JPH01300898A

JPH01300898A - 生理活性蛋白質の精製法

Info

Publication number: JPH01300898A
Application number: JP13126888A
Authority: JP
Inventors: Daisuke Ejima; 大輔江島; Yutaka Sato; 豊佐藤; Wataru Nakamatsu; 亘中松; Mayumi Watanabe; 真弓渡辺
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1988-05-28
Filing date: 1988-05-28
Publication date: 1989-12-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は簡便で効率が良く、しかも汎用性に富んだ生理
活性蛋白質の精製法に関する。

〈従来技術〉蛋白質、４ｆチドを真核、及び原核細胞を宿主として生
産した後精製する場合には、従来抽出にひきつづきクロ
マトグラフィー操作を重ねる方法がとられている。

しかしながら、この操作には以下に示すような３つの大
きな問題点がある。即ち、 ■　精製しようとする目的蛋白質又はペゾチドが９盪し
か含まれない場合には、従来法では多段階のクロマトグ
ラフィー操作が必要である為に、目的物質の回収率が低
下する。

■　大腸菌などの微生物を用いて物質生産を行う場合、
菌体内に生成蓄積した物質を抽出するためには、菌体の
破砕を必要とする。機械的破砕（例えば超音波破砕）を
よシ効率的に行うために通常、機械的破砕の前に細胞壁
溶解酵素（例えばリゾチーム）で処理する場合が多い（
リゾチームーンニック法）。この時に混入するリゾチー
ムと目的蛋白質又はベグチドと分離する為にも、前述の
ような多段階クロマトグラフィー操作が必要でちゃ、非
常に煩雑である。

■　生産宿主に動物細胞を用いる場合には、細胞を維持
する為高濃度の血清を必要とすることが多い。血清は複
雑な蛋白質の混合物であり、とくに血清アルブミンは含
有量が高い上に他の蛋白質を吸着する性質を有すること
から前述の多段階クロマトグラフィー操作を作っても精
製が極めて困難である。

このような間厘点を解決する為に従来よシ種々の検討が
行なわれている。例えば宿主より抽出したインターフェ
ロン水溶液にチオシアン酸カリウム、エタノールの混液
を加え声をステップ的に上昇させ、各−で沈澱を除き、
最終的にインターフェロンを沈澱・分離する方法（特開
昭５８−８９１９６）及び宿主からの抽出液に５〜２０
％のトリフルオ溶化して分離する方法（ＵＳＰ　４４０
５６０１）がある。

どちらの方法も上述の欠点を解消した優れた方法である
が、どちらの方法にも以下のような別の問題点がある。

即ち、特開昭５８−８９１９６の方法は■多段階クロマ
トグラフィー操作は不用になったか、そのかわシ段階的
ＰＨ調整及び沈澱除去操作が必要であるので、別の意味
で操作性が悪い、＠インターフェロン以外の物質には適
応できない、またＵＳＰ４４０５６０１ノ方法は、■Ｔ
ＦＡ　ａ度（５〜２０％）が過激である為に使用しに＜
＜、汎用性に欠ける等がある。

従って、簡便な操作で、リゾチーム、血清アルブミン等
の夾雑物を分離でき、しかも汎用性の高い精製法の確立
は当業界において待ち望まれている。

く本発明が解決しようとする課題〉本発明の課題は簡便な操作で、リゾチーム、血清アルブ
ミン等の夾雑物を分離でき、しかも、種々の蛋白質に適
応し得る汎用性の高い精製法の提供である。

〈課題を解決する為の手段〉本発明者等は上記課題を解決する為に鋭意検討を重ねた
結果、有機酸を含む有機溶媒で処理する操作を導入する
ことよシ上記課題を解決するに至った。

即ち、本発明は生理活性蛋白質の精製において、生理活
性蛋白質含有溶液１００容量部あたり■０．０５〜ｉ、
　ｏ容量チの有機酸を含む有機溶媒２５〜４００容債部
を単独又は＠０．０５〜１．０容量％の有機酸を含む有
機溶媒２５〜４００容量部及び０．１〜３．ＯＭのカオ
トロピックイオンを合せて添加することを特徴とする生
理活性蛋白質の精製法である。

