JPH04500156A - 活性型ヒト好中球走化因子ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 活性型ヒト好中球走化因子ポリベブチドの製造方法本発明は、ヒト好中球走化因 子ポリベブチドを、該ポリペプチド生産用発現ベクターが組み込まれた形質転換 細胞から製造する方法に関する。

ヒト好中球走化因子（以下、ＮＣＦと記す）は、生理活性ポリベブチドであり、 Ｔリンパ球の胸腺及びリンパ節への移動（回帰）等の成育及び恒常化の機構並び に免疫応答の調節において重要な役割を果たしている。ＮＣＦは好中球及びリン パ球を動員し、これらの細胞を活性化する生物活性を有することが報告されテイ る。［ヨシムラ，　Ｔ，　（ＹｏｓｈｉＩＩｌｕｒａ，Ｔ．　）ら，　ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．，　１３９巻，７８８頁，　１９８７年，ウ才ルツ，Ａ．（Ｗａｌ ｚ，Ａ．）　ら，　Ｂ１ｏｃｈｅｍ．Ｂ．１ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｗ＋ｕ ｎ．，　１４９巻．７５５頁，　１９８７年．グレゴリー，　｝ｌ，　（Ｇｒｅ ｇｏｒｙ，Ｈ．）ら，　Ｂｉｏｃｈａｍ．Ｂ１ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ ｎ．，　１５１巻，８３３頁，　１９８８年コ。これらの知見から、ＮＣＦは悪 性腫瘍及び免疫不全症の患者への有用な免疫療法剤であることが示される。

本発明者らは大腸菌を宿主とするＤＮＡ組換え法によりヒトＮＣＦを生産するこ とに成功し、さらにその形質転換体破砕液の可溶画分から該ポリペプチドを分離 することにも成功し、１９８８年５月２日にこの発明に関する特許を特許出願番 号１８９，１６４として米国特許商標庁に出願した。

さらに、本発明者らは形質転換体破砕液からヒトＮＣＦポリペプチドを製造する ための簡便で効率的な方法について研究した。そして、意外にも、ＤＮＡ組換え 法により該ポリペプチドの発現ベクターを有する大腸菌で生産された大量のヒト ＮＣＦポリペプチドの大部分が形質転換体破砕液から遠心分離して１＝られ乙沈 、を画分に分布し、その沈澱画分から尿素や塩酸グアニジン等の蛋白変性剤処理 と該変性剤を、例えば、透析により除去することにより、活性型ヒトＮＣＦポリ ペプチドを簡便でかつ効率的に得ることができることを見出した。

本発明の目的は、形質転換体破砕液から大量に活性型ヒトＮＣＦポリペプチドを 製造する方法を提供することにある。

本発明の目的は、また形質転換体破砕液の沈澱画分から活性型ヒ）　ＮＣＦポリ ペプチドを精製する簡便で効率的な方法を提供することにある。

他の目的は以下の記述から明らかであろう。

ヒトＮＣＦポリペプチドの典型的なアミノ酸配列は、第１表に示す式［１１で表 される。しかしながら、ヒトＮＣＦとは該アミノ酸配列を持ったポリペプチドば かりでなく、第１表に示す式［１１で表されるアミノ酸配列に類似のアミノ酸配 列を有し、ヒトＮＣＦ活性を有するポリペプチドを意味する。

本発明を更に詳しく記載すると、形質変換体破砕液の沈澱画分を蛋白変性剤、例 えば最終濃度４　Ｍ以上、好ましくは６ＭからＩＯＭの尿素又は塩酸グアニジン で溶解したのち、その蛋白変性剤を、例えば１０〜５０　ｍＭリン酸塩又はトリ ス塩酸緩衝液（ｐＨ６〜８）に対して透析することにより除く。この時、修飾さ れたＮＣＦを含む本質的に不溶性である物質のみが再び沈澱する。その沈澱物を 取り除くことによって、可溶性活性型ヒトＮＣＦポリペプチドを大量に含む溶液 を容易に得ることができる。

形質転換体破砕液から得られた沈澱画分を分離する前に、鼾質耘！ＩＩ体破砕液 中の核酸をデオキクリボヌクレアーゼで消化して切断する処理を行うことが好ま しい。

上記沈澱画分より回収された可溶性活性型ＮＣＦポリペプチドは、例えば塩析、 陰イオン交換及び、／又は陽イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、ゲル濾 過、透析、電気泳動、特異抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー等を 組み合わせることにより、さらにｔ［することができる。

ヒトＮＣＦポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて構築した発現ベクターで形 質転換させた細胞を培養することにより、その形質転換細胞中にヒトＮＣＦポリ ペプチドが生産される。

すなわち、第一に、ヒトＮＣＦポリペプチド生産用発現プラスミドは、例えば参 考例２に従い該ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて構築でき、そのＤＮＡ は例えば参考例１に記載の方法あるいは常法による全合成により得られる。第二 に、ヒトＮＣＦポリペプチドを生産する形質転換細胞は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ ）　ら　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．、　ＵＳＡ、　６９巻、２ １１０頁。

１９７２年）の方法に従い、上記発現プラスミドを導入することにより得ること ができる。最終段階として、適当な培養条件下で得られた形質転換細胞を培養す ることにより、ヒトＮＣＦポリペプチドを生産することができる。

さらに、形質転換体破砕液は培養細胞を、例えばリゾチーム消化と凍結融解、超 音波破砕、又はフレンチプレスを用いて破壊するこにより製造できる。

実施例で製造されたヒトＮＣＦの化学的及び生物学的性質は、ヒトＮＣＦポリペ プチドを蛋白分解酵素消化後の高速液体クロマトグラフィーによるベブチドマ・ ソビング解析及びマルチウェル・ケモタキシス・ボイデンチャンバ−（Ｎｅｕｒ ｏ　Ｐｒｏｂｅ。

Ｉｎｃ４．米国）を用いた好中球走化性試験の結果、参考例２に記載の方法に従 って得られた形質転換体破砕液の可溶性画分から製造したヒトＮＣＦポリペプチ ドと一致した。

尚、本明細書及び請求の範囲には記載の簡略化のために以下の略号を使用する。

ｄＡＴＰ　デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ　デオキシシチジン三リン酸 ｄＧＴＰ　デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ　デオキシチミジン三リン酸 ＡＴＰ　アデノシン三リン酸 ＤＮＡ　デオキシリボ核酸 ｃ　ＤＮＡ　相補ＤＮＡ ｋｂｐ　キロ塩基対 ＳＤ配列　シャイン・ダルガーノ配列 ｋＤ　キロダルトン ＳＤＳ　ラウリル硫酸ナトリウム 本明細書及び請求の範囲において、単鎖で示した塩基配列は翻訳（センス）鎖の 塩基配列であり、その左端は５′末端であり、右端は３゛末端である。アミノ酸 配列の左端はＮ末端であり、右端はＣ末端である。

以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

尚、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

以下に示す参考例をさらに分かりやすくするために、本明細書に図表１から図表 ３を添付する。

図表１は発現プラスミドｐＨＮＰ１０１の構築工程を示す（参考例２）。

図表２は発現ベクターｐＥＰ２０５の構築工程を示す（参考例３）。

図表３は発現プラスミドｐＨｌＰＨ３８３ａの構築工程を示す（参考例４）。

実施例Ｉ ヒトＮＣＦポリペプチドの生産 ヒ）　ＮＣＦポリペプチド生産用形質転換細胞、すなわち、参考Ｍ　２−　（２ ）で得られた大腸菌Ｈ８１０１／ｐＨＮＰ１０１を３７℃で一夜ＬＢ培地［組成 ：１ｚトリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）］ 中で培養した。その培養液を、１００倍容量の３−インドールアクリル酸（２０ μｇ／罰１ン添加栄養培地［ｌｉｉ成；　１．５％リン酸二ナトリウム・１２水 和物、０．３＄ＩＪン酸−カリラム、０．１ｚ塩化アンモニウム、２　ｍｇ／ｌ 　ビ９　Ｅ　ンＢ＋　、０．５Ｘカザミノ酸、２　ｍＭ硫酸マグネシウム、０． １ｍＭ塩化カルシウム、１χトリプトン、０，５％酵母エキス、１χ塩化ナトリ ウム及び０．４％グリセリン］に接種した。培養を３５℃で２８時間行った。細 胞を逮Ｃ分離で集め、０．０２％リゾチーム含有５Ｏｆｉ間トリフ！酸緩衝液（ ｐＨ８，０）に懸濁させた。この細胞懸濁液を氷水中で３０分間静置した。

