JPH0129558B2 - - Google Patents
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- JPH0129558B2 JPH0129558B2 JP18411886A JP18411886A JPH0129558B2 JP H0129558 B2 JPH0129558 B2 JP H0129558B2 JP 18411886 A JP18411886 A JP 18411886A JP 18411886 A JP18411886 A JP 18411886A JP H0129558 B2 JPH0129558 B2 JP H0129558B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- rosmarinic acid
- plant
- cell suspension
- suspension culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
Description
技術分野
本発明は、シソ（Labiatae）科植物の組織培
養によりロズマリン酸を産生する方法に関する。 発明の背景 ある種の香辛植物（例えばロズマリナスオフイ
シナリス（R.officinalis）やサルビアオフイシナ
リス（S.officinalis）は、有用な抗酸化性のある
化合物を含有することが知られている。例えば米
国特許第4012531号；3950266号；3732111号明細
書を参照。この様な香辛植物の抽出物を食物の抗
酸化剤として使用することは公知である。種々の
抽出方法が提唱されているが、抗酸化性を有する
比較的少量の画分を得るにも多量の香辛植物材料
が必要である。又普通各植物に特徴的な強い香辛
臭を除く必要があり、そのためにしばしば大量の
高価な溶媒が必要である。 合成抗酸化剤（例えばBHAやBHT）を使用す
ることも可能であるが、合成抗酸化剤の主要な欠
点は、水に溶けないことである。BHAは水分散
性ゴムとして入手できるが、合成添加物を使用し
ない食物の方が消費者に人気がある。従つて香辛
植物抽出物に関係する問題を有しない水溶性抗酸
化剤を、天然資源から開発することは有益であ
る。 発明の要約 本発明の目的は、非合成、水溶性抗酸化剤の製
造法を与えることである。 本発明の又別の目的は、シソ科植物細胞の懸濁
培養によるロズマリン酸の製造法を与えることで
ある。 本発明のさらに別の目的は、香辛植物の特徴的
な強い臭いのない、シソ科植物より得られる抗酸
化剤を与えることである。 本発明のさらに別の目的は、シソ科植物の組織
細胞を、細胞懸濁培養で増殖させる方法を与える
ことである。 これら及び他の目的は以下の態様により達成さ
れる。本発明は、(イ)シソ科のロズマリン酸産生植
物の細胞を、特定の非形態形成関与栄養液体増殖
培地中で懸濁させて増殖させ、(ロ)培地から細胞の
少なくとも１部を採取し、(ハ)採取した細胞から、
ロズマリン酸含有画分を回収することより成る、
細胞懸濁培養によりロズマリン酸を産生する方法
を与える。 好適な態様の説明 本発明の一部は、ロズマリン酸は天然に存在す
る抗酸化剤であり、シソ科植物の抽出物の抗酸化
作用の少なくとも一部はロズマリン酸に帰因する
という発見である。又本発明は、液体増殖培地中
でシソ科植物の組織細胞を増殖させて、細胞懸濁
培養中で増殖した細胞からロズマリン酸を含有す
る画分を回収することにより、ロズマリン酸組成
物を産生する方法を与える。 本発明にはいくつかの利点がある。第一に市販
の乾燥香辛料からの抽出に比較して、本発明では
３から４倍量のロズマリン酸が産生される。第二
にロズマリン酸は水溶性のため、食品（例えば
肉、果実飲料等）の製造に極めて有用である。第
三にロズマリン酸はシソ科植物（例えばマンネン
ロウ、ヤクヨウサルビア、ハツカ、タチジヤコ
ウ、ハナハツカ、マヨラナ、メボウキ等）由来の
天然物であり、従つて合成食品添加物に伴う悪い
印象はない。 本発明は、ロズマリン酸を産生するシソ科植物
の任意の種の細胞の使用を含有する。本発明は、
ロズマリナス（Rosmarinus）、サルビア
（Salvia）、ヒソプス（Hyssopus）、イボジア
（Ibozia）、ラバンジユラ（Lavandula）、リコプ
ス（Lycopus）、メンサ（Mentha）、モナルダ
（Monarda）、オリガヌム（Origanum）、ペロウ
スキア（Perowskia）、プレクトランサス
（Plectranthus）、サツレイア（Satureia）及びサ
イマス（Thymus）のロズマリン酸産生種を含有
するが、これらに限定されるものではない。この
うちロズマリナス（Rosmarinus）とサルビア
（Salvia）が好適である。ロズマリン酸の高産生
物であるロズマリナスオフイシナリス（R.
officinalis）又はサルビアオフイシナリス（S.
officinalis）又はこれらの変種の細胞組織を選択
することが特に好ましい。本発明の代表的な植物
は、マンエンソウ、ヤクヨウサルビア、タチジヤ
コウソウ、ハナハツカ、マヨラナ、メボウキ、セ
イヨウハツカ、オランダハツカ、コウスイハツカ
及びキダチハツカという名前で一般的に知られて
いる。当業者は容易に他のシソ科のロズマリン酸
産生植物を、見つけることができる。例えば、
EllisとTowers、「Biochem.J」第118巻、291−
297頁（1970年）；Reschke、「Z.Lebensm.