本発明を以下に更に詳細に説明する。

本発明に用いられる生理活性蛋白質の種類は特にこだわ
らないが、好ましくは、比較的疎水性が高く、しかも、
有機溶媒及び低−下でも安定な生理活性蛋白質が好まし
い。具体的には、ヒト　ＢＣＤＦ。

ヒトＢＵＦ−３、ヒトＥＧＦ及びヒトＩＬ−２が挙げら
れる。

尚、これらの物質は既に公知の生理活性蛋白質で、構造
及び特性については既に報告されている。

ヒトＢＣＤＦについては（文献）　ＰＲＯＣＥＥＤＩＮ
ＧＳ　０ＦＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＣＡＤＥＭＹ　ＯＦ　
５ＣＩＥＮＣＥＳ　ＵＳＡ　８２．５４９０〜５４９４
（１９８５）　、ヒトＢＵＦ−３（ＥＤＦともｄうが本
発明においてはＢＵＦ−３とする）については（文献）
ＢＩＱ（、ＨεＨＩＣＡＬ１ＡＮＤ　ＢＩＯＰＨＹＳＩ
Ｃ’ＡＬ　ＲＥＳＥＡＲＣＨＣＯ［ＮＩＣＡＴＩＯＮＳ
　１４２．１０９５〜１１０３（１９８７）　、ヒト（
１９７５）　、ヒトＩＬ−２についてはＮＡＴＵＲＥ　
３０２．３０５ｒ−３０９（１９８３）を参照されたい
。原核生物及び真核生物細胞で生産された生理活性蛋白
質のこれら宿主からの抽出は常法に従って行なえばよい
。

このようにして抽出した生理活性蛋白質を含む溶液を有
機酸を含む有機溶媒で処理するわけであるが、通常、処
理する前に溶液の蛋白濃度１．０〜８０ｍ９７ｆｔｔｌ
になるように調整する。

このように調整された生理活性蛋白含有溶液１００容量
部あたシ、■０．０５〜１．０容量チの有機酸を含む有
機溶媒２５〜４００容量部を単独又は（ｏ）　０．０５
〜１．０容量チ有機酸を含む有機溶媒及び０．１〜３．
ＯＭのカオトロピックイオンを合せて添加する。

これが本発明の必須構成要件であり、これＫより簡便で
、効率よく夾雑物を除去でき、しかも汎用性の高い、と
いう本発明の効果を生み出すことができるのである。

本発明で用いる有機酸としてはＴＦＡ、　ＨＦＢＡ等が
ある。

また、本発明で用いられる有機溶媒としてはアセトニト
リル、エチルアルコール、クロビルアルコール、インク
ロビルアルコール等があるが、好ましくはアセトニトリ
ルを用いるのが望ましい。

さて、ここにカオトロピックイオンとは、水溶液中の水
の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触した時に起こる
水のエントロピーの減少を抑制し、疎水性物質の溶解度
を高める性質を示すイオンである。（「蛋白質・酵素の
基礎実験法」堀尾武−１山下仁平編、１９８１年南江堂
）。

本発明で用いられるカオトロピックイオンとしては、チ
オシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素
酸ナトリウム、塩酸グアニジノ等があシ、好ましくはチ
オシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウムを用いる
のが望ましい、カオトロピックイオンは塩として使用す
るのが好ましく、もちろんカオトロピックイオン同志の
塩でもよい。これらの塩は１種でも２種以上を混合して
使用してもよい。使用するカオトロピックイオンの濃度
は通常０．０５〜６．０Ｍであシ、好ましくは０、１〜
３．０Ｍである。

さて、この有機酸を含む有機溶媒又は有機酸を含む有機
溶媒及びカオトロピックイオン溶液を添加し死後に攪拌
を行う。攪拌後、先程使用した有機酸と同じ有機酸を添
加して−を７．０以下、好ましくはｐＨ２，０〜３．０
に調整する。この時に用いる有機酸の濃度は通常１〜ｌ
Ｏ容量チである。

