JPH0680697A - ヒト好中球エラスターゼ阻害活性を有する天然型ポリペプチドおよびそれを含有する医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 エラスターゼ阻害活性及びカテプシンＧ阻害
活性を示し、実質的にトリプシン阻害活性を示さない、
エラスターゼ阻害活性ポリペプチド、又はそのホモポリ
マーを提供する。 【構成】 ＳＬＰＩのアミノ酸配列のＡｒｇ⁵⁸―Ａｌａ
¹⁰⁷ に相当する５０アミノ酸残基で表わされるアミノ酸
配列もしくはＡｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ に相当する４９アミ
ノ酸残基で表わされるアミノ酸配列もしくはエラスター
ゼ阻害活性を有するそれらの一部分又はそれらと生物学
的に同等のアミノ酸配列を有するエラスターゼ阻害活性
ポリペプチド又はそれらのホモポリマー、それらの製造
方法、それらを含有する医薬製剤等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト好中球エラスター
ゼ阻害活性を有する天然型ポリペプチド及びそれを含有
する医薬製剤等に関する。更に詳細には、配列番号１お
よび配列番号２で表わされるアミノ酸配列又はそれらと
生物学的に同等のアミノ酸配列を有するエラスターゼ阻
害活性ポリペプチド又はそのホモポリマー、それらの製
造方法、及びそれらの治療有効量と医薬的に許容される
担体とからなる医薬製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】好中球が喀痰中や気管支および肺胞洗浄
液中に増加する疾患として慢性気管支炎、びまん性汎細
気管支炎、気管支拡張症、肺気腫、ＡＲＤＳ、細菌性肺
炎、気管支喘息などが知られており（Am. Rev. Respir.
Dis.,１３２，４１７，１９８５；Am. Rev. Respir. D
is.,１４２，５７，１９９０）、このように肺内、気管
支内へ遊走してくる好中球からはエラスターゼの放出が
起こり（Am. Rev. Respir. Dis.,１４１，６８９，１９
９０）、したがって、このような炎症性呼吸器疾患の気
道液中あるいは膿性痰中には、好中球由来の高濃度エラ
スターゼが検出されることが報告されている（Am. Rev.
Respir. Dis.,１２０，１０８１，１９７９；The New
England Journal of Medicine, Jan. ２２，１９２，１
９８１）。

【０００３】好中球プロテアーゼは、本来外来の異物、
細菌、ウイルスなどに対する生体防御機構としての役割
を有しているが、好中球プロテアーゼが過剰に存在する
と、自己を攻撃し、肺のマトリックスが分解されてしま
う（J. Biol. Chem., ２５５，８８４８，１９８０；J.
Biol. Chem., ２５５，１２００６，１９８０）。

【０００４】生体側が、この過剰なプロテアーゼに対し
て準備しているのがプロテアーゼインヒビター群である
が、好中球プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターの
バランスがくずれ、好中球プロテアーゼが過剰になる
と、肺マトリックスが傷害をうけ、このような状態が続
くと疾患が重篤化すると考えられている（Am. Rev. Res
pir. Dis.,１３２，４１７，１９８５；Am. Rev. Respi
r. Dis.,１２９，７３５，１９８４；Am. Rev. Respir.
Dis.,１４２，５７，１９９０；Annals of Internal M
edicine,１１１，９５７，１９８９）。

【０００５】ヒト白血球エラスターゼ阻害蛋白（Secret
ory Leukoprotease Inhibitor;以下ＳＬＰＩという）は
気道分泌腺細胞で産生されることにより、主に上気道
で、過剰な好中球エラスターゼから生体を防御するプロ
テアーゼインヒビターであるが、炎症局所において、過
剰に存在する好中球エラスターゼによるＳＬＰＩの分解
様式は解明されていない。

【０００６】ＳＬＰＩは人間の唾液、鼻汁、精液、子宮
粘液などにも存在し、耳下腺分泌液から単離されたＳＬ
ＰＩのアミノ酸配列の解析がなされ（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA、８３，６６９２，１９８６；特表昭６２
―５０１２９１号明細書）、また、ヒト耳下腺遺伝子ラ
イブラリーよりこの蛋白遺伝子が単離され、構造決定さ
れている（Nucl. Acid. Res.１４，７８８３，１９８
６；特表昭６２―５０１２６２号明細書）。しかし、人
間の唾液、鼻汁、精液、子宮粘液などに存在するＳＬＰ
Ｉの分解様式は解明されていない。

【０００７】ＳＬＰＩはヒト好中球エラスターゼ、ヒト
カテプシンＧ、ヒト膵臓エラスターゼ、ヒトキモトリプ
シンなどのキモトリプシン様酵素に対する阻害活性のみ
ならず、生理的に重要なトリプシン様酵素、例えばトリ
プシン、に対する阻害活性をあわせ持っている。このト
リプシン様酵素阻害活性のために、ＳＬＰＩは優れたエ
ラスターゼ阻害活性、カテプシンＧ阻害活性を有してい
るにもかかわらず、ヒト疾患治療薬として用いることが
困難であった。この理由から、遺伝子工学的手法によ
り、ＳＬＰＩの前半部分を除去し後半部分だけを調製し
て得られたＳＬＰＩカルボキシ末端ポリペプチドは、Ｓ
ＬＰＩのエラスターゼ阻害活性を維持しながら、トリプ
シン阻害活性を実質的に有さないことがすでに確認され
ている（Biotech,７，５５，１９８９；Protein Engine
ering,３，２１５，１９９０；ＷＯ８９／０６２３９号
明細書）。

【０００８】しかし、これらのＳＬＰＩカルボキシ末端
ポリペプチドは、副作用につながると予想されるトリプ
シン様酵素阻害活性を除去することには成功している
が、これらを治療を目的とした製剤に応用する場合、新
たな問題を生じることが考えられる。なぜなら、これま
でに報告されたＳＬＰＩカルボキシ末端ポリペプチドは
全て遺伝子工学的に調製されたいわば人工的な非天然型
ポリペプチドであるため、製剤としてヒトに用いた場
合、抗原性が生じ抗体の産生が懸念されるからである。

【０００９】ポリペプチド製剤に対する抗体が生じた場
合、その抗体により同製剤の効果は阻害され、薬効が消
失するだけでなく、生体内で急激な抗原―抗体反応が生
じる危険性もあり、抗体産生患者に対して、同製剤の投
与は、抗体産生以後不可能となる。

【００１０】一方、ヒトは非天然型ポリペプチドに対し
て特に抗体を産生しやすいことは公知であり、この危険
性が高いこれまでに報告された非天然型ＳＬＰＩカルボ
キシ末端ポリペプチドを製剤として使用することは当然
避けるべきである。

【００１１】これに対し、すでに生体内に存在する天然
型ポリペプチドは、いわば、自己ポリペプチドであり、
抗体の産生は懸念されず、ヒトに投与する製剤として明
らかに優れている。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】従って、優れたエラス
ターゼ阻害活性及びカテプシンＧ阻害活性を有し、トリ
プシン阻害活性を実質的に示さず、しかも製剤として使
用する場合、抗原性の発現する危険性のないエラスター
ゼ阻害蛋白の提供が求められている。

【００１３】炎症性呼吸器疾患の局所に存在する高濃度
好中球エラスターゼによるＳＬＰＩの分解様式は解明さ
れていないが、好中球エラスターゼにより分解されたフ
ラグメントは生体内に存在する天然型ポリペプチド、す
なわち自己ポリペプチドであり抗体の産生は懸念されな
い。

【００１４】唾液中に存在するＳＬＰＩの分解様式は解
明されていないが、唾液中の酵素により分解されたフラ
グメントは生体内に存在する天然型ポリペプチド、すな
わち自己ポリペプチドであり、抗体の産生は懸念されな
い。

【００１５】そこで本発明者らは、このようなエラスタ
ーゼ阻害蛋白を提供すべく鋭意努力した結果、遺伝子工
学的手法により製造した天然型ＳＬＰＩが好中球エラス
ターゼの酵素によって特異的な限定分解を受けること、
この限定分解を受けたポリペプチド、すなわち配列番号
１で表わされるアミノ酸配列又はそれと生物学的に同等
のアミノ酸配列を有するポリペプチドが優れたエラスタ
ーゼ阻害活性、カテプシンＧ阻害活性を有し、かつトリ
プシン阻害活性を実質的に示さないことを知見し、本発
明に到達したものである。

【００１６】また、遺伝子工学的手法により製造した天
然型ＳＬＰＩが正常人唾液中の酵素によって特異的な限
定分解を受けること、この限定分解を受けたポリペプチ
ド、すなわち配列番号２で表わされるアミノ酸配列又は
それと生物学的に同等のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドが優れたエラスターゼ阻害活性、カテプシンＧ阻害
活性を有し、かつトリプシン阻害活性を実質的に示さな
いことを知見し、本発明に到達したものである。

【００１７】従来、カルボキシメチル化した直鎖状ＳＬ
ＰＩを酵素で限定分解したことについての報告が成され
ている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８３，６６９２
―６６９６，１９８６）。しかしながらこの場合に用い
られたＳＬＰＩは阻害活性を有しない非天然型ＳＬＰＩ
であり、当然その結果得られたフラグメントも、非天然
型ＳＬＰＩであって、そのエラスターゼ阻害活性、カテ
プシンＧ阻害活性、トリプシン阻害活性や抗原性につい
ては何の記載も示唆もなされていない。

【００１８】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、配列
番号１あるいは配列番号２で表わされるアミノ酸配列も
しくはエラスターゼ阻害活性を有するその一部分又はそ
れと生物学的に同等のアミノ酸配列を有するエラスター
ゼ阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマー、下記式
［Ｉ］ Ａ―Ｘ―Ｂ …［Ｉ］ （式中、Ａは担体蛋白を表わし；Ｂは上記配列番号１あ
るいは配列番号２で表わされるアミノ酸配列もしくはエ
ラスターゼ阻害活性を有するその一部分又はそれらと生
物学的に同等のアミノ酸配列を有するエラスターゼ阻害
活性ポリペプチド又はそのホモポリマーからなる目的蛋
白を表わし；Ｘは該目的蛋白を変性しない条件下で、化
学的方法又は生物学的方法により切断可能なアミノ酸配
列を有する架橋ポリペプチドを表わす。）で表わされる
融合蛋白、かかるエラスターゼ阻害活性ポリペプチド又
はそのホモポリマーの製造方法、担体蛋白をコードする
遺伝子と、配列番号１あるいは配列番号２で表わされる
アミノ酸配列もしくはエラスターゼ阻害活性を有するそ
の一部分又はそれらと生物学的に同等のアミノ酸配列を
有するエラスターゼ阻害活性ポリペプチドをコードする
遺伝子が、目的蛋白を変性しない条件下で化学的方法又
は生物学的方法により切断可能なアミノ酸配列を有する
架橋ペプチド又はそのホモポリマーをコードする遺伝子
を介して結合している融合蛋白遺伝子、かかる融合蛋白
遺伝子を含む融合蛋白遺伝子発現型プラスミドもしくは
組み換え微生物細胞、及びかかるエラスターゼ阻害活性
ポリペプチド又はそのホモポリマーの治療有効量と医薬
的に許容される担体とからなる医薬製剤、好中球過剰活
性化に起因する疾患、なかでも、例えばエラスターゼ及
び／又はカテプシンＧ等の、好中球放出プロテアーゼに
起因する疾患の治療剤である。

【００１９】従って、本発明は、配列番号１あるいは配
列番号２で表わされるアミノ酸配列もしくはエラスター
ゼ阻害活性を有するその一部分又はそれと生物学的に同
等のアミノ酸配列を有するエラスターゼ阻害活性ポリペ
プチド又はそのホモポリマーを提供する。

【００２０】本発明において「生物学的に同等のアミノ
酸配列」とは、本発明の目的であるエラスターゼ阻害活
性及びカテプシンＧ阻害活性を示し、実質的にトリプシ
ン阻害活性を示さず、かつヒトに対する抗原性がないか
又は実質的に低減化されているという性質を有する、配
列番号１あるいは配列番号２のアミノ酸配列において、
その１個若しくは複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／
又は置換がなされたエラスターゼ阻害活性ポリペプチド
又はそのホモポリマーをいう。

【００２１】ここで、「実質的にトリプシン阻害活性を
示さず」とは、本発明の目的とするエラスターゼ阻害活
性、カテプシンＧ阻害活性によるヒト疾患治療薬として
用いる場合に妨げとなるようなトリプシン阻害活性に起
因する生理的作用をほとんど生じない、という意味であ
り、例えば本発明の実施例の測定方法で天然ＳＬＰＩの
トリプシン阻害活性と比較した場合にそのトリプシン阻
害活性が約１／１０以下であり、また本発明の蛋白のト
リプシン阻害活性がそのエラスターゼ阻害活性の約１／
１００以下であることをいう。

【００２２】また、本発明のエラスターゼ阻害活性ポリ
ペプチドのホモポリマーとは、例えば複数のエラスター
ゼ阻害活性ポリペプチドがそのアミノ酸配列中のＣｙｓ
残基を介してジスルフィド結合によって生成する二量体
等の、オリゴマー等をいう。

