JPH01296996A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

を産業上の利用分野］ 本発明は、新規な生理活性ペプチドに関するものである
。 ［従来の技術おまひ問題点］ 現在、腸管由来のベグタイドホルモンか数多く知られて
おり、中でもＶＩＰは、血管拡張作用、血圧降下作用、
気管支拡張作用などの有用な薬理作用か知られている。 また、ヒトＶ　Ｉ　ＰとブタＶＩＰが全く同一であるよ
うに、動物種によるペプチド配列の変異が少なく、消化
管以外にも多くの器官でその存在が確認され、最近では
、ある種の神経伝達物質として、認識されるようになっ
て来ている重要なペプタイドである。 しかし、天然のヒトＶＩＰを、動物の臓器よりの抽出や
、有機化学合成により生産することは、コスト面より採
算が採れず、また、遺伝子組換えによる生産も、Ｃ末端
がアミドであることから、容易には生産出来ないため、
医薬品として市場に供されることのないまま今日に至っ
でいる。 Ｅ問題点を解決するための手段］ 本発明者は、経済効率の高い遺伝子組換えによる生産が
可能なヒ１−ＶＩＰ様活性を有するペプチドを得るべく
そのペプチド配列について、種々検Ｊ１を行った結果、
下記式 ％式％ Ａｓｎ−５ｅｒ−１ｌｅ　　Ｌ　ｅｕ−Ａｓｎ−ＯＨで
表される新、規ベグチドか、ヒ）ＶＩＰと同等の薬理作
用を有し、かつ遺伝子組換えにより容易に生産できるこ
とを見いだし、本発明を完成した。 即ち、本発明は、下記式 ％式％ で表される新規ペプチド（以下、本発明の化合物と称す
る）である。 上述した本発明の化合物の構造式、および以下の説明に
おいては、Ｈｉｓは、Ｌ−ヒスチジン、Ｓｅｒは、Ｌ−
セリン、ＡｓｐはＬ−アスパラギン酸、ＡｌａはＬ−ア
ラニン、Ｖａｌは、Ｌ−バリン、Ｐｈｅは、Ｌ−フェニ
ルアラニン、Ｔ）ｉｒは、Ｌ−スレオニン、Ａｓｎは、
Ｌ−アスパラギン、Ｔｙｒは、し−チロシン、Ａｒｇは
、Ｌ−アルギニン、Ｌｅｕは、Ｌ−ロイ・６／ン、Ｌｙ
ｓは、Ｌ−リジン、Ｇｌｎは、Ｌ−グルタミン、Ｉｌｅ
は、■、−インロイシンをそれぞれ意味する。 本発明の化合物は、液相法、同相法による一般的なペブ
タイドの有機化学合成法によっ°Ｃも製造できるが、大
腸菌等を用いた遺伝子組換え法により、容易に大量生産
できるという特徴を有しているので、遺伝子組換え法に
より生産するのが好ましい。 以下に、本発明の新規ペプチドの製造方法について、説
明する。 １）構造遺伝子 １）遺伝子の設計 本発明のペプチドは、新規ペプチドであり、天然には存
在

【７ないため、その構造遺伝子を合成しなけれはなら
ないが、本発明の新規ペプチドを構成するアミノ酸をコ
ー　ドするＤＮＡ配列のらち、大腸菌での利用度の高い
配列を選び、また、Ａ−Ｔ塩基対に富む領域が連続しな
いこと、また、この構造遺伝子を合成するための部品と
なる合成フラグメントが分子内自己相補性塩基配列を有
しないこと、繰り返し配列を有しないこと、３０塩基程
度の大きさになること、３゛末端がＡでないことに留意
して設計する。 従って、本発明で筐用する新規ペプチドの構造遺伝子の
好ましい具体例は、後記の実験例および遺伝子設計図に
示した塩基配列のものである（図中、この構造遺伝子は
、Ｈｉ　ｓ　Ｉこ対応するＣΔＣからＡ　ｓ　ｎに対応
するＡＡＣの部分までである）。 この構造遺伝子を発現させる方法は、例えば、大腸菌の
ラクトースオペロンのβ−ガラクトンダーゼの構造遺伝
子中にこの遺伝子を挿入して、融合蛋白として発現させ
ることができる。すなわち、まず、構造遺伝子の５′末
端側には、臭化ジアン分解のためのＭｅｔ（Ｌ−メチオ
ニン）のコドンを、３′末端側には、終止コドンを設け
る。この際、終止コドンは、２つ以上つなげることが好
ましい。 また、構造遺伝子の５′末端側には、臭化ンアン分解の
ためのＭｅｔのコドンのＡＴＧの代わりｌこ化学的分解
方法の一種であるＮ−ブロモコハク酸イミドによろうす
解のための１”ｒｐ（Ｉ−ｌ−リプ］・ファン）のコド
ンを設けてもよく、また、蛋白分解酵素の一種である血
液凝固因子Ｘａの認識Ｖるｒ　ｌ　ｅ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ
　Ｉ　ｙ−Ａｒ　ｇに相当するコドンあるいは、トロン
ビンの認識するＶ　ａ　Ｉ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇに相当す
るコドンを設けてもよい。 ｌ】）合成 北記のように設計した遺伝子を合成するには、七−両鎖
のそれぞれについて、これをいくつかの７ラグメントに
分けてこれらを化学的に合成し、各々のフラグメントを
結合する方法によればよい。 各鎖は、１８〜３０塩基からなり、各々が１０〜１２塩
基ずつ重なるように、８程度度のフラグメントに分ける
のが好ましい。 各７ラグメントの合成法どしては、固相法、液相法ｌこ
よる合成方法があるが、ホスホルアミダイト法による固
相合成法によるのがもっとも好ましい。 ｉ）精製 フラグメントを合成する際、鎖長が長くなると不純物か
多くなり、−船釣に精製が困難になるが、精製するには
、ホスホルアミダイ１−法によるオリゴヌクレオチド合
成の中間体である５′水酸基の保護基の付いたオリゴヌ
クレオチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相Ｈ
ＰＬＣ）で分取し、保護基を除いた後、更に陰イオン交
換カラムクロマトグラフィーを用いて分取した後、脱塩
することで達成出来る。 ■）リン酸化および結合 ５′末端７ラグメントを除く各フラグメントは、Ｔ４−
キナーゼでリン酸化し、それぞれの反応液において、酵
素を不活性化した後、混合し、脱塩した。脱塩したフラ
クションを濃縮し、５′末端フラグメントを加えて、９
０〜１００　’Ｃ！加熱したうえでゆっくり冷却して、
アニールさせ、さらにＴ、−ＤＮＡリガーゼを用いて反
応させることにより結合し、構造遺伝子断片として得る
ことができる。 ■）β−ガラク１−／ダービ発現系を有するベクターの
調製 本発明においては大腸菌染色体ＤＮＡ由来のβ−ガ２タ
ト／ダーゼの構造遺伝子とその発現のためのプロモータ
ー等の発現システムを有し、大腸菌内で増殖可能なさま
ざまなプラスミドを用いることが可能であり、それらの
グラスミドを調製するにあたっては、公知の常法に従っ
て行うことができるが、既にβ−ガラクトシダーゼの構
造遺伝子が導入されたｐｌＢｌ　（ＡＴＣＣ３１４４９
）等のプラスミドより、β−ガラクトシダーゼの構造遺
伝子を得ることが好都合である。この遺伝子の適当な場
所に、目的とするベプタイドの構造遺伝子を組み込むこ
とで、β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白が作られる。 ３）プラスミド組換え分子 前記のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を本発明のペ
プチドの構造遺伝子を含むプラスミドに一般の遺伝子組
換えの操作によって組込むことにより、プラスミド組換
え５子を構築する。 本発明の具体例で１よ、ベクターとしてｐＢＲ３２２を
使用し、その制限酵素ＥｅｏＲＩとＢａｍＨｌで切断さ
れた大きいほうのフラグメントに本発明のペプチドの構
造遺伝子を含む遺伝子を組込み、史にβ−ガラクトシダ
ーゼの構造遺伝子を組込むことによって、組換え分子と
している。本発明では、このプラスミド組換え分子をｐ
Ｙ１００５と命名した。 ４）形質転換 ｉ）宿主菌 が１記のような本発明のペプチドの構造遺伝子を組込ん
だプラスミド組換え分子、例えばｐＹ１００５を用いて
、形質転換させる宿主細胞としては、大腸菌株ＲＲＩΔ
Ｍ１５（ＡＴＣＣ３５１０２）、Ｊ　Ｍ　ｌ　０１、Ｊ
Ｍ１０５等の大腸菌に１２株の誘導体であって、ラクト
ースオペロンのしプレツサー活性の高いＩａｃ　　ｉ”
の宿主が望ましい。 ■）形質転換 常法により形質転換する。 山）形質転換体 形質転換体の具体例としては、宿主細胞としての大腸菌
株ＲＲＩΔＭ１５を、例えばｐＹ１００５を用いて形質
転換さゼたＲＲＩΔＭ１５（ｐＹ１００５）が挙げられ
る。 ５）ペプチドの産生 １）形質転換体の培養 形質転換体の培養に当たっては、Ｌ−培地、Ｍ９培地、
Ｍ９−カザミノ酸培地、高リン酸培地、高リン酸−カザ
ミノ酸培地等を用いることができ、こねにイソプロピル
