JPH03102259A - 液体クロマトグラフの方法，その装置，そのシステム，及びその分離カラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生体威分の液体クロマトグラフの方法及び装置
に関するものである， 特にグリコヘモグロビンの液体クロマトグラフの方法及
び装置に関するものである。

〔従来の技術〕

グリコヘモグロビンは血液中の糖がその濃度に応じて赤
血球中に入った後に，ヘモグロビンと結合して生成され
るものである。グリコヘモグロビンのうち、安定型のＡ
１ｃ　（ｓｔａｂｌｅ−Ａｔｃ　；　ｓ　−Ａ　ｓ　ｃ
　）の′濃度は過去２〜３ケ月の平均的な糖の濃度を反
映するといわれている＊８　　Ａｌｅ　　の濃度は血糖
値や尿糖値などに比べて生理的な要因に左右されにくい
ことから、糖尿病の診断や糖尿病患者の経過ａ察の指標
として用いられる。

ヘモグロビンはヘム（色素）とグロビン（タンパク質）
が結合した分子量約６４，５００　の複合タンパクであ
り，動物の体内での酸素の運搬体として重要な役割を果
している。

ヘモグロビンにグルコースなどの糖が結合すると酸素が
放出されにくくなり、末端血管や組織へ酸素が供給され
にくくなる。また，構造が固定的になり、血管の変形な
どを引き起こす．ヒトの正常ヘモグロビンとしては第１
表に示すものが知られている。健常戊人のヘモグロビン
（Ｈｂ）はＨ　ｂ　Ａｏ，　Ｈ　ｂ　Ａｘ，　Ｈ　ｂ　
Ｆからなっており，ＨｂＡｏに糖が結合したものがグリ
コヘモグロビンＧＨｂ（ＨｂＡｚ）である。Ｇ　Ｈ　ｂ
　（ＨｂＡ　１）はヘモグロビンのアミノ酸構造やヘモ
グロビンに結合する糖の種類が異なる，Ａ１ａ，Ａ１ｂ
，Ａｔｃなどで構威されている。グリコヘモグロビンの
中で量的に一番多いのが，β鎖のＮ末端にグルコースが
結合したＡ　Ｉ　Ｃ　　である。

Ａ　１　ｃ　　の生成は非酸素的に２段階の反応を経て
行われる。すなわち、１段階目の反応では生或したＡ　
ｉ　ｃ　　の一部が可逆反応によりグルコースとヘモグ
ロビンに戻る。いわゆる不安定型Ａｚｃ（ｌａｂｉｌｅ
　−　Ａ　ｌｃ　；　Ｑ　−　Ａ　ｔ　ｃ　）が生或す
る。それに対して、２段階目の反応は不可逆反応であり
、安定型Ａｒｃ　（ｓ−Ａｔｃ）が生或する。

糖尿病の指標として、Ｈ　ｂ　Ａｌｌ　Ａｌｅ　＊　ｓ
　−Ａ　ｓ　ｃ　　などが用いられているが、より正確
な指標としては，安定型ＡＩＣ　（Ｓ−Ａｔｃ）を測定
することが望ましい． グリコヘモグロビン，ヘモグロビン，ヘモグロビンの誘
導体を分ける方法としては、その電気的性質の差により
分ける方法が多く、電気泳動法，イオン交換クロマトグ
ラフィ法などがある。また，高速液体クロマトグラフィ
法に基づくものもある．ｓ　−　Ａ　１　ｃをＱ　−　
Ａ　ｔ　ｃと分けて測定する方法として，（１）あらか
じめ前処理によってＱ−Ａ　１ｃ　　を除去する方法、
（２）分離カラムでＳ−Ａ　ｌｃとＱ　　Ａｌａをクロ
マト的に分離，検出する方法の２通りの方法がある． 前処理によってＱ　−　Ａ　ｔ　ｃ　　を除去する方法
として、赤血球を生理食塩水あるいはセミ力ルバジドと
アニリンを含む緩衝液でふ置する方法（スペセン他、ダ
イアベトロジア，　Ｐ．　Ａ．　Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，ｅ
ｔ．ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１　９　，　
１　３　０　（　１　９　８　ｏ）；ナタン他、クリニ
カルケミストリー，　Ｄ．Ｍ．Ｎａｔｈａｎ，ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｃ１ｉｍ．Ｃｈｅｍ．，２　８，　　５　１　２
　　（１　９　８　２）　）がある。これらの方法は前
処理が煩雑であったり，処理に３０分〜４時間を要し、
迅速性の点で問題があった。また、市販の専用機ではオ
ンラインのＱ　−　Ａ　１　ｃ　除去機構を備えている
。市販の氾一Ａ　ｌｃ　除去試薬を血液に加え、５０゜
Ｃで１〜２分加熱し、処理時間の短縮を図っている（高
橋他，日本臨床検査自動化学会会誌，１２，１３３（１
９８７））．Ｌかし、このような加熱処理ではタンパク
が変性して沈殿が生ずることなどにより，配管やフィル
タが詰まるという問題点がある。

一方、分離カラムで党−Ａ　１　ｃとｓＡ１ｃを分ける
方法としては、シリカが基材でカルボキシル基をイオン
交換基とする充填剤を用いる方法、ポリビニルアルコー
ル系の多孔性樹脂からなる充填剤を用い″る方法などが
ある。また、市販の専用機でも、Ｑ　　Ａ１ｃとｓ　　
Ａｈａの分離が可能である。

シリカが基材でカルボキシル基をイオン交換基とする充
填剤を用いる方法では、ヘモグロビンをＡｘａ，Ａｔｂ
，ＨｂＦ，Ｑ−ＡＩＱ，Ｓ−Ａｔｅ，ＨｂＡｏの各成分
に分けるのに約２０分と長い時間を要している（特開昭
６３　−　７５５５８号公報）。

ポリビニルアルコール系の多孔性樹脂からなる充填剤を
用いる方法では、ヘモグロビンをＡ　ｌａ　，Ａｚｂ，
ＨｂＦ，Ｑ　　Ａ１ｃ，ｓ　　Ａｔｅ，ＨｂＡｏの各成
分に分けるのに約６０分と長い時間を要している（星野
他、第３■回　液体クロマトグラフ研究会講演要旨集，
Ｎｏ２９，１７５（１９８８））。

また，ビニルアルコール系の共重合体を充填剤として用
いるもう一つの方法では、約２５分で此−Ａｚａ，Ｓ−
ＡＩＣ，ＨｂＡｏを分けている。しかし、この方法では
Ａ１ａ，Ａｔｂ，ＨｂＦ成分は明らかではない（特開昭
６０−　２１３８６３号公報参照）。

これらの充填剤の詳細については明らかにされていない
が、充填剤の粒径，比表面積，交換容量などの充填剤物
性が最適化されていないために、各成分の分離が完全で
なかったり、分離に長い時間を要するものと考えられる
． 従来のグリコヘモグロビン分析装置では、ヘモグロビン
をＡｒａ　，　Ａｘｂ　，　Ｈ　ｂ　Ｆ　，　Ａｔｅ　
，Ｈ　ｂ　Ａ　ｏの５成分に分離するのに３．５分、Ａ
１ａ　，Ａ１ｂ，ＨｂＦ，Ｑ−Ａｔｅ，ｓ−Ａｓｃ，Ｈ
ｂＡｏの６ＩＩｊ．分に分けるのに８分要している（高
橋他，日本臨床検査自動化学会会誌，よ２，１３３（１
９８７）），なお，人によってはＡｚａ，Ａ１ｂ，Ｈｂ
Ｆ　などの含有率が少なくて検出されない場合、逆に別
のヘモグロビン誘導体が含まれている場合もあるため、
必ずしもすべての人の場合に５成分あるいは６成分に分
離されるわけで↓土ない．しかし、ここでは便宜的に５
威分及び６成分分析と示す。

上記５成分に分離するには、シリカゲル系の材料を用い
て分離カラム（φ４．６Ｘ３５ｎｍ）を用いる。一方、
上記６成分に分離する場合には同材料で寸法の異なる分
離カラム（φ４，６Ｘ１２０ｎｎ）を用いる。また、５
成分分析及び６成分分析ともに、３種類の溶離液を段階
的に分離カラムに流すステツプワイズグラジエント法に
より溶離している。なお、５成分分析と６成分分析の場
合では用いる分離カラム及び溶離液の組或が異なってい
る。

従って、５成分分析と６成分分析を連続的に行うことは
できない。たとえば５成分分析を行った後に，６ｄ分分
析を行うような場合、カラムや溶離液を交換しなければ
ならず、操作が煩雑である。

