JPH01297554A - グリコヘモグロビン測定法 - Google Patents
グリコヘモグロビン測定法Info
- Publication number
- JPH01297554A JPH01297554A JP12929288A JP12929288A JPH01297554A JP H01297554 A JPH01297554 A JP H01297554A JP 12929288 A JP12929288 A JP 12929288A JP 12929288 A JP12929288 A JP 12929288A JP H01297554 A JPH01297554 A JP H01297554A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lithium
- ghb
- measurement
- liquid chromatography
- performance liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 19
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 claims description 4
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 15
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 4
- 229910001386 lithium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 abstract description 4
- TWQULNDIKKJZPH-UHFFFAOYSA-K trilithium;phosphate Chemical compound [Li+].[Li+].[Li+].[O-]P([O-])([O-])=O TWQULNDIKKJZPH-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 abstract description 3
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M lithium perchlorate Chemical compound [Li+].[O-]Cl(=O)(=O)=O MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 2
- 229910001486 lithium perchlorate Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 abstract description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- -1 carboxyl methyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 22
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 7
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 6
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 3
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101710186643 Insulin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000020006 aldose 1-epimerase Human genes 0.000 description 1
- 108091022872 aldose 1-epimerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- HPGPEWYJWRWDTP-UHFFFAOYSA-N lithium peroxide Chemical compound [Li+].[Li+].[O-][O-] HPGPEWYJWRWDTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 description 1
- ISPBABGJNLPGOY-UHFFFAOYSA-K zinc barium(2+) hydroxide sulfate Chemical compound [OH-].[Zn+2].[Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPBABGJNLPGOY-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬ
Ｃと記す）を用いたグリコヘモグロビンの測定法に関す
る。
Ｃと記す）を用いたグリコヘモグロビンの測定法に関す
る。
（従来の技術）
糖尿病診断において、また糖尿病薬による血糖コントロ
ールを確認するために酵素法等による血糖値の測定が一
般的に行われている。しかし、食事の前後などで血糖値
は激しく変動するため、−日の平均的な血糖値を正確に
安定して測定するのは困難であり、優れた測定法が求め
られている。近年、血糖の平均値を正確に反映する指標
として、グリコヘモグロビンが注目され、その測定法が
実際に臨床の場で使用され始めている。
ールを確認するために酵素法等による血糖値の測定が一
般的に行われている。しかし、食事の前後などで血糖値
は激しく変動するため、−日の平均的な血糖値を正確に
安定して測定するのは困難であり、優れた測定法が求め
られている。近年、血糖の平均値を正確に反映する指標
として、グリコヘモグロビンが注目され、その測定法が
実際に臨床の場で使用され始めている。
グリコヘモグロビン（以下、ＧＨｂと記す）はヘモグロ
ビンに糖が付加したものの総称であり、ヒトではＨｂ
Ａ１ａ＋ ％Ａｌａ！、Ａｌｂ及びＡｌｅの４種が知ら
れている。なかでも）ｌｂＡｌｃは、ＨｂＡＯに非酵素
的にグルコースが付加し生成するもので、その量は赤血
球寿命中の平均血糖値を定量的に反映し糖尿病患者で高
値を示す、従って、糖尿病のスクリーニングや長期血糖
値コントロールの指標としては、従来の総ＧＨｂの測定
に変わって、正確なＨｂＡｌｃの測定が重要視されつつ
ある。
ビンに糖が付加したものの総称であり、ヒトではＨｂ
Ａ１ａ＋ ％Ａｌａ！、Ａｌｂ及びＡｌｅの４種が知ら
れている。なかでも）ｌｂＡｌｃは、ＨｂＡＯに非酵素
的にグルコースが付加し生成するもので、その量は赤血
球寿命中の平均血糖値を定量的に反映し糖尿病患者で高
値を示す、従って、糖尿病のスクリーニングや長期血糖
値コントロールの指標としては、従来の総ＧＨｂの測定
に変わって、正確なＨｂＡｌｃの測定が重要視されつつ
ある。
ラットは糖尿病の実験モデル動物として頻繁に利用され
、そのＧＨｂ値は比色法、ミニカラム法、イオン交換カ
ラム法等で測定されている。しかし、こ。
、そのＧＨｂ値は比色法、ミニカラム法、イオン交換カ
ラム法等で測定されている。しかし、こ。
れらはすべてヒトＧＨｂの測定法をラットに応用して求
めた総ＧＨｂ値であり、不安定ＧＨｂをも含むため正確
さに欠ける。そのうえ測定操作が煩雑であったり、正確
な温度管理が必要だったり、測定に長時間を要するなど
の欠点があり、ラットのＨｂＡｌｃ値を迅速かつ正確に
測定する方法が必要となってきた。
めた総ＧＨｂ値であり、不安定ＧＨｂをも含むため正確
さに欠ける。そのうえ測定操作が煩雑であったり、正確
な温度管理が必要だったり、測定に長時間を要するなど
の欠点があり、ラットのＨｂＡｌｃ値を迅速かつ正確に
測定する方法が必要となってきた。
しかし、ラットのヘモグロビンは現在１０種以上あると
いわれており、それらの中から微量成分であるＡｌｅを
正確に分離定量することは非常に困難である。
いわれており、それらの中から微量成分であるＡｌｅを
正確に分離定量することは非常に困難である。
本発明者は、これら困難を克服してＨＰＬＣを用いたＧ
ＨｂＡｌｃの正確な測定法を見出し本発明を完成した。
ＨｂＡｌｃの正確な測定法を見出し本発明を完成した。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明の目的は、ＨＰ Ｌ Ｃを用いたＧＨｂの測定法
を提供することにある。
を提供することにある。
（問題点を解決するための手段）
本発明は、ＧＨｂ、中でもグルコースが安定して結合し
ており平均血糖値の正確な指標となるＧＨｂＡｌｃを迅
速かつ正確に測定する方法である。
ており平均血糖値の正確な指標となるＧＨｂＡｌｃを迅
速かつ正確に測定する方法である。
本発明方法によれば、各種動物、例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル及び
ヒトなどのＨｂＡｌｃを測定できる。特に、１０種類以
上のヘモグロビンを有し測定困難であるラットのＨｂＡ
ｌｃを測定する際に最も有効である。
ス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル及び
ヒトなどのＨｂＡｌｃを測定できる。特に、１０種類以
上のヘモグロビンを有し測定困難であるラットのＨｂＡ
ｌｃを測定する際に最も有効である。
以下に本発明Ｇ Ｈｂ １ｊｌｌｌ定法について述べる
。
。
本発明測定法はＧＨｂの分析測定にＨＰ Ｌ Ｃを用い
るが、ＨＰＬＣカラムとしては弱カチオン交換カラム、
例えばシリカゲルの担体でカルボキシメチル基を交換基
とするイオン交換カラム等を利用できる。
