JPH0130420B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般に分析装置、詳述すれば試料中の
被分析物の定量的ルミネセンス分析に使用する分
析装置の分野に関する。 従来、尿や血液のような液体中の特殊な成分を
測定するため種々の試験組成物及び方法が開発さ
れた。このような従来の試験系は、測定すべき被
分析物に直接応答するか、または被分析物応答系
の生成物と組合せ、反応する１種以上の呈色性レ
ドツクス指示薬を試薬組成物中に含む型のもので
あつた。重要な分析中間体ATP、NAD(H)及び過
酸化物に対するルミネセンス分析の極めて高い感
度及び適用性から、臨床化学における分析手段と
して化学ルミネセンス及び生物ルミネセンスの開
発がなされた。分析用ルミネセンスの優れた観察
はホワイトヘツド（Whitehead）らのClin.
Chem.、25巻1531〜1546頁（1979）にある。 最近までに、個別に構成された装置またはルミ
ネセンスの特別の要件に適合するように変更した
市販の装置を使用して大多数のルミネセンス測定
がなされた。変更された市販の装置は、光度計、
蛍光計及びシンチレーシヨンカウンターを含む
（ホワイトヘツドの前掲文献参照）。 ルミネセンスを測定するため尽力された別のア
プローチは、発光反応によつて放出される光に写
真フイルムを露光することである。種々の系中の
向上剤、抑制剤、触媒及び酸化剤を検出するため
化学ルミネセンス反応を他のものによつてフイル
ム上で監視した。イサクソン（Isacsson）ら著、
Analytica Chem.Acta.、68巻339頁（1974）；バ
ブコ（Babko）ら著J.Anal.Chem.U.S.S.R.、20
巻1150頁（1965）；ルコフスカヤ（Lukovskaya）
ら著、J.Anal.Chem.U.S.S.R.、26巻1492頁
（1971）；バブコ（Babko）ら著Zavod.Lab.、29
巻404頁（1963）；及びバブコ（Babko）ら著
Ukri Khim.、Zh.29巻57頁（1963）参照。しかし
ながら、どの文献も装置を記載していない。 また、写真フイルムで包囲した密封容器中に試
料及び化学ルミネセンス試薬を注入し、フイルム
の露光度を濃度の函数として測定することも示唆
された〔ザイツ（Seitz、W.R.）ら著、Anal.
Chem.、46巻188〜202頁、殊に191〜192頁
（1974）参照〕。 フオーゲルハツト（Vogelhut）の米国特許第
4231754号明細書は、被分析物の存在に応答して
反応生成物を生ずる第一試薬系及び前記反応生成
物の存在に応答してルミネセンスを生ずる第二試
薬系を混入した単一の固体担体手段から成る、試
料中の被分析物の測定用試験装置を開示してい
る。この試験装置は更に、前記担体手段と物理的
に結合し、化学ルミネセンス系の発する光に応答
する光応答層を含む。 カバノー（Cavanaugh）の米国特許第3923462
号明細書は、環境空気中のオゾンまたは汚染物質
の自動検出装置を開示している。遮光容器に空気
の試料を導通して、オゾンの存在で発光する物
質、例えばローダミンＢと反応させるか、または
通常では発光する（例えば黒色光で）が、オゾン
の存在では消光する物質と反応させる。容器中の
写真フイルムは化学ルミネセンス系から離して置
かれ、露光される。ルミネセンス反応にさらされ
ると、フイルムの粒子密度は増加する。フイルム
が緻密である程、多量の汚染物質が存在すること
を示す。しかしながら、粒子密度に依存するに
は、精巧な装置または色差の小さい色相間の評価
を必要とする。 本発明のルミネセンス検出装置は、簡単で安価
な成分を使用し、ナノモル濃度で存在する反応成
分の検出用ルミネセンスを定量的に肉眼で好適に
読取ることができる。測定は迅速であり、生ずる
画像は永久記録となる。免疫分析を含めてルミネ
センス分析を写真フイルム上で監視することがで
き、外部動力源を必要としない。読取り機器（反
射計またはデンシトメータ）も必要に応じて含ん
でいてもよい。 本発明によれば、 (i) 主軸に沿つて複数の対向端部を有し、第一の
端部が液体試薬及び試料を反応室中に導入する
ものであり、他の端部が所定寸法の光透過孔を
形成するものであり、被分析物含有試料との接