さらに、ドライアイス／エタノール中での凍結と３７℃での溶解を繰り返して細 胞を破砕した。得られた破砕液に塩化マグネシウム及びデオキシリボヌクレース Ｉ　（全酒造２日本）を、それぞれ最終１度１　ｍＭ及び２　Ｕ／ｍｌになるよ うに添加した。

０℃で３０分間の反応の後、不溶性沈澱物を遠心分離で集め、０．７５　Ｍ尿素 及び１％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で ２回洗浄した。この洗浄沈澱物を６Ｍ塩酸グアニジン含有５　ｍＭリン酸緩衝液 （ｐＨ６，５）に溶解した。遠心分離にて清澄な抽出液を得て、これを２０　ｍ Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）　（以下、Ｐａと称す）に対して透析した。透 析中に形成された沈澱物を遠心分離にて除去し、その透析内液をＰＢで予め平衡 化したＣＭ−セファｏ−スＣＬ−６８［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａ＋ｊａ） 、スウェーデン］カラムに負荷した。カラムをＰＢで洗浄し、ＰＢ中塩化ナトリ ウム１度のＯＭから０．５Ｍの直線的勾配で溶出した。ヒトＮＣＦポリペプチド が含まれる両分を集めてプールし、限外濾過で濃縮した。さらに、濃縮液をトヨ パールＨＷ−５５（東ソー株式会社１　日本）カラムでのゲル濾過にて高度精製 ヒトＮＣＦポリペプチドを得た。

高度精製ヒトＮＣＦポリペプチド調製品中には５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲ ル電気泳動分析で不純物を認めなかった。

高度精製ＮＣｒを、実施４５１！１に記載の形質転換体破砕液から得た洗浄沈澱 物を８Ｈ尿素含［５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）に溶解し、さらに実施ｆ ｌｊｌに記載の同じ方法を用いて得た。

参考例１ ヒトＮＣＦをフードするｃ　Ｄ　Ｎ　、ＡのクローニングｃＯＮＡライブラリー は、１０μｇ／ｎ＋のりポポリサッカライドで６時間刺激した正常ヒト単球から 得たポリアデニル化ｍＲＮ＾を鋳型として用いて合成したｃＤＮＡをファージベ クターλ９ｔ１０のＥｃｏＲＩ切断位置に挿入することにより作製した。５０万 個の各プラークを、［３２ｐｌで標識した次式ＥＣ］と［Ｄ］に示す２゛　種類 の化学合成オリゴヌクレオチドプローブとの結合反応によりスクリーニングした 。

ＡＩＴＡＡＩＴ ５’−ＡＡ　ＧＧ　ＴＴ　ＣＴ　ＴＡ　ＧＴ　ＴＴＩＡＴ−３’　［（：　）Ｇ ＣＣＧＧＣＣ 及び 一次スクリーニングで、１３個の陽性と思われるクローンを得た。これらの陽性 クローンから、１個のクローン（ｒ−ＭＤＮＣＦ２−１と称す）をもう一方のプ ローブを用いた二次スクリーニングで選択した。ｒ−Ｍ［）ＮＣＦ２−１中のフ ァージＤＮＡをｐＵｃ１９プラスミドに挿入した。得られた組換えプラスミドを ｐＵｃ１９−１．７−５と命名した。

組換えプラスミドｐＵｃ１９−１．７−５中のクローン化ｃＤＮＡは、第２表に 示すヒトＮＣＦをフードする塩基配列を含んでいる。

第１表の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するヒトＮＣＦポリペプチドを以 下の方法で製造した。

（１）発現プラスミドｐＨＮＰ１０１の構築参考例１に記載のヒ）、　ＮＣＦ　 ｃＤＮＡが組み込まれた組換えプラスミドｐＬｌｃ１９−１．７−５　カラ制限 酵素ＰｓｔＩトＥｃｏＲＩ＋：　ヨル消化にて、ヒトＮＣＦ前駆体ポリペプチド のＮ末端から第１８〜９７番目のアミノ酸に相当するポリペプチドをコードする ＤＮＡ断片（第２表に示した塩基配列の第５２〜２９１番目に相当）を単離した 。このＤＮＡ断片をファージベクターＭ１３ｍｌ）１８　（全酒造。

日本）のポリリンカー配列内の制限酵素Ｐｓｔ４とＥｃｏＲＩの切断部位の間の 領域に挿入した。この組換えファージＤＮＡを用い、クンケル（Ｋｕｎｋｅ］） らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎ　Ｅｎｚｙｍｏ＋、、　１５４巻。