また、カラムを交換した後にはカラムを安定化させるた
めに溶離液を１０分程度カラムに流通させる必要があり
、測定に長い時間を要する。

これらのカラムに充填されている充填剤としては、通常
粒径約５μｍのシリカゲルを基材としカルボキシメチル
基を官能基として導入した充填剤が使用されている。

粒径５μｍレベルの充填剤をφ４．６　Ｘ　３　５ｎｍ
の大きさカラムに充てんした分離カラムでは，上記５成
分を分離することはできる。しかし、６成分を分離する
のにはこのサイズ（長さ）のカラムでは，分離性能的に
不十分であり、φ４．６Ｘ１２０閣とより長い分離カラ
ムを用いなければならい。

なお、分離性能（分離度Ｒｓ）はカラム長さの平方根に
比例してよくなる（分離度Ｒｓの値が大きくなる）．こ
のようにカラム長さを長くすると分離性能は改善される
が、カラムが長くなった分だけ分析に要する時間が長く
なる。また、カラムの圧力損失が大きくなり，カラムの
寿命，ポンプのシールの寿命などに影響を与える。

以上のように，従来の方法ではヘモグロビンをＡｘａ，
Ａ１ｂ，ＨｂＦ，Ｑ−Ａｌｃ，Ｓ−Ａｌｅ，ＨｂＡｏの
６成分に分離するのに８分から６０分と長い時間を要し
ており、分析時間の点で問題があった． また、従来の方法では１本の分離カラムで５成分分析（
ヘモグロビンをＡｌａ　，　Ａ工ｂ　，　Ｈ　ｂ　Ｆ　
，Ａ　ｌｃ　Ｈ　Ａ　ｏに分離）及び６成分分析（ヘモ
グロビンをＡ　ｓ　ａ　＊　Ａ　１　ｂ　ｔ　Ｈ　ｂ　
Ｆ　ｔ　Ｑ　　Ａ　１　ｃ　＋　　ｓ　一Ａｌｅ，Ｈｂ
Ａｏに分離）の２種類の威分分析には対応できなかった
。すなわち、Ｓｔｃ分分析と６成分分析とを連続的に行
うことができず、操作の簡便性や迅速性の点で問題があ
った． 〔発明が解決しようとする課題〕 上記従来技術は安定型Ａｘｃ　（ｓ−Ａｔｅ）を他のＨ
ｂ成分（Ａｘａ，Ａｔｂ，ＨｂＦ，Ｑ　　Ａ１ａ，Ｈｂ
Ａｏなど）と分離して測定するのに長い時間を要すると
いう問題があった。

また，ヘモグロビンをＡｔａ，Ａｔｂ，ＨｂＦ，Ａｓｃ
，ＨｂＡｏの５成分とＡ１ａ，Ａｔｂ，ＨｂＦ，Ｑ−Ａ
ｓｃ，ｓ−Ａｘｅ，ＨｂＡｏの６成分に分ける場合には
，単一の分離カラム及び同一組成の溶離液を使用できず
、分離カラムや溶離液を交換しなければならず、操作が
煩雑であるという問題があった．また，分離カラムや溶
離液の交換などに時間がかかるという問題があった。ま
た、経済性という点でも問題があった。

本発明の目的は，安定型Ａｚｃ　（ｓ−Ａ１ｅ）を他の
ヘモグロビン成分と短い時間で分離定量する方法及びそ
の際使用される装置を提供することにある． また、本発明の他の目的は、同一のカラム及び溶離液を
用いて、上記５成分分析及び６成分分析を連続的に行う
方法及びその際使用される装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段ゴ 上記目的を達或するための、本発明の特徴は、官能基を
導入した多孔性物質をイオン交換体とした充填剤を充填
した分離カラムと，分離カラムに試料を注入する手段と
、分離カラムに溶離液を流通させる手段と、ヘモグロビ
ン，ヘモグロビン誘導体又はグリコヘモグロビンを検出
する手段とを具備し，充埴剤の乾燥状態での平均粒径が
４μｍ以下である液体クロマトグラフ装置又は，上記分
離カラムを用いた液体クロマトグラフの方法にある。

さらに、充填剤の乾燥状態での比表面積が１０〜１００
ｍ２／ｇ，充填剤の乾燥重量／ｇ当たりの交換容量が０
．１〜１　ｍｅｑであることを特徴とする。

また、官能基は、カルボキシアルキル基であることを特
徴とする。さらにまた、溶離液としてｐＨ５．０〜７．
０の緩衝液を用いることを特徴とする。

また、連続して異なるタイプの分析（例５成分分析，６
成分分析）を実施できる液体クロマトグラフシステムに
構或することを特徴とする。

〔作用〕

充填剤の乾燥状態の平均粒径を４μｍ以下と微粒化する
ことによって分離性能が向上でき、それだけ短いカラム
が使用できるので分析時間の短縮が可能である． 充填剤は原料により、無機系ポリマ充填剤と有機系ポリ
マ充填剤とに分けられる．無機系ポリマ充填剤としては
シリカゲルを母材とするものが広く使われている。

シリカゲルは材料の性質上、微粒化しても耐圧性の点で
はそれほど問題がない。一方、有機系ボリマ充填剤では
微粒化することによってカラムの圧力損失が大きくなる
と、充填剤が圧力によって変形し、分離性能が低下する
。このように分離性能が低下するのは充填剤が圧力によ
って変形し，カラム内での充填剤の充填状態が変化する
ことなどによる。

カラムの圧力損失は充填剤の比表面積，細孔径などの物
性が一定の場合、粒径の２乗に反比例して増大する。従
って、とりわけ有機系ボリマの場合には充填剤自身の耐
圧性すなわち機械的強度を向上させるとともに、カラム
の圧力損失を低減させる、すなわち透過性を高めること
が必要である．本発明では、分離性能，耐圧性（機械的
強度），透過性の点ですぐれているグリコヘモグロビン
分析用の充填剤を提案し，高性能分離カラムに必要とさ
れる充填剤の粒径、さらには，比表面積，官能基の種類
，官能基の導入量すなわち交換容量などの物性の望まし
い範囲を明らかにした。

本発明の分析方法及び装置で使用している分離カラムは
、物性を最適化した充填剤を用いているため、従来のカ
ラムに比べて分離性能，耐圧性，透過性などの点で優れ
ている。分離性能の点で優れているので、より短いカラ
ムを使用でき，分析時間を短縮できる。また、溶離液の
組成や溶離条件を変えることにより（溶離液の種類は変
えなくてもよい）、１本のカラムで前述したような５成
分分析及び６成分分析に対応できる。また、透過性及び
耐圧性の点で優れているので、長時間安定に使用できる
． 従って、このような分離カラムを用いた本発明のグリコ
ヘモグロビンの分析方法及び装置では、迅速，安定かつ
容易（簡便）にグリコヘモグロビンを分析できる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。

本発明の分離カラムとしては、乾燥状態での平均粒径が
４μｍ以下、比表面積が１０〜１００ｍ／　ｇ　＋交換
容量が０．１〜ｌＩＩＩｅｑ／ｇである無機あるいは有
機多孔性物質に官能基を導入した充填剤を充填したもの
をあげることかでざる。また、本発明に使用する分離カ
ラムとしては種々のものをあげることができるが、好ま
しくはカルボキシアルキル基を有する充填剤を充填した
ものであり、さらに好ましくはカルボキシメチル基を有
する充填剤を充填したものが好適に使用される。

充てん剤としては無機及び有機多孔性物質を母材とする
ものが用いられる．多孔性物質としては液体クロマトグ
ラフィによりグリコヘモグロビン，ヘモグロビンなどを
分析する際一般に用いられるものを用いることができる
。例えば、無機系多孔性物質としてはシリカゲル、有機
系多孔性物質としてはメタクリレート系ポリマ，ビニノ
レアルコール系ポリマ，スチレンジビニルベンゼン系ポ
リマなどをあげることができる。

充填剤の粒径に関しては、無機あるいは有機多孔性物質
について走査型電子顕微鏡写真を撮影したり，コールタ
ーカウンタ法により粒径を測定して、目的の粒径になっ
ていることを確認した。充填剤の比表面積をＢＥＴ法に
より測定した。また、充填剤の交換容量の測定は通常行
われている従来公知の方法に準じて行った。

本発明のカラムとしては、内径１〜８　ｍｍ　，長さ２
０ａ＋＋以下、好ましくは内径１〜６ｍｍ，長さ２〜１
０ｃｍの円筒形のものが望ましい。

カラムへ充填剤を充填する方法は、均一な状態に充填で
き、充填率を制御できる方法であれば従来公知の方法で
よい。充填率の制御は充填時の溶媒の送液流量を充填開
始時より時間経過に従って増大させることなどによって
行われる。