触に応答して発光する組成物を保有するのに適
当な反応室； (ii) 前記の第一の端部において液体を前記反応室
中に導入するカニユールを入れ、反応室を閉鎖
する閉鎖部材； (iii) 光応答性画像形成層； (iv) 光応答性画像形成層が孔を形成する端部から
所定の距離で、好ましくは反応室の主軸に実質
的に垂直に配置されて、孔から発する光にさら
されるように、光応答性画像形成層と反応室と
を関連させる装置；及び (v) 光応答性画像形成層を周囲の光に露光される
のを防止する部材 から成ることを特徴とする液体試料中の被分析物
を定量的に検出するルミネセンス検出装置が提供
される。 孔から放出される光は、接触する画像形成層の
帯域を露光する。放出される光の量は試料中の被
分析物の量に比例する。低い被分析物濃度でさ
え、光は画像形成層の「基底帯域」を露光する。
この「基底帯域」は孔と同じ領域を有する。被分
析物濃度が増加すると、完全に露光されるまでこ
の「基底帯域」の露光が増加する。ルミネセンス
検出系中の試薬の濃度を調節することによつて基
底帯域を完全に露光するのに有効な被分析物濃度
を選択することができる。これより高い被分析物
濃度は、孔から画像形成層上の直径のより大きい
領域を露光するルミネセンスを起す。従つて、露
光される帯域は基底帯域または孔の領域より大き
い寸法を有する。この範囲における被分析物濃度
は露光される帯域の直径に比例する。 反応室は１個以上の要素から成つていてよい。
例えば、反応室は、多重ウエルを予め形成した、
一般にプラスチツク製の段階希釈板または組織培
養板中のウエルであつてよい。ルミネセンス試薬
を直接ウエル中に置き、板の頂部にカバーをし、
試薬及び試料をウエル中にカバーを通して導入す
る。また、反応室は反応容器ハウジング及び反応
容器から成つていてよい。反応容器ハウジングは
例えば垂直に穿孔された円筒形凹所を有する不透
明なブロツクであつてよい。この場合の反応容器
は円筒形凹所中にきれいにはまるガラス試験管で
あつてよい。 いずれの実施態様においても、反応室は試薬及
び試料を導入する第一の端部を有する。この端部
は、液体導入用カニユールの貫通しうる閉鎖部材
によつて閉鎖される。この閉鎖部材は、反応室と
一体であるか、または別個の要素、例えば隔壁で
あつてよい。第一の実施態様の例として、反応室
はゴムまたは他の弾性材料製の反応容器ハウジン
グから成つていてよい。第一の端部を、全体の一
部として形成されている、弾性材料の薄い隔膜に
よつて閉鎖する。閉鎖部材が別個に構成されてい
る場合、これは血液試料の収集用の排気容器と共
に一般に使用されるような隔壁または栓であるの
が好ましい。 光応答性画像形成層は写真フイルムであるのが
好ましい。これは、黒白またはカラーフイルムで
あつてよい。フイルムは、便宜上、自己現像フイ
ルムであるのが好ましい。 装置全体の機械的要素は、光応答性画像形成層
が反応室の主軸に対して実質的に垂直に、孔を形
成する端部から所定の距離に、孔から発する光に
さらされるように配置されるように、光応答性画
像形成層と反応室を関連させるのに充分な構造を
提供するものである。このような構造は、例えば
光応答性画像形成層を受容する水平室とその上に
反応室を垂直に保持するキヤリツジを有する基台
によつて得られる。基台は場合により、更に反応
室と光応答性画像形成層との間に設置したシヤツ
タを含んでいてよい。このような基台は、更に光
応答性画像形成層が周囲の光にさらされないよう
に遮蔽する作用をする。この実施態様は第１図〜
第４図の説明のため選択したものである。 第１図に示したように、一般に１０で示したル
ミネセンス検出装置は不透明な反応容器ハウジン
グ１２、反応容器１４及び光応答性画像形成層１
６から成る。本体２０を有する不透明な反応容器
ハウジング１２は複数の円筒形側壁２２を有し、
そのそれぞれが容器受容室２４を形成する。各容
器受容室２４は、注射針２６を光を通さないで導
入するのに適当な手段によつて閉鎖されている。
容器受容室２４は底部でも開口して、所定の形及
び寸法の孔１８を形成する。光応答性画像形成層
１６は、孔１８から所定の距離に、孔から発する
光にさらされるように配置されている。 容器受容室２４の頂部は、本体２０と連続して
全体的に不透明な単一要素を形成する一体構造の
