−５０／２０　５０　３３　９２　３１Ｚｒ−９５
／２０　９５　３４　１１０　３６Ｚｒ−１５０／２０
１５０　４０　１４７　４５本市販品しナイアコル」　
（登録商標）系の製剤箱■表のデータから明らかなよう
に、原料であるコロイド状ｚｒｏ２の寸法を適切に選択
する口とによって焼成小球体の平均細孔直径が制御でき
る。原料コロイドが大きい寸法のものである場合には、
細孔直径および細孔容積の比較的大きい焼成小球体が生
じる。
例　　５ コロイド状ＺｒＯ２製剤［［ナイアコル（登録商標）−
Ｚ　ｒ９５／２０Ｊ　］を実験室用遠心分！１ＩｔＶｌ
置に入れ、沈積物を形成させた。上澄液をケイシヤによ
って除去した。沈積物であるＺｒＯ２を等容量の蒸留水
中に再分散させた。上記の遠心分離操作によって得られ
たゾルを用いて例２の操作を行うことによって小球体を
製造した。
例　　６ 例５の遠心分離操作を行い、次いで再分散操作を行うこ
とによって得られたゾルに、再び遠心分離操作を行って
沈積物を形成させ、上澄液をケイシャににつて除去し、
Ｉｒ？−られたＺｒＯ２沈積物を再び分散させた。遠心
分！１Ｍ操作を上記のごとく２回行って得られたゾルを
用いて例２の操作を行うことによって、小球体を製造し
た。
例　　７ 例６に記載の方法に従って遠心分離操作を２回行い、次
いで再び分散させてゾルを生成さＬ’、Ｌｔ後にさらに
遠心分離操作を行って沈積物を形成させ、上澄液をケイ
シャによって除去し、得られた７ｒ０２沈積物を再び分
散させた。上記のようにして遠心分離操作を３回行うこ
とによって得られたゾルに例２の操作を行うことによっ
て、小球体を製造した。
例２、例５、例６および例７の方法によって製造され、
６００℃において６時間焼成された小球体の表面積、細
孔直径および細孔容積を第■表に示す。
第　　■　　表 表面積　　平均細孔　　細孔容積 Ｚｒ−９５／２０　　　　　　　　　　３４　　　　１
１０　　　３６Ｚｒ−９５／２０（遠心　１回）　　　
　５０　　　１６２　　５５Ｚｒ−９５／２０　（遠心
　２回）　　　　５２　　　　２３５　　　６２Ｚｒ−
９５／２０　（遠ｒｐｓ　　３回）　　　　４６　　　
　２５０　　　６２傘市販品「ナイアコル〈０縁面ｍ）
−ＺｒＪ系列の製剤。
原料であるコロイド状ＺｒＯ２製剤に遠心分離操作、上
澄液除去および再分散操作を行った結果として、焼成小
球体の平均細孔直径、細孔容積および表面積が大きくな
る。この増大は、原料である［ナイア、コル（登録商標
）」中に微ａ成分として存在することが知られている小
寸法（約５−１Ｑｒｖ）のコロイド状ＺｒＯ２粒子が除
去された結果として、もたらされるものであると考えら
れる。すなわち、微１１ＩＺｒＯ２粒子の大部分は、遠
心分離操作実施中に懸濁状態で残り、上澄液の廃棄のと
きに除去され、次いで、沈積物である比較的大きいＺｒ
Ｏ２粒子の再分散操作が行われるのである。もし上記の
ごとき過度に小寸法のＺｒＯ２粒子が存在したならば、
これは比較的大きいＺｒＯ２粒子の隙間に入り、そのた
めにＺｒＯ２粒子の充填密度が増大し、その結果として
、焼成小球体の平均細孔直径、細孔容積および表面積が
小さくなるのであると思われる。
前記の遠心分離、沈積操作の結果としてコロイド状Ｚｒ
Ｏ２が凝集し、この凝集物は非凝集粒子よりも一層人な
る開放構造を有し、すなわち該凝集物は一層大きいＺｒ
−０２粒子のごとき！ｉｌ！すＪをすると考えられる。
これらの理論的考察や仮説は決して本発明を制限するも
のではない。例５−７に記載の遠心分離操作等を含む処
理方法は、無処理のコロイド状ＺｒＯ２ゾルから作られ
た小球体よりも一層大なる平均細孔直径、細孔容積およ
び表面積を有するすぐれた小球体の製造方法である。
下記の実施例は、既述の製法によって製造された無変性