さて、−を調整した後は、この溶液を放置して沈澱を生
ぜしめる。この生じた沈澱を遠心分離で除去し、精製さ
れた目的蛋白質を上清に得るのである。以上の操作は一
１５℃〜４０℃、望ましくは５〜３０℃で行えばよい。

更に、上清１００容量部あたり、１００〜３００＃量部
の０．１容量チのＴＦＡ水溶液を添加し、有機溶媒濃度
をｌＯ〜２０容量チとする。これを化学結合型シリカダ
ルを充填剤とする逆相液体クロマトグラフィーに供し、
純粋な蛋白質を得る。

以下、本発明を実施例に基すいて説明する。

〈実施例１　：　ＴＨＰ−１細胞で生産されたヒトＢＵ
Ｆ−３の精製〉ヒト骨髄性白血病細胞ＴＩＰ−１（ＩＦ
Ｏ５０１４７）をホルボールエステル（ＴＰＡ）を用い
て刺ａ　後得タヒト　ＢＵＦ−３を含む培養上清１５０
１（ヒトＢ［ＪＦ’−３。

８０Ｗ；総ヒトＢＵＦ−３、１２００万Ｕ；比活性。

１．５　Ｘ　１０　　ＵＡＱＲ白）をペリコンカセット
（分子量分画、１０にダルトン；ミリＩア社製）を用い
て、約４０倍濃縮した。尚、このＴＨＰ−１細胞にょる
ＢＵＦ−３の生産の詳細は細胞工学、別刷４％ｐ４８〜
５８．１９８８年に記載されている。

次に、６５％飽和硫安で４℃、ｔ２ｈｒｉ析後、遠心分
離（７０００，９，１５分間）でベレットを回収した。

これを５０　ｍＭ　トリス・塩酸”７７アー。

ｐＨ７，８に再溶解後、同様のバッファーに対して４℃
で２４　ｈｒ透析した。このようにして透析内液（ヒト
　ＢＵＦ−３、１２００万Ｕ、比活性２．９Ｘ１０３則
卸蛋白、蛋白濃度２０φ）を得た。

この溶液１００容量部に０．１容量％ＴＦ’Ａを含むア
セトニトリル２５０容量部を添加、攪拌した。

これに１０容量％　ＴＦＡ水溶液を適量加えてｐｈｌ　
２．０に調ｉ後、遠心分離（７０００，！ｉ’　、１５
分間）して上清を得た。上溝中のヒトＢＵＦ−３は１１
５０万Ｕ。

比活性は１．５　Ｘ　１０５Ｕ、Ａ’蛋白であり、回収
率は９６チ、約５２倍精製されたことになった。

この上溝１００容１部に、０．１８量チのＴＦＡ水溶液
２００容量部を加えて、アセトニトリル濃度を充分低下
させた後、化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相液
体クロマトグラフィーに供した。

得たヒト　ＢＵＦ−３画分を再び同様の逆相液体クロマ
トグラフィーに供し、蛋白化学的に純粋なヒトＢＵＦ−
３、６７２万Ｕを得た。

〈実施例２　：大腸菌により生産されたヒトＥＧＦの精
製〉ヒト　ＥＧＦを大腸菌を用いて製造した場合、例え
ばヒト　ＥＧＦ遺伝子を合成し、ヒト　ＩＬ−２のＮ末
端側の一部にカリクレイン切断部位を付した後に接続し
て発現ベクターを構築し、これを有する大腸菌を培養し
て融合蛋白を顆粒状に蓄積させる手法（先高ら、昭和６
３年度日本農芸化学会大会講演要旨集ｐ、６３）で生産
した融合蛋白を菌体から抽出するために、リゾチーム−
ソニック法を用いた。