【００２３】かかる本発明のエラスターゼ阻害活性ポリ
ペプチド又はそのホモポリマーは、配列番号１あるいは
配列番号２で表わされるアミノ酸配列もしくはエラスタ
ーゼ阻害活性を有するその一部分、又はそれと生物学的
に同等のアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチド
はこの配列番号１で表わされるアミノ酸配列から明らか
なように、Ｃｙｓ残基がカルボキシメチル化等されてい
ないＣｙｓ残基であるが、本発明のポリペプチドとして
は好ましくは、このＣｙｓ残基が相互に本発明の阻害活
性に必要なジスルフィド結合を形成しているものが挙げ
られる。なかでも、４つのジスルフィド結合を有するも
のが好ましい。

【００２４】以下、本発明のエラスターゼ阻害活性ポリ
ペプチドを表わす場合に、天然ＳＬＰＩのアミノ酸配列
のＮ末端からの番号を用いて配列番号１で表わされるエ
ラスターゼ阻害ポリペプチドを（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩと表わすことがあるが、この（Ａｒｇ
⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）のアミノ酸配列は配列番号１の配列表
における（Ａｒｇ¹ ―Ａｌａ⁵⁰）に対応している。そこ
で、４つのジスルフィド結合を有するものとしては、例
えば天然ＳＬＰＩにおけるジスルフィド結合と同様に、
Ｃｙｓ⁶⁴―Ｃｙｓ⁹³，Ｃｙｓ⁹²―Ｃｙｓ⁸⁰，Ｃｙｓ⁷¹―
Ｃｙｓ⁹⁷，及びＣｙｓ ⁸⁶―Ｃｙｓ¹⁰¹ 、即ち、配列番号
１の配列表においては、Ｃｙｓ⁷ ―Ｃｙｓ³⁶，Ｃｙｓ³⁵
―Ｃｙｓ²³，Ｃｙｓ¹⁴―Ｃｙｓ⁴⁰，及びＣｙｓ²⁹―Ｃｙ
ｓ⁴⁴に対応する、の４つのジスルフィド結合を有するポ
リペプチドが好ましいものとして挙げることができる。
しかしながら、本発明の目的とする阻害活性及び低減化
された抗原性を有する限りにおいて、少なくとも１ケ以
上のジスルフィド結合を有するポリペプチドあるいはホ
モポリマーであってもよい。

【００２５】また、天然ＳＬＰＩのアミノ酸配列のＮ末
端からの番号を用いて配列番号２で表わされるエラスタ
ーゼ阻害ポリペプチドを（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩと表わすことがあるが、この（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）のアミノ酸配列は配列番号１の配列表における
（Ａｒｇ¹ ―Ａｌａ⁴⁹）に対応している。そこで、４つ
のジスルフィド結合を有するものとしては、例えば天然
ＳＬＰＩにおけるジスルフィド結合と同様に、Ｃｙｓ⁶⁴
―Ｃｙｓ⁹³，Ｃｙｓ⁹²―Ｃｙｓ⁸⁰，Ｃｙｓ⁷¹―Ｃｙ
ｓ⁹⁷，及びＣｙｓ⁸⁶―Ｃｙｓ¹⁰¹ 、即ち、配列番号２の
配列表においては、Ｃｙｓ⁶ ―Ｃｙｓ³⁵，Ｃｙｓ³⁴―Ｃ
ｙｓ²²，Ｃｙｓ¹³―Ｃｙｓ³⁹，及びＣｙｓ²⁸―Ｃｙｓ⁴³
に対応する、の４つのジスルフィド結合を有するポリペ
プチドが好ましいものとして挙げることができる。しか
しながら、本発明の目的とする阻害活性及び低減化され
た抗原性を有する限りにおいて、少なくとも１ケ以上の
ジスルフィド結合を有するポリペプチドあるいはホモポ
リマーであってもよい。

【００２６】本発明はさらに、前記ポリペプチドの製造
のための中間体として有用な、下記式［Ｉ］ Ａ―Ｘ―Ｂ …［Ｉ］ （式中、Ａは担体蛋白を表わし；Ｂは配列番号１もしく
は配列番号２で表わされるアミノ酸配列もしくはエラス
ターゼ阻害活性を有するその一部分又はそれらと生物学
的に同等のアミノ酸配列を有するエラスターゼ阻害活性
ポリペプチドもしくはエラスターゼ阻害活性を有するそ
の一部分、又はそのホモポリマーからなる目的蛋白を表
わし；Ｘは該目的蛋白を変性しない条件下で、化学的方
法又は生物学的方法により切断可能なアミノ酸配列を有
する架橋ポリペプチドを表わす。）で表わされる融合蛋
白を提供する。

【００２７】また本発明は、上記のエラスターゼ阻害活
性ポリペプチド又はそのホモポリマーの製造方法であっ
て、上記式［Ｉ］で表わされる融合蛋白を、化学的方法
又は生物学的方法によって処理することからなる方法、
並びに上記のエラスターゼ阻害活性ポリペプチド又はそ
のホモポリマーの製造方法であって、配列番号１あるい
は配列番号２で表わされるアミノ酸配列を構成するアミ
ノ酸を用いて化学的に合成することからなる方法を提供
する。

【００２８】さらに本発明は、担体蛋白をコードする遺
伝子と、配列番号１あるいは配列番号２で表わされるア
ミノ酸配列もしくはエラスターゼ阻害活性を有するその
一部分又はそれらと生物学的に同等のアミノ酸配列を有
するエラスターゼ阻害活性ポリペプチドをコードする遺
伝子が、目的蛋白を変性しない条件下で化学的方法又は
生物学的方法により切断可能なアミノ酸配列を有する架
橋ペプチド又はそのホモポリマーをコードする遺伝子を
介して結合している融合蛋白遺伝子、及びかかる融合蛋
白遺伝子を含む融合蛋白遺伝子発現型プラスミドもしく
は組換え微生物細胞を提供する。

【００２９】さらにまた本発明は、上記のエラスターゼ
阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマーの治療有効
量と医薬的に許容される担体とからなる医薬製剤、並び
に好中球過剰活性化に起因する疾患、なかでも、例えば
エラスターゼ及び／又はカテプシンＧ等の、好中球放出
プロテアーゼに起因する疾患の治療剤を提供する。

【００３０】本発明の式［Ｉ］で表わされる融合蛋白
は、その手法自体は公知の遺伝子組換えの手段によっ
て、例えばＷＯ８９／０６２３９号明細書に例示された
融合蛋白を得る方法であって、その融合蛋白遺伝子を用
いて該融合蛋白を発現するプラスミドを構築し、かかる
プラスミドを微生物宿主細胞例えば大腸菌に導入して微
生物細胞を培養後、例えば遠心分離により、形質転換さ
れた微生物細胞を集め該細胞から融合蛋白を単離する方
法と同様の方法によって得ることができる。

【００３１】本発明のエラスターゼ阻害活性ポリペプチ
ドの製造のための中間体として有用な融合蛋白を表わす
前記式［Ｉ］において、Ａで表わされる担体蛋白及びＸ
で表わされる架橋ポリペプチドとしては、例えばＷＯ８
９／０６２３９号明細書に例示されたものを挙げること
ができる。Ａで表わされる担体蛋白としては、融合蛋白
の発現量が高く、微生物細胞内で封入体として存在する
ため単離、精製が容易であるヒト成長ホルモン及びその
一部分または、Ｔ７ファージｇｅｎｅ１０蛋白（Studie
r, F. et al, J. Mol. Biol.１８９，１１３，１９８
６）及びその一部分を用いるのが好ましい。ヒト成長ホ
ルモンとしては、メチオニルヒト成長ホルモンやアミノ
酸配列が天然のものと一部異なる改変体も含まれる。ヒ
ト成長ホルモンの一部を担体蛋白として用いる場合、ヒ
ト成長ホルモンのアミノ酸残基１位のＰｈｅから１３９
位のＰｈｅまでのポリペプチド断片及び１位のＰｈｅか
ら１２２位のＧｌｎまでのポリペプチド断片が好まし
い。

【００３２】Ｘで表わされる架橋ポリペプチドとして
は、目的蛋白を変性しない条件下で、化学的方法又は生
物学的方法により切断可能なアミノ酸配列であって、公
知の物を含むあらゆる認識アミノ酸配列が含まれる。

【００３３】化学的方法によって切断可能なアミノ酸配
列としては、例えばヒドロキシルアミンで開裂可能な架
橋ペプチドとしてＡｓｎ―Ｇｌｙ（P. Pornstein, Met
h. Enzymol., ４７，１３２，１９７７）、その２〜１
０個の反復配列があげられる。生物学的方法により切断
可能なアミノ酸配列としては、例えば酵素的に切断可能
なアミノ酸配列としてトロンビンにより開裂される（B.
Blombackら、ＢＢＡ １１５，３７１―３９６，１９６
６；T. Takagi ら、Biochemistry１３，７５０―７５
６，１９７４等に報告されている）アミノ酸配列、なか
でもＶａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒｇ又はＬｅｕ―Ｖａｌ―Ｐｒ
ｏ―Ａｒｇ、あるいはこれらの２〜１０個の反復配列
等、エンテロキナーゼにより開裂されるアミノ酸配列、
例えばＡｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ｌｙｓ、ある
いはこれらの２〜１０個の反復配列等目的蛋白のアミノ
酸１次配列、立体構造に影響を受けることなく目的蛋白
を確実に放出、分離できるものであれば特に制限なく用
いることができる。これらの担体蛋白、架橋ポリペプチ
ドには、遺伝子発現の際等の必要に応じてシグナル等を
適宜付加することもできる。

【００３４】かかるＸで表わされる架橋ポリペプチドと
Ｂで表わされるエラスターゼ阻害活性ポリペプチド又は
そのホモポリマーからなる目的蛋白とは、該目的蛋白の
アミノ末端のＡｒｇとＸのそれぞれＧｌｙ、Ａｒｇ、Ａ
ｒｇ、又はＬｙｓのいずれかとが結合していることにな
る。

【００３５】本発明のエラスターゼ阻害活性ポリペプチ
ドを製造するには、前記式［Ｉ］で表わされる融合蛋白
を架橋アミノ酸又はペプチドＸにおいて、開裂せしめれ
ばよい。

【００３６】かかる開裂を酵素処理によって行う場合に
は、Ｘのアミノ酸配列中の特異的なアミノ酸（単一又は
複数）を認識し、特定のペプチド結合を優先的に切断す
るエンドペプチダーゼを用いる方法等がある。エンドペ
プチダーゼを用いる方法としては、例えばトロンビン又
はその同族体を用いることができ、かかるトロンビン又
はその同族体としては、例えばヒトトロンビン、ウシト
ロンビン、ウマトロンビン、ブタトロンビン等を挙げる
ことができる。この場合にはＸとしてＶａｌ―Ｐｒｏ―
Ａｒｇ、Ｌｅｕ―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒｇ、又はこれら
の反復配列を使用するのが好ましい。また、エンテロキ
ナーゼ又はその同族体を用いることもでき、かかるエン
テロキナーゼ又はその同族体としては、例えばβ―ガラ
クトシダーゼからエンケファリンを放出させるためのウ
シエンテロキナーゼ（V.N. Dobrynin ら、Bioory-Khim
１３，１１９―１２１，１９８７）、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼからヒト心房性ナトリ
ウム尿排泄因子を放出させるためのエンテロキナーゼ
（A. Hobden ら、ＷＰＩ８７―０８８５０９／１３）等
を挙げることができる。この場合にはＸとして例えばＡ
ｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ｌｙｓ、又はこれらの
反復配列を使用するのが好ましい。

【００３７】かかる開裂を化学処理によって行う場合に
は、例えばヒドロキシルアミン又は、その同族体を用い
ることができ、かかるヒドロキシルアミン又はその同族
体としては、例えばアルキルヒドロキシルアミン、ヒド
ラジン等を挙げることができる。この場合のＸとして
は、Ａｓｎ―Ｇｌｙ、又はこの反復配列を使用するのが
好ましい。

【００３８】本発明の式［Ｉ］で表わされる融合蛋白
は、その手法自体は公知の遺伝子組み換えの手段によっ
て生産される。この場合に、本発明においては、ヒト成
長ホルモン又はその断片からなる担体蛋白をコードする
遺伝子と、前記目的蛋白又はその一部分をコードする遺
伝子が、目的蛋白を変性しない条件下で、化学的方法又
は生物学的方法により切断可能なアミノ酸配列を有する
ペプチド又はポリペプチドをコードする遺伝子を介して
結合している融合蛋白遺伝子を用いることを特徴とす
る。

【００３９】（Ｍｅｔ^-1Ｐｈｅ¹ ―Ｐｈｅ¹³⁹ ）ヒト成
長ホルモン断片と（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ断
片ポリペプチドとが、トロンビン切断配列を介して結合
している融合蛋白を発現するプラスミド（ｐＧＨ―Ｔ５
９）を構築する方法を図５に示す。

【００４０】（Ｍｅｔ^-1Ｐｈｅ¹ ―Ｐｈｅ¹³⁹ ）ヒト成
長ホルモン断片と（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ断
片ポリペプチドとが、エンテロキナーゼ切断配列を介し
て結合している融合蛋白を発現するプラスミド（ｐＧＨ
―Ｅ５９）を構築する方法を図７に示す。

【００４１】（Ｍｅｔ^-1Ｐｈｅ¹ ―Ｐｈｅ¹³⁹ ）ヒト成
長ホルモン断片と（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ断
片ポリペプチドとがトロンビン切断配列を介して結合し
ている融合蛋白を発現するプラスミド（ｐＧＨ―Ｔ５
８）を構築する方法を図１４に示す。