るが、ＨＰＬＣカラムとしては弱カチオン交換カラム、
例えばシリカゲルの担体でカルボキシメチル基を交換基
とするイオン交換カラム等を利用できる。
従来法では分析困難であったラットのＧＨｂを測定可能
とするために、本発明方法においては溶出液としてリン
酸リチウム緩衝液を用いて高いＨＰＬＣ分解能を得た。
とするために、本発明方法においては溶出液としてリン
酸リチウム緩衝液を用いて高いＨＰＬＣ分解能を得た。
該緩衝液の調製は、リン酸と水酸化リチウムを適宜組合
せてｐＨを合わせ、過塩素酸リチウム、塩化リチウム等
でリチウム塩の濃度を調整する通常の方法で行うことが
できる。
せてｐＨを合わせ、過塩素酸リチウム、塩化リチウム等
でリチウム塩の濃度を調整する通常の方法で行うことが
できる。
ＨＰ Ｌ Ｃで用いるポンプ、オートサンプラー、検出
器、データ処理装置等は一般に使用されている機器の如
何なるものでも利用することができ、特に限定されるも
のではない。
器、データ処理装置等は一般に使用されている機器の如
何なるものでも利用することができ、特に限定されるも
のではない。
カラムの流速、リチウム濃度勾配、温度などは使用する
カラムの種類、試料等によって適宜設定することができ
る。
カラムの種類、試料等によって適宜設定することができ
る。
（実施例）
次に、本発明測定法を実施例により詳細に説明する。
ｆｌｌストレプトシトシン誘発高血糖ラットの作成８週
齢の一４ｓｔａｒ系雄性ラット（体重１８０−２００
ｇ ）６４匹にストレプトシトシン（ＳＴＺ）を静脈内
投与した（２０ｓ＋ｇ／ｋｇ）。その２週間後に血糖値
（２８０−３５０ＩＩｇ／ｄ１）、尿糖排泄量（３００
−８００ｍｇ１５ｈ）並びに体重が均一なもの１０匹を
選択し実験に供した。
齢の一４ｓｔａｒ系雄性ラット（体重１８０−２００
ｇ ）６４匹にストレプトシトシン（ＳＴＺ）を静脈内
投与した（２０ｓ＋ｇ／ｋｇ）。その２週間後に血糖値
（２８０−３５０ＩＩｇ／ｄ１）、尿糖排泄量（３００
−８００ｍｇ１５ｈ）並びに体重が均一なもの１０匹を
選択し実験に供した。
またマウスの場合は、体重３０−４０ ｇのｄｄＹ系雄
性マウスにＳＴＺを１２５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与してＳ
ＴＺ高血糖マウスを作成した。
性マウスにＳＴＺを１２５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与してＳ
ＴＺ高血糖マウスを作成した。
（２）試料の調製
ラント尾静脈より採取した血液５０ｐｌを、水酸化バリ
ウム−硫酸亜鉛法により除蛋白した上清を用いてムタロ
ターゼＧＯＤ法により血糖値を測定した。
ウム−硫酸亜鉛法により除蛋白した上清を用いてムタロ
ターゼＧＯＤ法により血糖値を測定した。
ＧＨｂ測定用試料は以下のようにして調製した。
採血後、直ちに１０倍容の０．１％ＥＤＴＡ−２Ｎａを
含む生理食塩水と混和し、４℃で遠心分離した。沈澱と
して得られた血球に１０倍容の０．１％トリトンＸ−１
００及び０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１ｋＭ トリ
ス塩酸緩衝液ｐＨ８，７（ラットヘモグロビンの沈澱を
防ぐため）を加えて溶血させた。本発明測定法には本溶
血液を４倍希釈したものを用いた。
含む生理食塩水と混和し、４℃で遠心分離した。沈澱と
して得られた血球に１０倍容の０．１％トリトンＸ−１
００及び０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１ｋＭ トリ
ス塩酸緩衝液ｐＨ８，７（ラットヘモグロビンの沈澱を
防ぐため）を加えて溶血させた。本発明測定法には本溶
血液を４倍希釈したものを用いた。
マウスの場合は、血液５０ｄを０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａを含む生理食塩水５００ｍに加え、遠心分離して血球
を得た。これに２．０−の０．１％トリトンＸ−１００
水溶液を加え溶血させ、溶血液１ｏＩＩｌを測定に供し
た。
ａを含む生理食塩水５００ｍに加え、遠心分離して血球
を得た。これに２．０−の０．１％トリトンＸ−１００
水溶液を加え溶血させ、溶血液１ｏＩＩｌを測定に供し
た。
（３１ＨＰ Ｌ ＣによるＧＨｂの測定ＨＰ Ｌ Ｃに
おいて、ポンプはＴＲＩ４０ＴＡＲ，オートサンフラー
はＡＳ−Ｌ３５０、検出器はタングステンランプ着装Ｎ
ＩＤＥＣ−１００ＶＩ、テータ処理装置ハ０５−Ｌ３０
０（以上、日本分光工業■製）、カラムは東ソー■製の
ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−２３Ｗ （４，６Ｘ ２０ｍｍ）
を用いた。カラムは恒温水槽に入れ２３℃に保った。
おいて、ポンプはＴＲＩ４０ＴＡＲ，オートサンフラー
はＡＳ−Ｌ３５０、検出器はタングステンランプ着装Ｎ