３６７頁、　１９８７年）による部位特異的変異誘導法により、ヒトＮＣＦ前駆 体ポリペプチドのＮ末端から第２７番目のＡｒ９に対応するコドンと第２８番目 のＳｅｒに対応するコドンの間に５°−工ＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧ−３°の特異な 塩基配列を挿入した。部位特異的変異誘導には、ＭＵＴＡ−ＧＥＮＥインビトロ 　ムタジエ不シスキット　［バイオラッド社、米国（Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ 、、　ＵＳＡ）］を用い、操作手順書に従って行った。組換えファージＤＮＡを 大腸菌ＪＭＩ０５株に感染させ、これを培養して組換えファージを採取した。次 いで、上記の組換えファージを大腸菌ＣＪ２３６株に感染させ、ウリジン（１Ｍ ｇ／ｍｌ　）及びクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍ））を添加した２Ｘ　Ｔ Ｙ培地［組成：１．６％　ｌ−ＩＪ　））ン、１χ酵母エキス、０．５ｘ塩化ナ トリウムコ中、３７℃で５時間培養した。その培養液からウラシルを含む単鎖フ ァージＤＮＡを単離した。

別途、下記式［Ｅ］で示される３３塩基の変異誘導プライマーを化学合成した。

５　’−ＧＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＡＡ Ｇ−３”　［Ｅ］この変異誘導プライマーの５゛末端にリン酸基を予め付加した 。このリン酸化プライマーを先に調製したウラシルを含む単鎖ファージＤＮＡと アニール緩衝液［２ｍＭ塩化マグネシウム及び５０Ｉｌ１Ｍ塩化ナトリウムを含 む２０＋ｎＭｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７□４）］中、７０℃で１０分間反応さ せ、次いで１分間に１℃の割合で３０℃まで冷却することにより結合させた。次 いで、合成緩衝液［各０．４　ｍＭのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＧＴＰ 。

ｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｃｌＴＴＰ）　、０．７５　ｍＭ　ＡＴＰ　、３．７ ５　ｍＭ塩化マグネシウム及び１．５　ｍＭジチオスレイトールを含む１１０ｌ １１トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）］中、水中に５分間、２５℃で５分間及び ３７℃で９０分間の連続反応で、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合 成し、その末端を７４　ＤＮＡリガーゼにて結合させた。反応を一２０℃での凍 結にて停止させた。環状二重鎖ＤＮＡ［ヘテロ二重鎮］を大腸菌ＪＭ１０５株に 導入して培養し、変異型二重鎮復製型ＤＮＡを単離した。その変異型ＤＮＡの塩 基配列は、培養液から単離した単ＭＤＮＡを用いて確認した。

得られた変異型二重鎖ＤＮＡを制限酵素ＱｒａＩとＥｃｏＲＩにて消化し、ヒト ＮＣＦポリペプチドをコードする領域の大部分を含むＤＮＡ断片を単離した。こ の単離したＤＮＡ断片を、ＮＣＦ（ＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩ）断片ト記ス。

このＮＣＦ（Ｄｒａｌ−ＥｃｏＲＩ）断片に、下記の式［Ｆコで示される化学合 成オリゴヌクレオチドアダプターを７４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。

ここで得られたＤＮＡ断片を、ＮＣＦ（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片という。

別途、参考例３に記載の発現プラスミドｐＥＰ２０５を制限酵素ＤｒａＩとＸｈ ｏｌにて消化し、アンピシリン耐性遺伝子及び復製開始点を含む大きなりＮＡ断 片（ＥＰ２０５ベクターＤＮＡ断片と記す）を単離し、このＥρ２０５ベクター ＤＮＡ断片を上記のＮＣＦ（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼ を用いて結合させることにより、ヒトＮＣＦ生産用発現プラスミドｐＨＮＰ１０ １を構築した（図表１参照）。

（２）大腸菌の形質転換 上記の発現プラスミドｐＨＮＰ１０１を、下記の方法で大腸菌８８１０１株に導 入した。

大腸菌８８１０１株をＬＢ培地［組成＝１χトリプトン、０．５％酵母エキス、 １ｚ塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）］に接種し、３０℃で一夜培養した。得られ たｊ＠ｅｌｆｔの１ｍ１を１００　＋ｎｌのＬＢ培地に接種し、波長６００　ｎ ｍの濁度か約０．６に達するまで、３０℃で更に培養した。氷水中で３０分間静 置したのち、遠心分離にて菌体を採取（、た。この菌体を５０ｍ］の５０　ｍＭ 塩化カルシウム液中に再懸濁させ、氷水中で６０分間ＤＢした。次いで、遠心分 離にて菌体を採取し、２０χグリセリンを含む５０　ｍＭ塩化カルシウム液の１ ０ｍ１に再懸濁させた。