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に培養する
ことにより、本発明のペプチドとβ−ガラクトシダーゼ
の融合蛋白（以下融合蛋白と省略する。）を量産するこ
とができる。 ｉ）融合蛋白の精製 大腸菌で発現した融合蛋白は、大腸菌を超音波破砕後、
遠心分離することによって、水不溶性画分として得るこ
とができ、この操作により大腸菌中の多くの水可溶性蛋
白との分離が可能である。 この時点での水不溶性画分には、融合蛋白の他に、膜蛋
白が存在するため、トリトン−ｘｉｏ。 等の界面活性剤による膜蛋白の可溶化を行って、不溶性
の融合蛋白を得るかまたは、塩酸グアニ・ノン溶液を含
む緩衝液を用いたゲル濾過ならびにイオン交換ツノラム
を用いた精製等を行うことで分離可能である。 また、更に抗β−ガラクＩ−シダーゼ抗体、抗ＶＩＰ抗
体を適当なカラム担体に保持させたイムノアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにイ寸すごともできる。 １ｉｉ）融合蛋白の分解 融合上白を分解し、本発明のペプチド全切り出すために
は、上記のように精製した融合蛋白がＭｅｔを介して結
合している場合は、臭化シアンを用いて、β−ガラク［
・ンダーゼ七本発明のベブチドヲ連結しているメチオニ
ンを分解す−ることで得られるが、Ｔｒｐを介しで結合
している場合においては、Ｎ−ブロモコハク酸イミドを
用いることで化学的に分解される。 また、Ｉ　ｌ　ｃ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａｒ　ｇ
を介して結合している場合は、血液疑固因子Ｘａを用い
て、また、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇをｆして結合してい
る場かは、ｌ−ｃ＋ンヒンを用いて酵素的に分解するこ
とかでさる。 １ν）本発明のペプチドのＦｉ’を製 融合蛋白を上記のように分解して得られたペプチド混合
物より本発明の化合物を精製するには、逆相１（Ｐ　Ｌ
　ＣＪダよび陽イオン交換高速液体クロ１トゲラフイー
（陽イオン交換！−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）に付すことにより
なされるが、更に、抗ＶＩＰ抗体を用いたイムノアフィ
ニティーカラムクロマトグラフィーに付すことにより、
効率的な精製を達成することかで謝る。 Ｖ）本発明のペプチドの確認 このようにしで、得られた本発明のペプチドは、アミノ
酸組成分析、エドマン分解によるアミノ酸配列分析およ
び抗Ｖ　Ｉ　り抗体よ６（ムノアノセイ！こより、確認
することができる。 Ｆ実施例１ 実施例１゜ （Ｃ［

【−）゛１ヘキンカルポニル−１，−アスパラギ
ンの結罰した４−（オキシメイル）フＬニルアセトアミ
ドメチル樹脂（アプライドバイオシステム社製）０　、
５１ａｍｏｆｆを塩化メチレン中、５０％ｉ−リフロロ
酢酸で処理しｒ、１ｅｒｔ−ブトキンカルボニルＭ　ヲ
はずし、ｔｅｒｔ−ブＩ・キシカルボニル−し−ロイシ
ン（アプライドバイオシステム社製）２ｍｍｏｌをジシ
クロへキシルカルボジイミドを用いて結合させた。 以下、Ｂ　ｏ　ｃ−アミノ酸を、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｓ
ｎ１Ｌｅｕ、Ｔｙｒｓ　Ｌｙｓ、Ｌｙｓ。 Ｖａｌｓ　Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇ１ｎ５　Ｌｙｓ。 Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ。 Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ％　Ｐｈｅ、Ｖａ　ｌ、Ａｌａ
ＳＡｓｐ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓの順で結合させ反応液を得た
。 以上の反応は、アプライドバイオシステム社製のペプチ
ドシンセサイザ・−モデル４３０ＡにＪ：り行った。 結合反応終了後、この樹脂をアニソールＢよびエチルメ
チルスルフィドの存在下、フッ化水素酸を加え、−２０