ＩＤＥＣ−１００ＶＩ、テータ処理装置ハ０５−Ｌ３０
０（以上、日本分光工業■製）、カラムは東ソー■製の
ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−２３Ｗ （４，６Ｘ ２０ｍｍ）
を用いた。カラムは恒温水槽に入れ２３℃に保った。
最初に、正常及びＳＴＺ高血糖ラットより得た溶血液を
直線濃度勾配法にて測定し、ラットヘモグロビンの多様
性による複雑なりロマトグラム部分ではなく、かつ高血
糖ラントで著しく増加していたピークを選び、該ピーク
をＧＨｂであると仮定し、より短時間で分析可能な段階
濃度勾配法による分析条件を決定した。
直線濃度勾配法にて測定し、ラットヘモグロビンの多様
性による複雑なりロマトグラム部分ではなく、かつ高血
糖ラントで著しく増加していたピークを選び、該ピーク
をＧＨｂであると仮定し、より短時間で分析可能な段階
濃度勾配法による分析条件を決定した。
溶出液（リン酸リチウム緩衝液）は、Ａ及びＢの２種を
用いた。緩衝液Ａは５０１１Ｍリン酸リチウム緩衝液（
ｐＨ５，６６）であり、Ａ液に０．２Ｍの過酸化リチウ
ムを加えた溶液を緩衝液Ｂとした。これら溶出液は正確
に試薬を秤量し調製した後、０，２２μｍのフィルター
で濾過した後使用した。
用いた。緩衝液Ａは５０１１Ｍリン酸リチウム緩衝液（
ｐＨ５，６６）であり、Ａ液に０．２Ｍの過酸化リチウ
ムを加えた溶液を緩衝液Ｂとした。これら溶出液は正確
に試薬を秤量し調製した後、０，２２μｍのフィルター
で濾過した後使用した。
ラットＧＨｂは流速０−７＋ａｌ／ｗｉｎで以下に示す
段階溶出法により分離した。
段階溶出法により分離した。
■０〜７分：緩衝液Ａ（７６％）十緩衝液Ｂ（２４％）
■７〜１０分＝Ｉｌ衝液Ｂ （１００％）■１０〜２６
分：緩衝液Ａ（７６％）十緩衝液Ｂ（２４％）溶血液１
０ｐ１を注入し、クロマトグラムは４１５ｎｍで検出し
た。
■７〜１０分＝Ｉｌ衝液Ｂ （１００％）■１０〜２６
分：緩衝液Ａ（７６％）十緩衝液Ｂ（２４％）溶血液１
０ｐ１を注入し、クロマトグラムは４１５ｎｍで検出し
た。
（作用）
上記実施例に従って、正常及びＳＴＺ高血糖ラットのＧ
Ｈｂの分析測定を行った。ＨＰＬＣクロマトグラム結果
の一例を第１図に示す。
Ｈｂの分析測定を行った。ＨＰＬＣクロマトグラム結果
の一例を第１図に示す。
第１図のピークａ ”−ｃにつき正常及び高血糖ラソト
で比較した結果を第１表にまとめた。
で比較した結果を第１表にまとめた。
第 １ 表
ピーク 保持時間 正常ラット 高血糖う７）ａ
８．９分 ０．９５％ １．４４％ｂ １
１．２分 １．７７％ １．９６％ＣＩ２．７
分 １．４８％ ３．５１％アフィニティ力ラ
ムにより調製したＧ Ｉ−１ｂ画分のＨＰ Ｌ Ｃ分析
において、ピークａ及びピークＣが溶出されたことより
これらがＧＨｂであることがＩｌｉ ｉＵされた。
８．９分 ０．９５％ １．４４％ｂ １
１．２分 １．７７％ １．９６％ＣＩ２．７
分 １．４８％ ３．５１％アフィニティ力ラ
ムにより調製したＧ Ｉ−１ｂ画分のＨＰ Ｌ Ｃ分析
において、ピークａ及びピークＣが溶出されたことより
これらがＧＨｂであることがＩｌｉ ｉＵされた。
正常ラット血球を高４度のグルコースと装置し、経時的
にＨＰ Ｌ Ｃで分析した結果、ピークａ及びＣはほぼ
一定の値であるのに対し、ピークｂはグルコースとのＭ
置により増加し、グルコースを除くことにより減少した
。以上の結果よりピークｂは不安定Ｇ Ｈｂであり、ピ
ークａ及びＣは安定ＧＨｂであると結論した。ａ及びＣ
二つのピークのうち、ピークａはピーク高が低く測定誤
差が大きいので、ビークＣ値をラットＧＨｂ値として測
定基準に定めるのが好ましい。
にＨＰ Ｌ Ｃで分析した結果、ピークａ及びＣはほぼ
一定の値であるのに対し、ピークｂはグルコースとのＭ
置により増加し、グルコースを除くことにより減少した
。以上の結果よりピークｂは不安定Ｇ Ｈｂであり、ピ
ークａ及びＣは安定ＧＨｂであると結論した。ａ及びＣ
二つのピークのうち、ピークａはピーク高が低く測定誤
差が大きいので、ビークＣ値をラットＧＨｂ値として測
定基準に定めるのが好ましい。
同様の方法により、正常及びＳＴＺ高血糖マウスのＧＨ
ｂのＨＰ Ｌ Ｃクロマトグラムを比較した。グルコー
スとのり９置による増減を調べ、不安定ＧＨｂのピーク
を検出して除外し、ラットの場合と同様にＧＨｂの指標
となる安定ビークを定めることができた。
ｂのＨＰ Ｌ Ｃクロマトグラムを比較した。グルコー
スとのり９置による増減を調べ、不安定ＧＨｂのピーク
を検出して除外し、ラットの場合と同様にＧＨｂの指標
となる安定ビークを定めることができた。
（効果）
ストレプトヅトシン投与より６週目がらインシュリン２
０単位／ｋｇを１日１回、また９週目がら１日２回投与
し、血糖値及びＧＨｂ値を経時的に測定した（第２図）
。
０単位／ｋｇを１日１回、また９週目がら１日２回投与