分離カラムにグリコヘモグロビン、ヘモグロビン及び／
又はその誘導体を吸着させ，次いで溶離液を流通させて
グリコヘモグロビンなどを分離することにより液体クロ
マトグラフィをおこなう。

溶離液としてはｐＨ５．０〜７．０の緩衝液であれば、
通常グリコヘモグロビンを液体クロマｌ−グラフイで分
析するときに用いられる溶離液でよい。

例えば、酢酸ナトリウム系，リン酸ナトリウム系，リン
酸カリウム系のような緩衝液，あるいは塩化ナトリウム
や硫酸ナトリウムのような塩を含む液が用いられる．な
お、尿素やグアニジンを添加してもよい．また、アセト
ニトリル，エタノール，メタノール，メルカプトエタノ
ール等の有機溶媒を混合してもよい。

溶離液の組成、例えば緩衝剤，塩，尿素，有機溶媒等の
濃度やｐＨは，液体クロマトグラフィによりグリコヘモ
グロビン，ヘモグロビン等を分析する際、必ずしも一定
である必要はない。例えば、連続的勾配方式あるいは段
階的勾配方式によって変化させることもできる６また，
溶離液の送液流量も一定である必要はなく、時間経過に
従って連続的あるいは段階的に変化させることができる
．本発明の分離カラムにより分離された溶出液中のグリ
コヘモグロビン，ヘモグロビン及びヘモグロビンの誘導
体は波長４１５ｎｍの可視光の測定することにより検出
でき、分離・定量を容易に行うことができる。

次に本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、
本発明のその要旨を越えない限り、以下の実施例により
、何等の限定を受けるものではない。

（実施例１，比較例１〜２） 充填剤としては、メタクリレート系ボリマを母材とし、
これに官能基としてカルボキシメチル基を導入した充填
剤を使用した。

第２表に本実施例の充填剤の物性及び圧力損失を測定し
た結果を示す。

実施例１の充填剤は３．５±０．５μｍ，比表面積２０
ｒｄ／ｇ，交換容量０．２８ｍｅｑ／ｇである。

比較例１の充填剤は実施例１と比表面積及び交換容量の
値がほぼ一定で平均粒径が５μｍになるように合成した
ものである。

比較例２の充填剤は多孔性物質でないものであり、物理
的に細孔をあけていない（すなわち，マクロボーラスを
有さない）ものであり，比表面積の値が小さい。粒径は
３．５±０．５μｍであり、実施例１と等しい。比表面
積は５　ｍ　／　ｇであり、実施例１の充填剤に比八で
小さい。実施例↓と同様の方法でカルボキシメチル基を
導入した。比較例２はマクロボーラスを有さす、比表面
積が小さいので、交換容量が０　．０　１　ｒｎｅｑ／
　ｇとカルボキシメチル基の導入量を少なかった。

これら３種の充填剤を各々カラムに充填して分離カラム
とした。実施例１，比較例１の充填剤については、内径
４．６ｍｍ，長さ３５＋ｓ＋のステンレスカラムに充填
した。一方、比較例２の充填剤については、充填剤の比
表面積，交換容量が小さく、試料との接触面積が小さい
ので，内径７．５ｎｗｎ，長さ７５＋＋ｎ＋と大きなカ
ラムに充填した。

充填はいずれもスラリー法によった。スラリー溶媒及び
充填溶媒としては、８０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．２０）を使用し、充屓圧力１５０ｋｇｆ／ｃｌｆ
にて充填溶媒を１時間送液した。

試料としては抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム塩を添加して採血した正常成人の新鮮血を用い
た．この新鮮血に市販の溶血剤を加えて２００倍に希釈
した。この溶血液２０μＱを測定試料として用いた． 溶離液としてはリン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）及び
リン酸二カリウム（ＫｚＨＰＯ番）を下記濃度になるよ
うに脱塩水に溶解したものを使用した。

ａ液：　　　３　３ｍＭ　　　ＫＨｚＰＯ＋７ｍＭ　　
ＫｚＨＰＯ＋ ｐＨ　　６．２ ｂ液：　１　６　０ｍＭ　　ＫＨｚＰＯａ４０ｍＭ　　
ＫｚＨＰＯａ ｐＨ　　６．１ 実験装置としては、ポンプには日立製Ｌ　−　６２００
形インテリジェントポンプ，インジェクタは容量２０μ
Ｑ、検出器には日立製Ｌ−４　２　０　０形ＵＶ一ｖｒ
ｓ検出器、データ処理装置には日立製Ｌ一２５００形デ
ータ処理装置を使用した。

カラム温度は２５℃，検出波長は４１５ｎｍで分析を行
った。各成分の分離は下に示すようなリニアグラジエン
ト法によった． ａ液／ｂ液＝１００／Ｏ　（体積比） 溶離液流量：１．ＯｍＱ／ｗｉｎ 実施例１及び比較例１〜２のカラムについての圧力損失
ΔＰの測定値を第１表に示した。これらノ値ハ、第１液
（ａ液／ｂ液＝１００／Ｏ）　を流量１．０ｍｆｌ／■
ｉｎで送液したときの値である。

比較例１では充填剤の粒径が５μｍと大きいため、他の
例に比べてΔＰの値が約１／２と小さかった。実施例１
，比較例２より，粒径が一定の場合交換容量の小さな充
填剤の方がΔＰが小さい傾向がみられた（実施例ｌ一交
換容量；Ｑ．２８ｍｅｑ／　ｇ　ｅΔＰ　：　４　５ｋ
ｇｆ／ａ＃，比較例２一交換容量：０．０１Ｉｌｅｑ／
ｇｔΔｐ　：　４　０ｋｇｆ／ａＪ）。

上記の分析条件により，実施例１，比較例１〜２により
得られたクロマトグラムをそれぞれ第１図〜第３図に示
す． 第１図において、ビークｌがＡ１ａ　　ｔピーク２がＡ
ｚｂ，ビーク３がＨｂＦ，ピーク４が不安定型Ａｓａ　
ＣＱ−Ａｔｅ）ｙピーク５が安定型Ａｘｅ（ｓ−Ａｒｃ
），ピーク６がＨｂＡｏである。

各ピークの同定は以下のように行った．血液と糖誘導体
とをふＩ！（インキュベート）することにより，種々の
グリコヘモグロビンを生成させることができることがわ
かっているので、このとき増大したピークを確認するこ
とにより，各ピークの同定が可能である．フルクトース
−１，６−ニリン酸（Ｆ−１．６−ＤＰ），グルコース
ー６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）添加によりＡｌａ　　（ピ
ーク１）を、ピルビン酸添加によりＡｒｂ（ピーク２）
を確認した．また、血液にグルコースを添加し、インキ
ユベートした後に試料を調製して測定したところ，ビー
ク４が顕著に増大したこと，また、生理食塩水中で同様
にインキュベート後測定したところ、ビーク４は減少し
たが、ピーク５は変化がなかったことから，ピーク４が
ＱＡｌｃ　　であり、ビーク５がｓ−Ａｚｃ　　がある
と同定した．また、ピーク３は謄帯血の主威分と同じ挙
動を示す（同一位置に溶出される）ことからＨｂＦであ
ると同定した。

第２図（比較例１）において、ピーク７は（Ａｘａ＋Ａ
ｔｂ）−　ビーク８は（　Ｈ　ｂ　Ｆ　＋　Ａ　１　ｃ
　）　，ピーク６はＨｂＡｏの存在を示す。各ピークの
同定は実施例１と同様の方法で行った。

比較例１では使用している充填剤の平均粒径が５μｍと
大きいので、実施例１に比べて各ヘモグロビン成分の分
離が悪い。すなわち，比較例１のカラムではＡ　１　ｃ
　　をＨｂＦと分離することができない．また、Ａ　１
　ａとＡ　ｔ　ｂも同一位置に溶出され，分離できない
． 第３図（比較例２）において、ピーク１はＡ１ａ，ピー
ク２はＡ１ｂ　　ｓ　ピーク８は（Ｈ　ｂ　Ｆ　＋Ａｔ
ｃ　）　，ビーク６はＨｂＡｏを示す．各ピークの同定
は実施例１と同様の方法で行った。

多孔性物質を用いない比較例２では使用してぃるカラム
のサイズがφ７．５ｍＸ７５ｍであり、実施例１に比べ
て大きい（カラムの体積で５．７倍、カラムの長さで２
．１倍）。一般的に長いカラムを用いることにより分離
を改善できる。比較例２では大きなカラムを用いている
にもかかわらず．ＡＬＱ　　をＨｂＦと分離することが
できない．また、Ａ１ｃ（ビーク８）とＨｂＡｏとの分
離が、実施例１でのｓ　−Ａｘｅ　　（ビーク５）とＨ
　ｂ　Ａ　ｏ（ピーク６）との分離に比べると悪い．以
上のように，比較例１〜２（第２図〜第３図）では実施
例１（第１図）に比べて、ピークがブロードである。ま
た、比較例１〜２ではヘモグロビンの各成分の分離が不
充分である。