【００４２】（Ｍｅｔ^-1Ｐｈｅ^-1―Ｐｈｅ¹³⁹ ）ヒト成
長ホルモン断片と（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ断
片ポリペプチドとが（Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ
―Ｌｙｓ）エンテロキナーゼ切断配列遺伝子を介して結
合している融合蛋白発現遺伝子を含む融合蛋白遺伝子発
現型プラスミド（ｐＧＨ―Ｅ５９）を鋳型ＤＮＡとし、
合成ＤＮＡフラグメント（図１４に示す，）及び合
成ＤＮＡフラグメント（図１４に示す，）を各々プ
ライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅を繰
り返し、次いで、得られた増幅物をＢｇｌIIで切断して
ヒト成長ホルモン断片―架橋ポリペプチド―（Ａｒｇ⁵⁸
―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ断片からなる遺伝子フラグメン
トを得る。

【００４３】一方、他のｐＧＨ―Ｅ５９をＢｇｌIIで切
断してＴｒｐプロモータを含むＢｇｌII―ＢｇｌII切断
遺伝子フラグメントを得、このフラグメントの５′末端
脱リン酸化反応を行う。このようにして得られた２つの
フラグメントをligationして、ヒト成長ホルモン断片と
（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ断片の融合蛋白発現
型プラスミドｐＧＨ―Ｔ５８を得る。図１４においてｐ
ＧＨ―Ｔ５８は、トロンビン切断配列を有する融合蛋白
発現プラスミドである。

【００４４】なお、ｐＧＨ―Ｔ５９を構築した方法と同
様に、ヒト成長ホルモン発現プラスミドｐＧＨ―Ｌ９
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,８１，５９５６，１９
８４）のヒト成長ホルモン遺伝子後半１／３を除去した
遺伝子フラグメントとＳＬＰＩサブクローンｐＵＣ―Ｄ
６（ＷＯ８９／０６２３９）を制限酵素で切断等して得
られた（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ断片とを、合
成ＤＮＡリンカー（例えば、トロンビン切断配列遺伝子
を含むＤＮＡフラグメント）とligationして、上記と同
様に発現型プラスミドｐＧＨ―Ｔ５８を得ることもでき
る。

【００４５】本発明において、ヒト成長ホルモン又はそ
の一部をコードする遺伝子とを連結する融合部の認識ア
ミノ酸配列をコードする遺伝子は、担体蛋白であるヒト
成長ホルモン又はその一部分の遺伝子と同じリーディン
グフレームのもので、発現した融合蛋白を、前記化学的
方法又は生物学的方法で処理することにより容易に開裂
し、目的蛋白を分離できるアミノ酸配列であれば特に限
定はない。例えば（Ａｓｎ―Ｇｌｙ）_ｎ、（Ａｓｐ―Ａ
ｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ｌｙｓ）_ｎ、（Ｌｅｕ―Ｖａｌ
―Ｐｒｏ―Ａｒｇ）_ｎ、（Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒｇ）_ｎ
（ｎは１〜１０の整数を示す）をコードする遺伝子であ
ればいかなるものでもよい。

【００４６】担体蛋白とこれら認識アミノ酸配列をコー
ドする遺伝子の間に、リーディングフレームを合わせる
ために合成ＤＮＡリンカーを挿入することもできる。

【００４７】また、（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ
遺伝子断片として、この（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩポリペプチド断片に対応する遺伝子、又はその２〜
１０個の反復遺伝子を用いることもできる。

【００４８】本発明の融合蛋白遺伝子は、適当なプロモ
ータ及びＳＤ配列の下流につなぐことにより、発現型遺
伝子とすることができる。使用可能なプロモータとし
て、トリプトファン・オペロン・プロモータ（ｔｒｐプ
ロモータ）、ラクトース・オペロン・プロモータ（ｌａ
ｃプロモータ）、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ、
Ｉｐｐプロモータ、Ｔ７プロモータ等があげられ、とり
わけｔｒｐプロモータを用い、ＳＤ配列と翻訳開始シグ
ナルＡＴＧの間隔を最適化したｐＧＨ―Ｌ９の５′フラ
ンキング配列が好適である（特開昭６０―２３４５８４
号公報）。

【００４９】融合蛋白を効率的に発現させるための融合
蛋白遺伝子発現型ＤＮＡは、ｔｒｐプロモータ、ＳＤ配
列、翻訳開始コドン、次いでヒト成長ホルモン又はその
一部分をコードする遺伝子、次いで架橋ペプチドをコー
ドする遺伝子、そして目的蛋白又はその一部分をコード
する遺伝子、さらに翻訳終了コドンがこの順序で連結し
たものが好ましい。かかる融合蛋白遺伝子発現型ＤＮＡ
は、適当なプラスミド、例えばｐＢＲ３２２及びこれに
類縁のプラスミドに挿入することにより、融合蛋白遺伝
子発現型プラスミドが作成できる。好ましいプラスミド
はｐＢＲ３２２である。

【００５０】本発明の融合蛋白遺伝子を発現させるため
の微生物宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、放
線菌などの原核細胞；例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞等
の哺乳動物細胞、例えばカイコ等の昆虫細胞、例えば酵
母細胞等の真核細胞があげられる。とりわけ大腸菌細胞
が好ましい。

【００５１】上記融合蛋白遺伝子発現型プラスミドは、
例えば、公知の方法（M.V. Norgardら、Gene, ３，２７
９，１９７８）を用いて微生物宿主細胞、例えば大腸菌
細胞に導入することができる。

【００５２】このようにして得られた形質転換された微
生物を、それ自体は公知の方法、例えばＷＯ８９／０６
２３９号明細書に記載された培地の種類、培養条件で培
養し、培養後形質転換された微生物細胞を集めて、これ
を破砕し、融合蛋白を単離・精製する方法、で融合蛋白
を得ることができる。

【００５３】得られた融合蛋白は前記の化学的方法又は
生物学的方法で処理することによって開裂することがで
き、必要によってはスルホ化してスルホ化分子としてか
ら処理して無傷の目的蛋白を分離・放出できる。

【００５４】本発明のエラスターゼ阻害活性ポリペプチ
ド又はそのポリマーの製造方法のうち、ヒト白血球エラ
スターゼ阻害蛋白（ＳＬＰＩ）を酵素的方法で処理する
か、又は配列番号１あるいは配列番号２で表わされるア
ミノ酸配列を構成するアミノ酸を用いて化学的に合成す
ることからなる方法は、以下の方法によって実施するこ
とができる。

【００５５】本発明のＳＬＰＩを酵素的に処理する方法
におけるＳＬＰＩとしては、ヒト白血球エラスターゼ阻
害蛋白であって人間の唾液、鼻汁、精液、子宮粘液など
に存在するヒトＳＬＰＩ、例えば耳下腺分泌液由来のＳ
ＬＰＩ（R.C. Thompson ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, ８３，６６９２−６６９６，１９８６；特表昭６２
―５０１２９１号明細書）等の天然型ヒトＳＬＰＩ；天
然型ヒトＳＬＰＩのアミノ酸配列をコードする遺伝子を
用いて遺伝子工学的手法によって得られた組換え天然型
ヒトＳＬＰＩ；あるいはＷＯ８９／０６２３９号明細書
に記載されている遺伝子工学的手法によって得られた組
換え天然型（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ヒトＳＬＰＩ断片
等があげられる。

【００５６】また、酵素処理に用いる酵素としては、上
記人間の唾液、鼻汁、精液、子宮粘液等に存在する酵
素、例えばヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ等が
あげられるが、これらの酵素を含む人間の唾液等を用い
ることもできる。

【００５７】かかる酵素的方法における処理条件として
は、約２０〜４５℃で３０分〜７２時間、作用させるの
が好ましい。

【００５８】また、本発明のエラスターゼ阻害活性ポリ
ペプチド又はそのホモポリマーの製造方法のうち配列番
号１あるいは配列番号２で表わされるアミノ酸配列を構
成するアミノ酸を用いて化学的に合成する方法として
は、例えばそれ自体従来公知の方法であるかかるアミノ
酸を原料として自動ペプチド合成機を用いて合成するこ
とができる。

【００５９】このようにして得られる目的蛋白であるエ
ラスターゼ阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマー
は、それ自体公知の分離、精製法を適当に組み合わせて
反応液中より分離、精製することができる。これらの公
知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶
解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法
及びＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの
主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマ
トグラフィー、イオン交換高速液体クロマトグラフィー
などの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマ
トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用す
る方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する
方法などがあげられる。また得られた目的蛋白等が生物
学的な活性を有する高次構造を有していない場合には、
それ自体公知のジスルフィド結合形成反応を用い、目的
蛋白を生物学的な活性を有する高次構造蛋白にすること
もできる。

【００６０】かくして得られた目的蛋白が、ジスルフィ
ド結合を介して高次構造を形成している場合、例えば、
チャンスらの方法（R.E. Chance ら、Peptides：第７回
米国ペプチドシンポジウムProceedings (D.H. Rich及び
E.Gross 編）、７２１―７２８、Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL.（１９８１）参照）あるいは本発明者ら
が既に開示した特願平２―１４１５２３号明細書に記載
の方法を用いることにより、天然の蛋白と同様な高次構
造を有する生物学的に活性な蛋白とすることができる。
トロンビン開裂法でスルホ化法を経由する方法では、ス
ルホ化目的蛋白を直接あるいは還元後分子内ジスルフィ
ド結合を形成させ天然の蛋白と同一の高次構造を有する
生物学的に活性な蛋白とすることができる。

【００６１】本発明のエラスターゼ阻害活性ポリペプチ
ドにはエラスターゼ阻害活性及びカテプシンＧ阻害活性
を示し、実質的にトリプシン阻害活性を示さないという
性質を有し、かつ天然型由来のものであるために抗原性
がないか、又は実質的に抗原性が低減化されていると予
想されるので、各種の疾患、例えば好中球過剰活性化に
起因する疾患、なかでも、例えばエラスターゼ及び／又
はカテプシンＧ等の、好中球放出プロテアーゼに起因す
る疾患、例えば炎症性疾患、血小板凝集血栓症、又は虚
血後再かん流障害の治療薬、特に炎症性疾患のなかでも
呼吸器疾患、例えば慢性気管支炎、びまん性汎細気管支
炎、肺気腫、気管支拡張症、細菌性肺炎、副鼻腔炎、Ａ
ＲＤＳ（呼吸窮迫症候群）、喘息、及び間質性肺炎、等
の治療薬として利用できる。

【００６２】本発明のエラスターゼ阻害活性ポリペプチ
ドを医薬製剤又は治療剤として利用する場合には、必要
に応じて凍結乾燥により粉末とすることができ、その際
には、例えばソルビトール、マンニトール、デキストロ
ース、マルトース、グリセロール、ヒト血清アルブミン
等の安定剤を加えることもできる。

【００６３】本発明の医薬製剤及び治療剤は経気道的又
は経口的に、あるいは静脈内、皮下、筋肉内、経皮、直
腸内等の非経口的に投与することができる。

【００６４】経気道投与の剤型としては液剤及び粉剤か
らなる吸入製剤又はスプレー形態の製剤が知られてい
る。必要に応じて添加物として制菌剤、抗酸化剤を加え
ることができる。

【００６５】経口投与の剤型としては、例えば錠剤、丸
剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、カプセル剤などが挙げられ
る。

【００６６】錠剤の形態にするには、例えば乳糖、デン
プン、結晶セルロースなどの賦形剤；カルボキシメチル
セルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどの結
合剤；アルギン酸ナトリウム、デンプン、結晶セルロー
スなどの崩壊剤等を用いて通常の方法により成形するこ
とができる。

【００６７】丸剤、散剤、顆粒剤も同様に上記の賦形剤
等を用いて通常の方法によって成形することができる。

【００６８】液剤、懸濁剤は、例えばトリアセチンなど
のグリセリンエステル類、エタノール等のアルコール類
などを用いて通常の方法によって成形することができ
る。カプセル剤は顆粒剤、散剤又は液剤などをゼラチン
などのカプセルに充填することによって成形することが
できる。

【００６９】皮下、筋肉内、静脈内投与の剤型として
は、水性又は非水性溶液剤などの形態にある注射剤が知
られている。水性溶液剤としては生理食塩水などが用い
られる。非水溶性溶液剤は、例えばプロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、オリーブ油、オレイン酸
エチルなどが用いられ、これらに必要に応じて防腐剤、
安定剤などが添加される。注射剤はバクテリア除去フィ
ルターを通す濾過、殺菌剤の配合等の処理を適宜行うこ
とによって無菌化される。

【００７０】経皮投与の剤型としては、例えば軟膏剤、
クリーム剤などが挙げられ、軟膏剤はヒマシ油、オリー
ブ油などの脂肪油；ワセリン等を用いて、クリーム剤は
脂肪油；ジエチレングリコール、ソルビタンモノ脂肪酸
エステルなどの乳化剤等を用いて通常の方法によって成
型することができる。

【００７１】直腸投与のためには、ゼラチンソフトカプ
セルなどの通常の坐剤が用いられる。

【００７２】本発明のポリペプチドの投与量は、投与経
路、患者の年令、性別、疾患の程度によって異なるが、
通常１〜５０００mg／回程度であり、投与回数は通常１
〜３回／日であり、このような条件を満足するように製
剤を調整するのが好ましい。