Unters.Forsch.」第176巻、116−119頁（1983
年）；「Z.Naturforschg.」第21巻ｂ、604−605頁
（1966年）を参照。種及び株を見つけた後は、ロ
ズマリン酸産生量の最も多い組織細胞を選択す
る。この様な組織細胞は蛍光顕微鏡で観察するこ
とにより見つけることができる。331又は325nｍ
で蛍光を発する細胞が普通ロズマリン酸産生量が
最も多い。 細胞懸濁培養を始める１つの方法は、固形の非
形態形成関与培地上で増殖させた植物組織のカル
スを、液体培地に接種することである。培地への
接種に用いる組織は、植物の葉からのものが好ま
しい。当該分野においていくつかの固定培地が公
知である（例えばガンボルグ（Gamborg′s）Ｂ
−５倍地、ホワイト（White′s）倍地及びシエン
ク−ヒルデブラント（Schenk−Hildebrandt）倍
地）。例えば、Gamborgら、「In vitro」第12巻、
473−478頁（1976年）参照。多くの種にとつて最
適の培地はムラシゲとスクーグ（Murashige
and Skoog）（MS）培地である。 「Physiol.Plant.」第15巻、473−479頁（1962
年）参照。数週間後に細胞懸濁を開始するのに適
したもろいカルスが得られる。 普通、固形培地中に増殖調節剤を加えることが
好ましい。例えばロズマリナスオフイシナリス
（R.officinalis）の好適な増殖調節剤は２，４−
ジクロロフエノキシル酢酸（２，４−Ｄ）とキネ
チンである。これらの増殖調節剤の典型的な濃度
範囲は、２，４−Ｄが約１から20μMであり、キ
ネチンは０から約40μMである。しかし当業者は
この範囲以外の濃度を使用することもできる。ロ
ズマリナスオフイシナリス（R.officinalis）の特
に好適な培地は、約1μMずつの２，４−Ｄとキ
ネチンを含むMS培地である。サルビア種ではイ
ンドール−３−酢酸（IAA）と６−ベンジルア
デニン（６−BA）を培地中に含有させることが
好ましい。典型的な濃度範囲は、IAAは約１か
ら約40μM、６−BAは約10から約40μMである。
サルビア種の特に好適な培地は、約10μMずつの
IAAと６−BAを含むMS培地である。サルビア
種の別の培地組成の例は、約５から約20μMの
２，４−Ｄと約１から約40μMのキネチンを含有
するMS培地である。さらに別の組成としては、
約0.2から約1.0μMの２，４−Ｄと約0.47μMのキ
ネチンを含有するガンボルグ（Gamborg′s）Ｂ
−５培地がある。 カルスを得た後、これを用いて細胞懸濁培養を
開始する。細胞懸濁培養に好適な培地は液体MS
培地である。本発明ではかかる培地に約４％から
約８％（特に好ましくは約６％）（Ｗ／Ｖ）のシ
ヨ糖を存在せしめる。 当該分野で公知の他の液体培地や上記培地を適
当に変更したものも使用できる。例えば、固形培
地について記載した上記の増殖調節剤を細胞懸濁
培養中に加えることもできる。増殖調節剤の添加
により、細胞懸濁培養を長期間維持することがで
きる。細胞懸濁培養を連続工程で実施する場合
（この場合定期的に少量の細胞を採取する）、この
増殖調節剤の添加は特に好ましい。しかしバツチ
工程を行い全ての細胞を一度に採取する場合は、
増殖調節剤の添加は好ましくない。なぜなら増殖
調節剤のない細胞懸濁培養の方が、全細胞重量当
たりのロズマリン酸の産生量が多い。 ロズマリン酸の収率を上げるために、細胞懸濁
培地にロズマリン酸の前駆体を加えても良い、例
えば細胞懸濁培養液にチロシンを添加すればロズ
マリン酸の産生量が増加する。好適な濃度は約
3000μMである。しかし前駆体を実際に用いる場
合の濃度は、主に経済性を考慮して決められるで