ＺｒＯ２小球体を、蛋白質の分離のためのり０マドグラ
フイに使用する方法を例示したものである。
例　　８ 例２に記載の方法によって製造されたＺ　ｒ　Ｏ２小球
体を６００℃に６時間加熱した。小球体を分級し、５−
１０μの粒度のものを下記の操作に使用した。小球体の
表面積は５５ｍ２／ｇ、平均細孔直径は１４６人であっ
た。ＺｒＯ２小球体をメタノール中に入れてスラリーを
作り、４，０００ｐＳｉの定圧下に寸法０．４６Ｘ３０
ｃｍのステンレス鋼製のコラム内に充填した。これによ
ってＺｒＯ２／メタノールスラリーは速やかに圧縮され
、均質に充填された。充填後に、流動条件は、１１Ｉ１
１／分、１０００ｐｓｉに保った。コラムを１００ｍ１
４−燐酸ナトリウム１５０ｔｄテ洗浄シタ（ｐＨ７，０
）。次いで、すべてのクロマトグラフィを燐酸塩緩衝剤
の存在下に行った。コラムを２０％メタノール／水中で
貯蔵した。
同、じ燐酸塩緩衝液を用いて蛋白質の溶液（２■／ｄ）
を［４した。すなわち、バシトラシン（１，４Ｋｌ）ａ
）、オバルブミン（４５ＫＤａ）および牛の血清アルブ
ミン（６７ＫＤａ＞の試料２０μｌを調製した。これら
の試料を注入し、緩衝剤３０Ｉｄで溶離した。ずべての
り６マトグラフイ操作を、スペクトラ、フィジックス、
８７００ＸＲ型のＨＰ　Ｌ　Ｃ装置を用いて行い、かつ
該装置に７５７型の司変波長形検出器を取付け、２８Ｏ
ｎ＋ｉにセットした。溶１１１１Ｆ−タ、ピークの面積
および溶１１１ｆｄ（容積）を４２９０型インテグレー
タ／レコーダで記録した。第１Ｖ表に示したように、蛋
白質の溶ｔｗｉｔは、排除クロマトグラフィで予想され
ど結果とよく一致した。
第　　ＩＶ　　　人 蛋　　　　白　　　　質　　　　　　　　禮ヨ閣二邑−
（ｍｅ−とバシトラシン　　　　　　　３．３５ Ａバルブミン　　　　　　　２，５１ 牛の血清　アルブミン　　　２．３８ 例　　９ 例２記載の製法で得られたＺｒＯ２小球体を６００℃に
６時間加熱した。粒子径３０−４０μ、表面積３０ｍ２
／ｇ、平均細孔直径１ｏｏ入の粒子を使用した。小球体
のメタノールスラリーを作り、寸法５Ｘ０．２１ｃｍの
コラムに手で充填した。
充填後に、ｐ１１７．０の燐酸塩緩衝液（濃度５０１１
１Ｍ＞を０．２１ｄ／分の割合で使用してコラムを１２
時間洗浄した。其後のすべてのクロマトグラフィ操作は
ＩＢＭ−９５３３−Ｌ、Ｃ，を用イテ行い、流速は１−
７分であり、ｐＨ２，ｏの５０ｍＭ−Ｈ３ＰＯ４からｐ
Ｈ１０の５０１１Ｈ−Ｎａ２ＨＰＯ４に至るｐＨ勾配を
形成させ、この状態を１０分間保ち、次いで５０３Ｈ−
Ｎａｌ−１２ＰＯ４１，−よッｒＤＩ１１Ｏにおいて均
質化（１ｓｏｃｒａｔｉｃ　）操作を行った。
牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）およびミオグロビンを吸
着−およびイオン交換−クロマトグラフィによって分離
した。生成のための保持時間は１３．３分間（ＢＳＡ）
および１７．８分間（ミオグ［］ビン）であった。
［追 アニオン交換クロマトグラフィに適した固定相を次の方
法によって調製した。ポリエチレンイミン［米国ペンシ
ルバニア州ワリントンのポリサイエンシズ社製の市販品
１を吸着させ、次いで１゜４−ブタンジオールジグリシ
ジルエーテル（９５％；米国ウィスコンシン州ミルウオ
−４−一のアルドリッチ、ケミカル社製の市販品）で架
橋した。
この操作はレグニヤ等の方法［［Ｊ、ＣｈｒＯｌａｔＯ
（］、　Ｊ、１８５．３７５　（１９７９）：１１１．
１５７（１９８５）；３５９，１２１　（１９８６）］
に従って行った。
ピクリン酸の吸着の際のアニオン交換容量の測定値は、
変性Ｚｒ０２１ｇ当り２３０μｍｏｊ！であった。この
担体をＢＳＡからのオバルブミンの分離操作に使用した