閉鎖部材３４によつて閉鎖することができる。或
いは、第２図に示したように、容器受容室２４の
頂部は、容器受容室２４中にぴつたりはまつて着
脱可能の遮光閉鎖部材を形成する着脱可能の隔壁
３５で閉鎖することもできる。いずれの実施態様
でも、容器受容室２４の閉鎖部材は、光を通さな
いまま、反応容器１４中に液体を導入するため皮
下注射針２６の貫通しうる特性を有する材料から
成る。反応容器ハウジング１２は、明確な形をと
るのに適当な任意の材料から作られる。このよう
な材料は不透明なプラスチツク、ゴム、金属また
は公知材料であつてよい。 第１図に関して、反応容器１４は反応容器ハウ
ジング１２中に設置される。反応容器１４は、反
応容器ハウジング１２の円筒形側壁２２内に同軸
に嵌合する側壁４２及び側壁４２と連続している
底部４６から成る。底部４６は丸くなつていて
も、平坦であつてもよく、反応容器１４が保有す
る反応溶液４８から発生する光をほとんど散乱し
ないような特徴を有する。反応容器１４はその上
端で空所４４によつて制限される。従つて、容器
受容室２４中に挿入された針は空所４４を通して
反応容器１４中に液体を導入することができる。
反応容器１４は、目的のルミネセンス反応溶液を
入れるのに適当な、任意の透明または半透明材料
から作るべきである。このような材料は光学的に
澄明なガラス、石英、プラスチツクまたは他の公
知材料であるのが好ましい。反応容器１４は光学
的に澄明な試験管であるのが便利である。 特に、第１図の下部及び第３図の拡大図に関し
て、光応答性画像形成層１６は、孔１８から発す
る光に露光されるように孔１８に対面する感光性
表面５０を有する。周囲の光による感光性表面５
０の露光を防止する不透明な支持体５６は、光応
答性画像形成層と積層関係にある。光応答性画像
形成層１６は適当な手段によつて反応容器ハウジ
ング１２の孔１８から所定の距離に保持される。
この手段の実施態様を次に詳述する。 本発明のこの実施態様は、不透明な反応容器ハ
ウジング１２と光応答性画像形成層１６との間に
シヤツタ６０（第１図だけ）を含む。シヤツタ板
６２（第１図だけ）はシヤツタガイド６４中で、
光応答性画像形成層１６に対して平行に摺動する
（第１図に矢印で示した側方運動）。シヤツタ板６
２を開放方向に移動させて、画像形成層１６の感
光性表面５０と孔１８から発する光との間で光接
触を行わせる。 更に、孔１８と感光性表面５０との間の距離の
限定を更に可能にするスペーサ７０が設けられて
いる。スペーサ７０は、距離を限定するため所定
の高さのスペーサ壁７４を有する光学的澄明体７
２を有する。スペーサ７０の光学的澄明体７２は
光散乱特性を有しないのが好ましい。 別の実施態様（図示せず）では、不透明な反応
容器ハウジング上にカメラを設置して、孔が孔１
８から所定の距離に保持された光応答性画像形成
層、この場合写真フイルムを、場合によりシヤツ
タを含めて、所望のルミネセンスを光学的に澄明
に透過するのに適当なレンズ系によつて露光する
ようにすることができる。 第４図は、画像形成層１６の光応答表面５０上
の露光領域の増加状態を略示する同心円８０を想
像線で示す。不透明な支持体５６の一部も示され
ている。反応容器中で前記被分析物の存在に応じ
て光を生ずるのに有効な組成物と試料を反応さ
せ、その光応答性画像形成層上で生じた任意の露
光部分の直径を測定することから成る、試料中の
被分析物の定量的検出方法により、装置を使用す
る。 本発明の別の好ましい実施態様を第５図及び第
６図に示すが、第１図〜第４図に示す実施態様に
おける要素と同等の要素を、同じ番号に記号
「ａ」を付して示す。 第５図及び第６図に示したように、一般に１０
ａで示したルミネセンス装置は不透明な反応容器
ハウジング１２ａ、反応容器１４ａ及び光応答性
画像形成層１６ａから成る。本体２０ａを有する
不透明な反応容器ハウジング１２ａには、複数の
円筒形側壁２２ａが設けられており、この円筒形
側壁２２ａは、側壁２２ａと連続している底部４
６ａと一緒に反応容器１４ａを形成する。底部４
６ａは透明または半透明でなければならない。各
容器受容室２４ａは注射針２６ａを光を通さない
で導入するのに適当な手段によつて頂部を閉鎖さ
れている。この実施態様では、孔１８ａは底部４