あろう。 植物細胞は、好ましくは懸濁培養から約７から
約17日、最も好ましくは約10から約14日に採取す
る。チロシンのような前駆体を用いる場合は、細
胞は好ましくはもつと長く（約28日）培養され
る。 酸素の欠乏を防ぐため細胞は通気し、細胞が懸
濁状態で固まつてカルスになるのを防ぐため撹拌
しなければならない。このためには当該分野の多
くの方法（振盪、撹拌、振動、又は培地に無菌空
気を泡立たせる）を使用できる。 ロズマリン酸を単離するために、細胞懸濁液か
ら植物組織細胞の全て又は一部が回収される。そ
して残りの細胞は、採取する細胞を余分に採るた
めにさらに培養すると便利である。当該分野では
他の細胞採取方法も公知であるが、好適な方法は
連続操作で用いられる自動脱スラツジ
（desludging）遠心分離である。バツチ法で細胞
懸濁培養をする場合、濾過が用いられることもあ
る。ドラム型濾過のような連続濾紙濾過方法も当
該分野で公知である。採取した細胞からロズマリ
ン酸を抽出するには、種々の方法がある。その内
の１つは熱水抽出とエタノール抽出である。エタ
ノール抽出により好適な生成物が得られるが、こ
の方法には溶媒を蒸発させ、回収するという余分
な操作、火災又は爆発を避けるため特別な注意そ
して税法上の規制による余分な管理が必要であ
る。従つて好適な方法は、熱水抽出である。 約140〓から212〓の熱水で細胞を溶解させるこ
とにより、ロズマリン酸を抽出できる。一般的
に、細胞を熱水に約10から約30分間熱水に接触さ
せる。正確な時間は特に、抽出される物質の全
量、水温、抽出容器の形及び撹拌条件に依存す
る。エタノール抽出では、細胞を約140〓から約
173〓で無水エタノールに約10から約30分間接触
させる。この場合も、正確な時間は特に、抽出さ
れる物質の全量、エタノールの温度、抽出容器の
形及び撹拌条件に依存する。 熱水抽出又はエタノール抽出のいずれかの場合
も、固形物質は適当な方法（例えば濾過）で除去
され、残りの液体画分がロズマリン酸を含有す
る。他の抽出法は当業者には明らかである。 上記の方法で得られるロズマリン酸含有画分は
強い臭いや味はないため、ひき肉（例えば牛、豚
又は七面鳥）、マーガリン、果実飲料、又はチヨ
コレート等の食品に直接使用可能である。実質的
に味のない、無臭の抗酸化剤組成物を得るために
必要であれば、クロマトグラフイーの様な標準的
な方法により、ロズマリン酸画分をさらに精製で
きる。 食品中のロズマリン酸の適当量は多くの因子に
左右されるが、普通約0.001％から約0.01％でか
なりの期間酸化を防止できる。ある特定の食品に
適したロズマリン酸の量は、当業者は容易に決定
できる。 以下の実施例は例示のためだけであり、決して
本発明を限定するものではない。 実施例 １ ロズマリナスオフイシナリス（R.officinalis）
及びサルビア（Salvia）種の多くの変種について
ロズマリン酸の産生量を試験した。温室中で増殖
させた植物から成熟した葉を採取した。葉を抽出
し、乾燥重量当たりのロズマリン酸の割合を求め
た（第１図に示す）。
養によりロズマリン酸を産生する方法に関する。 発明の背景 ある種の香辛植物（例えばロズマリナスオフイ
シナリス（R.officinalis）やサルビアオフイシナ
リス（S.officinalis）は、有用な抗酸化性のある
化合物を含有することが知られている。例えば米
国特許第4012531号；3950266号；3732111号明細
書を参照。この様な香辛植物の抽出物を食物の抗
酸化剤として使用することは公知である。種々の
抽出方法が提唱されているが、抗酸化性を有する
比較的少量の画分を得るにも多量の香辛植物材料
が必要である。又普通各植物に特徴的な強い香辛