し、血糖値及びＧＨｂ値を経時的に測定した（第２図）
。
第２図からも明らかのように、血糖値は採血時間、生理
条件などで変化するため誤差が大きく、インシュリンの
血糖低下作用が正確に観察できない。即ち、−日の間で
食事等の影響により血糖値は激しく変化するため、平均
的な値を得るのは困難である。しかし、ＧＨｂ値（ピー
クＣ）を指標にする本発明測定法によれば、インシュリ
ンの経時的な治療効果が少ない誤差で明らかにすること
ができた。
条件などで変化するため誤差が大きく、インシュリンの
血糖低下作用が正確に観察できない。即ち、−日の間で
食事等の影響により血糖値は激しく変化するため、平均
的な値を得るのは困難である。しかし、ＧＨｂ値（ピー
クＣ）を指標にする本発明測定法によれば、インシュリ
ンの経時的な治療効果が少ない誤差で明らかにすること
ができた。
ヒトにおける糖尿病治療の指標として古くは血糖値や尿
糖値が用いられた。しがし、様々な生理条件により大き
く変化するこれらの値に変わって、インシュリン量や総
ＧＨｂ値へと、そしてさらに正確なＨｂＡｌｃの測定が
用いられるようになってきた。ヒトにおけるこの様な変
化に伴い、動物を用いた実験糖尿病の研究においても総
ＧＨｂ値の測定が多くなされるようになってきた。しか
しながら、その測定には迅速性、不安定ＧＨｂを含むこ
とによる正確さの点で問題がある。
糖値が用いられた。しがし、様々な生理条件により大き
く変化するこれらの値に変わって、インシュリン量や総
ＧＨｂ値へと、そしてさらに正確なＨｂＡｌｃの測定が
用いられるようになってきた。ヒトにおけるこの様な変
化に伴い、動物を用いた実験糖尿病の研究においても総
ＧＨｂ値の測定が多くなされるようになってきた。しか
しながら、その測定には迅速性、不安定ＧＨｂを含むこ
とによる正確さの点で問題がある。
本発明測定法は、ＨＰＬＣの工程において段階濃度勾配
法を適用したため、所要時間がわずか２６分間と短時間
であり、かつ非常に簡便な方法である。本性では不安定
ＧＨｂを除外することにより、赤血球寿命中の平均血糖
値を正確に反映するＨｂＡｌｃを少ない誤差内で測定可
能とした。
法を適用したため、所要時間がわずか２６分間と短時間
であり、かつ非常に簡便な方法である。本性では不安定
ＧＨｂを除外することにより、赤血球寿命中の平均血糖
値を正確に反映するＨｂＡｌｃを少ない誤差内で測定可
能とした。
本発明測定法は、ヘモグロビンの種類が１０種以上もあ
り微量成分であるため測定困難であったラットのＡｌｃ
を測定できるものであり、糖尿病薬のスクリーニングに
おける動物実験等において非常に有用性が高い。
り微量成分であるため測定困難であったラットのＡｌｃ
を測定できるものであり、糖尿病薬のスクリーニングに
おける動物実験等において非常に有用性が高い。
又、本実施例で使用されているＨＰＬＣ用のポンプ、オ
ートサンプラー、検出器及びデータ処理装置からも明ら
かなように、カラムを除いたＨＰＬＣの機器類は全て自
動測定用のものを利用でき、本発明測定法のキット化も
極めて容易である。
ートサンプラー、検出器及びデータ処理装置からも明ら
かなように、カラムを除いたＨＰＬＣの機器類は全て自
動測定用のものを利用でき、本発明測定法のキット化も
極めて容易である。
第１図は、本発明測定法による正常及びＳＴＺ高血糖ラ
ットのＨＰＬＣクロマトグラムであり、第２図は、ＳＴ
Ｚ投与からインシュリン投与を含む期間における高血糖
ラットの血糖値及びＧＨｂ値を経時的に測定した結果を
表したグラフである。 代理人 （６８９１） 弁理士 村山佐武部男１図 保持時間（分） 伽−一−クニエ宰う・ソト ４−−−） ：インタ１９フ１８１回投、与。 →：インシュリン１日２０投与 ストレプトシトシン設与撒（還）
ットのＨＰＬＣクロマトグラムであり、第２図は、ＳＴ
Ｚ投与からインシュリン投与を含む期間における高血糖
ラットの血糖値及びＧＨｂ値を経時的に測定した結果を
表したグラフである。 代理人 （６８９１） 弁理士 村山佐武部男１図 保持時間（分） 伽−一−クニエ宰う・ソト ４−−−） ：インタ１９フ１８１回投、与。 →：インシュリン１日２０投与 ストレプトシトシン設与撒（還）
Claims (1)
- （１）高速液体クロマトグラフィーを用いたグリコヘモ
グロビンの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63129292A JP2741516B2 (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | グリコヘモグロビン測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63129292A JP2741516B2 (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | グリコヘモグロビン測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01297554A true JPH01297554A (ja) | 1989-11-30 |