【００７３】

【実施例】以下、参考例、実施例により本発明をより具
体的に説明するが、本発明をこれらの実施例に限定する
ものでないことはいうまでもない。

【００７４】なお、参考例、実施例において採用された
種々の遺伝子工学的手法は、ＷＯ８９／０６２３９号明
細書第２４〜２６頁に記載された方法で行った。

【００７５】

【参考例１】（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩの製造 ＷＯ８９／０６２３９号明細書の実施例に従って（Ａｓ
ｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩを製造した。

【００７６】すなわち、（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩをコードするＤＮＡフラグメントを適当なコドンを
用いて化学合成した。トロンビンで切断し得るＬｅｕ―
Ｖａｌ―Ｐｒｏ―ＡｒｇをコードするＤＮＡ配列を介し
て、ヒト成長ホルモン遺伝子を（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩに融合した。このようにして得られた
発現ベクター（プラスミドｐＧＨ―ＴＥ）をＥ．ｃｏｌ
ｉ ＨＢ １０１に導入した。形質転換された細胞（大
腸菌ＨＢ １０１株（ｐＧＨ―ＴＥ））を培養して、包
合体を得、トロンビン処理及びＳ―Ｓ再構成さらにクロ
マトグラフィーで精製し、目的とする（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩを得た。得られた（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩは、そのＣｙｓ⁶⁴―Ｃｙｓ⁹³，Ｃｙｓ⁹²
―Ｃｙｓ⁸⁰，Ｃｙｓ⁷¹―Ｃｙｓ⁹⁷，及びＣｙｓ⁸⁶―Ｃｙ
ｓ¹⁰¹ のＣｙｓ残基が相互に４個のジスルフィド結合を
形成しているものであることをＭａｓｓスペクトル及び
２次元ＮＭＲによって確認した。

【００７７】なお、上記大腸菌ＨＢ １０１株（ｐＧＨ
―ＴＥ）は、微工研条寄２１６８号（ＦＥＲＭ ＢＰ―
２１６８）として、工業技術院微生物工業研究所に１９
８８年１２月１日付で国際寄託されているものである。

【００７８】

【参考例２】ＳＬＰＩの製造 ＳＬＰＩのアミノ酸配列（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A，８３，６６９２―６６９６，１９８６）をコードす
るＤＮＡフラグメントを化学合成した。ＷＯ８９／０６
２３９号明細書の実施例と同様の方法で、トロンビンで
切断し得るＬｅｕ―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒｇをコードす
るＤＮＡ配列を介して、ヒト成長ホルモン遺伝子にＳＬ
ＰＩをコードするＤＮＡを融合した。このようにして得
られた発現ベクター（プラスミドｐＧＨ―ＳＬＰＩ）を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ １０１に導入した。形質転換され
た細胞（大腸菌ＨＢ １０１株（ｐＧＨ―ＳＬＰＩ））
を培養して、包合体を得、トロンビン処理及びＳ―Ｓ再
構成さらにクロマトグラフィーで精製し、目的とするＳ
ＬＰＩを得た。得られたＳＬＰＩのエラスターゼに対す
る阻害定数（Ｋｉ）は２．５×１０^-10 Ｍであり、天然
から単離されたＳＬＰＩと同等の活性（特表昭６２―５
０１２９１号明細書）を示した。

【００７９】

【実施例１】正常人唾液によるＳＬＰＩの分解物の同定 （１）正常人唾液を０．２２μｍのフィルター（マイレ
クスＧＳ、ミリポア社）で限外濾過した後、参考例２で
得られたＳＬＰＩを１mg／mlの濃度に溶解し、３７℃で
３０日経過迄保温した。濾過後の唾液、及びＳＬＰＩを
生理食塩水（フィシザルツ、扶桑薬品工業）に１mg／ml
の濃度に溶解したものを、対照検体として、同様に３７
℃で３０日経過迄保温した。

【００８０】これら各検体を経時的に採取した後、Ｔｒ
ｉｓ―ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）、ＳＤＳ、２―
メルカプトエタノール、グリセロールをそれぞれ最終濃
度６０ｍＭ、２w/w ％、４w/w ％、１０w/w ％になるよ
うに加え、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ（U.K. Laemmli, Nature,
２２７，６８０，１９７０）を行った。その結果を図１
に示す。なお、泳動後のゲルはクーマーシーブリリアン
トブルーにて染色を行った。図中、レーンＮｏ．２バン
ドａ（分子量約１３，０００）はＳＬＰＩのバンドを示
している。

【００８１】図１から明らかなように、３７℃保温第１
日以降、分子量約１０，０００（バンドｂ）に、また、
第３日目以降、分子量約７，０００（バンドｃ）及び分
子量約３，０００（バンドｅ）に新たなバンドが出現し
た。さらに、ＳＬＰＩに想到する分子量約１３，０００
のバンドａは、保温時間の延長につれ減少するが、バン
ドｂ，ｃ，ｅは、増加することが確認された。なお、生
理食塩水中のＳＬＰＩは、保温時間の経過にも拘らず、
分子量約１３，０００のバンドを維持した（レーンＮ
ｏ．９）。また、３７℃保温３０日におけるＳＤＳ―Ｐ
ＡＧＥの結果より、分子量約５，５００のバンドｄが確
認された。

【００８２】（２）次に、かくして得られたポリアクリ
ルアミドゲル中のポリペプチドを、Milli Blot―ＳＤＥ
装置（ミリポア社）を用いて、電気的にメンブレン（Im
mobilon 、ミリポア社）に転写した。転写後、メンブレ
ンを０．１w/w ％クーマーシーブル／４０w/w ％メタノ
ール／１w/w ％酢酸にて染色し、水洗した。風乾後、バ
ンドｂ，ｃ，ｄ，ｅを切り出し、Applied Biosystemsプ
ロテインシーケンサー（Applied Biosystems社製；４７
０Ａ）にて、Ｎ末端よりＰＴＨ―アミノ酸の切断を行
い、ＰＴＨアナライザー（Applied Biosystems社製、１
２０Ａ）にて解析し、Ｎ末端から最長１０番目までのア
ミノ酸配列を決定した。その結果を表１に示す。なお、
バンドｅのＮ末端アミノ酸配列は２通り存在した。

【００８３】

【表１】

【００８４】表１より、バンドｂ，ｃはＳＬＰＩのＴｙ
ｒ²¹からのアミノ酸配列、またバンドｄはＡｒｇ⁵⁹から
のアミノ酸配列、バンドｅはＬｅｕ⁷⁴又はＭｅｔ⁷³から
のＳＬＰＩアミノ酸配列と完全に一致した。従って、正
常人唾液中でのＳＬＰＩの選択的な切断部位は、Ａｒｇ
²⁰―Ｔｒｙ²¹の間、Ａｒｇ⁵⁸―Ａｒｇ⁵⁹の間、Ｌｅｕ⁷²
―Ｍｅｔ⁷³の間、Ｍｅｔ⁷³―Ｌｅｕ⁷⁴の間であることが
確認された。

【００８５】また、バンドｂ，ｃ，ｄ，ｅのＮ末端アミ
ノ酸配列（表１）及び分子量（図１）より、それぞれポ
リペプチドは下記の表２に示すようなポリペプチドであ
ることが確認された。

【００８６】

【表２】

【００８７】

【実施例２】正常人唾液による（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩの
分解物の同定 （１）実施例１と同様の方法で、（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩを唾液処理し、各検体を経時的に採取し
たときのＳＤＳ―ＰＡＧＥの結果を図２に示す。参考例
１で得られた（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ（分子
量約５，８００、バンドｆ）を正常人唾液中で３７℃に
て保温した際、１２時間目より、分子量約５，５００の
バンドｇが新たに出現した。保温時間延長につれてバン
ドｆは徐々に消失し、９６時間後には、バンドｇのみと
なった。なお、生理食塩水中の（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩは、３７℃、９６時間後においても分
子量約５，８００の単一のバンドｆであった。

【００８８】（２）次に、このバンドｇを実施例１と同
様の方法でメンブレンに電気的に転写した後、Ｎ末端ア
ミノ酸配列を解析した。その結果は表３のとおりであ
る。

【００８９】

【表３】

【００９０】この結果より、バンドｇのＮ末端アミノ酸
配列は、Ａｒｇ⁵⁹以降のＳＬＰＩアミノ酸配列であっ
た。

【００９１】以上より、（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩは、正常人唾液中において、Ａｒｇ⁵⁸―Ａｒｇ⁵⁹の
間で切断され、すべて（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰ
Ｉに変換することが確認できた。

【００９２】

【実施例３】本発明のポリペプチド：（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩの製造 配列番号２で表わされる本発明のポリペプチドを、自動
ペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ社製、４
３１Ａ）により合成し、逆相クロマトグラフィー（ＹＭ
Ｃ―PackＯＤＳ―ＡＰ，ＹＭＣ社）にて精製した。得ら
れたペプチドは非天然型の分子内、分子間ジスルフィド
結合を有しているので、（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩスルホ化誘導体へと変換し、全てのジスルフィド結
合を切断した後、リホールディング反応により、天然型
分子内ジスルフィド結合を有する（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩを得た。すなわち、自動ペプチド合成機
により合成した配列番号２のポリペプチド２０mgを０．
２５Ｍ Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．２）、３．
５Ｍ尿素、０．３５Ｍ Ｎａ₂ ＳＯ₃ ，０．０６Ｍテト
ラチオン酸ナトリウム２０mlに溶解し、室温で２時間反
応させた後、反応溶液を逆相クロマトグラフィー（Prot
ein Ｃ₄ ，ＶＹＤＡＣ社）にて分離精製後、凍結乾燥し
（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩスルホ化誘導体１８
mgを得た。

【００９３】なお、リホールディング反応及び精製は特
願平２―１４１５２３号に記載の方法と同様の方法で実
施した。

【００９４】このスルホ化誘導体１０mgを０．１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）、０．２ｍＭ酸化
型グルタチオン、１．５ｍＭ還元型グルタチオン５０ml
に溶解し、４℃で７日間反応させた。次いで、Ｓ―Seph
arose （ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー（Protein Ｃ₄ ，ＶＹＤ
ＡＣ社）で精製し、リホールディングで副生成したオリ
ゴマーを分離した。次いで凍結乾燥し、（Ａｒｇ⁵⁹―Ａ
ｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ ７．８mgを得た。得られたポリペ
プチドを逆相クロマトグラフィー（Protein Ｃ₄ ，ＶＹ
ＤＡＣ社）で分析したところ単一ピークとして溶出さ
れ、単一物質であることを確認した。その溶出パターン
を図３に示す。

【００９５】

【実施例４】（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのエラスターゼ及び
トリプシン阻害活性の測定 測定方法を次に示す。

【００９６】（１）試薬溶液緩衝液 ；０．１Ｍ Ｎ―（２―ヒドロキシエチル）ピペ
ラジン―Ｎ′―２―エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、
１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧ６０００（ｐＨ
７．５）酵素溶液 ；下記各酵素を表４に示す終濃度の９倍濃度に
なるように上記緩衝液に溶かす。 （イ）ヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ（ＥＰＣ
社製、フナコシ薬品） （ロ）ウシ脾臓トリプシン（シグマ社製）基質溶液 ；上記の酵素（イ）に対し下記（ハ）の基質、
（ロ）に対しては（ニ）の基質をそれぞれ表４に示す終
濃度の９倍濃度になるように、（ハ）はＤＭＳＯ；上記
緩衝液が１：９、（ニ）はＤＭＳＯのみに溶解して基質
溶液とする。 （ハ）ＭｅＯ―Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｖａ
ｌ―ｐＮＡ（Bachem社製） （ニ）Ｂｚ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Bachem社製）

【００９７】

【表４】

【００９８】（２）方法 ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの穴に１２０μｌ
の緩衝液を入れ、次に２０μｌの実施例３で得られた
（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのサンプル溶液を加
え、次に２０μｌの酵素溶液を加えて、この混合物を３
７℃で１時間攪拌した。次に２０μｌの基質溶液を加え
て３７℃で１５分間攪拌し、発色せしめ、４０５ｎｍに
て吸光度を測定した。対照としてＳＬＰＩを使用し、溶
液の濃度を変化させ、阻害活性を測定して、５０％の阻
害濃度を示す阻害蛋白濃度（ＩＣ₅₀値）を求めた。結果
を表５に示した。

【００９９】なお、同様の方法で測定した実施例３で副
生したオリゴマーのエラスターゼに対するＩＣ₅₀値は
３．０×１０^-7Ｍであった。

【０１００】

【表５】

【０１０１】

【実施例５】（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのカテプシンＧ阻害
活性の測定 実施例４と同様の方法でカテプシンＧ阻害活性を測定し
た。ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの穴に１２０
μｌの緩衝液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，１．０Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，０．１％ＰＥＧ６０００ ｐＨ７．５）を入れ、
次に２０μｌの実施例３で得られた（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのサンプル溶液を加え、次に２０μｌの
カテプシンＧ溶液（終濃度１．１×１０^-8Ｍ）を加え
て、この混合物を３７℃で１時間攪拌した。次に２０μ
ｌの基質溶液（Ｓｕｃ―Ｐｈｅ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮ
Ａ；終濃度１．１ｍＭ）を加えて３７℃で２時間攪拌
し、発色せしめ、４０５ｎｍにて吸光度を測定した。サ
ンプル溶液の濃度を変化させ、阻害活性を測定して、５
０％の阻害濃度を示す阻害蛋白濃度（ＩＣ₅₀値）を求め
た結果、（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのＩＣ₅₀の
値は１．１×１０^-8Ｍであり、カテプシンＧに対し強い
阻害活性を示した。