臭を除く必要があり、そのためにしばしば大量の
高価な溶媒が必要である。 合成抗酸化剤（例えばBHAやBHT）を使用す
ることも可能であるが、合成抗酸化剤の主要な欠
点は、水に溶けないことである。BHAは水分散
性ゴムとして入手できるが、合成添加物を使用し
ない食物の方が消費者に人気がある。従つて香辛
植物抽出物に関係する問題を有しない水溶性抗酸
化剤を、天然資源から開発することは有益であ
る。 発明の要約 本発明の目的は、非合成、水溶性抗酸化剤の製
造法を与えることである。 本発明の又別の目的は、シソ科植物細胞の懸濁
培養によるロズマリン酸の製造法を与えることで
ある。 本発明のさらに別の目的は、香辛植物の特徴的
な強い臭いのない、シソ科植物より得られる抗酸
化剤を与えることである。 本発明のさらに別の目的は、シソ科植物の組織
細胞を、細胞懸濁培養で増殖させる方法を与える
ことである。 これら及び他の目的は以下の態様により達成さ
れる。本発明は、(イ)シソ科のロズマリン酸産生植
物の細胞を、特定の非形態形成関与栄養液体増殖
培地中で懸濁させて増殖させ、(ロ)培地から細胞の
少なくとも１部を採取し、(ハ)採取した細胞から、
ロズマリン酸含有画分を回収することより成る、
細胞懸濁培養によりロズマリン酸を産生する方法
を与える。 好適な態様の説明 本発明の一部は、ロズマリン酸は天然に存在す
る抗酸化剤であり、シソ科植物の抽出物の抗酸化
作用の少なくとも一部はロズマリン酸に帰因する
という発見である。又本発明は、液体増殖培地中
でシソ科植物の組織細胞を増殖させて、細胞懸濁
培養中で増殖した細胞からロズマリン酸を含有す
る画分を回収することにより、ロズマリン酸組成
物を産生する方法を与える。 本発明にはいくつかの利点がある。第一に市販
の乾燥香辛料からの抽出に比較して、本発明では
３から４倍量のロズマリン酸が産生される。第二
にロズマリン酸は水溶性のため、食品（例えば
肉、果実飲料等）の製造に極めて有用である。第
三にロズマリン酸はシソ科植物（例えばマンネン
ロウ、ヤクヨウサルビア、ハツカ、タチジヤコ
ウ、ハナハツカ、マヨラナ、メボウキ等）由来の
天然物であり、従つて合成食品添加物に伴う悪い
印象はない。 本発明は、ロズマリン酸を産生するシソ科植物
の任意の種の細胞の使用を含有する。本発明は、
ロズマリナス（Rosmarinus）、サルビア
（Salvia）、ヒソプス（Hyssopus）、イボジア
（Ibozia）、ラバンジユラ（Lavandula）、リコプ
ス（Lycopus）、メンサ（Mentha）、モナルダ
（Monarda）、オリガヌム（Origanum）、ペロウ
スキア（Perowskia）、プレクトランサス
（Plectranthus）、サツレイア（Satureia）及びサ
イマス（Thymus）のロズマリン酸産生種を含有
するが、これらに限定されるものではない。この
うちロズマリナス（Rosmarinus）とサルビア
（Salvia）が好適である。ロズマリン酸の高産生
物であるロズマリナスオフイシナリス（R.
officinalis）又はサルビアオフイシナリス（S.
officinalis）又はこれらの変種の細胞組織を選択
することが特に好ましい。本発明の代表的な植物
は、マンエンソウ、ヤクヨウサルビア、タチジヤ
コウソウ、ハナハツカ、マヨラナ、メボウキ、セ
イヨウハツカ、オランダハツカ、コウスイハツカ
及びキダチハツカという名前で一般的に知られて
いる。当業者は容易に他のシソ科のロズマリン酸
産生植物を、見つけることができる。例えば、
EllisとTowers、「Biochem.J」第118巻、291−
297頁（1970年）；Reschke、「Z.Lebensm.