この菌体懸濁液に発現プラスミドｐＨＮＰ１０１を添加し、氷水中で２０分間、 次いで室温で６０分間反応させた１、この菌体懸濁液にＬＢ培地を添加し、て３ ７°Ｃで６０分間振盪培養した。この得られた菌体懸濁液の一定量を、２５μｇ ／ｍ１Ｊ１度のアンピシリンを含むＬＢ寒天平板（寒天１．５％）に播いた。３ ７℃で一夜培養したのち、アンピシリン耐性クローンを選択することにより形質 転換体を得た。この形質転換体のひとつを大腸菌ＨＢ１．０１／ｐＨＮＰ１０１ と名付け、ヒトＮＣＦポリペプチドの生産に使用した。

（３）ヒトＮＣＦポリペプチドの生産 上記の大腸菌ＨＢ１０１／ｐＨＮＰＩＯＩを、ＬＢ培地にて３７℃で一夜培養し た。その培養液を１００倍容量の３−インドールアクリル酸（２０μｇ／＋ｎｌ ）を含む実験の栄養培地に接種した。培養は３５℃で２８時間行った。菌体を遠 心分離により採取し、０．１にリゾチーム及び３０　ｍＭ塩化ナトナトリウムむ ５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨａ、ｏ）に懸濁させた。この懸濁液を氷水中で ３０分間静置した。更に、ドライアイス／エタノール浴での凍結と３７℃での融 解を繰り返して菌体を破壊した。これに１１５０容量の１０％ポリエチレンイミ ンを加えたのち、遠心分離にて澄明な菌体抽出液を得た。この菌体抽出液に硫酸 アンモニウムを７０％飽和になるように添加し、析出した沈澱を遠心分離により 採取した。この沈澱を蒸留水に溶解させ、５　ｍＭす〉・酸塩緩衝化、生理食塩 液（ｐＨｓ、ｓ）に対して透析した。この透析内液をセファクリルＳ−２００カ ラムに負荷し、分子量約６〜１０ｋＤのポリペプチドを含む両分を集めてプール した。各溶出液中のポリペプチドの分子量は５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳 動で測定した。上記のプールした画分を実施例に示したＰＢに対して透析した。

この透析内液を、ＰＢにて予め平衡化したＣＭ−セファロースＣＬ−６８カラム に負荷した。カラムをＰａにて洗浄し、ＰＢ中０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの 直線的濃度勾配にて溶出した。

このヒトＮＣＦポリペプチドを含む画分を集め、プールし、限外濾過にてａ縮し た。更に、このａ縮液をトヨバールＨＷ−５５カラムを用いるゲル濾過に付し、 高度精製ヒトＮＣＦポリペプチドを得た。

参考例３ 発現ベクターｐＥＰ２０５の構築 プラスミドｐＢＲ３２２を、制限酵素ＡｖａＩとＰｖｕｌＩ＋、：て消化し、得 られた大きな断片（約３．７ｋｂｐ）を単離した。このＤＮＡ断片の両粘着末端 を、ｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの存在下で、大腸菌０１１４ ポリメラーゼＩ　［クレノー断片コを用いて平滑末端としたのち、その両端をＴ ４　ＤＮＡリガーゼにて結合させることにより、プラスミドρ８Ｒ３２２の復製 開始点近傍のコピー数＃ｉｊ御領域を欠失させた新規プラスミドベクター（ｐ８ ＲＳ６という）を作製した。

このプラスミドベクターｐＢＲｓ６を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにて消化 し、アンピシリン耐性遺伝子の上流領域を含む小さな［ｌＮＡＮＡ断片０．７５ ｋｂｐ）を単離した。このＤＮＡ断片をＡｍｐ（Ｐｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ　）断片 と記す。