遠心分離して融合蛋白の顆粒を回収する際、リゾチーム
が混入した。混入量は可溶化、活性変換の後、カリクレ
インの作用でヒトＩＬ−２ｄｆｉ片を切除して得られた
ヒト　ＥＧＦ　（１，０ψｌ）の１０チ以上の量比であ
った。この溶液１００各ｉ部に０．１容ｉｔ％ＴＦＡを
含むアセトニトリル溶液を各２５゜４３．６７容量部ず
つを添加し、室温で約１時間放置した後、沈澱物を除去
した。上清中のヒトＥＧＦの回収率とりゾチームの残存
率は第１表のようになった。

第１表アセトニトリル終濃度（（５）　　ヒト２０２回収率（
（６）　リゾチーム残存率（（６）この上清１００容量
部（ヒト　ＥＧＦとして１ｍ９）に、０．１容量チのＴ
ＦＡ水溶液１６０容量部を加えて、アセトニトリル濃度
を充分低下させた後、化学結合型シリカゲルを充填剤と
する逆相クロマトグラフィーに供し、蛋白化学的に純粋
なと）　ＥＧＦ（８９０μｍりを得た。

〈実施例３　　：　ＣＨＯ細胞で生産されたヒト　ＢＵ
Ｆ−３の精製〉ヒトＢＵＦ’−３のｃＤＮＡを有する発
現ベクターを導入し、メントレキセート（ＭＴＸ）耐生
を付与することで得たヒト　ＢＵＦ−３高生産組換えＣ
ＨＯ細胞（’Ｂ丁ＯＣＨＥＭ１．Ｃ：ＡＬ　、ＡＭＤ　
ＢｒＯ３）ＨγＳＥＡ／Ｊ＋　　ＲＥＥ；ＥＡＩ？ＣＨ
ＣＯ１’Ｈ（ＪＮＩＣＡＴｒＯＮＳ　１５１．　＆　１
　、２３０−２３５（’８８）　、　ＩＦＯ−５０１４
６）由来の培養上清１０１（ヒトＢＵＦ−３１１０，０
００則ゼ；総ヒトＢＵＦ−３、１０，０００万Ｕ；比活
性２．　ＯＸ　１０３Ｕ／ｆｈ９蛋白：ウシ胎児血清１
０チを含む）をベリコンカセット（分子量分画　１０に
ダル　ト　ンカー’／ト）４）ｆ’ｌａ−ζｌＯイ＊’
ｒ蕉！　１’Ｑ　ｌ−ｒ−ｍ次に、６０％飽和硫安で４
℃ｐ１２ｈｒ塩析後、遠心分離（７００ＯＮ　、１５分
間）してペレットを集めた。５０ｍＭトリス・塩酸バッ
ファーに再溶解後、同様のバッファーに対して４℃で２
４ｈｒ透析した。こうして得た透析内液１００容量部（
ヒトＢ［ＪＦ−３、１０，０００万Ｕ；比活性５．０Ｘ
１０３卯〜蛋白；蛋白濃度＋　４０　ｒｎ％ｔｌ　）に
チオ７アン酸カリウムを最終濃度２Ｍとなる様添加し、
完全に溶解した後、０．１８４５ｇ　ＴＦ’Ａを含むア
セトニトリル２３３容量部を加え、攪拌した。更にこれ
に１０容１ｓＴＦＡ水溶液を適量加えてｐＨ２，０に調
整後、遠心分離（７０００Ｊ　、１５分間）して上清を
得た。上清中のＢＵＦ−３の比活性は９．　ＯＸ　１０
’ＵＡ＋蛋白であシ、回収率は８２％、約１８倍精製し
たことになる。　　′この上清ｌＯＯ容量部に、０．１
各ｉ％のＴＦＡ水溶液２００容量部を加えて、アセトニ
トリル濃度を充分低下させた後、化学結合をシリカゲル
を充填剤とする逆相液体クロマトグラフィーに供した。