【０１０２】

【実施例６】ヒト成長ホルモン断片ポリペプチドと（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩポリペプチドの融合蛋白発現プラスミ
ドの構築とその形質転換体の調製 （１）架橋ペプチドがトロンビン切断配列を有する発現
プラスミド （Ｍｅｔ^-1Ｐｈｅ¹ ―Ｐｈｅ¹³⁹ ）ヒト成長ホルモン発
現プラスミドｐＧＨ―Ｌ９（M. Ikeharaら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, ８１，５９５６，１９８４）を制
限酵素ＢｇｌIIとＳａｌＩ（宝酒造）で切断し、アガロ
ース電気泳動で分離、ゲルより約４．７ｋｂｐのＤＮＡ
断片をGENECLEAN II ＫＩＴ（ＢＩＯ１０１社製）を用
いて回収した。

【０１０３】また、ＳＬＰＩサブクローンｐＵＣ―Ｄ６
（ＷＯ８９／０６２３９）を制限酵素ＭｌｕＩとＸｈｏ
Ｉ（宝酒造）で切断し、アガロース電気泳動で分離、ゲ
ルより約０．１５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＭＥＲｍａｉｄ
^TMｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて回収した。

【０１０４】一方、トロンビン切断配列遺伝子を含むＤ
ＮＡフラグメント，（図４）を全自動合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ社モデル３９２）にて合成し
た。合成ＤＮＡフラグメントはＭＥＧＡＬＡＢＥＬ
^TH（宝酒造）を用いて１ｍＭ ＡＴＰ存在下で５′末端
をリン酸化した後、合成ＤＮＡフラグメントとアニー
リングを行い、２本鎖ＤＮＡを得た。アニーリング反応
は、９０℃で５分間加熱後室温になるまで放置した。

【０１０５】融合蛋白発現プラスミドの構築はまず最初
にｐＧＨ―Ｌ９ ＢｇｌII―ＳａｌＩ約４．７ｋｂｐ
ＤＮＡ断片とスロンビン切断部位を含む２本鎖合成ＤＮ
Ａをモル比１：１０の割合でligation kit（宝酒造）を
用いてligation反応を行った後、ウルトラフリーＣ３Ｈ
Ｋ ＵＦフィルター付き（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にて濃
縮した。さらにｐＵＣ―Ｄ６ ＭｌｕＩ―ＸｈｏＩ約
０．１５ｋｂｐ ＤＮＡ断片とligation反応を行った後
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（宝酒造）
に導入し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で一晩培養
し、目的の融合蛋白発現プラスミドを含む形質転換体
（ＨＢ／ＧＨ―Ｔ５９）を得た。形質転換体よりプラス
ミドＤＮＡを抽出、ＱＩＡＧＥＮ（ＢＩＯ１０１社製）
で精製し、ヒト成長ホルモン断面と（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ断片ポリペプチドの融合蛋白発現プラス
ミドｐＧＨ―Ｔ５９を取得した（図５）。ＤＮＡ塩基配
列はプラスミドＤＮＡを鋳型にして、Dye Terminator k
it（日立）を用いて、日立製蛍光式自動ＤＮＡシーケン
サーＳＱ３０００を用いて直接確認した。

【０１０６】（２）架橋ペプチドがエンテロキナーゼ切
断配列を有する発現プラスミド ｐＧＨ―Ｔ５９（図５）を鋳型ＤＮＡとし、合成ＤＮＡ
フラグメント，（図６）をプライマーとしてポリメ
ラーゼ連鎖反応；ＰＣＲ法（Saiki ら、Science,２３
９，４８７―４９１，１９８５）にて増幅、その増幅物
を再び合成ＤＮＡフラグメント，（図６）をプライ
マーとしてＰＣＲ法にて増幅した後、ＢｇｌII（宝酒
造）にて切断し、約１１５ｂｐのフラグメントを得た。

【０１０７】なお、ＰＣＲ法の条件は、９３℃、５分間
変性した後、１サイクルを９３℃，１．５分間、５７
℃，２分間、７２℃，２分間として３０サイクル行い、
最後に７２℃，７分間にて反応を止めた。

【０１０８】一方、ｐＧＨ―Ｔ５９をＢｇｌII（宝酒
造）にて切断後、アガロースゲル電気泳動により、約
４．６ｋｂｐのＢｇｌII―ＢｇｌII断片を分離、GENECL
EAN II（ＢＩＯ１０１社製）を用いて回収した。この約
４．６ｋｂｐのＢｇｌII―ＢｇｌII断片を宝酒造のプロ
トコールにそってBacterial Alkaline Phosphatase（宝
酒造）を用い、５′末端の脱リン酸化反応を行った。

【０１０９】脱リン酸化した約４．６ｋｂｐのＢｇｌII
―ＢｇｌII断片と、ＰＣＲ法にて増幅した約１１５ｂｐ
のＢｇｌII―ＢｇｌII断片をligation kit（宝酒造）を
用いてligation反応を行った後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１コンピテントセル（宝酒造）に導入し、アンピシリ
ン含有ＬＢ寒天培地上で培養し、目的の融合蛋白発現プ
ラスミドを含む形質転換体（ＨＢ／ＧＨ―Ｅ５９）を得
た。

【０１１０】形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、ＱＩＡＧＥＮ（ＢＩＯ１０１社製）にて精製し、ヒ
ト成長ホルモン断片ポリペプチドとエンテロキナーゼ断
片配列遺伝子をもつ（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ
ポリペプチドの融合蛋白発現プラスミドｐＧＨ―Ｅ５９
を取得した（図７）。

【０１１１】塩基配列は、プラスミドＤＮＡを鋳型にし
て、Dye Terminator kit（日立）を用いて日立製蛍光式
自動ＤＮＡシーケンサーＳＱ３０００にて直接確認し
た。

【０１１２】

【実施例７】融合蛋白遺伝子の発現 実施例６で得られた融合蛋白遺伝子発現プラスミドｐＧ
Ｈ―Ｔ５９を含有する大腸菌ＨＢ１０１株を、０．２５
％グルコース、３mg／mlイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ社
製）２０mg／mlのカザミノ酸（ＤＩＦＣＯ社製）を含む
改変型Ｍ９培地（１％（ＮＨ₄ ）₂ ＨＰＯ₄ ―０．３％
Ｋ₂ ＳＯ₄ ―０．３％ＮａＣｌ）をオートクレーブ滅菌
した後に、ＭｇＳＯ₄ およびＣａＣｌ₂ を最終濃度が１
ｍＭとなるように無菌的に加えた培養液５００mlに接種
し、一晩培養した。

【０１１３】この一晩培養液を、前記と同様の培養液１
０リットルに対し、ＯＤ６６０が０．２となるように加
え、３７℃でジャー・ファーメンター培養を行った。Ｏ
Ｄ６６０が２０となった時に、３―β―インドールアク
リル酸を最終濃度が１５０μｇ／mlとなるように培養液
中に添加し、さらに３７℃で４時間培養を続けた。その
後、遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、０．５Ｍト
リス・バッファー（ｐＨ８．０）で洗浄した。

【０１１４】洗浄後の菌体を、リゾチーム（菌体湿重量
の１／２００）およびＥＤＴＡ・３Ｎａ（菌体湿重量の
１／２０）を含む０．５Ｍトリス・バッファーに懸濁さ
せ、超音波発生装置（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、CELL DISRU
PTOR 900）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離し、目
的とする融合蛋白を沈殿部分に封入体（inclusion bod
y）として得た。

【０１１５】なお、ｐＧＨ―Ｔ５９を含有する大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株（ＨＢ／ＧＨ―Ｔ５９）は、微工研条寄３８
６３号（ＦＥＲＭ ＢＰ―３８６３）として、工業技術
院微生物工業研究所に１９９２年５月２０日付で国際寄
託されている。

【０１１６】なお、ｐＧＨ―Ｅ５９を含有する大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株（ＨＢ／ＧＨ―Ｅ５９）は、微工研条寄３８
６１号（ＦＥＲＭ ＢＰ―３８６１）として、工業技術
院微生物工業研究所に１９９２年５月２０日付で国際寄
託されている。

【０１１７】

【実施例８】融合蛋白のシステイン残基のスルホ化とスルホ化融合蛋
白のトロンビンによる切断反応 実施例７で得られた融合蛋白２５ｇを０．５Ｍトリス・
バッファー（ｐＨ８．０）２００mlに懸濁させた後、尿
素２４０ｇを加え可溶化させ、次いで終濃度が０．７Ｍ
となるように亜硫酸ナトリウム（和光純薬）を加えて４
５℃で２０分間反応させた。さらに終濃度０．１Ｍとな
るように４―チオン酸ナトリウム（シグマ社）を加え
て、４５℃で２０分間反応させた。１０ｍＭトリス・バ
ッファー（ｐＨ８．０）を加え、反応溶液を１リットル
とした後、この容量が２００mlになるまで限外濾過（富
士フィルター；ＦＩＬＴＲＯＮ）を行う操作を５回繰り
返した。このようにして、得られたスルホ化融合蛋白溶
液（限外濾過膜を通過しなかった部分）に対し、３００
０Ｕのウシスロンビン（持田製薬）を加え、３７℃で３
時間反応させた。次いで、限外濾過により、３００Ｋフ
ィルターを通過した溶液に含まれる（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩスルホ化誘導体を、逆相ＨＰＬＣ（ＶＹ
ＤＡＣ社；Protein Ｃ₄ ）で精製し、凍結乾燥した。得
られた（Ａｒｇ ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩスルホ化誘導
体のＮ末端アミノ酸配列を、プロテイン・シーケンサー
（Applied Biosystems４７７Ａ）により決定した。

【０１１８】

【実施例９】（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩスルホ化誘導体の活
性分子へのRefolding（ジスルフィド化反応） 実施例８で得られた（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ
スルホ化誘導体１ｇを５リットルのRefolding 緩衝液
（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．３
ｍＭ酸化型グルタチオン、１．５ｍＭ還元型グルタチオ
ン）に溶解させ、４℃で２日間反応させ、次いで反応液
をS-Sepharose （ファルマシア製）イオン交換クロマト
グラフィーに付し、その溶出パターンを図８に示す。
０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出する目的の画分を、逆相ＨＰ
ＬＣ（ＶＹＤＡＣ，Protein Ｃ₄ ）でさらに精製した
後、凍結乾燥し、活性型（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩを得た。

【０１１９】

【実施例１０】（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのセリンプロテアー
ゼ阻害活性の測定（１） 測定方法を次に示す。

【０１２０】（１）試薬溶液 緩衝液：０．１Ｍ―（２―ヒドロキシエチル）ピペラジ
ン―Ｎ′―２―エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）０．５
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素濃度：下記各酵素を表６に示す濃度の９倍濃度にな
るように上記緩衝液に溶かす。 Ａ．ヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ（ＥＰＣ社
製、フナコシ薬品） Ｂ．ウシ脾臓トリプシン（シグマ社製） Ｃ．ウシ脾臓キモトリプシン（シグマ社製） Ｄ．ブタ脾臓エラスターゼ（シグマ社製） Ｅ．ヒト由来カテプシンＧ（ＥＰＣ社製、フナコシ薬
品） 基質溶液：上記の酵素Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ．Ｅそれぞれに対
し下記ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅの基質をそれぞれ表６に示す
濃度の９倍になるようにＤＭＳＯ：上記緩衝液（１：
９）溶液に溶解して（ＤＭＳＯ最終濃度が緩衝液中１０
％となる）基質溶液とする。 ａ．ＭｅＯ―Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｖａｌ
―ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製） ｂ．Ｂｚ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製） ｃ．Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡ
（Ｂａｃｈｅｍ社製） ｄ．Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ａｌａ―ｐＮＡ（半井化
学薬品） ｅ．Ｓｕｃ―Ｐｈｅ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡ（Ｂａｃ
ｈｅｍ社製）

【０１２１】

【表６】

【０１２２】（２）方法 ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの穴に１２０μｌ
の緩衝液を入れ、次に２０μｌの実施例９で得られた
（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのサンプル溶液を加
え、次に２０μｌの酵素溶液を加えて、この混合物を３
７℃で１０分間反応した。次に２０μｌの基質溶液を加
えて３７℃で発色し、４０５ｎｍにて吸光度を測定し
た。

【０１２３】対照としてＳＬＰＩを使用し、溶液の濃度
を変化させ、阻害活性を測定して５０％の阻害濃度を示
す阻害蛋白濃度（ＩＣ₅₀値）を求めた。結果は表７に示
した。

【０１２４】

【表７】

【０１２５】

【実施例１１】（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのセリンプロテアー
ゼ阻害活性の測定（２） 下記に示す４種の酵素における、（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ及び対照としてＳＬＰＩの５０％阻害を
示す阻害蛋白濃度（ＩＣ₅₀）値を求めた。 Ｆ．ヒト血漿由来スロンビン（シグマ社製） Ｇ．ヒト血漿由来プラスミン（シグマ社製） Ｈ．ヒト血漿由来カリクレイン（プロトジェン社製、フ
ナコシ薬品） Ｉ．ブタ由来ＦＸａ（第一化学薬品） 測定方法を以下に示す。