従って、充填剤としては乾燥状態の平均粒径は，４μｍ
以下が望ましい．さらに好ましくは，１μｍ〜４μｍ，
製造容易さをかんがえると２μｍ〜４μｍが好ましい。

（実施例２） 充填剤としては、メタクリレート系ボリマを母材とし，
これに官能基としてカルボキシメチル基を導入した充填
剤を使用した。第工表に示した実施例１の充填剤をさら
に分級し、平均粒径３．２μｍの充填剤を得た。この充
填剤の粒径は３．２±０．４　　μｍ，比表面積は２１
ｍ２／ｇ、交換容量はＱ．２８ｍｅｑ／ｇであった。

分級後の充填剤を内径４．６ｍ、長さ３５ｍｍのステン
レスカラムに充填して分離カラムとして用いた。充填は
スラリー法によった。スラリー溶媒及び充填溶媒として
は、８０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２０）を
使用した。充填溶媒を充墳圧力１５０ｋｇｆ／ａＪにて
１時間送液した。

上述した分離カラムを用い、高速液体クロマトグラフィ
により、グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを分析し
た。

試料としては抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム塩を添加して採血した正常成人の新鮮血を用い
た。血液に市販の溶血剤を加えて、２００倍に希釈した
。この溶血液２０μａを測定試料として用いた． 溶離液としてはリン酸一カリウム（　Ｋ　ＨｚＰ　Ｏ　
４）及びリン酸二カリウム（　Ｋ　２．Ｈ　Ｐ　Ｏ　ａ
）を下記濃度になるように脱塩水に溶解したものを使用
した。

Ａ液：　　３３ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４ ７ｍＭ　　ＫｚＨＰＯｎ ｐＨ　　６．２ Ｂ液：　　６　６　ｍ　Ｍ　　Ｋ　Ｈ　ｚ　Ｐ　Ｏ　４
１４ｍＭ　　　ＫｚＨＰＯ＜ ｐＨ　　６。２ Ｃ液：１６０ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４ ４　０　ｍＭ　　　Ｋ２Ｈ　Ｐ　Ｏａ ｐＨ　　　６．１ 実験装置としては、ポンプには日立製Ｌ−６２００形イ
ンテリジェントポンプ，インジエクタは容量２０μ（と
じ、検出器には日立製Ｌ−４２００形ＵＶ−ＶＩＳ検出
器，データ処理装置には日立製Ｌ−２５００形データ処
理装置を使用した。

カラム温度は２５℃，検出波長は４１５ｎｍで分析を行
った．各成分の分離は下に示すようなステツプワイズグ
ラジエント法に依った。

第ｌ液：Ａ液　　　　　　　　　　０〜０．２分第２液
：Ａ液／Ｂ液＝５０／５０　　０．３〜１．５分第３液
：Ｃ液　　　　　　　　１．６〜１．９分第４液：Ａ液
　　　　　　　　　２．０〜３．５分溶離液流量：　１
．２ｍｍ／ｗｉｎ カラムの圧力損失ΔＰ　：　６　５ｋｇｆ／ｃｄ上記の
分析条件により得られたクロマトグラムを第４図に示す
． ビーク１がＡ　１　ａ、ピーク２がＡ１ｂ．　　ピーク
３がＨｂＦ．ビーク４が不安定型Ａ　ｔ　ｃ　（党一Ａ
ｔｅ）．ビーク５が安定型Ａｘｅ　（ｓ−Ａｔｅ）　、
ピーク６がＨ　ｂ　Ａ　ｏである．各ピークの同定は実
施例１に示した方法に従った。

このように血液中のヘモグロビンをＡｈａ，Ａ　ｓ　ｂ
　，　Ｈ　ｂ　Ｆ　，　Ｑ　−　Ａ　ｔ　ｃ　，　ｓ　
−　Ａ　Ｉ　Ｃ　Ｉ　Ｈ　ｂ　Ａ　ｏの６成分に高速か
つ良好に分離できた。

（実施例３） 実施例２と同じ分離カラム及び装置を用いて、グリコヘ
モグロビン及びヘモグロビンを測定した。

試料は実施例ｌと同じものを使用した。各成分の分離は
下に示すようなステツプワイズグラジエント法に依った
。使用する溶離液は実施例１と同じであり，グラジエン
トのプログラムのみ実施例１と異なる。

第１液：Ａ液　　　　　　　　０−０．１分第２液二Ｂ
液　　　　　　　０．２〜１．０分第３液：Ｃ液　　　
　　　　１．１〜１．３分第１液：Ａ液　　　　　　　
１．４〜２．５分溶離液流量：１．２ｍＱ／ｗｉｎ カラムの圧力損失：６５ｋｇｆ／ａｊ これ以外の測定条件は実施例１に従った．上記の分析条
件により得られたクロマトグラムを第５図に示す。

ピーク１がＡ１ａ、ピーク２がＡ　１　ｂ、ピーク３が
ＨｂＦ、ピーク９がＡＪｃ　（４１−Ａｔｃ＋ｓＡｚｃ
）．ピーク６がＨ　ｂ　Ａ　ｏである。

各ピークの同定は実施例工に示した方法に従って行った
。

本方法の場合、Ｑ−ＡＩＱとｓ−．Ａｔｃはクロマト的
に分離されず、Ａｘｃ　のｌつのピークとして検出され
る。しかし，分析時間は実施例２よりもさらに短い．事
実、この５成分分析により、糖尿病の健診や治療の指標
としている施設も多い。

このように本法は血液中のヘモグロビンをＡｌａ，Ａｘ
ｂ，ＨｂＦ，Ａ１ｅ，ＨｂＡｏの５成分に高速かつ良好
に分離できる方法であることがわかった。

（実施例４） 実施例２と同じ分離カラム及び装置を用いて、グリコヘ
モグロビン，ヘモグロビン，ヘモグロビンの誘導体を分
析した．試料は実施例１と同じものを使用した．各成分
の分離は下に示すようなリニアグラジエント法に依った
。溶離液は実施例２のＡ液とＣ液を使用した． Ａ液／Ｃ液＝１００／Ｏ　（体積比） 溶離液流量：１．０ｍＱ／ｗｉｎ カラムの圧力損失ΔＰ＝５５ｋｇｆ／ｃｄこれ以外の測
定条件は実施例２に従った。

上記の分析条件により得られたクロマトグラムを第６図
に示す。

ビーク１がＡ　ｔ　ａ、ピーク２がＡ　ｓ　ｂ、ピーク
３がＨｂＦ、ビーク４がｎ　　Ａ１ａ、ピーク５がＳ−
Ａ　ｌｃ、ピーク６がＨｂＡｏである。

各ピークの同定は実施例１に示した方法に従い行った。

上述した以外のピークに関しては以下に示すような物質
であると推測される。

ヘモグロビンに薬物などが結合したもののピークはＡｓ
ｂ（第６図のピーク２）付近に、ヘモグロビンにアスピ
リン，ビタミンＢｅが結合したもののピークはＡ１ｃ（
第６図のピーク４及びピーク５）付近にあらわれる。ま
た、ヘモグロビンの分解物のピークがＡｗｅ（第６図の
ピーク４及びピーク５）とＨｂＡｏ（第６図のピーク６
）との間にあらわれる。ヘモグロビンＳやヘモグロビン
Ｃなどの異常ヘモグロビンはＨｂＡｏ（第６図のピーク
６）の後にあらわれる。

このように本方法は血液中のヘモグロビンをより細かく
分けることができる。従って、より正確なｓ−ＡｌＧ　
　の測定が可能である．また、ヘモグロビン，グリコヘ
モグロビン，ヘモグロビン誘導体，異常ヘモグロビンな
どについての情報を得ることもできる． 従来、このような詳細なクロマトグラムを得るには分析
に１時間程要していた（星野他：第３１回液体クロマト
グラフ研究会講演要旨＠　　Ｎｃｉ２９（１９８８））
。本方法では分離カラムの充填剤などを工夫することに
より７分と従来の１／８以下の時間で分析できる． なお、グラジエントの傾きをさらにゆるやかにすること
により、分析時間は長くなるが、より精密な分析を行う
ことも可能である。