Unters.Forsch.」第176巻、116−119頁（1983
年）；「Z.Naturforschg.」第21巻ｂ、604−605頁
（1966年）を参照。種及び株を見つけた後は、ロ
ズマリン酸産生量の最も多い組織細胞を選択す
る。この様な組織細胞は蛍光顕微鏡で観察するこ
とにより見つけることができる。331又は325nｍ
で蛍光を発する細胞が普通ロズマリン酸産生量が
最も多い。 細胞懸濁培養を始める１つの方法は、固形の非
形態形成関与培地上で増殖させた植物組織のカル
スを、液体培地に接種することである。培地への
接種に用いる組織は、植物の葉からのものが好ま
しい。当該分野においていくつかの固定培地が公
知である（例えばガンボルグ（Gamborg′s）Ｂ
−５倍地、ホワイト（White′s）倍地及びシエン
ク−ヒルデブラント（Schenk−Hildebrandt）倍
地）。例えば、Gamborgら、「In vitro」第12巻、
473−478頁（1976年）参照。多くの種にとつて最
適の培地はムラシゲとスクーグ（Murashige
and Skoog）（MS）培地である。 「Physiol.Plant.」第15巻、473−479頁（1962
年）参照。数週間後に細胞懸濁を開始するのに適
したもろいカルスが得られる。 普通、固形培地中に増殖調節剤を加えることが
好ましい。例えばロズマリナスオフイシナリス
（R.officinalis）の好適な増殖調節剤は２，４−
ジクロロフエノキシル酢酸（２，４−Ｄ）とキネ
チンである。これらの増殖調節剤の典型的な濃度
範囲は、２，４−Ｄが約１から20μMであり、キ
ネチンは０から約40μMである。しかし当業者は
この範囲以外の濃度を使用することもできる。ロ
ズマリナスオフイシナリス（R.officinalis）の特
に好適な培地は、約1μMずつの２，４−Ｄとキ
ネチンを含むMS培地である。サルビア種ではイ
ンドール−３−酢酸（IAA）と６−ベンジルア
デニン（６−BA）を培地中に含有させることが
好ましい。典型的な濃度範囲は、IAAは約１か
ら約40μM、６−BAは約10から約40μMである。
サルビア種の特に好適な培地は、約10μMずつの
IAAと６−BAを含むMS培地である。サルビア
種の別の培地組成の例は、約５から約20μMの
２，４−Ｄと約１から約40μMのキネチンを含有
するMS培地である。さらに別の組成としては、
約0.2から約1.0μMの２，４−Ｄと約0.47μMのキ
ネチンを含有するガンボルグ（Gamborg′s）Ｂ
−５培地がある。 カルスを得た後、これを用いて細胞懸濁培養を
開始する。細胞懸濁培養に好適な培地は液体MS
培地である。本発明ではかかる培地に約４％から
約８％（特に好ましくは約６％）（Ｗ／Ｖ）のシ
ヨ糖を存在せしめる。 当該分野で公知の他の液体培地や上記培地を適
当に変更したものも使用できる。例えば、固形培
地について記載した上記の増殖調節剤を細胞懸濁
培養中に加えることもできる。増殖調節剤の添加
により、細胞懸濁培養を長期間維持することがで
きる。細胞懸濁培養を連続工程で実施する場合
（この場合定期的に少量の細胞を採取する）、この
増殖調節剤の添加は特に好ましい。しかしバツチ
工程を行い全ての細胞を一度に採取する場合は、
増殖調節剤の添加は好ましくない。なぜなら増殖
調節剤のない細胞懸濁培養の方が、全細胞重量当
たりのロズマリン酸の産生量が多い。 ロズマリン酸の収率を上げるために、細胞懸濁
培地にロズマリン酸の前駆体を加えても良い、例
えば細胞懸濁培養液にチロシンを添加すればロズ
マリン酸の産生量が増加する。好適な濃度は約
3000μMである。しかし前駆体を実際に用いる場
合の濃度は、主に経済性を考慮して決められるで
あろう。 植物細胞は、好ましくは懸濁培養から約７から
約17日、最も好ましくは約10から約14日に採取す
る。チロシンのような前駆体を用いる場合は、細
胞は好ましくはもつと長く（約28日）培養され
る。 酸素の欠乏を防ぐため細胞は通気し、細胞が懸
濁状態で固まつてカルスになるのを防ぐため撹拌
しなければならない。このためには当該分野の多
くの方法（振盪、撹拌、振動、又は培地に無菌空
気を泡立たせる）を使用できる。 ロズマリン酸を単離するために、細胞懸濁液か
ら植物組織細胞の全て又は一部が回収される。そ
して残りの細胞は、採取する細胞を余分に採るた
めにさらに培養すると便利である。当該分野では
他の細胞採取方法も公知であるが、好適な方法は
連続操作で用いられる自動脱スラツジ
（desludging）遠心分離である。バツチ法で細胞
懸濁培養をする場合、濾過が用いられることもあ
る。ドラム型濾過のような連続濾紙濾過方法も当
該分野で公知である。採取した細胞からロズマリ
ン酸を抽出するには、種々の方法がある。その内
の１つは熱水抽出とエタノール抽出である。エタ
ノール抽出により好適な生成物が得られるが、こ
の方法には溶媒を蒸発させ、回収するという余分