【０１２６】（１）試薬溶液 緩衝液；各酵素における緩衝液を下記に示す。

【０１２７】トロンビン、ＦＸａ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
―ＨＣｌ、７．５ｍＭ ＥＤＴＡ―２Ｎａ、１７５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ８．４ プラスミン；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．４ カリクレイン；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、３６１ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．０２mg／ml、ポリブレン、ｐＨ７．
８ 酵素濃度；各酵素の最終濃度は表８に示した。

【０１２８】

【表８】

【０１２９】基質溶液：上記の酵素Ｆ．Ｇ．Ｈ．Ｉそれ
ぞれに対し下記ｆ，ｇ，ｈ，ｉの基質を用い、これらの
最終濃度は表８に示した。 ｆ．Ｈ・Ｄ―Ｐｈｅ―Ｐｉｐ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Kabi V
itrum 社製） ｇ．Ｈ・Ｄ―Ｖａｌ―Ｌｅｕ―Ｌｙｓ―ｐＮＡ（Kabi V
itrum 社製） ｈ．Ｈ・Ｄ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Kabi V
itrum 社製）

【０１３０】

【化１】

【０１３１】（２）方法 ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの穴に実施例９で
得られた（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ溶液を加
え、次に酵素溶液を加えて、この混合物を３７℃で１０
分間保温した。次に基質溶液を加えて３７℃で発色し、
４０５ｎｍにて吸光度を測定した。

【０１３２】対照としてＳＬＰＩを使用した。

【０１３３】（３）結果 （Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩとＳＬＰＩは最終濃
度１×１０^-5Ｍ以下では、上記４種の酵素すべてに対し
て阻害活性は認められなかった。

【０１３４】

【実施例１２】（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩの阻害物質定数（Ｋ
ｉ）値 測定方法を次に示す。

【０１３５】（１）試薬溶液 緩衝液：０．１Ｍ Ｎ―（２―ヒドロキシエチル）ピペ
ラジン―Ｎ′―２―エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、
１．０Ｍ ＮａＣｌ ０．１％ポリエチレングリコール
（ｐＨ７．５） 酵素溶液：下記各酵素を表９に示す濃度の９倍濃度にな
るように上記緩衝液に溶かす。 （イ）ヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ（ＥＰＣ
社製、フナコシ薬品） （ロ）ウシ脾臓トリプシン（シグマ社製） 基質溶液：上記の酵素（イ）（ロ）それぞれに対し下記
（ニ）（ホ）の基質をそれぞれ表９に示す濃度の９倍に
なるように（ニ）はＤＭＳＯ：上記緩衝液が１：９に溶
解して、（ホ）はＤＭＳＯに溶解して基質溶液とする。 （ニ）ＭｅＯ―Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｖａ
ｌ―ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製） （ホ）Ｂｚ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製）

【０１３６】

【表９】

【０１３７】（２）方法 ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの穴に１２０μｌ
の緩衝液を入れ、次に２０μｌの実施例９で得られた
（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのサンプル溶液を加
え、次に２０μｌの酵素溶液を加えて、この混合物を２
５℃で１時間反応した。次に２０μｌの基質溶液を加え
て２５℃で発色せしめ、４０５ｎｍにて吸光度を測定し
た。対照としてＳＬＰＩを使用した。

【０１３８】この結果よりHenderson らの方法（Hender
son, P.J.F. (1972), Biochem. J.１２７，３２１―３
３３）に従って本発明の（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩの阻害定数（Ｋｉ）値を求めた。結果は表１０に示
す。

【０１３９】表１０より実施例９で得られた活性型（Ａ
ｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのエラスターゼ阻害活性
に対するトリプシン阻害活性の相対活性比（トリプシン
に対する阻害定数ｋｉ（Ｔ）／エラスターゼに対する阻
害定数ｋｉ（Ｅ））は約１４，０００であった。すなわ
ち（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩは実質的にトリプ
シン阻害活性を示さなかった。

【０１４０】

【表１０】

【０１４１】

【実施例１３】ヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼによるＳＬＰＩ
の処理 ヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ（ＥＰＣ社製、
フナコシ薬品）およびＳＬＰＩをそれぞれ緩衝液（０．
１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＰＥ
Ｇ６０００、ｐＨ７．５）で溶解し、一定濃度のＳＬＰ
Ｉ溶液に対し、エラスターゼ溶液を加え、３７℃で保温
した。これら各検体を適時採取した後、Ｔｒｉｓ―ＨＣ
ｌバッファー（ｐＨ６．８）、ＳＤＳ、２―メルカプト
エタノール、グリセロール、クーマーシーブリリアント
ブルーをそれぞれ最終濃度５０ｍＭ、４w/v ％、２v/v
％、１２v/v ％、０．０１w/v ％になるように加え、Ｔ
ｒｉｃｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を電極緩衝液として用いた
ＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Schagger,
H., Anal. Biochem.１６６，３６８，１９８７）を行っ
た。泳動後のゲルはクーマーシーブリリアントブルーＧ
―２５０で染色した、５０v/v ％メタノール／１０v/v
％酢酸にて脱色した。

【０１４２】（１）１００μＭのＳＬＰＩに対し、エラ
スターゼを最終濃度２００μＭ加え、１９２時間まで３
７℃で保温した結果を図９に示す。サンプルは経時的に
採取した。図９中レーン２バンドａのＳＬＰＩ（ＳＤＳ
―ＰＡＧＥ上で分子量約１４０００）は、３７℃保温４
５分以降より顕著に減少した。それに伴い、バンドｂ
（分子量約１１，０００）は４５分目より出現し、６時
間目まで認められた。また、分子量約５，５００のバン
ドｃは４５分目より徐々に増加し、３７℃６時間〜８日
目に至るまで、ほぼ一定のバンドの濃さを示した。

【０１４３】（２）ＳＬＰＩ ５０μＭに対し、エラス
ターゼを最終濃度２００μＭから２倍稀釈ずつ３．１３
μＭまでの７濃度を加えた後、３７℃で１時間保温した
際の結果を図１０に示す。図１０中レーン２のバンドｅ
（分子量約１４，０００）はＳＬＰＩのバンドを示して
いる。図１０より明らかなように、ＳＬＰＩ ５０μＭ
に対し、エラスターゼが最終濃度１００μＭ以上におい
て、バンドｅのＳＬＰＩの顕著な分解が認められた。バ
ンドｆ（分子量約１１，０００）及びバンドｇ（分子量
約５，５００）は明らかに新規なバンドであり、バンド
ｅの消失に伴い出現していることより、ＳＬＰＩ分解物
と考えられた。

【０１４４】（３）次に、かくして得られたポリアクリ
ルアミドゲル中のポリペプチドを、Milli Blot―ＳＤＥ
装置（ミリポア社）を用いて、電気的にメンブレン（Im
mobilon ―Ｐ^SQ、ミリポア社）に転写した。転写後、メ
ンブレンを０．１w/v ％クーマーシーブルー／４０v/v
％メタノール／１v/v ％酢酸にて染色し、水洗した。風
乾後対象とするバンドを切り出し、Applied Biosystems
プロテインシーケンサー（Applied Biosystems社製；４
７７Ａ）にて、Ｎ末端よりアミノ酸を切断し、ＰＴＨ化
後、ＰＴＨ―アミノ酸アナライザー（Applied Biosyste
ms社製、１２０Ａ）にて解析し、Ｎ末端アミノ酸配列を
決定した。その結果を表１１に示す。

【０１４５】

【表１１】

【０１４６】表１１よりバンドｂおよびｆはＳＬＰＩの
Ａｌａ¹⁶からのアミノ酸配列、またバンドｃ及びｇはＡ
ｒｇ⁵⁸からのアミノ酸配列と完全に一致した。従ってヒ
ト喀痰由来エラスターゼでのＳＬＰＩの選択的な切断部
位は、Ｓｅｒ¹⁵―Ａｌａ¹⁶の間、Ｔｈｒ⁵⁷―Ａｒｇ⁵⁸の
間であることが確認された。

【０１４７】また、バンドｂおよびｆ、バンドｃおよび
ｇのＮ末端アミノ酸配列（表１１）及び分解パターンと
分子量（図９及び図１０）より、それぞれのポリペプチ
ドは下記の表１２に示すようなポリペプチドであること
が確認された。

【０１４８】

【表１２】

【０１４９】

【実施例１４】正常人唾液及びヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ
によるＳＬＰＩの同時処理 （１）ＳＬＰＩ及びヒト喀痰由来多形核白血球エラスタ
ーゼ（ＥＰＣ社製、フナコシ薬品）を０．２２μｍのフ
ィルター（マイレクスＧＳ、ミリポア社）で限外濾過し
た正常人唾液にて、それぞれ最終濃度５０μＭに溶解し
た。この混合溶液を３７℃で保温し、経時的に採取した
後、実施例１と同様にＳＤＳ―ＰＡＧＥにて解析した。
その結果を図１１に示す。図中、レーン２バンドＩにて
示したＳＬＰＩ（分子量約１４，０００）を等濃度のエ
ラスターゼが存在する唾液中にて３７℃で保温した際、
９６時間目には分子量約５，５００のバンドＪが新たに
出現した。

【０１５０】（２）次に、このバンドＪを実施例１と同
様の方法でメンブレンに電気的に転写した後、Ｎ末端ア
ミノ酸配列を解析した。その結果は表１３のとおりであ
る。この結果より、バンドＪのＮ末端配列はＡｒｇ⁵⁸以
降のＳＬＰＩアミノ酸配列と完全に一致した。

【０１５１】以上より、外分泌腺液である正常人唾液
中、かつＳＬＰＩと等濃度のエラスターゼ共存下におい
て、ＳＬＰＩはＴｈｒ⁵⁷―Ａｒｇ⁵⁸の間で切断されるこ
とが確認された。また、図１１のバンドＪの分子量（約
５，５００）及び表１３のＮ末端アミノ酸配列より、バ
ンドＪは（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩポリペプチ
ドであることが確認された。

【０１５２】

【表１３】

【０１５３】

【実施例１５】正常人唾液及びヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ
による（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩの同時処理 （１）実施例１４と同様の方法で、正常人唾液中に（Ａ
ｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ及びヒト喀痰由来多形核
白血球エラスターゼをそれぞれ最終濃度５０μＭ、１０
０μＭに溶解し、この混合溶液を３７℃にて保温した。
この検体を経時的に採取し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥにて解析
した。

【０１５４】その結果を図１２に示す。（Ａｓｎ⁵⁵―Ａ
ｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ（分子量約５，８００、バンドＬ）
を、正常人唾液とエラスターゼで同時処理することによ
り、バンドＬに比べわずかに分子量が低いバンドＭが３
７℃、１２時間目に新たに出現した。保温時間の延長に
つれて、バンドＬは徐々に減少し、４８時間目以降に
は、ほぼバンドＭのみとなった。

【０１５５】（２）次に、このバンドＭのＮ末端アミノ
酸配列を、実施例１と同様の方法で解析した。その結果
は表１４のとおりである。

【０１５６】この結果より、バンドＭのＮ末端アミノ酸
配列は、Ａｒｇ⁵⁸以降のＳＬＰＩアミノ酸配列であっ
た。

【０１５７】以上より、（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩは、正常人唾液とエラスターゼの同時処理におい
て、Ｔｈｒ⁵⁷―Ａｒｇ⁵⁸間で切断され、すべて（Ａｒｇ
⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩに変換することが確認でき
た。

【０１５８】

【表１４】

【０１５９】

【実施例１６】ヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼによる（Ａｓｎ
⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩの処理 実施例１３と同様の方法で、最終濃度１００μＭの（Ａ
ｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩに対し、最終濃度２００
μＭのエラスターゼにて３７℃、４８時間処理した。

【０１６０】この検体をＳＤＳ―ＰＡＧＥにて分離後、
実施例１と同様の方法で、電気的にフィルターに転写
し、分子量約５，５００に相当するバンドを切り出し、
Ｎ末端アミノ酸配列を解析した。その結果は表１５のと
おりである。

【０１６１】この結果より、３７℃、４８時間、エラス
ターゼ処理した（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのＮ
末端アミノ酸配列は、Ａｒｇ⁵⁸以降のＳＬＰＩアミノ酸
配列に変換した。

【０１６２】以上より、（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬ
ＰＩは、ヒト喀痰由来エラスターゼにより、Ｔｈｒ⁵⁷―
Ａｒｇ⁵⁸間で切断され、すべて（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩに変換することが確認できた。

【０１６３】

【表１５】

【０１６４】実施例１３〜１６の結果から（Ａｒｇ⁵⁸―
Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩが、天然型ＳＬＰＩカルボキシ末
端ポリペプチドであることが判る。