以上述べてきたように、本発明のカラムでは、同一の分
離カラムを用い、同一の溶離液で、グラジエントのプロ
グラムを変えるだけで実施例２〜４（第４図〜第６図）
に示したような分析が可能である． 従って、あらかじめ複数個のグラジエントのプログラム
を入力しておけば、測定したいプログラムをスイッチに
より選択することにより、実施例２〜４（第４図〜第６
図）に示したような６成分分析，５成分分析及び多成分
分析（精密分析）を連続して行うことが可能である． このように、分離カラムや溶離液を交換しないで５成分
，６成分，多成分分析などを行えるので、分離カラムや
溶離液を交換するという手間がかからない。また、１本
の分離カラムですむのでコストの低減も図れる． ここで実施例２の分析方法での測定値と実施例３の分析
方法での測定値の比較を行った．試料としては正常或人
及び糖尿病患者の抗擬固剤の入った新鮮血を溶血剤で希
釈したものを用いた。

６０例について測定した結果を第７図に示す。

第７図の横軸は実施例２に示した方法により測定した党
一Ａ　１　ｃ　の濃度（％）とＳ　−ＡＩＱ　　の濃度
（％）を足した値を、たて軸は実施例３に示した方法に
より測定したＡ　ｌｃ　　の濃度（％）を示す。

実施例２の方法と実施例３の方法の相関係数γは０．９
９４　　であった．また、相関式は実施例１の方法をＸ
、実施例２の方法をＹとした場合、Ｙ＝１．０３４Ｘ−
０．３１０で示され、２つの方法の間で非常によい相関
が得られた。

このように実施例の方法は血液中のヘモグロビンを精度
良く分析できる方法であることがわかる。

すなわち、６成分分析の場合のように分析成分数が増加
しても精度よく測定できることがわかる。

（実施例５） 第８図に本発明の装置の主なシステム構或を、第９図に
装置の詳細な構成を示す。

試料としては抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム塩を添加して採血した新鮮血を用いた。この血
液を市販の溶血剤で２００倍に希釈し，これを第８図及
び第９図に示したオートサンプラ１４のサンプルテーブ
ル１９にセットした。

分離カラム２５は実施例２で用いたものと同じものを使
用した。カラムサイズは内径４．６ｎｏ、長さ３５ｎｍ
であるゆカラム恒温槽（オーブン）２６の温度は３０℃
に設定した。溶離液としては実施例２に示したＡ液１１
，Ｂ液１２及びＣ液１３を用いた。第８図及び第９図中
、実線の矢印は試料又は試薬等の液体の流れを示し、鎖
線の矢印は、信号の流れを示す。

各成分の分離は、５成分分析（ヘモグロビンをＡｌａ，
Ａｚｂ，ＨｂＦ＊　Ａ１ｅ及びＡｏの５成分に分Ｗ）の
場合には、以下に示すようなステツプワイズグラジエン
トにより行った。

Ａ液：　　０〜０．１分 Ｂ液；０．２〜１．０分 Ｃ液：１．１〜１．３分 Ａ液：１．４〜２．５分 溶離液流量：１．２ｒｎＱ／ｗｉｎ サンプルテーブル１９にセットされた．試料は、吸引ノ
ズル２０と試料輸送管２１を介してシリンジｌ８によっ
て６方バルブ２３に入り、その後フィルタ２４を通り、
分離カラム２５に入る。符号２２はサンプルループであ
る。洗浄液３０は、三方バルブ１７を介して供給される
。Ａ液１１，Ｂ液１２，Ｃ液１３は、三方電磁弁１５を
介して送液ポンプ（インテリジェントポンプ）１６によ
って，分離カラム２５に供給される。分離カラム２５か
らの溶出液を検出器２７で波長４１５ｎｍ及び６９０ｎ
ｍ　（バックグランド測定用）における吸光度を測定し
た。

このグラジエント条件では、第５図に示したようにヘモ
グロビンを１サイクル２．５分でＡｘａ，Ａ　ｓ　ｂ　
ｐ　Ｈ　ｂ　Ｆ　Ｈ　Ａ　ｉｃ　，Ｈ　ｂ　Ａ　ｏの５
成分に分離できる。クロマトグラムにより．データプロ
セッサ（処理装置）２８にて、トータルのヘモグロビン
に対するＡ　ｔ　ｃ　　の割合（百分率）（％）を求め
た。

また、６成分分析（ヘモグロビンをＡ１ａ，Ａｘｂ，Ｈ
ｂＦ，ｎ−Ａｔｅ，ｓ−Ａ１ｅ，ＨｂＡｏの６成分に分
離）の場合には，以下に示すようなステツプワイズグラ
ジエントにて分析を行った。

Ａ液　　　　　　　　：　　Ｏ〜０。２分Ａ液／Ｂ液＝
５０／５０　：　０．３〜１．５分Ｃ液　　　　　　　
　：１．６〜１．９分Ａ液　　　　　　　　：２．０〜
３．５分溶離液の流量：　１　，　２　ｍＱ　／ＩＩｉ
ｎこのグラジエント条件にて分析を行った場合、第４図
に示したようにヘモグロビンを１サイクル３．５分でＡ
　ｔ　ａ　，Ａ　１　ｂ　，Ｈ　ｂ　Ｆ　ｔ　Ｑ　　Ａ
　Ｉ　Ｑ　Ｉ　Ｓ−ＡＩＱ及びＨｂＡｏの６成分に分離
できる。クロマトグラムより、データ処理装置２８にて
、トータルのヘモグロビンに対するｓ　−Ａｘｅ　　の
割合（百分率）（％）を求めた。

演算部２９は、データ処理装置の出力にもとづき，オー
トサンプラ１４，送液ポンプ（インテリジェントポンプ
）１６，三方電磁弁１５を制御する。

さらに、多成分分析の場合には、以下に示すようなリニ
アグラジエント法によった。

Ａ液／Ｃ液＝１００／Ｏ　（体積比） 溶離液流量：１．ｏｍＱ／ｌｌｉｎ その後、Ａ液を８．１　分から１０．０　分まで、流量
１　．０　ｍ　Ｑ　／ｗｉｎで送液し、カラムを初期状
態に戻した。

このグラジエント条件にて分析を行った場合，第６図に
示したようなクロマトグラムが得られる．（実施例６） 第１０図にグリコヘモグロビンの分析のフローチャート
の一例を示す。装置は実施例５に示したものを使用した
。なお，実施例５に示した５成分分析を行うときのグラ
ジエントのプログラムをプログラムの，６成分分析を行
うときのグラジエントのプログラムをプログラム■、多
成分分析を行うときのグラジエントのプログラムをプロ
グラム■と称する． まず，グラジエントのプログラムので、５成分分析を行
う。プログラムのでは第５図に示したようにヘモグロビ
ンを１サイクル２．５分でＡｚａ，Ａ１ｂ，ＨｂＦ，Ａ
ｔｅ及びＨ　ｂ　Ａ　ｏに分けることができる。クロマ
トグラムより、各成分の百分率を計算する。Ａ　１　ｃ
の百分率（％）がある値（Ｂ　エ）以下のものについて
は分析を終了する。一方、Ａ　Ｉ　Ｑ　　の百分率（％
）がある値（Ｂ１）をこえるものについてのみ６成分分
析を行う。

演算部２９からオートサンプラ１４に６成分分析の必要
なサンプルのＮαを指示する信号を送る。

また、それと同時に演算部２９から三方向電磁弁１５及
び指令により流量などの調整が可能なインテリジェント
ボンプｌ６に信号を送り、６成分分析のプログラム■を
実行する。この際，溶離液の混合比，切替時間，流量な
どを変化させることが必要である．なお、Ｂｌ値として
は、ｘ十ＳＤ（ｘ：平均値，ＳＤ：標準偏差），ｘ＋２
８Ｄなどを用いて自由に設定することができる．プログ
ラム■により、ヘモグロビンをＡ１ａ．Ａｘｂ，ＨｂＦ
，Ｑ　　Ａｌｅ，ｓ　　Ａｔｃ及びＨｂＡｏの６成分に
１サイクル３．５分で分析できる。

Ａ　１ｃ　　は非酵素的に２段階の反応を経て生成され
ることが知られている。まず、グルコースとヘモグロビ
ンがアルジミン結合して、ＱＡｒａ　　が生成される。

次に、アマドリ転移により、徐々にケトアミン結合に変
化し，不可逆的にｓ　　Ａｓｃが生成される。Ｑ　　Ａ
ｌａの生成速度はｓＡｔｃの生或速度の約６０倍と大き
く、α−Ａｘｃ　　の大部分は再びグルコースとヘモグ
ロビンに解離する．ｓ　　Ａｓｃ　は食事などの生理的
要因によって変化しないが，　Ｑ−ＡＬＧ　は食事など
により急激に増加する。従って，Ａｌｃ　　を測定する
よりもｓ　一Ａ　１ｃ　　を測定する方がより正確に糖
尿病の健診のスクリーニングなどを行うことができる。