°Ｃで３０分、ついで０℃で１０分間反応させて、脱保
護および樹脂からの脱離を行い、２Ｎ−酢酸を用いて溶
解し、凍結乾燥後、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにより精製し、白
色粉末１２０！９を碍た。 以上のようにして生産され！−ペプチドの構造は、アミ
ノ酸配列をペプチド／−タエンサ＝　（アプライドバイ
オシステム社製・モデル４７７Ａ）により、エドマン分
解して得られｌ−フェニルチオヒダントイン（Ｐ　Ｔ　
１−（）アミノ酸を逆相ＨＰ　Ｉ−Ｃで分析することＩ
こより所望のアミノ酸配列を何することを確認した。 実施例２゜ １）本発明のペプチドの構造遺伝子を含む遺伝子の製造 りフラグメントのα成 本発明のペプチドの構造遺伝子を含む遺伝子（後記第１
図参照、以下遺伝子ｌとする。）の構成は、以下に示す
８フラグメントからなるかこのフラグメントの合或は、
Ｄ　Ｎ　Ａ合成機（アプライドパイオンステム社Ｗ、３
８０Ａ）を用いて、ホスホルアミダイト法により固相合
成した。 ■５’−ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＧ■５″
−ＣＡＧＴＧＡＡＴＡＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＣＡ
ＴＧ ■５’−ＣＴＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣＴＡＣＡ
ＣＴＣＧＴＣ ■５’−ＴＧＴＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴ
ＴＧＴ ■５’−ＴＧＣＧＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡ
Ｇ ■５’−ＴＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧ
Ｃ ■５’−ＡＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧ
ＡＡＣＴＧＡＴＡＧ ■５°−ＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧＡ
ＧＴ 以上の７ラグメントの精製に当たっては、それぞれ、Ｄ
ＮＡ合成機による固相合成終了後、得られた塩基及び５
′水酸基の保護基の付いたオリゴヌクレオチドを含むア
ンモ、−ア溶液を５５°Ｃ，５時間加熱して、塩基の保
護基を外し、反応後アン七ニアを減圧留去した後、逆相
ＨＰＬＣに付して、５′水酸基の保護基のみ付いたオリ
ゴヌクレオチドを分取した。得られたフラクションを８
０％酢酸で室温１５〜３０分処理して、５′水酸基の保
護基を除去し、減圧留去俊、陰イオン交換カラム（ＤＥ
ＡＥ−２ｓｗ）に付し、オリゴヌクレオチド画分を得た
。これをゲル濾過カラム（セファデックスＧ２５）で脱
塩しで、それぞれのフラグメ　ン　ト　をｔ与ｌ二。 １１）リン酸化 上記■〜■のフラグメント各８００　ｐｍｏｌをそれぞ
れ６０鰭　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｘＭ
　Ｍｇ　Ｃｌ　２．１５ＲＭ２−メルカプトエタノール
、０．０８．ＭＡＴＰからなる混合液に加え、更に、Ｔ
４−キナーゼ　２５単位（ＢＲＬ社製）を加えて、３７
°Ｃ，２時間反応させた。反応後、６５”Ｃ，１５分加
熱して、酵素を不活化した後、各反応液を合し、ゲル濾
過カラム（セファデックスＧ５０）でまとめて、脱塩し
た。 ｉｉｉ　）フラグメントの結合 脱塩後のフラクションを遠心濃縮機で濃縮後、更に、■
、■のオリゴヌクレオチド７ラグメント各１６００ｐｍ
ｏｌを、５０　ＩＮ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６
）、ｌＯ關ＭｇＣｌ□からなる上記■〜■のリン酸化し
たオリゴヌクレオチドフラグメントの混合液に加え、９
０°Ｃ１３分加熱後、ゆっくり冷却して、アニールさせ
た。冷却後、反応液を２０１＠の濃度となるようジチオ
スレイ］・−ルを加え、更に、ｌ　ｘＭの濃度となるよ