６ａによつて与えられる。光応答性画像形成層１
６ａは、孔１８ａから所定の距離に、孔から発す
る光にさらされるように設置されている。 反応容器１４ａの頂部は、不透明な一体構造の
閉鎖部材３４ａによつて閉鎖することができ、こ
の閉鎖部材３４ａは本体２０ａを連続して被覆し
て単一のシールを形成し、好ましくは接着剤によ
つて固定される。閉鎖部材は、フイルムへの光の
透過を増加する光反射性内表面を積層して有して
いてもよい。一体構造の閉鎖部材３４ａは、光を
透過しないまま、反応容器１４ａ中に液体を導入
するため皮下注射用針２６ａを貫通しうる特性を
有する材料から成る。反応容器ハウジング１２ａ
は、明確な形をとるのに適当な任意の材料から作
られる。このような材料は不透明なプラスチツ
ク、ゴム、金属または他の公知材料であつてよ
い。 光応答性画像形成層１６ａは、孔１８ａから発
する光にされされるように孔１８ａに対面する感
光性表面５０ａを有する。周囲の光による感光性
表面５０ａの露光を防止する不透明な支持体５６
ａは、光応答性画像形成層１６ａと積層関係にあ
る。光応答性画像形成層１６ａは、露光されない
であろう感光性表面５０ａの部分上に例えばクラ
ンプまたは両面接着剤（図示せず）を使用して、
反応容器ハウジング１２ａの底に固定することに
よつて孔１８ａから所定の距離に保持される。 この好ましい実施態様の変形として、反応容器
ハウジングに結合される画像形成層を選択的に露
光するためシヤツタ機構を有するカートリツジ状
フイルムパツクを代用することができる。酸化
剤、例えば、過酸化水素の注入によりルミネセン
ス反応の開始直前にシヤツタを開放することがで
きる。シヤツタを含めてフイルムパツクを次に取
り出し、フイルムを現像することができる。この
実施態様の変形として、各反応容器の下に選択し
た直径の穴を配置したシヤツタを設けることがで
きる。穴を有するこのようなシヤツタはダンパと
して作用することができる。即ち、より小さい穴
は、基底帯域の寸法を減少し、それに比例して露
光領域の直径増加を減少し、これにより高濃度ま
で測定が可能になる。 どの実施態様でも、また装置の要素をどのよう
に変形しても、ある種のルミネセンス反応系は試
薬配合物の製造時に洗浄工程を必要し、他の系は
これを必要としない。例えば、ルミネセンス免疫
分析は一般に種々の試薬の導入工程の間に洗浄工
程を必要とする。このような着脱可能の隔壁とし
て、これらの場合に、反応容器ハウジング用のユ
ニツトアセンブリより一層望ましい変形がありう
る。また、ルシフエラーゼを使用するアデノシン
三燐酸（ATP）の分析は、洗浄工程を必要とし
ないので、一体のシールを介してその分析を付加
することができる。 ルミネセンス系 ルミネセンスとは、化学反応の結果である可視
または不可視光線の放出であると簡単に定義する
ことができる。化学ルミネセンスでは、励起状態
の分子を生ずるエネルギー源が化学反応のエネル
ギーであり、励起状態から基底状態への減衰は光
の放出（ルミネセンス）を伴なう。分析的には、
最も興味をひいたルミネセンスは化学ルミネセン
ス及び生物ルミネセンスである。後者は、触媒蛋
白がルミネセンス反応の効率を高める生物学的系
に見られる特殊な形の化学ルミネセンスに与えら
れた名称である。 １ 化学ルミネセンス分析系 要約すれば、溶液中の有機化学ルミネセンス
の機構は下記の３工程を含む：即ち、(a)中間体
キー化合物を生ずる予備反応、(b)中間体キー化
合物の化学エネルギーを励起エネルギーに変え
る励起工程、及び(c)化学反応で生成した励起生
成物から光の放出。化学ルミネセンスを増強す
るため蛍光化合物を添加する反応では、有効な
エネルギー移動が起り、生ずる化学ルミネセン
スは「増感化学ルミネセンス」として知られて
いる。 化学ルミネセンス反応系は酸化剤（通常過酸
化水素）を必要とし、この酸化剤は前記(a)工程
で、中間体キー化合物を生成する予備反応によ
つて生成されるものであつてもよい。反応系は
更に、触媒、例えばミクロペルオキシダーゼ、
ヘム、ヘモグロビンまたはコバルトを必要とす
る。更に、反応系は、触媒の作用によつて中間
体キー化合物（過酸化水素）から励起エネルギ
ーを受け取る化学発光原化合物
（chemilumingenic compound）を必要とす
る。化学発光原化合物が高エネルギー励起状態