な操作、火災又は爆発を避けるため特別な注意そ
して税法上の規制による余分な管理が必要であ
る。従つて好適な方法は、熱水抽出である。 約140〓から212〓の熱水で細胞を溶解させるこ
とにより、ロズマリン酸を抽出できる。一般的
に、細胞を熱水に約10から約30分間熱水に接触さ
せる。正確な時間は特に、抽出される物質の全
量、水温、抽出容器の形及び撹拌条件に依存す
る。エタノール抽出では、細胞を約140〓から約
173〓で無水エタノールに約10から約30分間接触
させる。この場合も、正確な時間は特に、抽出さ
れる物質の全量、エタノールの温度、抽出容器の
形及び撹拌条件に依存する。 熱水抽出又はエタノール抽出のいずれかの場合
も、固形物質は適当な方法（例えば濾過）で除去
され、残りの液体画分がロズマリン酸を含有す
る。他の抽出法は当業者には明らかである。 上記の方法で得られるロズマリン酸含有画分は
強い臭いや味はないため、ひき肉（例えば牛、豚
又は七面鳥）、マーガリン、果実飲料、又はチヨ
コレート等の食品に直接使用可能である。実質的
に味のない、無臭の抗酸化剤組成物を得るために
必要であれば、クロマトグラフイーの様な標準的
な方法により、ロズマリン酸画分をさらに精製で
きる。 食品中のロズマリン酸の適当量は多くの因子に
左右されるが、普通約0.001％から約0.01％でか
なりの期間酸化を防止できる。ある特定の食品に
適したロズマリン酸の量は、当業者は容易に決定
できる。 以下の実施例は例示のためだけであり、決して
本発明を限定するものではない。 実施例 １ ロズマリナスオフイシナリス（R.officinalis）
及びサルビア（Salvia）種の多くの変種について
ロズマリン酸の産生量を試験した。温室中で増殖
させた植物から成熟した葉を採取した。葉を抽出
し、乾燥重量当たりのロズマリン酸の割合を求め
た（第１図に示す）。
【表】
ナスオフイシナリス〓プロストレータス〓
(R.off.〓Prostratus〓)(非常に細かい)
(R.off.〓Prostratus〓)(非常に細かい)
【表】
【表】
＊ 乾燥重量当たりの％として表示。
実施例 ２ ロズマリン酸を産生するロズマリナスオフイシ
ナリス（R.officinalis）の４種の異なる細胞株に
ついてロズマリン酸産生量を試験した。ロズマリ
ナスオフイシナリスの細胞株（Ａ、Ｂ、Ｃそして
Ｄと呼ぶ）は、普通の種類のロズマリン酸から得
た。 各々1μMの２，４−Ｄとキネチンを含有する
個体MS培地上で増殖させたカルス株から、細胞
懸濁培養を開始した。ロータリーシエーカー上の
250ml三角フラスコ中の各1μMの２，４−Ｄとキ
ネチンを含有する75mlの液体MS培地に５グラム
（乾燥重量）のカルス細胞を移植した。懸濁培養
液をさらに７日間の間隔で培養し、７日、14日、
そして24日にレプリカを採取した。 採取した細胞を７cmのブフナーロート中ワツト
マンNo.１濾紙で濾過し、10mlの蒸留水で２回洗滌
してから重量を測定した。採取した湿細胞を１ｇ
当たり５mlの無水エタノールで約２時間沸騰させ
てロズマリン酸を抽出した。次にこの熱抽出物を
長管ロート中でワツトマンNo.１濾紙で濾過した。
抽出物を完全に採取するために、細胞を30mlまで
の熱エタノールで洗滌した。濾液は分析するまで
冷蔵保存した。 分析の前に試料を濾過し、正確に50又は100ml
に希釈した。抽出した細胞を２日間空気乾燥し、
３日目に乾燥重量を測定した。抽出物中の固形分
の重量に、乾燥、抽出細胞の重量を加えて、総乾
燥重量を求めた。 パーキンエルマー（Perkin Elmer）601HPLC
を用いてＣ−18逆相カラムで分析した。0.01Mの
クエン酸からエタノールへの凸型濃度勾配溶出を
用いた。下記の第２図に示す様に、細胞株により
ロズマリン酸合成の変化が観察された。又17日目
と24日目の間でロズマリン酸合成量の減少が観察
された。
実施例 ２ ロズマリン酸を産生するロズマリナスオフイシ
ナリス（R.officinalis）の４種の異なる細胞株に
ついてロズマリン酸産生量を試験した。ロズマリ
ナスオフイシナリスの細胞株（Ａ、Ｂ、Ｃそして
Ｄと呼ぶ）は、普通の種類のロズマリン酸から得
た。 各々1μMの２，４−Ｄとキネチンを含有する
個体MS培地上で増殖させたカルス株から、細胞
懸濁培養を開始した。ロータリーシエーカー上の
250ml三角フラスコ中の各1μMの２，４−Ｄとキ
ネチンを含有する75mlの液体MS培地に５グラム
（乾燥重量）のカルス細胞を移植した。懸濁培養
液をさらに７日間の間隔で培養し、７日、14日、
そして24日にレプリカを採取した。 採取した細胞を７cmのブフナーロート中ワツト
マンNo.１濾紙で濾過し、10mlの蒸留水で２回洗滌
してから重量を測定した。採取した湿細胞を１ｇ
当たり５mlの無水エタノールで約２時間沸騰させ
てロズマリン酸を抽出した。次にこの熱抽出物を