。コラムは次の如く操作し、すなわち、ｐＨ７，５の１
０ｍＭ−トリス緩衝液から、０．５Ｍ−ＮａＣ１を含む
ｐＨ７，５の１０ｍ＾−トリス！１１ｉ液に至る勾配を
２０分間にわたって形成し、次いで、０．５Ｍ−ＮａＣ
１を用イＴ　ｐｌ＋７．５において１０分間にわたって
均質化操作を行った。流速は１ｄ／分であった。保持時
間は９．７５分間（′Ａバルブミン）および２２．８分
間（８８△）であった。
下記の実施例は、蛋白質の固定のためにＺｒＯ２小球体
を使用する方法を例示したしのである。
例　　１１ 粒子径約３０μ、表面積５０ｍ２／ｇ、平均細孔直径１
２４人のＺｒＯ２小球体を使用した。マウスのアンチヒ
ユーマンＩＱＥ抗体を精製し、放射性沃素（１）処理を
Ｓ、Ｍ、バーチエル等の方法［ｒＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
Ｈｅｔｈ、　Ｊ　、６９　、３３　（１９８４）：に、
Ｌ、ホルムズ等ｒＰＮＡｓＵＳＡＪ　、８２．７７０６
　（１９８６）Ｊ　］に従って行い、次いで無ラベル抗
体で希釈して、５゜０００ＣＩ）ＩＱ／ｕ９の放（ト）
能を有する抗体試料を作成した。抗体試料（ｐＨ３，０
の５ｍＨ−１−リス中に抗体を２５０μｇ／ｍ！含有し
てなるもの）２５０μｍの一部を、小球体１０ηを含む
管に加えた。
混合物に排気操作を短時間行い、次いで周囲温度（室温
）において適当な時間（５−１２０分間）１工動させた
。各時点において３つのレプリケートを採取した。
前記の管に遠心分離操作を行い、ｌｄの緩衝液で２回洗
浄した。小球体を、Ｉ！衝Ｗ１２ａｅを入れた新しい管
に移し、緩衝液を除去し、８管の放用能をハラカード５
２３０型のガンマシンチーレーションカウンタで測定し
た。結合した蛋白質の吊（ＣＤＩ単位から換ｎされたｎ
１位の値で示す）を第Ｖ表に示す。
第　　Ｖ　　表 一部　間（分）　　抗体結合量／■（小球体）１０　　
　　　　　　　　　５４ｎｇ ２０　　　　　　　　　　　６６ｎ（１３０７２ｒ＋。
６０　　　　　　　　　　　　　　　　６９　　　ｎり
例　　１２ 例１１の場合と同じ材料および技術を用いて、２時間培
養のときの抗体の結合量を、その濃度（１−２５０μｇ
／Ｉｄ）の関数として測定した。
３個のレプリケートの平均値は、飽和値であることを示
した（第■表）。このデータを複式相ＵＩＲ析法（ｄｏ
ｕｂｌｅ−ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ）
　ニ従ッテ外挿すると、飽和時の小球体１ｇ当りの抗体
結合噴は１００μ９になる。
第　　ＶＩ　　　表 蛋白質の濃度　　　　抗体結合量／■ （μりｌｄ）　　　　　　（小球体） １　　　　　　　　１．５ｎｌｌ１ ５　　　　　　　　７．５ｎＱ １０　　　　　　　１４．０ｎ。
５０　　　　　　　３８．０ｎ（１ ２５０６２、Ｏｎ（１ 例　　１３ Ａ、　トリプシンの固定 １〜リプシン（２４ＫＤａ蛋自分解酵素）および７１の
血清アルブミン（６７ＫＤａ蛋白質）の溶液（２１＋９
／ｄ）を、ｐ）１８．Ｏの５ｎ＋Ｈ−トリス巾のＺｒＯ
２小球体（平均細孔直径１００人、表面積３０ｍ２／ｇ
）７０１９に結合させる実験を行った。
この実験では、脱気した小球体を緩衝液１．０蛇中で１
７．５時間撹拌した。小球体１！ｊ当りトリプシン１５
．３１１ＩｇおよびＢＳＡ＜０．２ηが結合した。この
量は、これらの物質の相対的寸法および細孔寸法から予
期され得る値である。
トリプシンの検出は、Ｐ、Ｌ、コールマン等のチオエス
テラーゼ検出法［［Ｈｅｔｈ、ＥｎｚｙＩＩｌｏｌ、　
Ｊ、且、４０８　（１９８１）］によって行った。酵素
が結合した小球体を緩衝１１−中に懸濁させ、基体１，