から基底状態にもどる場合に、検出しうる光の
形でエネルギーが放出される。 この項に記載する化学ルミネセンス系はすべ
て、一般に予備反応で生ずる過酸化水素を検出
しうるという共通の特徴を有する。被分析物に
応答して光を生ずるのに有効な組成物は、試料
中の被分析物の存在に応答して反応生成物、例
えば過酸化水素のような酸化剤を生ずる酵素を
少なくとも１種含むものであるのが好ましい。
この酵素は特にオキシダーゼ、例えば臨床分析
に使用されることの知られているもの、例えば
グルコースオキシダーゼまたはコレステロール
オキシダーゼである。他の系で生成または使用
される他の公知酸化剤は、過沃素酸塩、次亜塩
素酸塩、フエリシアン酸塩または過マンガン酸
塩を含む。生成した過酸化水素はペルオキシダ
ーゼのような、過酸化物活性化物質と反応す
る。 ペルオキシダーゼ類は一般に、鉄ポルフイリ
ンを含む複合蛋白である。ペルオキシダーゼは
西洋わさび、バレイシヨ、いちじくの樹液及び
かぶら（植物ペルオキシダーゼ）；ミルク（ラ
クトペルオキシダーゼ）；及び白血球（ベルド
ペルオキシダーゼ）中に産生する。ペルオキシ
ダーゼはまた、微生物中に産生し、発酵によつ
て産生される。ある種の合成ペルオキシダーゼ
類、例えばテオレル（Theorell）及びマーリ
イ（Maehly）著Acta.Chem.Scand.、４巻422
〜434頁（1950）に開示されているペルオキシ
ダーゼも、H2O2検出系に使用するのに申し分
ない。過酸化物活性化物質は過酸化物の還元を
触媒する点で酵素様である。ヘモグロビン及び
その誘導体は、酵素ペルオキシダーゼの挙動に
類似して挙動するので、このような「過酸化物
活性」物質の代表例である。酵素でないが、過
酸化物活性を示す他の物質は、チオシアン酸
鉄、タンニン酸鉄、フエロシアン化鉄、シリカ
ゲルに吸着されたクロム塩（例えば硫酸クロム
カリウム）等である。 数種の化学ルミネセンス系が従来知られてお
り、以下に本発明の検出系に使用される若干の
系の例を挙げるが、これらは本発明の範囲を限
定するものではない。使用する化学ルミネセン
ス化合物の性質により下記の系が挙げられる。 (a) ジアシルヒドラジド 式： 〔式中R1及びR2の一方は水素であり、他方
は−NR3R4基（式中R3及びR4はそれぞれ独
立に水素または炭素原子数１〜６個の直鎖ア
ルキル基から選択される）を表わす〕を有す
る環状ジアシルヒドラジドから強い化学ルミ
ネセンスが得られる。好ましい化合物の１つ
は、R1が−NH2であり、R2が−Ｈであるル
ミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン）である。別の好
ましい化合物は、R1が−Ｈであり、R2が−
NH2であるイソルミノール（６−アミノ−
２，３−ジヒドロフタラジン−７，４−ジオ
ン）である。環構造中の置換はルミネセンス
に著しく影響する、即ちルミネセンスを著し
く増加または減少する。ヘテロ環式環が置換
されている場合、光の完全な損失が起る。シ
ユレーダー（Schroeder、H.R.）ら著、スペ
シフイツク・プロテイン・バインデイング・
リアクシヨンス・モニタード・バイ・ケミル
ミネセンス、イミノアツセイス（Specific
Protein Binding Reactions Monitored by
Chemluminescence、Immunoassays化学ル
ミネセンスにより検査された特異蛋白結合反
応、免疫分析）；クリニカル・ラボラトリ
イ・テクニクス・フオー・ザ・1980
（Clinical Laboratory Techniques for the
1980′s）Alan R.Liss、Inc.（ニユーヨーク州
ニユーヨーク市）189〜204頁（1980）参照。 発光の点でルミノールより一層有効な、ル
ミノールの融合類縁体が判明した。その１例
は式： を有する化合物であり、この化合物はマツク
カプラ（McCapra、F.）著、ザ・ケミルミ
ネセンス・オブ・オルガニツク・コンパウン
ズ（The Chemiluminescence of organic
compounds、有機化合物の化学ルミネセン
ス）、Q.Rev.（ロンドン）、20巻485頁
（1966）、及びシユレーダー（Schroeder、H.