長管ロート中でワツトマンNo.１濾紙で濾過した。
抽出物を完全に採取するために、細胞を30mlまで
の熱エタノールで洗滌した。濾液は分析するまで
冷蔵保存した。 分析の前に試料を濾過し、正確に50又は100ml
に希釈した。抽出した細胞を２日間空気乾燥し、
３日目に乾燥重量を測定した。抽出物中の固形分
の重量に、乾燥、抽出細胞の重量を加えて、総乾
燥重量を求めた。 パーキンエルマー（Perkin Elmer）601HPLC
を用いてＣ−18逆相カラムで分析した。0.01Mの
クエン酸からエタノールへの凸型濃度勾配溶出を
用いた。下記の第２図に示す様に、細胞株により
ロズマリン酸合成の変化が観察された。又17日目
と24日目の間でロズマリン酸合成量の減少が観察
された。
【表】
実施例 ３
細胞懸濁培養液にロズマリン酸生合成のいくつ
かの前駆体を添加して、そのロズマリン酸産生へ
の影響を求めた。 実施例２の細胞株Ｄを、各1μMの２，４−Ｄ
とキネチンを含有する液体MS培地（PH5.7）中で
増殖させた。250mlの三角フラスコ中約75mlの培
地を250〓で15分間オートクレーブしてから、５
ｇ（湿重量）の濾過したロズマリナスオフイシナ
リス（R.officinalis）細胞に添加した。異なる前
駆体を3000μMの濃度で含む７種類の培地を調製
した。その前駆体は、Ｌ−フエニルアラニン、シ
ナミン酸、カフエイン酸、ｐ−クマリン、チロシ
ン、DOPA（DL）及びDOPA（Ｌ）である。 ７日間間隔で細胞を採取、抽出し、実施例２に
記載した様にロズマリン酸合成の分析を行つた。
シナミン酸（444.7mg／）とＰ−クマリン
（492.6mg／）を含有する懸濁培養菌は、７日で
死滅した。残りの５種類の結果は以下の第３表に
示す。チロシンの場合は対照に比較して、28日で
ロズマリン酸産生量が20倍増加した。
かの前駆体を添加して、そのロズマリン酸産生へ
の影響を求めた。 実施例２の細胞株Ｄを、各1μMの２，４−Ｄ
とキネチンを含有する液体MS培地（PH5.7）中で
増殖させた。250mlの三角フラスコ中約75mlの培
地を250〓で15分間オートクレーブしてから、５
ｇ（湿重量）の濾過したロズマリナスオフイシナ
リス（R.officinalis）細胞に添加した。異なる前
駆体を3000μMの濃度で含む７種類の培地を調製
した。その前駆体は、Ｌ−フエニルアラニン、シ
ナミン酸、カフエイン酸、ｐ−クマリン、チロシ
ン、DOPA（DL）及びDOPA（Ｌ）である。 ７日間間隔で細胞を採取、抽出し、実施例２に
記載した様にロズマリン酸合成の分析を行つた。
シナミン酸（444.7mg／）とＰ−クマリン
（492.6mg／）を含有する懸濁培養菌は、７日で
死滅した。残りの５種類の結果は以下の第３表に
示す。チロシンの場合は対照に比較して、28日で
ロズマリン酸産生量が20倍増加した。
【表】
【表】
実施例 ４
実施例２の細胞株Ｄでロズマリン酸産生に対す
るシヨ糖濃度の影響を調べた。実施例２に記載の
液体MS培地中で細胞を増殖させたが、増殖調節
剤を含む培地に加えて、増殖調節剤を含まない液
体MS培地を用いた。実施例２に記載のように７
日、14日そして21日目に、ロズマリン酸を抽出し
分析した。 第４表は、増殖調節剤を含まない細胞懸濁培養
の結果、そして第５表は、各1μMの２，４−Ｄ
とキネチンを含む培養液についての結果を示す。
わずかに６％（Ｗ／Ｖ）のシヨ糖を含み増殖調節
剤を含まない培地で、最大量のロズマリン酸の蓄
積が観察された。増殖調節剤を含む細胞懸濁液の
方が、増殖調節剤を含まない細胞懸濁液より、細
胞増殖量は多かつた（14日目に６％シヨ糖で1.9
倍多かつた）。増殖調節剤を含む懸濁液に比較す
ると、増殖調節剤を含まない細胞懸濁液では、６
％シヨ糖で14日目に、ロズマリン酸の産生量は２
倍多かつた（乾燥重量当りの割合）。
るシヨ糖濃度の影響を調べた。実施例２に記載の
液体MS培地中で細胞を増殖させたが、増殖調節
剤を含む培地に加えて、増殖調節剤を含まない液
体MS培地を用いた。実施例２に記載のように７
日、14日そして21日目に、ロズマリン酸を抽出し
分析した。 第４表は、増殖調節剤を含まない細胞懸濁培養
の結果、そして第５表は、各1μMの２，４−Ｄ
とキネチンを含む培養液についての結果を示す。
わずかに６％（Ｗ／Ｖ）のシヨ糖を含み増殖調節
剤を含まない培地で、最大量のロズマリン酸の蓄
積が観察された。増殖調節剤を含む細胞懸濁液の
方が、増殖調節剤を含まない細胞懸濁液より、細
胞増殖量は多かつた（14日目に６％シヨ糖で1.9
倍多かつた）。増殖調節剤を含む懸濁液に比較す
ると、増殖調節剤を含まない細胞懸濁液では、６
％シヨ糖で14日目に、ロズマリン酸の産生量は２
倍多かつた（乾燥重量当りの割合）。
【表】
【表】
【表】
％ 番号 mg mg 重量 mg
mg 重量 mg mg 重量
mg 重量 mg mg 重量