０−を含む管に、５μに一アリ」−１”・（ａｌｉｑｕ
ｏｔ　）を加えた。連続的ふりまぜ操作を２．５分間行
った後に、りＴン酸塩−ダイズ系のトリプシン阻害素＜
ＳＴ　Ｉ　）の溶液を添加して反応を急速に停止させた
。これに速やかに遠心分離操作を行い、上澄液を除去し
、４１２ｎｌにおいて吸光度（ｃ）測定を行った。検出
操作は、トリプシンを含む小球体、ＢＳＡ含有小球体、
およびトリプシン含有小球体から得られた上澄液につい
て行った。また、基体の溶液中のトリプシン阻害素につ
いても検出操作を行って、結合状態のトリプシンに対し
ても阻害素が阻害作用を行い得るかどうかについて調べ
た。これらの検出試験の結果を第Ｖ１表に示す。
第　　■　　表 トリプシン含有小球体　２．３６　　　１．７９ＢＳＡ
含有小球体　　　０．１０　　　０．１３トリプシンの
上澄液　　０．１９　　　０．１２第■表の結果から明
らかなように、ＳＴＩがトリプシンより小さいものであ
る場合でえ、結合状１＆のときの活性の約７５％はＳＴ
Ｉの作用を受けていない。活性の４％のみが、非結合状
態のトリプシンに起因するものである。非常に低い値は
、ここで用いられた洗浄方法が非能率的な試料洗浄方法
であったことを示している。
上記の実験結果を基準にして計算を行うことによって、
若干の予想外の結果が得られた。たとえば、トリプシン
１５ｑ／ｇ（ＺｒＯ２）は、小球体の密度を３．３ｇ／
ｄとした場合の５１１１ｔｇ／ａ＋９に相当する。これ
はコラム中のトリプシン濃度２ｍＨに相当する。これの
チエツクは、この検出のための４１２ｎｍにおける予想
値へを篠山することによって行うことができる。この検
出試験では、小球体に結合した酵素は０．２１μＭであ
り、基体の）（ｃａｔは７５／秒であり［Ｇ、Ｄ、Ｊ、
グリーン等、ｒＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　９３
　、　２２３　（１９７９）］、吸光係数は１４．１０
０であり、吸光度の変化の計算値は３．３であり、これ
は測定値２．４とかなりよく対応する。色素原は、４１
２ｎｌにおける２、８Ａのみを与えるのに充分な最存在
するから、結合状態のトリプシンのほとんどすべてが活
性を有すると云い得るであろう。かように、予想外に多
聞の蛋白質が結合され、その酵素活性を保っているので
ある。
Ｂ、キモトリブシ、ノーゲンーキ七パパイン−ＢＳＡの
固定 例７の製法に従って２４０人の細孔および２７ｍ　　７
ｇの表面積を有するＺｒＯ２小球体を製造した。小形の
コラムの各々に小球体約１．０ｇを入れ、流動操作を行
い、２０１１８−　トリスクロライド緩衝液（ｐＨ８，
０＞または５ＱｍＨ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１４
，５）で甲高に達成せしめた。
このトリス緩衝液にキモトリプシノーゲン（２４，５に
！’）ａ）およびキモパパイン（３２ＫＤａ）を溶解し
、酢酸塩緩衝液にＢＳＡを溶解した。蛋白質含有液を連
続的にコラムに添加し、この添加は、溶離物の２８０　
ｎｍにおＧＪる吸光度が原料溶液の該吸光度に等しくな
るまで行った。非結合状態の蛋白質をコラムから洗い流
し、溶離剤の添加量と回収量との差から結合蛋白質の量
を算出した。
＃（蛋白質）７ｇ（小球体）で表わされるキモｉ−リブ
シノーゲンおよび１モパバインの結合量は、ｐ１１８に
おいてそれぞれ７６．９ｍｇおよび２４．５■であり、
小球体１ｒＩ当りの結合ＢＳＡの猷はｐＨ７，５におい
て６４　Ｒｇであった。これらの値をコラム容積１−当
りの結合密度値（ｂｉｎｄｉｎｇｄｅｎｓｉｔｉｅｓ　
）に換算すれば、それぞれ２５４．８１および２１１ａ
！Ｊ／ｄ（蛋白質として）となる。
酸性のｐ＋＋では、アルブミンはそれより小さいキモパ