うにＡＴＰを加えて、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２０００単位
（ＮＥＢ社装）を用いて、１６°０，１９．５時間反応
させた。 １ｖ）ｖ４製 反応液を厚さ２ＩＩ１ｍの１０％ポリアクリルアミド電
気泳動（ＰＡＧＥ）に付し、目的の長さ（９８ｂｐ）の
バンドを切り出した。切り出したゲルから電気的にＮＡ
−４５ペーパー（Ｓｃｂｌｅｉｃｂｅｒ　＆　５ｃｈｕ
ｅｌｆ社製）にＤＮＡを吸着させｌ−後、ペーパーを１
ＭＮａｃｌ、２０ｉ１ｉ１１−リス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
８，０）　、０．１．１４　ＥＤＴＡからなる高塩濃度
緩ｔｊ液中６５°Ｃ，１時間加熱することにより溶出し
た。この溶液を７エノール及びエーテルで不純物を除い
た後、２．５倍量のエタノールを加え、エタノール沈澱
を行′つた。 Ｖ）リン酸化 このようにして得た遺伝子は、それぞれ、５′末端がリ
ン酸化されていないため、これを６０３Ｉ８トリス塩酸
緩衝液（ｐＩ−１７，５）　、ｌ　Ｏ鰭ＭｇＣ１゜、１
５鰭　２−メルカプトエタノール、０．０８１ＭＡＴＰ
からなる混合液に加え、更に、Ｔ４−キサーゼ　２５単
位（ＢＲＬ社製）を加えて、３７°Ｃ１２時間反応させ
た。反応後、６５°Ｃ１１５分加熱して、酵素を不活化
した後、ゲル濾過カラノ、（セファデックスＧ５０）で
脱塩し、遺伝子フラグメント（ＶＩＰ９８）（後記第１
図参照）として精製した。 ｖｉ）ベクターの調整 プラスミドＩ）ＢＲ３２２（７アルマシア社製）８１！
９を１０次Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７、５）、１
０鰭ＭｇＣｌ２．１鰭ジチオスレイトール、１００１１
４Ｎａｃ！からなる混合液に加え、これに、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ　　１６０単位および制限酵素ＢａｍＨ１１５
０単位を加えて、３７℃、２時間反応させた後、反応液
を０．６％アガロースゲル電気泳動で分離し、大きいほ
うのフラグメントをＮＡ−４５ペーパーに吸着させた後
、ペーパーを１ＭＮａｃ１．２０ｘ［ｌ−リス塩酸緩衝
液（ｐＨ８、０）　、０　、１　ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａか
らなる高塩濃度緩衝液中６５°０．　１時間加熱するこ
とにより溶出した。この溶液をフェノール及びエーテル
で不純物を除いた後、２．５倍量のエタノールを加え、
エタノール沈澱を行った。このうち、ｏ、ｉｕ９を、遺
伝子フラグメンｈＶＩＦ９８　０．２膚とともに、５０
、Ｍｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）　、】、Ｏ鰭Ｍ
ｇＣ＋□、１０關ジチオイスレイトール、２５３１ＭＮ
ａＣ１％　ｌｄ　ＡＴＰからなる混合液に加え、更に、
Ｔ４−リガーゼ　４００単位を加えて、１６°Ｃ１１８
時間反応させた。常法にしたがい、この反応液を用いて
、Ｃａ　ＣＩ　ｘ法により、大腸菌株ＲＲＩΔＭ１５を
形質転換し、５０Ａｌｉ／ｄのアンピシリンを含有する
し一プレート上で、形質転換体を得た。更に、得られた
形質転換体を１０４／−のテトラサイクリンを含有する
し一プレートにレプリケーションし、テトラサイクリン
感受性であることを確認した後、形質転換体よりアルカ
リンリシス法により、プラスミドを抽出し、１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｘ１．１Ｍｇｃ＋
２、Ｉ　ｚＭ　ジチオスレイト・−ル、１００ｊｌｉｌ
ＮａＣｌからなる混合液に加え、これに、制限酵素Ｅ　
ｃ　ｏ　ＲＩおよび制限酵素ＢａｍＨ１を加えて、３７
°Ｃ１２時間反応させた後、反応液を３％アガロースゲ
ル電気泳動で遺伝子フラグメントｖＩＰ９８を確認して
、組換え体ＲＲＩΔＭ１５（ｐＹ１００４）を得た。 上記のアルカリンリシス法により抽出したプラスミドｐ
Ｙ１００４　８膚を１０．１４　　トリス塩酸緩衝液（
＋）　Ｈ７，５）　、１０ｚＭ　Ｍｇ　Ｃｌ　ｚ、１　
ｚＭジチオスレイトール、１００１ＭＮａＣ１，１０ｕ