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ロズマリン酸組成物の製造方法において、 (イ) シソ（Labiatae）科のロズマリン酸産生植
物の細胞を、非形態形成関与栄養液体増殖培地
である約４％から約８％（Ｗ／Ｖ）の濃度範囲
のシヨ糖を含有するムラシガとスクーグ
（Murashiga and Skoog）培地中で懸濁させ
て増殖させ、 (ロ) 培地から細胞の少なくとも一部を採取し、 (ハ) 採取した細胞から、ロズマリン酸含有画分を
回収することより成る、上記方法。 ２ 植物はロズマリナス（Rosemarinus）及び
サルビア（Salvia）より成る群から選ばれる属で
ある、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 植物はロズマリナスオフイシナリス（R.
officinalis）及びサルビアオフイシナリス（S.
offidinalis）より成る群から選ばれる、特許請求
の範囲第２項に記載の方法。 ４ 組織細胞の採取されない部分は２回目の細胞
懸濁培養の開始に使用する、連続工程である特許
請求の範囲第１項に記載の方法。 ５ 組織細胞の採取されない部分は２回目の細胞
懸濁培養の開始に使用する、連続工程である特許
請求の範囲第２項に記載の方法。 ６ 組織細胞の採取されない部分は２回目の細胞
懸濁培養の開始に使用する、連続工程である特許
請求の範囲第３項に記載の方法。 ７ 植物細胞はロズマリナスオフイシナリス
（R.officinalis）種由来であり、非形態形成関与
栄養液体増殖培地は２，４−ジクロロフエノキシ
ル酢酸とキチネンより成る群から選ばれる増殖調
節剤を含有する、特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 ８ 植物細胞はサルビアオフイシナリス（S.
offidinalis）種由来であり、非形態形成関与栄養
液体増殖培地はインドール−３−酢酸と６−ベン
ジルアデニンより成る群から選ばれる増殖調節剤
を含有する、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76278185A | 1985-08-06 | 1985-08-06 | |
| US762781 | 1985-08-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232889A JPS6232889A (ja) | 1987-02-12 |
| JPH0129558B2 true JPH0129558B2 (ja) | 1989-06-12 |
Family
ID=25066022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18411886A Granted JPS6232889A (ja) | 1985-08-06 | 1986-08-05 | ロズマリン酸の生合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6232889A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019230626A1 (ja) | 2018-05-28 | 2019-12-05 | 花王株式会社 | 夜間頻尿の予防又は改善剤 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09308402A (ja) * | 1996-05-23 | 1997-12-02 | Pola Chem Ind Inc | 新規ブロードリーフセージ及びそのエッセンスを含有する組成物 |
| JP5986793B2 (ja) * | 2012-04-26 | 2016-09-06 | 小川香料株式会社 | セイボリーエキスの製造方法 |
| CN108546722A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-09-18 | 上海中医药大学 | 一种利用丹参功能基因从头生物合成迷迭香酸的方法 |
-
1986
- 1986-08-05 JP JP18411886A patent/JPS6232889A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019230626A1 (ja) | 2018-05-28 | 2019-12-05 | 花王株式会社 | 夜間頻尿の予防又は改善剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6232889A (ja) | 1987-02-12 |
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