【０１６５】

【実施例１７】ヒト成長ホルモン断片ポリペプチド（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩポリペプチドの融合蛋白発現プラスミド
の構築とその形質転換体の調製 （Ｍｅｔ^-1Ｐｈｅ¹ ―Ｐｈｅ¹³⁹ ）ヒト成長ホルモン断
片ポリペプチドとエンテロキナーゼ切断配列遺伝子をも
つ（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩポリペプチドの融
合蛋白発現プラスミドｐＧＨ―Ｅ５９を鋳型ＤＮＡと
し、合成ＤＮＡフラグメント，（図１３）をプライ
マーとしてポリメラーゼ連鎖反応：ＰＣＲ法（Saiki,
R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Schare, S.J., Hi
guchi, R.,Hoen, G.T., Mullis, K.B. & Erlich, H.A.;
Science, ２３９， ４８７―４９１，１９８５）にて
増幅、その増幅物を再び合成ＤＮＡフラグメント，
（図１３）をプライマーとしてＰＣＲ法にて増幅した
後、ＢｇｌII（宝酒造）にて切断し、約１２０ｂｐのフ
ラグメントを得た。なおｐＧＨ―Ｅ５９は実施例６で得
られたものである。

【０１６６】なお、ＰＣＲ法の条件は、９３℃５分間変
性した後、１サイクルを９３℃１．５分間、５７℃２分
間、７２℃２分間として３０サイクル行い、最後に７２
℃７分間にて反応を止めた。

【０１６７】一方、ｐＧＨ―Ｅ５９をＢｇｌII（宝酒
造）にて切断後、アガロースゲル電気泳動により、約
４．６ｋｂｐのＢｇｌII―ＢｇｌII断片を分離、GENE C
LEAN II（ＢＩＯ１０１社製）を用い回収した。この約
４．６ｋｂｐのＢｇｌII―ＢｇｌII断片を宝酒造のプロ
トコールにそってBacterial Alkaline Phosphatase（宝
酒造）を用い、５′末端の脱リン酸化反応を行った。

【０１６８】脱リン酸化した約４．６ｋｂｐのＢｇｌII
―ＢｇｌII断片と、ＰＣＲ法にて増幅した約１１５ｂｐ
のＢｇｌII―ＢｇｌII断片をligation kit（宝酒造）を
用いてligation反応を行った後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１コンピテントセル（宝酒造）に導入し、アンピシリ
ン含有ＬＢ寒天培地上で培養し、目的の融合蛋白発現プ
ラスミドを含む形質転換体（ＨＢ／ＧＨ―Ｔ５８）を得
た。形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出、ＱＩＡＧ
ＥＮ（ＢＩＯ１０１社製）にて精製し、ヒト成長ホルモ
ン断片ポリペプチドとスロンビン切断配列遺伝子をもつ
（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩポリペプチドの融合
蛋白発現プラスミドｐＧＨ―Ｔ５８を取得した（図１
４）。

【０１６９】塩基配列は、プラスミドＤＮＡを鋳型にし
て、合成ＤＮＡをプライマーとし、Dye Terminetor kit
（日立）を用いて、日立製蛍光式自動ＤＮＡシーケンサ
ーＳＱ３０００にて直接確認した。

【０１７０】

【実施例１８】融合蛋白遺伝子の発現 実施例１７で得られた融合蛋白遺伝子発現プラスミドｐ
ＧＨ―Ｔ５８を含有する大腸菌ＨＢ１０１株を、０．２
５％グルコース、３mg／mlイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ
社製）２０mg／mlのカザミノ酸（ＤＩＦＣＯ社製）を含
む改変型Ｍ９培地（１％（ＮＨ₄ ）₂ ＨＰＯ₄ ―０．３
％Ｋ₂ ＳＯ₄ ―０．３％ＮａＣｌ）をオートクレーブ滅
菌した後に、ＭｇＳＯ₄ およびＣａＣｌ₂ を最終濃度が
１ｍＭとなるように無菌的に加えた培養液５００mlに接
種し、一晩培養した。

【０１７１】この一晩培養液を、前記と同様の培養液１
０リットルに対し、ＯＤ６６０が０．２となるように加
え、３７℃でジャー・ファーメンター培養を行った。Ｏ
Ｄ６６０が２０となった時に、３―β―インドールアク
リル酸を最終濃度が１５０μｇ／mlとなるように培養液
中に添加し、さらに３７℃で４時間培養を続けた。その
後、遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、０．５Ｍト
リス・バッファー（ｐＨ８．０）で洗浄した。

【０１７２】洗浄後の菌体を、リゾチーム（菌体湿重量
の１／２００）およびＥＤＴＡ・３Ｎａ（菌体湿重量の
１／２０）を含む０．５Ｍトリス・バッファーに懸濁さ
せ、超音波発生装置（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、CELL DISRU
PTOR 900）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離し、目
的とする融合蛋白を沈殿部分に封入体（inclusion bod
y）として得た。

【０１７３】なお、ｐＧＨ―Ｔ５８を含有する大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株（ＨＢ／ＧＨ―Ｔ５８）は、微工研条寄３８
６２号（ＦＥＲＭ ＢＰ―３８６２）として、工業技術
院微生物工業研究所に１９９２年５月２０日付で国際寄
託されている。

【０１７４】

【実施例１９】融合蛋白のシステイン残基のスルホ化とスルホ化融合蛋
白のトロンビンによる切断反応 実施例１８で得られた融合蛋白２５ｇを０．５Ｍトリス
・バッファー（ｐＨ８．０）２００mlに懸濁させた後、
尿素２４０ｇを加え可溶化させ、次いで終濃度が０．７
Ｍとなるように亜硫酸ナトリウム（和光純薬）を加えて
４５℃で２０分間反応させた。さらに終濃度０．１Ｍと
なるように４―チオン酸ナトリウム（シグマ社）を加え
て、４５℃で２０分間反応させた。１０ｍＭトリス・バ
ッファー（ｐＨ８．０）を加え、反応溶液を１リットル
とした後、この容量が２００mlになるまで限外濾過（富
士フィルター；ＦＩＬＴＲＯＮ）を行う操作を５回繰り
返した。このようにして、得られたスルホ化融合蛋白溶
液（限外濾過膜を通過しなかった部分）に対し、３００
０Ｕのウシトロンビン（持田製薬）を加え、３７℃で３
時間反応させた。次いで、限外濾過により、３００Ｋフ
ィルターを通過した溶液に含まれる（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩスルホ化誘導体を、逆相ＨＰＬＣ（ＶＹ
ＤＡＣ社；Plotein Ｃ４）で精製し、凍結乾燥した。得
られた（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩスルホ化誘導
体のＮ末端アミノ酸配列を、プロテイン・シーケンサー
（Applied Biosystems４７７Ａ）により決定した。

【０１７５】

【実施例２０】（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩスルホ化誘導体の活
性分子へのRefolding（ジスルフィド化反応） 実施例１９で得られた（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰ
Ｉスルホ化誘導体１ｇを５リットルのRefolding 緩衝液
（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．３
ｍＭ酸化型グルタチオン、１．５ｍＭ還元型グルタチオ
ン）に溶解させ、４℃で２日間反応させ、次いで反応液
をS-Sepharose （ファルマシア製）イオン交換クロマト
グラフィーに付し、その溶出パターンを図１５に示す。
０．３ＭＮａＣｌで溶出する目的の画分を、逆相ＨＰＬ
Ｃ（ＶＹＤＡＣ，Protein Ｃ４）でさらに精製した後、
凍結乾燥し、活性型（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ
を得た。

【０１７６】

【実施例２１】（Ａｓｎ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのセリンプロテアー
ゼ阻害活性の測定（１） 測定方法を次に示す。

【０１７７】（１）試薬溶液 緩衝液：０．１Ｍ―（２―ヒドロキシエチル）ピペラジ
ン―Ｎ′―２―エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）０．５
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素濃度：下記各酵素を表１６に示す濃度の９倍濃度に
なるように上記緩衝液に溶かす。 Ａ．ヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ（ＥＰＣ社
製、ナフコシ薬品） Ｂ．ウシ脾臓トリプシン（シグマ社製） Ｃ．ウシ脾臓キモトリプシン（シグマ社製） Ｄ．ブタ脾臓エラスターゼ（シグマ社製） Ｅ．ヒト由来カテプシンＧ（ＥＰＣ社製、フナコシ薬
品） 基質溶液：上記の酵素Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅそれぞれに対
し下記ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅの基質をそれぞれ表１６に示
す濃度の９倍になるようにＤＭＳＯ：上記緩衝液（１：
９）溶液に溶解して（ＤＭＳＯ最終濃度が緩衝液中１０
％となる）基質溶液とする。 ａ．ＭｅＯ―Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｖａｌ
―ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製） ｂ．Ｂｚ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製） ｃ．Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡ
（Ｂａｃｈｅｍ社製） ｄ．Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ａｌａ―ｐＮＡ（半井化
学薬品） ｅ．Ｓｕｃ―Ｐｈｅ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡ（Ｂａｃ
ｈｅｍ社製）

【０１７８】

【表１６】

【０１７９】（２）方法 ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの穴に１２０μｌ
の緩衝液を入れ、次に２０μｌの実施例２０で得られた
（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのサンプル溶液を加
え、次に２０μｌの酵素溶液を加えて、この混合物を３
７℃で１０分間反応した。次に２０μｌの基質溶液を加
えて３７℃で発色し、４０５ｎｍにて吸光度を測定し
た。

【０１８０】対照としてＳＬＰＩを使用し、溶液の濃度
を変化させ、阻害活性を測定して５０％阻害濃度を示す
阻害蛋白濃度（ＩＣ₅₀値）を求めた。結果は表１７に示
した。

【０１８１】

【表１７】

【０１８２】

【実施例２２】（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのセリンプロテアー
ゼ阻害活性の測定（２） 下記に示す４種の酵素における、（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ及び対照としてＳＬＰＩの５０％阻害を
示す阻害蛋白濃度（ＩＣ₅₀）値を求めた。 Ｆ．ヒト血漿由来スロンビン（シグマ社製） Ｇ．ヒト血漿由来プラスミン（シグマ社製） Ｈ．ヒト血漿由来カリクレイン（プロトジェン社製、フ
ナコシ薬品） Ｉ．ブタ由来ＦＸａ（第一化学薬品） 測定方法を以下に示す。 （１）試薬溶液 緩衝液；各酵素における緩衝液を下記に示す。

【０１８３】トロンビン、ＦＸａ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
―ＨＣｌ、７．５ｍＭ ＥＤＴＡ―２Ｎａ、１７５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ８．４ プラスミン；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．４ カリクレイン；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、３６１ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．０２mg／ml、ポリブレン、ｐＨ７．
８ 酵素濃度；各酵素の最終濃度は表１８に示した。 基質溶液：上記の酵素Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉそれぞれに対し下
記ｆ，ｇ，ｈ，ｉの基質を用い、これらの最終濃度は表
１８に示した。 ｆ．Ｈ・Ｄ―Ｐｈｅ―Ｐｉｐ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Kabi V
itrum 社製） ｇ．Ｈ・Ｄ―Ｖａｌ―Ｌｅｕ―Ｌｙｓ―ｐＮＡ（Kabi V
itrum 社製） ｈ．Ｈ・Ｄ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Kabi V
itrum 社製）

【０１８４】

【化２】

【０１８５】

【表１８】

【０１８６】（２）方法 ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの穴に実施例２０
で得られた（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのサンプ
ル溶液を加え、次に酵素溶液を加えて、この混合物を３
７℃で１０分間保温した。次に基質溶液を加えて３７℃
で発色し、４０５ｎｍにて吸光度を測定した。

【０１８７】対照としてＳＬＰＩを使用した。

【０１８８】（３）結果 （Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩとＳＬＰＩは最終濃
度１×１０^-5Ｍ以下では上記４種の酵素全てに対して阻
害活性は認められなかった。

【０１８９】

【実施例２３】（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩの阻害物質定数（Ｋ
ｉ）値 測定方法を次に示す。

【０１９０】（１）試薬溶液 緩衝液：０．１Ｍ Ｎ―（２―ヒドロキシエチル）ピペ
ラジン―Ｎ′―２―エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、
１．０Ｍ ＮａＣｌ ０．１％ポリエチレングリコール
（ｐＨ７．５） 酵素溶液：下記各酵素を表１９に示す濃度の９倍濃度に
なるように上記緩衝液に溶かす。 （イ）ヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ（ＥＰＣ
社製、フナコシ薬品） （ロ）ウシ脾臓トリプシン（シグマ社製） 基質溶液：上記の酵素（イ）（ロ）それぞれに対し下記
（ニ）（ホ）の基質をそれぞれ表１９に示す濃度の９倍
になるように（ニ）はＤＭＳＯ：上記緩衝液が１：９に
溶解して（ホ）はＤＭＳＯにて溶解して基質溶液とす
る。 （ニ）ＭｅＯ―Ｓｕｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｖａ
ｌ―ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製） （ホ）Ｂｚ―Ａｒｇ―ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製）

【０１９１】

【表１９】

【０１９２】（２）方法 ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの穴に１２０μｌ
の緩衝液を入れ、次に２０μｌの実施例２０で得られた
（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのサンプル溶液を加
え、次に２０μｌの酵素溶液を加えて、この混合物を２
５℃で１時間反応した。次に２０μｌの基質溶液を加え
て２５℃で発色せしめ、４０５ｎｍにて吸光度を測定し
た。対照としてＳＬＰＩを使用した。

【０１９３】この結果よりHenderson らの方法（Hender
son, P.J.F. （１９７２），Biochem. J. １２７，３２
１―３３３）に従って本発明の（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩの阻害定数（Ｋｉ）値を求めた。結果
は表２０に示す。

【０１９４】表２０より実施例２０で得られた活性型
（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのエラスターゼ阻害
活性に対するトリプシン阻害活性の相対活性比（トリプ
シンに対する阻害定数ｋｉ（Ｔ）／エラスターゼに対す
る阻害定数ｋｉ（Ｅ））は約１２，０００であった。す
なわち（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩは実質的にト
リプシン阻害活性を示さなかった。