パインよりも結合力が−ｉ大きく、そして−層小形のキ
モトリシノーゲンと大体同程度の結合力を示すという事
実からみて、後者の酵素は低ｐＨにおいて、すなわちそ
のｏｌａより低いＩ）Ｈにおいて、−農大なる密度で結
合すると思われる。
例　　１４ 重合体の吸着／架橋 製造Ａ・・・高負荷ＺｒＯ２ ポリブタジェン（分子１４５００：米国ウィスコンシン
州ミルウオーキーのアルドリッチ、ケミカル社製の市販
品；カタログ番号２０−０５０−６）０．５５びをペン
タン５０ｄ中に含有する溶液を、例２の製法によって製
造されたＺｒＯ２小球体（６００において６時間焼成し
たちの；粒子径−２０−４５ミク［ｌン）３．５５Ｊに
添加した。
なお、該小球体はその使用前に、ＣＯ２を含まない水中
で煮沸してその表面を充分に水和させ、其後に１２５℃
において乾燥したものであった。
生じたスラリーを超音波浴に入れ、水の７スビレータで
真空力を適用した。次いで過酸化ジクミル（ＤＣＰ）０
．０１９を添加し、再び超音波浴に入れ、真空力を適用
した。ペンタンを真空下に除去し、試料を真空下に７０
℃において乾燥した。
次いで試料をチューブ炉で２００℃に２時間加熱し、其
侵でペンタン、トルエン、塩化メチレン、デトラヒドロ
フラン、メタノールおよび０．１Ｍ−水酸化ナトリウム
液で順次洗浄した。被覆小球体の元素分析によって、炭
素流（ｃａｒｂｏｎ　１ｏａｄ　）は７．７％であるこ
とが判った。同じ方法によって同様な試料（第２試料）
を作成したが、その炭Ｘｆｆ１は７．５％であった。ポ
リブタジェンを極端に多く添加したために、ＢＥ丁法に
よる多孔質小球体の比表面積の測定値は４ｍ２／ｌｊで
あって、比表面積が５０．４ｍ２７９かう４ｍ２／ｇニ
減少したことが確認された。
ポリブタジェン０．０９ｇのペンタン中溶液３５ｄをＺ
ｒＯ２小球体３．５ｇに添加し、その結果得られたスラ
リーを超音波浴に入れ、水のアスピレータで真空力を適
用した。次いで、ＤＣＰを０．００２！７含有するペン
タン１０ＩＲ１を添加し、スラリーを超音波浴に入れ、
真空力を適用した。
其模にスラリーにふりまぜ操作を１時間行い、次いで濾
過して上澄液を除去した。其後に試料を“製造Ａ″に記
載の洗浄方法によって洗浄した。
この被覆小球体の元素分析を行い、炭素量は０．８４％
であることが判った。ＢＥＴ法ににる測定の結果は、比
表面積３８．７ｍ２／ｇであった。比表面積（７）５０
．４ｍ２／９から３８．７ｍ２／ｇへの現象は、普通の
無機担体のシリル化の際にみられる比表面積の減少に類
似のちのである。
製Ｕ・・・中程度の負荷 ＰＢＤ　（ｃ），２７ｇ）のペンタン５０ｄ中溶液をＺ
ｒＯ２小球体（平均粒子径３．５ミクロン）３．０ｇに
添加した。得られたスラリーを超音波浴に入れ、真空で
引いた。次いでＤＣＰ５．２ｆｆｌ！７のペンタン１０
Ｉｄ中溶液を添加した。其後に、″製造Ａ　ＩＩの場合
と同様な操作を行った。炭素の分析値（元素分析）は２
．７％であった。
炭素量（分析値）の値から明らかなように、炭素はＺｒ
Ｏ２小球体の表面に付着した。第１図は、この重合体変
性ＺｒＯ２小球体の逆相クロマトグラフィにおける特性
を例示した図面である。使用された］ラムｔよ、ｎ　ｙ
Ｊ造Ｃｎの方法で製造したＺｒＯ２小球体を充填した寸
法５Ｘ０．４６ｃｍのコラムであった。第１図のグラフ
には、一連のアルキルフェノン同族体の各々の炭素数（
横’Ｍｌ）とＪ！ＯＱｋ’（キャパシチイファクタ）（
縦軸）との間に直線的関係が成立つことが示されている
が、この直線的関係は逆相保持メカニズムを明らかに示
すものである。
例　　１５ 例１４中の“ｙＪ造Ｃｎに記載の製法に従って製造され
た小球体を、ｐＨ３において１００ｍＨ−１」３ＰＯ４