本法ではすべての試料にまず５成分分析を行い、Ａ　Ｉ
　Ｇ　　の百分率を求める．このＡＩＣ　の値から、さ
らに６成分分析が必要であるか否か（ＡＩＣ＞Ｂ１であ
るか否か）を演算部２９で判断し，Ａ　１　ｃ　）　Ｂ
　１をみたす試料についてのみ６成分分析を行う。

本法ではオートサンプラ１４にセットされたすべてのサ
ンプルについて５成分分析を行った後、Ａ　１　ｃ　＞
　Ｂ　１をみたす試料についてまとめて６成分分析を行
うことができる．また、個々の試料について５成分分析
の後、Ａ　１ｃ　＞　Ｂ　１をみたすならば６成分分析
を行うということを繰り返し行うこともできる． （実施例７） 第１１図にグリコヘモグロビン分析のフローチャートの
一例を示す． 使用した装置は実施例５と同様である．まず、５成分分
析を行い、Ａ１ｃ　の百分率を算出する。次にＡ　ｓ　
ｃ　）　Ｂ　ｔであるか否か判断し、Ａ　１　ｃ　）　
Ｂ　１である試料についてのみ６成分分析を行う。６成
分分析を行い、ｓ−Ａｌｅ　の百分率を算出する．同様
にＢ　−　Ａ　Ｉ　Ｑ　）　Ｂ　ｘであるか否かを判断
し．ｓ−Ａｘｃ＞Ｂｚをみたす試料についてのみ、さら
に多威分分析を行う． 演算部２９にてＡ　ｔ　ｃ　＞　Ｂ　ｘあるいはｓ　−
Ａｘｃ＞　Ｂ　ｚをみたしているか否かを判断し、この
条件をみたしている試料のＮαの信号をオートサンプラ
に送る。また、グラジエントプログラム■あるいは■実
行の信号を三方電磁弁（１５）及びインテリジェントポ
ンプ（１６）に送り、溶離液の混合比，流量，切替時間
などを変化させる。

なお、５成分分析の後、すぐに多成分分析を行ってもよ
い． （実施例８） 第１２図にグリコヘモグロビン分析のフローチャートを
示す． 本実施例はグリコヘモグロビンの測定値とグルコース濃
度から精密検査が必要であるか否かを判断するものであ
る。

日本総合健診医学会から以下のような観告案が出されて
いる。空腹時血糖値（ＦＰＧ）とＡ　１　ｃの組合わせ
により、耐糖能スクリーニングを行い、下記の条件を満
足する受診者を要精密検査者とし，７５ｇ糖負荷試験（
７５ｇＧＴＴ）を行う。

条件：（１）ＦＰＧ：　１４０ｍｇ／ｄＢ以上（２）Ａ
１ｃ　　：　ｘ＋２ＳＤ以上 （３）ＦＰＧ：　　１１０　〜１４０ｍｇ／ｄ　ＱＡＩ
Ｑ　　：ｘ＋ＩＳＤ以上 第１３図に耐糖能スクリーニングのＦＰＧとＡ　ｌｃ　
の関係を示す．斜線に示す位置にプロットされる受診者
は精密検査が必要である。

まず，５成分分析を行い、ＡＩＱ　　の百分率を算出す
る。ＡＬｃ　の百分率＞　Ｂ　ｔであるか否か判断する
。例えばＢ１としてはｘ＋ＳＤ，ｘ＋２ＳＤなどを用い
ることができる。Ａ　Ｉ　Ｃの百分率＞　８　１の場合
のみＡ　１　ｃ　の値を保持し、グルコース（ＦＰＧ）
濃度の算出値とＡＩＣ　　の百分率を第１３図に示すグ
ラフ上にプロットし、精密検査が必要であるか否かを判
断する。グラフ上へのプロットは演算部の内部で行って
もよい。

第１４図はｓＡｘｃ　の百分率と空腹時血糖値（ＦＰＧ
）から精密検査が必要であるか否かを判断する場合のフ
ローチャートを示したものである。

（実施例９） 第１５図にグリコヘモグロビン分析のフローチャートの
一例を示す。

まず、実施例５で示したシステムを用いて５成分分析を
行い、Ａ　１　ａ　，　Ａ　１　ｂ　，　Ｈ　ｂ　Ｆ　
，　Ａ　ｔ　ｃ　，Ｈ　ｂ　Ａ　ｏの百分率を算出する
。次に、Ａ１ａ，Ａ１ｂ　，　Ｈ　ｂ　Ｆ　，　Ａｔｅ
　，　Ｈ　ｂ　Ａｏのうちのある成分がある値以上であ
るか否か判断する（ある値以上の場合には、異常パター
ンを示していることも考えられる）。ヘモグロビンの分
画成分のうちのある成分（どの成分かは検査の目的によ
って適宜設定できる）がある値以上である場合にのみ多
成分分析を行い、異常ヘモグロビンパターンを示すか否
か確認する。

以上述べてきたように、本法では同一のカラム及び溶離
液を用いて、グラジエントのプログラムを変えるだけで
５成分分析，６成分分析，多成分分析などを連続して行
うことができる。従って、分析に要する時間を短縮でき
る。また、自動化が可能である．カラムや溶離液を交換
する必要がないので使い勝手がよい． また、グリコヘモグロビンの分画成分Ａ　１ｃ　　ある
いはｓ　−Ａｌｃ　　の測定値（百分率）から、より精
密な分析を行うか否かを判断し、必要とされる場合には
より精密な分析を行い、より正確な測定値を求めること
ができる．例えば、５成分分析→６成分分析，６成分分
析→多成分分析，５成分分析→多成分分析などをあげる
ことができる。

これにより、より正確に糖尿病の健診や治療を行うこと
ができる． （比較例３） 充填剤として、メタクリレート系ポリマを母材とし、こ
れに官能基としてカルボキシメチル基を導入した充填剤
を使用した。

比較例３の充填剤について物性を測定したところ、粒径
：８．０±１．６μｍ，比表面積：　２５ｍ／　ｇ　ｓ
交換容量：　Ｑ，３０ｍｅｑ／ｇであった。

この充填剤を内径４．６ｎａ，長さ１２０ｍのステンレ
スカラムに充填した．充填はスラリー法により，スラリ
ー溶媒及び充填溶媒としては、８０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ＰＨ６．２０）を使用し、充填圧力１００ｋｇ
ｆ／ｃｄにて充填溶媒をｌ時間送液した。

試料及び実験装置としては実施例１と同様のものを用い
た。

溶離液としてはリン酸一ナトリウム （Ｎ　ａ　ＨｘＰ　Ｏａ　・２　ＨｚＯ）及び塩化ナト
リウム（ＮａＣＱ）を下記濃度になるように脱イオン水
に溶解したものを使用した６なお，溶液のｐＨは，ＨＣ
Ｉ２を用いて調製した。

α液Ｈ　３０ｍＭ　　ＮａＨｚＰＯ４・２Ｈ２０（ｐＨ
５．５） β液：　３０ｍＭ　　ＮａＨｚＰＯｉ・２Ｈｚ○＋　３
　０　０　ｍ　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ　Ｑ　（　ｐ　Ｈ　５
　．　５　）多成分の分離は下に示すようなリニアグラ
ジエント法によった。

α液／β液＝１００／Ｏ　（体積比） 一−一→α液／β液＝７０／３０　（体積比）５０分 溶離液流量：１．０ｍｌｌ／＋ｉｉｎ 第１６図に、比較例４の充填剤を用い、上述したような
分析条件にて得られたクロマトグラムを示す。

第１６図において、ピーク１がＡｉａ，ピーク２がＡ１
ｂ　、ピーク３がＨｂＦ、ピーク４が不安定型ＡＩＱ　
（ｎ−Ａｔｅ）、ピーク５が安定型Ａ　Ｉ　Ｃ（　ｓ　
−　Ａ　１　ｃ　）、ピーク６がＨｂＡｏである。

粒径８μｍの充填剤ではヘモグロビンをＡ　１　ａＡｓ
ｂ，ＨｂＦ，１２−Ａｘｅ，ｓ−Ａｔｅ　，及びＨｂＡ
ｏの６成分に分離するのに、約５０分の時間を要する。

したがって、本発明の実施例の場合と比較して、著しく
測定時間が長くなり、多数のサンプルを短時間で検査処
理することはできない。

（実施例１０〜１２、比較例３〜４） 比較例３に示した充填剤（粒径８．０±１．６１’　ｍ
　ｔ比表面積：２５ｍ２／ｇ，交換容量：　０．３０ｍ
ａｑ／ｇ）と同様の比表面積，交換容量の値を有し、粒
径が約５μｍ，４μｍ，３．５μｍ，３μｍになるよう
に充填剤を合威した。これらの充填剤について，物性を
測定した結果を第３表に示す。粒径，比表面積，交換容
量の測定値から、比較例３〜４，実施例１０〜１２の充
填剤は比表面積，交換容量の値がほぼ等しく粒径が異な
る充填剤をみなすことができる。