得たヒト　ＢＵＦ−３画分を更に２回の同様の逆相クロ
マトグラフィーで順次精製することにより、蛋白化学的
に純粋なヒトＢＵＦ−３、４６００万Ｕを得た。

〈実施例４　：　ＣＨＯ細胞で生産されたヒトＩＬ−２
の蒋裏〉ヒト！Ｌ−２のｃ　ＤＮＡを有する発現ベクタ
ーを導入し、メソトレキセー）　（ＭＴＸ）耐生を付与
することで得たヒト　ＩＬ−２高生産組換えＣＨＯ細胞
（ＪＯｕ尺ＮＡムＯＦ　Ｅ工０ＣＨＥＨＩ５丁ρＹ　、
　１０２．１２３〜１３１（１９８７））由来の培養上
清（ヒトＩＬ−２，６１０Ｕ／ゼ；総ヒトＩＬ−２，１
９００万Ｕ；比活性、１２２Ｕ／Ｉｈ９蛋白；ウシ胎児
血清１０％を含む）を限外濾過装置ベリコンカセット（
分子量分画、ＩＯＫダルトン、ミリボア社）で４５倍濃
縮した。６０チ飽和硫安で４℃、２４時間塩析後、遠心
分離（７０００ｇ。

１５分間）して（レットを集めた。５０１Ｍトリス・塩
酸バッファーに再溶解後、同様のバッファーに対して４
℃、２４時間透析した。こうして得た透析内液１００容
量部（ヒトＩＬ−２，１７００万Ｕ；比活性１８０　Ｕ
Ａｙｉ白；蛋白濃度４０　ｍａｌ　）　Ｋ　チオシアン
酸カリウムを最終濃度２Ｍとなる様添加し、完全に溶解
した後、０．１％容量チＴＦＡを含むアセトニトリル１
８６容量部を加え、攪拌した。

更にこれに１０容量チＴＦＡ水溶液を適量加えて−２．
０に調製後、遠心分離（７００（１，１５分間）して上
清を得た。上清中のと）　ｒＬ−２の比活性は３、８　
Ｘ　１０３Ｕ／ｆｎ９蛋白２回収率は８５チ、２１倍精
製したことになる。

この上溝１００容量部に、０．１容量％のＴＦＡ水溶液
１００容量部を加えて、アセトニ）　ＩＪル濃度を充分
低下させた後、化学結合凰シリカゲルを充填剤とする逆
相液体クロマトグラフィーに供した。

得たヒト　ＩＬ−２画分を更に２回の同様の逆相クロマ
トグラフィーでｊ式次精製することにより、蛋白化学的
に純粋なヒトｒＬ−２、６００ＪＵｔ−得た。

く効果〉本発明の方法を用いると、原核又は真核生物で製造され
た生理活性蛋白質を簡便で、効率よく、しかも迅速に夾
雑物質を含まない形でｆｆｆＲすることができる。

また、この方法は各種生理活性蛋白質についても適応で
きる極めて優れた方法である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）生理活性蛋白質の精製において、生理活性蛋白質
含有溶液１００容量部あたり（イ）０．０５〜１．０容
量％の有機酸を含む有機溶媒２５〜４００容量部を単独
又は（ロ）０．０５〜１．０容量％の有機酸を含む有機
溶媒２５〜４００容量部及び０．１〜３．０Ｍのカオト
ロピックイオンを合せて添加することを特徴とする生理
活性蛋白質の精製法。
（２）生理活性蛋白質がヒトＢ細胞分化因子（以下ヒト
ＢＣＤＦと称する）、ヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３（以
下ヒトＢＵＦ−３と称する）、ヒトインターロイキン２
（以下ヒトＩＬ−２と称する）、及びヒト上皮細胞増殖
因子（以下ヒトＥＧＦと称する）である請求項（１）記
載の精製法。
（３）有機酸が、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと称
する）、ヘプタフルオロ酪酸（以下、ＨＦＢＡと称する
）、である請求項（１）記載の精製法。
（４）有機溶媒がアセトニトリル、エチルアルコール、
プロピルアルコール、イソプロピルアルコールである請
求項（１）記載の精製法。
（５）カオトロピックイオンがチオシアン酸カリウム、
チオシアン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、塩酸グ
アニジンである請求項（１）記載の精製法。