水溶液で約１時間処理することによって、混合カブオン
交換／逆相用担体を調製した。
第１表に記載の保持性データから明らかなように、１）
ｌｌ、有機溶媒の容積分率および移動相のイオン強度の
関数として、選択性が変化する。
第　　■　　表 選　　択　　率８ ブチルベンゼン　　　５．０２　　　５．１８　　　４
．８６　　　６．８９　　　６．９４リドカイン　　　
　　０．２８　　　０．０７４　　０．１　　　０．４
４　　　０．３２キニン　　　　　　　　２．９　　　
０．３９　　　０，２２　　　５．１７　　　０．６ノ
ルトリブヂリン　　６８，０　　　　２．６１　　　２
．０？　　　９９．２　　　　３．３８アミトリブチリ
ン　　１５．６　　　３．２９　　　３．４５　　３３
．７　　　５．６９本選択率＝［Ｋ’（溶質）］／［Ｋ
’　　＜トルエン）］ 条件およびトルエンのキャパシチイファクタを以下に示
す。
Ａ＝６０％のＭｅＯＨ／４０％・の１０１Ｍ−ＰＯ４、
ｐＨ７；　Ｋ’　　（トルエン）＝０．５７Ｂ＝６０％
のＭｅＯｌ−１／４０％の１０ｍＨＰＯ４、ｐＨ７（ｃ
），５Ｍ−ＮａＣｊ！と共に使用）；に′　（トルエン
）＝０．５４ Ｃ−６０％のＭｅＯＨ／４０％の１０ｍＨ−ＰＯ４、ｐ
Ｈ１２；に’（トルエン）＝０．５８Ｄ＝５０％のＭ　
ｅ　ＯＩ−１／　５０％の１０＋１Ｈ−ＰＯ４、ｐｌ＋
７　：　Ｋ’　　（＋−ルエン）＝１．２Ｅ＝５０％の
Ｍ　ｅ　ＯＨ／　５０％の１０ｍＭ−ＰＯ４、ｐＨ１２
；に’（トルエン）＝１．２ 高１）Ｈ値（アミンのｐＫａにより上の値）における分
離は、高イオン強度の移動相中の低ｐＨ値における分離
の場合と同様に、主として逆相保持メカニズムによるも
のである。一方、低イオン強度条件下の低ｐＨ値におけ
る分離は、主としてカチオン交換プロセスに制御される
。選択率は種々の方法によって変改できる。本発明の物
質は、シリカの使用の場合のアミン溶質のピークの対称
性に対し、顕著な改善効果を奏するものである。
例　　１５ 例１４の“製造Ａ　１１に記載の方法によって製造され
た試料のｌ）Ｈ安定性を、高ｐＨ値および高温における
クロマトグラフ実験によって調べた。この実験では、長
時間にわたって高ｐＨ条件下に保つ前および後に、試験
溶質の保持量を調べ、ざらにまた、担体上の炭素の吊を
測定した。この実験におけるクロマトグラフィ条件は、
移動相Ａ：０．１Ｍ−ＮａＯＨ（ＣＯ２を含まないも）
）：移！ＩＩＪｌｉ５Ｂ：メタノール；流動速度１−／
分；濾過度：５０℃という条件であった。
５０％Ｂ１５０％八からなる移動相中の２種の試験溶質
の保持量を、コラムを通過して排出された移動相のコラ
ム容積値の関数として表わしたデータを第２表に示す。
初期の保持間の減少は、コラムの平衡の高温側への移動
を反映したもので、結合相の損失を意味するものではな
い。低負荷材料（“製法Ｂ”）について測定を繰返し、
この材料の保持量に関するデータを第２Ｂ図に示した。
この場合にも、コラムの平衡に起因する保持間の初期減
少があった。１５時間にわたる期間において保持間は少
しだけ減少し、これに伴って当該［１ツトの移動相も変
化した。この変化は、炭素負荷量の著しい低下を反映し
たものではない。
上記の試験は、逆相用材料のｐＨ安定性について今迄報
告された試験のうちで最も効果的な試験であると思われ
る。また上記のデータは、例１４の“製造Ａ　ｎおよび
″製造Ｂ　ｎの製法で”ＦＪ造された小球体が上記の条
件下で実質的に安定であることを明確に示している。
例　　１７ 例２の方法によって製造されたＺｒＯ２小球体（３，４
ｇ：表面積６０ｍ２／ｇ：ｌｌ孔り径９５人）を、アリ
ルボスホネート１．６ｇの９５１５（Ｖ／Ｖ）メタノー
ル／水５０ｄ中溶液で処理した。
真空下に超音波処理を行い、１時間にわたってふりまぜ