| JP2741516B2 JP2741516B2 (ja) | 1998-04-22 |
Family
ID=15005968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63129292A Expired - Lifetime JP2741516B2 (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | グリコヘモグロビン測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2741516B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03102259A (ja) * | 1989-09-18 | 1991-04-26 | Hitachi Ltd | 液体クロマトグラフの方法，その装置，そのシステム，及びその分離カラム |
| JP2001349894A (ja) * | 2000-06-06 | 2001-12-21 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57135356A (en) * | 1981-02-14 | 1982-08-20 | Tadao Hoshino | Analysis of hemoglobin |
| JPS5872055A (ja) * | 1981-10-26 | 1983-04-28 | Sogo Seibutsu Igaku Kenkyusho:Kk | 血中ヘモグロビンａ↓１の簡易測定法 |
-
1988
- 1988-05-25 JP JP63129292A patent/JP2741516B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57135356A (en) * | 1981-02-14 | 1982-08-20 | Tadao Hoshino | Analysis of hemoglobin |
| JPS5872055A (ja) * | 1981-10-26 | 1983-04-28 | Sogo Seibutsu Igaku Kenkyusho:Kk | 血中ヘモグロビンａ↓１の簡易測定法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03102259A (ja) * | 1989-09-18 | 1991-04-26 | Hitachi Ltd | 液体クロマトグラフの方法，その装置，そのシステム，及びその分離カラム |
| JP2001349894A (ja) * | 2000-06-06 | 2001-12-21 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2741516B2 (ja) | 1998-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Goldstein et al. | Clinical application of glycosylated hemoglobin measurements | |
| Yatscoff et al. | Quantification of nonenzymically glycated albumin and total serum protein by affinity chromatography. | |
| JP2619537B2 (ja) | 液体クロマトグラフの方法，その装置，そのシステム，及びその分離カラム | |
| Sun et al. | Accurate measurement of stable isotopes of lithium by inductively coupled plasma mass spectrometry | |
| Manzo et al. | Poisoning by triphenyltin acetate. Report of two cases and determination of tin in blood and urine by neutron activation analysis | |
| KR20030014691A (ko) | 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청에서 알파-옥소알데히드를검출하는 방법 | |
| JP2741516B2 (ja) | グリコヘモグロビン測定法 | |