このＡａ＋ｐ（ρ″５ｔｌ−ＥｃｏＲＩ　）断片を、実施例に記載した方法に従 ってファージベクターＭ１３ｍｐ１８に挿入した。得られた組換えファージＤＮ Ａを用い、参考例２に記載の方法による部位特異的変異誘導法により、＾Ｉｎり （ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲｌ　）断片中の一塩基（Ｔ）を他の塩基（Ｃ）に変換する ことにより、制限酵素拍１が認識する特異な塩基配列（ＡＡＡＴＴＴ）を消去し た。

ウラシルを含む単鎖ファージＤＮＡを、上記の組換えファージＤＮＡを感染させ た大腸菌ＣＪ２３６株の培養液から単離した。

変異誘導プライマーとして、下記式［Ｇ］で示されるオリゴデオキシリボヌクレ オチドを化学合成した。

５’−ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣ−３’　［Ｇコリン酸化した該 プライマーを、ウラシルを含む鋳型ＤＮＡと結合させた。参考例２に記載の方法 に従って、目的とする変異型二重鎖ＤＮＡを単離した。

得られた変異型二重鎖ＤＮＡを制限酵素上１とＥｃｏＲＩにより消化し、上記の Ａｍｐ（Ｐｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ　）断片に対応し、かつ制限酵素ＤｒａＩの切断 認識配列が消去されたＤＮＡ断片［以下、変異Ａｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ　 ）断片と記す］を単離した。この変異Ａｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ　）断片を 、ベクターｐ８Ｒｓ６から制限酵素ＥｃｏＲＩとＰＳｔＩによる消化にて単離し た大きなＤＮＡ断片と結合させることにより、プラスミドベクターｐ８Ｒ５６中 のアンビシリン耐性遺伝子領域内の制限酵素肚すの切断認識配列が消去されたプ ラスミドベクターを作製した。この新規ベクターをｐＢＲ５６０Ｌと名付ける。

造１日本）とＴａ　ＤＮＡリガーゼにて結合させることにより、新規プラスミド ベクターを作製した。この得られた新規プラスミドベクターは、プラスミドｐＢ Ｒ５６の誘導体であり、制限酵素ＱｒａＩの切断認識塩基配列を含んでいない。

この新規プラスニドベクターをｐＥ！Ｒ５６０２と名付ける。

Ｓｍ♂■リンカ−の塩基配列は下記のとおりである。

５“−ＣＣＣＧＧＧ−３’ 下、ｐＢＲｓ６０２（ＡａｔｌＩ−５ａｌＩ）断片と記ずコ。

別途に、参考例４に記載したヒト　インターロイキンｌα生産用発現ブー）スＨ ドｐＨｌＰＨ３８３ａを制限酵素ＡａｔＩＩと５ａｌｌ　１．−より消化し、大 Ｉｌ！菌トリプトファンプロモーター配列及びヒト　インターロイキンｌαをコ ードする領域を含むＤＮＡ断片を単離した。コノ得られたＤＮＡ断片をｔｒｐ　 ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＩＬ−１（ｚ−ＤＮＡ断片と記す。

このｔｒｐ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＩＬ−１α−ＤＮＡ断片を、ｐＢＲ５６０２（ ＡａｔＩＩ−ＳａｌＩ）断片とＴａ　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることに より、新規の発現プラスミドを構築した（図表２参照）。

この新規発現プラスミドをｐＥＰ２０５と名付ける。

参考例４ 発現ベクターｐＨｌＰＨ３８３ａの構築ヒト　インターロイキン１α前駆体ポリ ペプチドをコードするクローン化ｃＤＮＡは、ヨーロッパ公開特許第０１１３８ ９２０号に記載の方法に従って単離した１、 ヒト　インターロイキンｌα前駆体をコードするｃＤＮＡが組み込まれた組換え プラスミドｐＨ１４［フルタニ、　Ｙ、（Ｆｕｒｕｔａｎｉ。

Ｙ、）ら、　Ｎｕｃ”１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３巻、　５８６９ 頁、　１９８５年〕から、ｃＤＮＡ領域を単離し、更に制限酵素ＥｃｏＲＩとＢ ｓｔＮＩにて消化し、成熟型ヒト　−イシターロ・ｆキン１αをコ・−ドする領 域の中央部のＤＮＡ断片（ａｌｌｂｐ　）を単離した。この単離したＤＮＡ断片 は、ヨーロッパ公開特許第０１８８９２０号の第５表に記載の塩基番号第３９８ 〜８０８番目の塩基配列に相当する。