比較例４及び実施例１０〜１２の充填剤を内径４．，６
［Ｉｎ，長さ３５＋ｓのカラムに充填し、分離カラムと
して用いた。なお、比較例３の充填剤については，上述
したように内径４　．　６　ｒｒｎ　，長さ１２００ｍ
ｌ１カラムに充填した。比較例４及び実施例１０〜１２
の充填剤のカラムへの充填は比較例３と同様の方法で行
った。

実験装置としては実施例１と同様のものを用レ）た。試
料としては，標準ヘモグロビンを用いた。

溶離液としてはリン酸一ナトリウム（ＮａＨｚＰＯ４・
２ＨｚＯ）と塩化ナトリウム（Ｎ　ａ　Ｃ　Ｑ　）を下
記のように混合したものを使用した． 第３表 ３０ｍＭ　　　ＮａＨｚＰＯａ・　２Ｈ２０１００ｍＭ
　　　ＮａＣＱ ｐＨ５．５ 上述した溶離液の流量を変えてＨＥＴＰ　（理論段一段
当りの充Ｕの高さ）を測定した。

第１７図は比較例３〜４、実施例１０〜１２の充填剤を
充填した分離カラムでの溶離液流量とＨＥＴＰどの関係
を示す図である６ 粒径の小さな充填剤の方がＨＥＴＰの最小値が小さい．
また、溶離液の流量を増加したときのＨＥＴＰの増加の
割合が小さい。

ＨＥＴＰは液体クロマトグラフィにおける分離能力の１
つの表現方法であり、この値が小さい程シャープなピー
クが得られる。

第１７図において、比較例４のＨＥＴＰの最小値（Ａ）
と同じ流量で１／５の値を示す点（Ｂ）と、ＨＥＴＰの
値が比較例４のＨ　Ｅ　Ｔ　Ｐの最小値（Ａ）と同じで
流量が５倍の点（Ｃ）を結んだ直線（破線）よりも下の
領域では，第１６図の分離性能を保ったまま、分析時間
を１／５以下に短縮することが可能である．さらに溶離
条件を検討する（例えば、ステツプワイズグラジエント
法を行う）ことにより、なおいっそうの分析時間の短縮
が可能である。

第ｌ７図の破線より上の部分では、分離性能の点で十分
ではなく、１／５の時間ではＡ１ｃ’ＩＱ−　Ａ　ｓ　
ｃ　　とｓ　　Ａｉｃ　　とに分けることはできない．
従って．ＡＩＣ　　をＱ　−　Ａ　ｔ　ｃ　　とｓ　−
　Ａ　１　ｃ　　とに分けるにはもつと長いカラムを用
いなければならない．それに伴い、分析時間は長くなる
。

第１７図において、比較例５（粒径約５μｍの充填剤）
では流量１．５ｍＱ／ｍｉｎでは破線より下になっては
いるが、通常使用する流量範囲１．０〜１．５ｍＱ／ｍ
ｉｎでは破線より上になっている。

流量が大きいとそれだけカラムにかかる圧力が大きく、
充填剤の寿命が短くなる。

第１７図において、実施例１０，１１．１２（粒径約４
．３．５，３．０μｍの充填剤）では流量１．０ｍｕ／
ｗｉｎでのＨＥＴＰの値が破線より下になっており、１
／５の分析時間で，充填剤の寿命を短くすることな＜　
Ａ　１　ａ　，　Ａ　１　ｂ　，　Ｈ　ｂ　Ｆ　，　ｎ
−ＡＩＧ，！ｌ−Ａｔｃ及びＨｂＡｏの６成分分析が可
能である。

（実施例１１，↓３〜１４、比較例５〜６）次に充填剤
の比表面積と交換容量又はＨＥＴＰとの関係について述
べる。

平均粒径３．５μｍで、種々の比表面積を有するように
，メタクリレート系ゲルからなる母材を合成し、その母
材に同一条件にてカルボキシメチル基を導入した。充填
剤の粒径，比表面積（官能基導入後），交換容量を測定
し、物性をチェックした。これら充填剤について物性を
測定した結果を第４表に、比表面積（官能基導入後）と
交換容量の関係を第１８図に示す。第１８図より，比表
面積の大きい充填剤の方が交換容量が大きい傾向がみら
れる。

これらを充填剤を内経４．６ｏｎ．長さ３５１帥のカラ
ムに充填し、分離カラムとして用いた。充填は比較例４
の方法に従った。これらのカラムについて、第１７図（
実施例１０〜１２、比較例３〜４）と同様に、溶離液の
流量を変えて、ＨＥＴＰを測定した。第１９図に，溶離
液流量１．０ｍＱ／ｗｉｎにおけるＨＥＴＰの値と充填
剤の比表面積との関係を示す。比較例５（比表面積４ｉ
／Ｈの充填剤）ではＨ　Ｅ　Ｔ　Ｐの値が大きく、ピー
ク幅が大きかった。その理由として、サンプルと接触す
第４表 る十分な面積がなく、サンプルが充填剤とすみやかに交
換反応がなされなかったことが考えられる。

また、比較例７（比表面積１８０ｒｒｆ／ｇの充填剤）
でもＨＥＴＰ値の増大がみられた。一般に細孔径の小さ
な充填剤の方が比表面積が大きし）傾向力１みられ、比
較例７では綱孔径が小さく、サンプルが自由に細孔や出
入りできないため、ピークが広がったものと考えられる
。以上のことより，充填剤の比表面積としては１０〜１
００ｍ２／ｇが望ましい。

（実施例１１，１５，１６、比較例７，８）実施例１ｌ
のメタクリレート系ゲルからなる母材に、条件を変えて
カルボキシメチル基を導入した．これらの充填剤につい
て物性を測定した結果を第５表に示す。

これらの充填剤を内径４．６＋ａｍ，長さ３５田のカラ
ムに充填し，分離カラムとして用いた。充填は比較例３
の方法に従った。これらのカラムについて、第１７図（
実施例１０〜１２、比較例３〜４）と同様に、溶離液の
流量を変えてＨＥＴＰを測定した。第２０図に、溶離液
流量１．０ｍＱ／ｗｉｎにおけるＨＥＴＰの値と充填剤
の交換容量との関係を示す。比較例８（交換容量０．０
５ｍｅｑ／ｇの充填剤）ではＨＥＴＰの値の増大が認め
られた。その理由として，官能基（カルボキシメチル基
）の導入量が少なく、サンプルが充填剤とすみやかに交
換反応が行なわれなかったということが考えられる。ま
た、比較例７（交換容量２　．　０　ｍｅｑ／ｇの充填
剤）でも多少ＨＥＴＰの値の増加がみられた。交換容量
の大きな充填剤は交換容量の小さな充填剤に比べて、溶
離液の塩濃度を変えたと第５表 き、膨潤・収縮が大きい。また、カラムの圧力損′失が
大きいという傾向がみられる。このように溶媒中（溶離
液中）で不安定であることや透過性が悪いことにより、
ＨＥＴＰが増大したものと考えられる。交換容量の大き
な充填剤はグラジエント溶離を行った場合、カラム寿命
の点で問題がある。

以上のことより、充填剤の交換容量としては０．１〜１
　ｍｅｑ／　ｇ　　が望ましい。

以上説明したように、本発明によれば、分離性能のよい
分離カラムを得ることができるので従来長い時間を要し
ていたｓ　−　Ａ　ｌｃ　　の分析（８分〜６０分）を
短時間（３．５分）で分析できるという効果がある。

また，分離能が高く、かつ溶離液の置換速度の早いカラ
ムが得られたので、同一のカラム及び溶離液を用いて、
溶離条件すなわちグラジエントのプログラムを変えるだ
けで、５成分分析（分画成分：　Ａｘａ，　Ａｔｂ，　
ＨｂＦ，　Ａｔｅ，　ＨｂＡｏ）、６成分分析（分画成
分：Ａ１ａ，Ａｔｂ，ＨｂＦ，Ｑ　−Ａｌｃ　，　ｓ　
　Ａｔｅ　，　Ｈ　ｂ　Ａｏ）、多成分分析（精密分析
）などの分析を連続して行うことができるという効果が
ある。溶離液や分離カラムを交換しなくても、複数の分
析を連続して行えるので分析に要する時間を短縮できる
。また、操作が容易である（分離カラムや溶離液を交換
したり、分離カラムが安定するまで溶離液を送液すると
いうような手間がかからない）。