| Lange et al. | Fast method for the simultaneous determination of 2-oxo acids in biological fluids by high-performance liquid chromatography | |
| Miles et al. | Diagnostic and clinical implications of plasma and salivary melatonin assay. | |
| Shimizu et al. | Serum concentration and renal handling of 1, 5-anhydro-D-glucitol in patients with chronic renal failure | |
| Brunnekreeft et al. | Improved rapid procedure for simultaneous determinations of hemoglobins A1a, A1b, A1c, F, C, and S, with indication for acetylation or carbamylation by cation-exchange liquid chromatography | |
| Klein et al. | Application of Fe (II)-5-pyridyl benzodiazepin-2-ones to the determination of serum iron and iron-binding capacity | |
| HASEGAWA et al. | Glycated hemoglobin fractions in normal and diabetic dogs measured by high performance liquid chromatography | |
| Nakamura et al. | Clinical evaluation of the liquid-chromatographic determination of urinary free cortisol. | |
| Yoshioka et al. | Concentrations of non-glucose polyols in serum and cerebrospinal fluid from apparently healthy adults and children. | |
| Pucci et al. | Iohexol plasma clearance in determining glomerular filtration rate in diabetic patients | |
| CN115372486A (zh) | 糖化血红蛋白检测试剂盒及其应用 | |
| JP4159321B2 (ja) | 異常ヘモグロビン検出方法 | |
| Maeda et al. | Automated determination of 5-fluorouracil and its metabolite in urine by high-performance liquid chromatography with column switching | |
| Bertil et al. | Reversed-phase ion-pair liquid chromatographic procedure with electrochemical detection for the analysis of urinary thiosulphate | |
| Mishra et al. | Estimation of HbA1c and Impact of Continuous Glucose Monitoring in Hypoglycemic States | |
| Sakai et al. | Mobilized plasma lead as an index of lead body burden and its relation to the heme-related indices | |
| Sreedevi et al. | Unexpected detection of abnormal hemoglobin variants during routine HbA1c analysis by HPLC technique: Challenges and opportunities in HbA1c testing | |
| Campbell et al. | Comparison of HbA1c and glycated protein methodologies | |
| Higashidate et al. | New high-speed fully automated guanidino compound analyzer |