９／１１１！Ｑ　ＢＳＡからなる混合液に加え、これに
、制限酵素ＥｃｏＲＩ　　８０単位を加えて、３７°Ｃ
，２時間反応させた後、反応液を０．７％アガロースゲ
ル電気泳動で分離し、ＮＡ−４５ペーパーに吸着させた
後、ペーパーをＩＭ　ＮａＣ＋、２０ｘＭ　　トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）　、Ｏ，１，）ｌ　ＥＤＴＡか
らなる高塩濃度緩衝液中６５°Ｃ，１時間加熱すること
により溶出した。この溶液をフェノール及びエーテルで
不純物を除いた後、２．５倍量のエタノールを加え、エ
タノール沈澱を行った。この沈澱を５０鰭　トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解後、アルカリンホスファタ
ーゼ１９単位を加えて、３７°Ｃ，１時間反応させ、反
応液をフェノール、クロロホルムで抽出後、エタノール
沈澱して、プラスミド断片（ｐＹ１００４−Ｅ）を回収
した。 ここで、ベクターｐｌＢ１　２０ｕ９をｌＯｊｌＭ　ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０鰭ＭｇＣ＋２、ｌ
　、ｉＭ　ジチオスレイトール、１００ｚＭ１００ｚか
らなる混合液に加え、これに、制限酵素ＥｃｏＲＩ　　
２４０単位を加えて、３７°０．２時間反応させた後、
反応液を０．６％アガロースゲル電気泳動で分離し、大
きいほうの７ラグメントをＮＡ−４５ペーパーに吸着さ
せた後、ペーパーをＬＭＮａＣ＋、２０１Ｍ　　トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、０　、　Ｉ　ＪＩＭ　Ｅ　
Ｄ　Ｔ　Ａからなる高塩濃度緩衝液中６５°０．１時間
加熱することにより溶出した。この溶液をフェノール及
びエーテルで不純物を除いた１、２．５倍量のエタノー
ルを加え、エタノール沈澱を行った。沈澱として得られ
たプラスミド断片（ｐＩＢＩ−Ｅ）のうち、０．１４を
、あらかじめ作成しておい？：ｐＹ１００４−Ｅ　　ｏ
、ｉ膚とともに、５０１１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）、ｌＯｄ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　ｚ、ＩＯＩＭ　ジチ
オイスレイトール、２５ｘＭＮａＣＩ、Ｊ、、ＭＡＴＰ
からなる液に加え、更に、Ｔ４−リガーゼ　４００単位
を加えて、１６℃、１８．５時間反応させた。常法にし
たがい、この反応液を用いて、ＣａＣｌ２法により、大
腸菌株ＲＲＩΔＭ１５を形質転換し、５０膚／−のアン
ピシリンを含有し、更に、２％Ｘ−ｇ　ａｌ　　５０成
および０．１＋ｌｌ　ＩＰＴＧ　　２０躍を塗布したＬ
〜プレート上で、青色コロニーとして検出される形質転
換体を得た。 この形質転換体におけるベクター上のβ−ガラクｉ・シ
ダーゼ遺伝子の挿入方向は、形質転換体より分離したベ
クターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ［［によ
って二重消化し、その７ラグメントパターンにより分析
し、所望のプラスミドにより形質転換された形質転換体
であることを確認し、組換え体ＲＲＩΔＭ１５　（ｐｙ
ｌｏｏｓ）を得た。 組換え体ＲＲＩΔＭ１５　（ｐＹｌｏ０５）を、Ｌ−培
地中で、３７°Ｃで培養し、０．Ｄ−ｓｓ。＝　０゜７
になったところで、最終濃度として２鱈のＩＰＴＧを加
え、更に５時間培養し、培養液より、遠心分離により、
菌体を回収し、回収した菌体に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ用緩
衝液を加え、１００°０．５分過熱し、１０％５ＤＳ−
ＰＡＧＥを行った。 このゲルをニトロセルロース紙にエレクトロブロッティ
ングし、ウサギ抗ＶＩＰ抗血清（Ｃ１８社製）およびア
ルカリ性ホスファターゼの結合した抗ウサギＩｇＧを用
いウェスタン・ブロッティングしたところ、目的の分子
量のバンドのみが発色し、本発明のペプチドがβ−ガラ
クトンダーゼとの融合蛋白として発現していることが確
認されｊこ。 ｖｉｉ）精製 組換え体ＲＲ１ΔＭ１５　（ｐＹ１００５）を、２．４