【０１９５】

【表２０】

【０１９６】

【配列表】

【０１９７】配列番号：１ 配列の長さ：５０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met 1 5 10 15 Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp 20 25 30 Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala 50

【０１９８】配列番号：２ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu 1 5 10 15 Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu 20 25 30 Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys 35 40 45 Ala 49

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における、ＳＬＰＩを正常人唾液で処
理した場合の限定分解物のＳＤＳ―ＰＡＧＥを示す。図
中、ａで示されたラインのバンドはＳＬＰＩ（ＭＷ約１
３，０００）のバンドを示し、同様にｂは限定分解物
（Ｔｙｒ²¹―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ、ｃは限定分解物
（（Ｔｙｒ²¹―Ｌｅｕ⁷²）又は（Ｔｙｒ²¹―Ｍｅｔ⁷³）
ＳＬＰＩ）、ｄは本発明のポリペプチド（ＭＷ約５，５
００）、ｅは（（Ｍｅｔ⁷³―Ａｌａ¹⁰⁷ ）又は（Ｌｅｕ
⁷⁴―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ）のバンドを示す。

【図２】実施例２における（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷ ）Ｓ
ＬＰＩを正常人唾液で処理した場合の限定分解物のＳＤ
Ｓ―ＰＡＧＥを示す。図中、ｆで示されたラインのバン
ドは（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁵ ）ＳＬＰＩ（ＭＷ約５，８
００）のバンドを示し、同様にｇは本発明のポリペプチ
ド（ＭＷ約５，５００）のバンドを示す。

【図３】実施例３における、製造された本発明のポリペ
プチド、（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ^{10 7} ）ＳＬＰＩの逆相クロ
マトグラフィーによる溶出パターンを示す。

【図４】実施例６（１）において用いたスロンビン切断
配列遺伝子を含むＤＮＡフラグメント（，）を表わ
す。

【図５】実施例６（１）における融合蛋白発現プラスミ
ドｐＧＨ―Ｔ５９の構築を表わす。

【図６】実施例６（２）において用いた合成ＤＮＡフラ
グメント（，，）を表わす。

【図７】実施例６（２）におけるｐＧＨ―Ｅ５９の構築
を表わす。

【図８】実施例９における活性型（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのS-Sepharose イオン交換クロマトグラ
フィーによる溶出パターンを示す。

【図９】実施例１３における、ＳＬＰＩを２倍量のヒト
多形核白血球エラスターゼ処理した場合のＳＤＳ―ＰＡ
ＧＥを示す。図中、ａで示されたラインのバンドはＳＬ
ＰＩ（ＭＷ約１４，０００）のバンドを示し、ｂは限定
分解物（Ａｌａ¹⁶―Ａｌａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ、同様にｃは
本発明のポリペプチド（ＭＷ約５，５００）のバンドを
示す。また、一群のバンドｄはエラスターゼを示す。

【図１０】実施例１３における、ＳＬＰＩをヒト多形核
白血球エラスターゼの濃度を変化させて処理した場合の
限定分解物のＳＤＳ―ＰＡＧＥを示す。レーン３から９
までは、５０μＭのＳＬＰＩに対し、エラスターゼを
３．１３μＭから２００μＭまで加えたことに相当し、
各レーン共に、５μｌずつ泳動した。図中、ｅで示され
たラインのバンドはＳＬＰＩ（ＭＷ約１４，０００）の
バンドを示し、ｆは限定分解物（Ａｌａ¹⁶―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩ、同様にｇは、本発明のポリペプチド
（ＭＷ約５，５００）のバンドを示す。また、一群のバ
ンドＨはエラスターゼを示す。

【図１１】実施例１４における、ＳＬＰＩを正常人唾液
とヒト喀痰由来多形核白血球エラスターゼで同時に処理
した場合の限定分解物のＳＤＳ―ＰＡＧＥを示す。図
中、Ｉで示されたラインのバンドはＳＬＰＩ（ＭＷ約１
４，０００）のバンドを示し、同様にＪは本発明のポリ
ペプチド（ＭＷ約５，５００）のバンドを示す。また、
一群のバンドＫはエラスターゼを示す。

【図１２】実施例１５における、（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ
¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩを正常人唾液とヒト喀痰由来多形核白血
球エラスターゼで同時に処理した場合の限定分解物のＳ
ＤＳ―ＰＡＧＥを示す。図中、Ｌで示されたラインのバ
ンドは（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ^{10 7} ）ＳＬＰＩ（ＭＷ約５，
８００）のバンドを示し、同様にＭは本発明のポリペプ
チド（ＭＷ約５，５００）のバンドを示す。また、一群
のバンドＮはエラスターゼを示す。

【図１３】実施例１７における合成ＤＮＡフラグメント
，，を示す。

【図１４】実施例１７における（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩポリペプチドの融合蛋白発現プラスミ
ドｐＧＨ―Ｔ５８の構築を示す。

【図１５】実施例２０における活性型（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌ
ａ¹⁰⁷ ）ＳＬＰＩのS-Sepharoseイオン交換クロマトグ
ラフィーによる溶出パターンを示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/12 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 9/99 15/15 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/06 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 須賀 哲也 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内 (72)発明者 竹内 明子 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内 (72)発明者 松本 洋一 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表わされるアミノ酸配列も
   しくはエラスターゼ阻害活性を有するその一部分又はそ
   れらと生物学的に同等のアミノ酸配列を有するエラスタ
   ーゼ阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマー。
2. 【請求項２】 該アミノ酸配列中のＣｙｓ残基が相互に
   阻害活性に必要なジスルフィド結合を形成している請求
   項１記載のエラスターゼ阻害活性ポリペプチド又はその
   ホモポリマー。
3. 【請求項３】 該ジスルフィド結合が、該アミノ酸配列
   中のＣｙｓ⁶⁴とＣｙｓ⁹³，Ｃｙｓ⁷¹とＣｙｓ⁹⁷，Ｃｙｓ
   ⁹²とＣｙｓ⁸⁰，及びＣｙｓ⁸⁶とＣｙｓ¹⁰¹ のＣｙｓ残基
   相互の結合である請求項２記載のエラスターゼ阻害活性
   ポリペプチド又はそのホモポリマー。
4. 【請求項４】 遺伝子組換え的手法によって得られたも
   のである請求項１〜３のうちいずれか１項に記載のエラ
   スターゼ阻害活性ポリペプチドまたはそのホモポリマ
   ー。
5. 【請求項５】 配列番号２で表わされるアミノ酸配列も
   しくはエラスターゼ阻害活性を有するその一部分又はそ
   れと生物学的に同等のアミノ酸配列を有するエラスター
   ゼ阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマー。
6. 【請求項６】 該アミノ酸配列中のＣｙｓ残基が相互に
   阻害活性に必要なジスルフィド結合を形成している請求
   項５記載のエラスターゼ阻害活性ポリペプチド又はその
   ホモポリマー。
7. 【請求項７】 該ジスルフィド結合が、該アミノ酸配列
   中のＣｙｓ⁶⁴とＣｙｓ⁹³，Ｃｙｓ⁷¹とＣｙｓ⁹⁷，Ｃｙｓ
   ⁹²とＣｙｓ⁸⁰，及びＣｙｓ⁸⁶とＣｙｓ¹⁰¹ のＣｙｓ残基
   相互の結合である請求項６記載のエラスターゼ阻害活性
   ポリペプチド又はそのホモポリマー。
8. 【請求項８】 遺伝子組換え的手法によって得られたも
   のである請求項５〜７のうちいずれか１項に記載のエラ
   スターゼ阻害ポリペプチドまたはそのホモポリマー。
9. 【請求項９】 下記式［Ｉ］ Ａ―Ｘ―Ｂ …［Ｉ］ （式中、Ａは担体蛋白を表わし；Ｂは上記請求項１ある
   いは請求項５記載のエラスターゼ阻害活性ポリペプチド
   又はそのホモポリマーからなる目的蛋白を表わし；Ｘは
   該目的蛋白を変性しない条件下で、化学的方法又は生物
   学的方法により切断可能なアミノ酸配列を有する架橋ポ
   リペプチドを表わす。）で表わされる融合蛋白。
10. 【請求項１０】 担体蛋白が、ヒト成長ホルモンまたは
    そのポリペプチド断片である請求項９に記載の融合蛋
    白。
11. 【請求項１１】 担体蛋白が、天然のヒト成長ホルモン
    のアミノ酸残基番号１位のＰｈｅから１３９位のＰｈｅ
    までのポリペプチド断片である、請求項９に記載の融合
    蛋白。
12. 【請求項１２】 担体蛋白が、天然のヒト成長ホルモン
    のアミノ酸残基番号１位のＰｈｅから１２２位のＧｌｎ
    までのポリペプチド断片である、請求項９に記載の融合
    蛋白。
13. 【請求項１３】 担体蛋白が、Ｔ７ファージｇｅｎｅ１
    ０蛋白又はそのポリペプチド断片である請求項９記載の
    融合蛋白。
14. 【請求項１４】 Ｘが（Ａｓｎ―Ｇｌｙ）_n、（Ｖａｌ
    ―Ｐｒｏ―Ａｒｇ）_n、（Ｌｅｕ―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａ
    ｒｇ_nn）_n、及び（Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―
    Ｌｙｓ）_n（ｎは１〜１０の整数を表わす）からなる群
    から選ばれるアミノ酸配列を有する架橋ペプチド又はポ
    リペプチドであり、そしてＢ中のアミノ末端のＡｒｇは
    ＸのそれぞれＧｌｙ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、又はＬｙｓのい
    ずれかと結合している、請求項９に記載の融合蛋白。
15. 【請求項１５】 請求項１あるいは請求項５記載のエラ
    スターゼ阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマーの
    製造方法であって、上記式［Ｉ］で表わされる融合蛋白
    を、化学的方法又は生物学的方法によって処理すること
    からなる方法。
16. 【請求項１６】 該化学的方法が、ヒドロキシルアミン
    又はその同族体によるものである請求項１５記載の方
    法。
17. 【請求項１７】 該生物学的方法が、トロンビン、エン
    テロキナーゼ又はこれらの同族体によるものである請求
    項１５記載の方法。
18. 【請求項１８】 担体蛋白をコードする遺伝子と、配列
    番号１あるいは配列番号２で表わされるアミノ酸配列も
    しくはエラスターゼ阻害活性を有するそれらの一部分又
    はそれらと生物学的に同等のアミノ酸配列を有するエラ
    スターゼ阻害活性ポリペプチドをコードする遺伝子が、
    目的蛋白を変性しない条件下で化学的方法又は生物学的
    方法により切断可能なアミノ酸配列を有する架橋ペプチ
    ド又はそのホモポリマーをコードする遺伝子を介して結
    合している融合蛋白遺伝子。
19. 【請求項１９】 目的蛋白を変性しない条件下で化学的
    方法又は生物学的方法により切断可能なアミノ酸配列
    が、（Ａｓｎ―Ｇｌｙ）_n、（Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒ
    ｇ）_n、（Ｌｅｕ―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒｇ）_n、及び
    （Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ａｓｐ―Ｌｙｓ）_n（ｎは
    １〜１０の整数を表わす）からなる群から選ばれるアミ
    ノ酸配列を有する架橋ペプチド又はポリペプチドである
    請求項１８に記載の融合蛋白遺伝子。
20. 【請求項２０】 担体蛋白が、ヒト成長ホルモン、Ｔ７
    ファージｇｅｎｅ１０蛋白又はそれらのポリペプチド断
    片である請求項１８に記載の融合蛋白遺伝子。
21. 【請求項２１】 担体蛋白が、天然のヒト成長ホルモン
    のアミノ酸残基番号１位のＰｈｅから１３９位のＰｈｅ
    までのポリペプチド断片である、請求項１８に記載の融
    合蛋白遺伝子。
22. 【請求項２２】 請求項１８〜２１のうちいずれか１項
    に記載の融合蛋白遺伝子を含む融合蛋白遺伝子発現型プ
    ラスミド。
23. 【請求項２３】 請求項１８〜２１のうちいずれか１項
    に記載の融合蛋白遺伝子を含む組み換え微生物細胞。
24. 【請求項２４】 請求項１あるいは請求項５記載のエラ
    スターゼ阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマーの
    製造方法であって、ヒト白血球エラスターゼ阻害蛋白
    （ＳＬＰＩ）を酵素処理するか、又は配列番号１あるい
    は配列番号２で表わされるアミノ酸配列を構成するアミ
    ノ酸を用いて化学的に合成することからなる方法。
25. 【請求項２５】 請求項１あるいは請求項５記載のエラ
    スターゼ阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマーの
    治療有効量と、医薬的に許容される担体とからなる医薬
    製剤。
26. 【請求項２６】 請求項１あるいは請求項５記載のエラ
    スターゼ阻害活性ポリペプチド又はそのホモポリマーの
    治療有効量と、医薬的に許容される担体とからなる、好
    中球過剰活性化に起因する疾患の治療剤。
27. 【請求項２７】 該疾患が好中球放出プロテアーゼに起
    因する疾患である請求項２６記載の治療剤。
28. 【請求項２８】 該疾患が炎症疾患、血小板凝集血栓
    症、又は虚血後再かん流障害である請求項２７記載の治
    療剤。