〔発明の効果〕

発明によれば、血液中のヘモグロビン，グリコヘモグロ
ビン，ヘモグロビン誘導体などの成分を高速に分析（又
は分離・定量）できる液体クロマトグラフの方法及び装
置・システムを提供できる。

また，血液中のヘモグロビン，グリコヘモグロビン，ヘ
モグロビン誘導体などの成分を精度よく分析できる液体
クロマトグラフの方法及び装置・システムを提供できる
。

さらに、連続した多種類の成分分析の実行を自動化でき
る液体クロマトグラフのシステムを提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたクロマトグラム、第２図は
比較例１で得られたクロマトグラム，第３図は比較例２
で得られたクロマトグラム、第４図は実施例２で得られ
たクロマトグラム、第５図は実施例３で得られたクロマ
トグラム、第６図は実施例４で得られたクロマトグラム
、第７図は実施例２の方法で測定したＣＱ−Ａ１０＋Ｓ
−Ａｔｅ）値と実施例３の方法で測定したＡ　Ｉ　Ｑ値
の相関関係を示す図、第８図及び第９図は本発明の分析
装置の一実施態様例、第１０図乃至第１２図は本発明の
一実施例のフローチャート、第１３図は耐糖能スクリー
ニングの条件を示した図、第１４図乃至第１５図は本発
明の一実施例のフローチャート、第１６図は比較例４の
クロマトグラムを示す図、第１７図は溶離流量とＨＥＴ
Ｐとの関係を示す図、第ｌ８図は比表面積と交換容量と
の関係を示す図、第１９図は比表面積とＨＥＴＰとの関
係を示す図、第２０図は交換容量とＨＥＴＰとの関係を
示す図である。 １−　Ａ　ｓ　ａ、２−Ａｔｂ、３−Ｈ　ｂ　Ｆ、４・
・・不安定型Ａｒｃ　（ｆｌ　　Ａｘｅ）　、５−安定
型Ａｔｃ　（ｓ　−Ａｚｃ　）　．　　６−Ｈ　ｂ　Ａ
ｏ、７−　（Ａ１ａ　＋Ａｔｂ）、８・・・（Ｈ　ｂ　
Ｆ　＋Ａｓｃ　）　，９・・・Ａ　ｔ　ｃ、１１・・・
溶離液Ａ、１２・・・溶離液Ｂ、１３・・・溶離液Ｃ、
１５・・三方電磁弁、１６・・・送液ポンプ，１７・・
・三方バルブ、１８・・・シリンジ、１９・・・サンプ
ルテーブル、２０・・・吸引ノズル、２１・・・試料輸
送管、２２・・・サンプルループ、２３・・・６方バル
ブ、２４・・・フィルタ、２５・・・分離カラム、２６
・・・カラム恒温槽、２７・・・検出器、２８・・・デ
ータプロセッサ、２９・・・演算部、３０・・・洗浄液
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、無機多孔性物質又は有機多孔性物質のいずれかに官
   能基を導入した充填剤を充填した分離カラムと、 分離カラムに試料を注入する手段と、 分離カラムに溶離液を流通させる手段と、分離カラムか
   らの溶出液の吸光度を検出する手段を具備し、 液体クロマトグラフィにより、血液中のヘモグロビン、
   ヘモグロビン誘導体又はグリコヘモグロビンを測定する
   液体クロマトグラフ装置において、 充填剤の乾燥状態での平均粒径が４μｍ以下であること
   を特徴とする液体クロマトグラフ装置。 ２、請求項１において、充填剤の乾燥状態での比表面積
   が１０〜１００ｍ＾２／ｇ、充填剤の乾燥重量／ｇ当た
   りの交換容量が０．１〜１ｍｅｑであることを特徴とす
   る液体クロマトグラフ装置。 ３、請求項１又は２において、官能基は、カルボキシア
   ルキル基であることを特徴とする液体クロマトグラフ装
   置。 ４、請求項１乃至３のいずれかにおいて、溶離液は、ｐ
   Ｈ５．０〜７．０の緩衝液であることを特徴とする液体
   クロマトグラフ装置。 ５、官能基を導入した無機多孔性物質、官能基を導入し
   た有機多孔性物質のいずれかからなり、かつその乾燥状
   態における平均粒径が４μｍ以下である充填剤を充填し
   た分離カラムに溶離液を流通させることにより、血液中
   のヘモグロビン，ヘモグロビン誘導体、グリコヘモグロ
   ビン、又はグリコヘモグロビン誘導体を分離することを
   特徴とする液体クロマトグラフの方法。 ６、請求項５において、充填剤の乾燥状態での比表面積
   が１０〜１００ｍ＾２／ｇ、充填剤の乾燥重量／ｇ当た
   りの交換容量が０．１〜１ｍｅｑであることを特徴とす
   る液体クロマトグラフの方法。 ７、請求項５又は６において、官能基は、カルボキシア
   ルキル基であることを特徴とする液体クロマトグラフの
   方法。 ８、請求項５乃至７のいずれかにおいて、溶離液は、ｐ
   Ｈ５．０〜７．０の緩衝液であることを特徴とする液体
   クロマトグラフの方法。 ９、１つ以上の溶離液と分離カラムと、１つ以上の試料
   を信号によつてサンプリングして分離カラムへ移送する
   手段と、 分離カラムで分離された各成分を検出する手段と、各成
   分の比率を演算する手段と各成分の比率を演算する手段
   よりのデータを処理・演算する手段と、 処理演算する手段からの信号にもとづいて、１つ以上の
   試料をサンプリングして分離カラムへ移送する手段と、 処理演算する手段からの信号にもとづいて、分離カラム
   に流入する１つ以上の溶離液の流量・組成又は混合比を
   変化させる手段とを有することを特徴とする液体クロマ
   トグラフのシステム。 １０、請求項９において、分離カラムには、多孔性物質
   に官能基を導入した充填剤が充填され、充填剤の乾燥状
   態における平均粒径が４μｍ以下であることを特徴とす
   る液体クロマトグラフのシステム。 １１、請求項１０において、充填剤の乾燥状態での比表
   面積が、１０〜１００ｍ＾２／ｇ、乾燥重量／ｇ当たり
   の交換容量が０．１〜１ｍｅｑであることを特徴とする
   液体クロマトグラフのシステム。 １２、請求項９において、 分離カラム及び溶離液を交換することなく、分画成分数
   の異なる分析を連続して行うことを特徴とする液体クロ
   マトグラフのシステム。 １３、液体クロマトグラフ法により、試料中の各成分の
   比率を求める第１のステップ、第１のステップで求めた
   特定成分の比率が、設定値を超えるか否かを判断する第
   ２のステップ、第２のステップの判断結果に基づき、液
   体クロマトグラフ法により第１のステップよりも多成分
   について各成分の比率を求める第３のステップを有する
   液体クロマトグラフのシステム。 １４、請求項１３において、第３のステップで求めた特
   定成分の比率が設定値を超えるか否かを判断する第４の
   ステップ、第４のステップの判断結果に基づき液体クロ
   マトグラフ法により第３のステップよりも多成分につい
   て各成分の比率を求める第５のステップを有する液体ク
   ロマトグラフのシステム。 １５、請求項１３において、第２のステップを内蔵した
   演算部を有する液体クロマトグラフのシステム。 １６、請求項１４において、第４のステップを内蔵した
   演算部を有する液体クロマトグラフのシステム。 １７、請求項１５において、第３のステップは、演算部
   よりの出力に基づいて、溶離条件を変化することによつ
   て実現することを特徴とする液体クロマトグラフのシス
   テム。 １８、ヘモグロビンを複数の分画成分に分離する液体ク
   ロマトグラフの装置において、 異なる分画数の分離を行なう際に、同一分離カラム及び
   同一の１つ以上の溶離液を用い、溶離液の混合比又は流
   量を変化させることにより行うことを特徴とする液体ク
   ロマトグラフの装置。 １９、無機多孔性物質又は有機多孔性物質のいずれかに
   官能基を導入した充填剤を充填し、充填剤の乾燥状態で
   の平均粒径が４μｍ以下でり、ヘモグロビン、ヘモグロ
   ビン誘導体又はヘモグロビンを分離することを特徴とす
   る分離カラム。 ２０、請求項１９において、充填剤の乾燥状態での比表
   面積が１０〜１００ｍ＾２／ｇ、充填剤の乾燥重量／ｇ
   当たりの交換容量が０．１〜１ｍｅｑであることを特徴
   とする分離カラム。