このＤＮＡ断片に、下記の式［Ｈ］及び［Ｊ］で示される二種類の化学合成オリ ゴヌクレオチドアダプターをＴａ　ＤＮＡリガーゼを用いて順次結合させた。こ こで得られたＤＮＡ断片を、５Ｏ−４Ｌ−１断片と記す。

化学合成オリゴデオキシヌクレオチドアダプター［Ｈ］は、下記式［ａ］〜［ｅ ］で示される５種類のＤＮＡ断片を、順次結合させて作製した。

５’　−ＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＡＡＣＴＴＴＡ　［ｄ １３　’　−ＡＣＴＣＧＴ丁ＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＴＡＣＴＣ及び 式［Ｊ］の塩基配列は、次の通りである。

別途に、発現ベクターｐＥＰ３０２［フルタニ、　Ｙ、（Ｆｕｒｕｔａｎｌ、Ｙ 、）ら、　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３巻、５８６９頁、　 １９８５年］を、制限酵素ＨｐａＩとＢａｍＨＩにて消化し、大腸菌トリプトフ ァンプロモーター配列及びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなりＮＡ断片（以 下、ＥＰ３０２ベクターＤＮＡ断片と記す）を単離した。

このＥＰ３０２ベクターＤＮＡ断片を上記の５Ｄ４Ｌ−１断片と、Ｔａ　ＤＮＡ リガーゼを用いて結合させることにより、成熟型ヒトインターロイキンｌαポリ ペプチド生産用の発現プラスミドｐＨＩＰ８３８３ａを構築した（図表３参照） 。

第１表 ＳｅｒＡｌａＬｙｓＧｌｕＬｅｕＡｒｇＣｙｓＧｌｎＣｙｓｌｌｅＬｙｓＴｈｒ ＴｙｒＳｅｒＬｙｓＰｒｏＰｈｅＨｉｓＰｒｏＬｙｓＰｈｅＩ　１ｅＬｙｓＧ１ ｕＬｅｕＡｒｇＶａｌＩＴｅＧ］ｕＳｅｒＧ１ｙＰｒｏＨｉｓＣｙｓＡｌａＡｓ ｎＴｈｒＧ１ｕＩ　１ｅＩ　１ｅＶａｌＬｙｓＬｅｕＳｅｒＡｓｐＧ１ｙＡｒｇ Ｇ１ｕＬｅｕＣｙｓＬｅｕＡｓｐＰｒｏＬｙｓＧ１ｕＡｓｎＴｒｐＶａｌＧ１ｎ ＡｒｇＶａｌＶａＴＧ１ｕＬｙｓＰｈｅＬｅｕＬｙｓＡｒｇＡ１ａＧ１ｕＡｓｎ Ｓｅｒ式［Ｉコ 第２表 ヒトＮＣＦ前駆体をコードするＣＤＮＡの塩基配列及び演鐸されＺアミノ酸配列 図表す る　発現ブ、３．ドｐＨＮＰ１０１　ｆ：ｒ構築ヒトＮＣＦ　ｃＤＮＡのクロー ン化・ｐ［Ｊｃ１９−１．７−５Ｔ Ｇ ウラシル含有ＤＮＡ鋳型 −統く− 図表１　（続き） ｃｏＲＸ 図表２ 発現ベクターｐＥＰ２０ｓの構築 プラスミドｐＢＲ３２２ プラスミドベクターｐＢＲ５６ 組換えファージ ウラシル含有ＤＮＡ鋳型 ヘテ四二重鎖 一絖く− 図表２（綬き） へテロ二重鎖 図表３ 発現プラスミドｐＨｌＰＨ３８３ａの構築ヒ　トＩＬ（ａ　ＣＤＮＡ＋　ｐＨＬ ４国際調査報告 ｌ　’ニー３−　４３５／６ａ、　７０、１７２．３．　８４８；　９３５／７ ’３

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．該ポリペプチド生産用発現ベクターを有する宿主を培養し、その形質転換体 破砕液から得られる沈澱画分を尿素又はグアニジン塩酸処理することを特徴とす る活性型ヒト好中球走化因子ポリペプチドの製造方法。
2. ２．活性型ヒト好中球走化因子が下記式で表されるアミノ酸配列からなるポリペ プチドである請求の範囲第１項に記載の該ポリペプチドの製造方法。 【配列があります】
3. ３．宿主が大腸菌である請求の範囲第１項に記載の該ポリペプチドの製造方法。