操作を行った後に、上澄液を濾過によって除去し、ホス
ホネート処理ＺｒＯ２を７０℃において１２時間乾燥し
た。この材料を真後に、例１４の″製造ＣＩ＋の方法に
従ってＰＢＤで変性した。
この方法によって残留ＺｒＯ２面が、第１Ｘ表中のデー
タに示したように不活性化された。カルボン酸は無ホス
ホネート化ＺｒＯ２上で溶離せず、ホスホネート化Ｚｒ
ｏ２上で溶離することに注目されたい。
第　　ＩＸ　　　表 溶　　質　　　Ｋ’　　（無処理）　Ｋ′　（処理）ト
ルエン　　　　　０．４６　　　０．４９安息香Ｍ　　
　　　溶離せず　　　６．１例　　１８ 例１４の方法でｙＪ造された材料を充填した］ラムで、
チトクロムＣの注入体（１ｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）を作成
した。該材料によるチトクロムＣの保持間は、各注入体
上の蛋白質の不可逆的吸着のために低下した。
不可逆的に吸着されたチトクロムＣを除去するために、
コラムに１Ｍ−Ｎａ○ト１５，１００μｌを脈動供給し
た（ｐｕｌｓｉｎｏ　）。
この脈動効果によって吸着蛋白質がコラムから除去され
、元の保持特性が回復できた。
例　　１９ 滅菌条件下における本発明の材料の抵抗力を調べた、例
１４の“製造Ｃｎに記載の方法によって作られた材料を
使用し、そのクロマトグラフィ特性を調べた。上記の材
料をＩＭ−ＮａＯＨに１００℃において１時間暴露し、
次いで再びクロマトグラフィ特性を調べた。下記の第Ｘ
表中のデータに示されているように、この方法による充
填剤へのチャレンジのときに無極性物質の保持量の減少
は認められなかった。
１−１−五 に′ 溶　　　　　質　　　　　　　　処　理　前　　処　　
理　　後ベンゼン　　　　　　１，３６　　１．４７ト
ルエン　　　　　　２．６８　　３．０１エチルベンゼ
ン　　　４．８３　　５．５７プロビルベンビン　　９
．２１　１０．’８６第２のコラム（米国ニュージＡ７
ジー州マールトンのＥＳインダス１−リース社製のもの
）に、Ｇ。
ションバーグの方法［ｒＬｃ−ＧＣＪ　、旦、３６（１
９８８）］で変性されたアルミ犬担体を使用した。第２
のコラムには、ｌＮ−ＮａＯＨの移動相を通じ、これを
２つの両分として集めた。第１の両分は１時間の溶離時
間のときの両分であり、第２の画分は２．２５時間の溶
離時間のときの両分であった。
元素分析を、誘導結合プラズマスペクトロメータを用い
て行った。第２のコラムからのエフルエント中のアルミ
ニウムの濃度値は、該コラム中のアルミナ全量の１０％
の溶出に相当する値であった。
上記とは反対に、ジルコニウムは、検出可能値０．０３
μｇ／−の分析装置では検出されなかった。Ｚｒが検出
限界量存在したとしても、この値は、試験コラム中のｚ
ｒｏ、、全Ｍの０．００１％よりも少ない損失量に相当
する微量にすぎない。
本明細書には本発明の若干の好ましい具体例について詳
細に記載されているけれども、本発明はその範囲および
要旨から逸脱することなく種々多様の態様で実施できる
ものであることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
第１図、第２Ａ図および第２Ｂ図の各々は、本明細書中
の実施例に記載の実験データのグラフである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）直径約２０−５００ミクロン、表面積約１−２０
    ０ｍ＾２／ｇ、細孔直径約０．５−５００Åの多孔質Ｚ
    ｒＯ＿２小球体を含有し、該小球体がＨＰＬＣコラムの
    充填剤を構成し、そして該小球体が約１−１４のｐＨの
    水溶液中で実質的に安定であることを特徴とする多孔質