Ｑのし一培地中で、３７°Ｃで培養し、０　、Ｄ　、ｓ
ｓ。−０，７になったところで、最終濃度として２繻の
Ｉ　ＰＴＧを加え、更に５時間培養し、培養液より、遠
心分離により、菌体を回収し、回収した菌体を１０ｍ１
Ｊ　トリス塩酸（ｐＨ８，０）、ｌ　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ
Ｉ　２．　　Ｌ　ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（ＰＭＳＦ）　、５ｍＭ　２−メルカプトエタノ
ールからなる緩衝液１００１１１に懸濁し、超音波処理
により破砕し、これを２７０００ｇで遠心分離し、本発
明のペプチドとβ−ガラクトンターゼの融合蛋白を含む
沈澱を得た。 この沈澱を７０％ギ酸溶液２０ｄに溶解後、ＢｒＣＮ２
．１ｉｉを加えて、室温で２６時間反応させ、融合蛋白
を分解した後、水で１０倍希釈して凍結乾燥し、得られ
た粉末から水可溶分を更に水で抽出して、逆相ＨＰＬＣ
（カラムＭＭＣ−ｐａｃｋ、ＡＭ３１２）に付し、実施
例１で得たペプチドを標準として本発明のペプチドを含
む両分を分取した。 この画分を濃縮後、更に陽イオン交換ＨＰＬＣ（Ａｓａ
ｈ　１ｐａｋ　　ＥＳ−５０２Ｃ）により、精製し、更
に脱塩を兼ねて逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃで、再度精製して目的
のペプチド５００膚を得た。 ｖｉｉｉ）確認 以上のようにして生産されたペプチドの構造は、アミノ
酸配列をベプチドシークエンサー（アフライドバイオシ
ステム社製）により、エドマン分解して得られたフェニ
ルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相ＨＰ　Ｌ
　Ｃで分析することにより所望のアミノ酸配列を有する
ことを確認した。 ［発明の効果］ 次に、本発明のペプチドが降圧作用を示すことを実験例
を挙げて説明する。 実験例 〈ラットの血圧に及ぼす影響〉 本発明のペプチドを、体重２００ｇのＳＤ系雄ラントの
頚静脈に４００　ｎｇ／ｋｇ投与したところ、１０ｍｍ
■ｇの頚動脈圧下降が観察され、本発明のペプチドの医
療応用上の有用性が示された。 本発明のペプチドは、注射剤として用いることができ、
注射剤を製造する場合には、希釈剤として、一般に注射
用蒸留水、生理食塩水、デキストロース水溶液、注射用
植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル等を用いることができる。さらに、必要に応じて、適
宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えても
よい。 また、本発明のペプチドは、ネブライザー、吸入器等を
用いて、鼻粘膜、気管支に直接投与することもできる。 また、本発明のペプチドは、浸透補助剤等とどもに、外
用剤として用いることもできる。 更に、本発明の化合物は、薬理学上使用し得る酸または
塩基を用いた塩として使用することもできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のペプチドの構造遺伝子を含む合成遺
伝子（ＶＩＰ９Ｂ）の全Ｄ　Ｎ　ｉ’、ンークエンスを
示す。 ■〜■は、化学合成りＮＡの７ラグメントおよびその配
列様式と示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記式 Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ
   −Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
   Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖ
   ａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅ
   ｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＯＨで表される新規ペプ
   チド。