    ＺｒＯ＿２小球体を含有する床。 （２）小球体が直径約４５−５００ミクロン、表面積約
    ４０−１５０ｍ＾２／ｇ、平均細孔直径約１００−３０
    ０Åのものである請求項１に記載の床。 （３）（ａ）コロイド性ＺｒＯ＿２粒子を含む水性ゾル
    に遠心分離操作を行つて、ＺｒＯ＿２粒子からなる残留
    物と、上澄液とを生成させ、 （ｂ）前記残留物を回収し、 （ｃ）前記残留物を大体等容量の水の中に再分散させて
    、コロイド性ＺｒＯ＿２粒子を含む水性ゾルを形成させ
    、 （ｄ）前記水性ゾルから水分を抽出し得る液状媒質中に
    前記水性ゾルを分散させてゲル化ＺｒＯ＿２小球体を形
    成させ、 （ｅ）前記媒質からゲル化小球体を回収し、そして、（
    ｆ）ゲル化小球体を加熱して固体の多孔質ＺｒＯ＿２小
    球体を生成させることを必須要件とする製法によつて製
    造された多孔質ＺｒＯ＿２小球体を含有する請求項１に
    記載の床。 （４）工程（ａ）−（ｃ）が約２−５回繰返される請求
    項１に記載の床。 （５）疎水性の架橋重合体で被覆されており、被覆小球
    体の細孔直径が約２０−５００Åであり、粒子直径が約
    ０．５−５００ミクロンであり、被覆小球体が水性媒質
    中で約１４のｐＨまで安定であることを特徴とする被覆
    された多孔質ＺｒＯ＿２小球体。 （６）重合体被覆がポリブタジエンを含有してなるもの
    である請求項５に記載の小球体。（７）ＺｒＯ＿２の小
    球体の表面を無機燐酸塩で処理することによつて該表面
    を変性し、これによつて前記小球体にカチオン交換性お
    よび疎水性を与えた請求項５に記載の小球体。 （８）無機燐酸塩がＨ＿３ＰＯ＿４である請求項７に記
    載の小球体。 （９）ＺｒＯ＿２小球体の表面に疎水性重合体を被覆す
    る前に、該表面を有効量の有機燐化合物で処理して該表
    面を不活性化した請求項５に記載の小球体。 （１０）被覆された小球体の表面を有効量の不飽和有機
    ホスホネートまたは有機ホスホン酸で処理して該表面を
    不活性化した請求項９に記載の ＺｒＯ＿２小球体。 （１１）有機ホスホネートがアリルホスホネートである
    請求項１０に記載のＺｒＯ＿２小球体。 （１２）小球体の表面に疎水性重合体の被覆を施した後
    に、この被覆小球体の表面を有効量の有機燐化合物で処
    理して該表面を不活性化した請求項５に記載のＺｒＯ＿
    ２小球体。（１３）被覆された小球体の表面を有効量の
    不飽和有機ホスホネートまたは有機ホスホン酸で処理し
    て該表面を不活性化した請求項５に記載のＺｒＯ＿２小
    球体。 （１４）有機ホスホネートがアリルホスホネートである
    請求項１３に記載のＺｒＯ＿２小球体。 （１５）請求項５、７、１０または１２に記載の小球体
    を含有する微細担体材料とバインダとの混合物で被覆さ
    れた基体を含有してなる薄層クロマトグラフィ用のプレ
    ート。 （１６）ＺｒＯ＿２小球体の表面を無機燐酸塩または有
    機燐化合物で処理することによつて該表面を変性した請
    求項１に記載の床。 （１７）直径約２０−５００ミクロン、表面積約１〜２
    ００ｍ＾２／ｇ、細孔直径約０．５−５００Åの多孔質
    のＺｒＯ＿２小球体を含有し、該小球体は約１〜１４の
    ｐＨの水溶液中で実質的に安定であり、かつ固定された
    蛋白質を含有するものであることを特徴とする床。 （１８）固定された酵素を小球体上に含有する請求項１
    ７に記載の床。
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