R.）及びイーガー（Yeager、F.M.）著ケミ
ルミネセンス・イールズ・アンド・デイテク
シヨン・リミツツ・オブ・イソルミノール・
デリバテイブス・イン・ベアリアス・オキシ
デイシヨン・システムス
（Chemiluminescence Yields and
Detection Limits of Isoluminol
Derivatives in Various Oxidation
Systems、種々の酸化系におけるイソルミノ
ール誘導体の化学ルミネセンス収率及び検出
限界）Anal.Chem.、50巻1114頁（1978）に
論じられている。 ルミノールにおける発光の効率、波長及び
最適PHは反応条件に著しく左右される。一般
に、過酸化水素は最も一般に使用される酸化
剤である。触媒は例えばFe（CN6）3-及び
Cu2+である〔ザイツ（Seitz、W.R.）及びニ
ーリイ（Neary、M.P.）著、ケミルミネセ
ンス（Chemiluminescence、化学ルミネセ
ンス）及びビオルミネセンス
（Bioluminescence、生物ルミネセンス）、
Anal.Chem.46巻188頁（1974）参照〕。使用
する他の酸化剤は次亜塩素酸塩、沃素、過マ
ンガン酸塩及び適当な触媒の存在で酸素を含
む。恐らくこの反応に最も有効な触媒はヘム
であり、最良の媒体は炭酸塩緩衝液である。
化学ルミネセンスに最適のPHは触媒及び酸化
剤により若干変動するが、ほとんどの酸化系
について最適PHは約PH11である。ルミノール
のルミネセンスは式１の化学論に従う。 式1. 一重励起状態で形成されるアミノフタル酸
イオンが反応における発光体であることが判
つている〔ホワイト（White、E.H.）、及び
バーシイ（Bursey、M.M.）、ケミルミネセ
ンス・オブ・ルミノール・アンド・リレイテ
ド・ヒドラジド（Chemiluminescence of
luminol and related hydrazides、ルミノー
ル及び同族ヒドラジドの化学ルミネセン
ス）：ザ・ライト・エミツシヨン・ステツプ
（The light emission step、発光工程）、J.
Am.Chem.Soc.、86巻941頁（1964）参照〕。
過酸化水素／ミクロペルオキシダーゼ系を用
いるルミノールの検出限界は１ピコモル／
である。 (b) アクリジニウム塩 ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニ
ウム硝酸塩）は、金属イオン触媒の存在で塩
基性溶液中で過酸化物で酸化すると発光す
る。反応は、ルミノール反応を触媒しない若
干の金属イオン、例えばPb2+で触媒され、
ルミノールでは可能でない分析用途に対する
基礎を提供する。 過酸化水素による化学ルミネセンス酸化を
受けるアクリジニウムフエニルカルボキシレ
ートは、ブリユツセル（1978）の生物及び化
学ルミネセンスの分析への応用に関する国際
シンポジウムの講演におけるマツクカプラ
（McCapra、F.）、タツト（Tutt、D.）及び
トツピング（Topping、R.M.）のザ・ケミ
ルミネセンス・オブ・アクリジニウム・フエ
ニル・カルボキシレート・イン・ジ・アツセ
イ・オブ・グルコース・アンド・ハイドロジ
エン・パーオキサイド（The
Chemiluminescence of Acridinium Phenyl
Carboxylates in the Assay of Glucose
and Hydrogen Peroxide、グルコース及び
過酸化水素分析におけるアクリジニウム フ
エニル カルボキシレートの化学ルミネセン
ス）及びマツクカプラらの英国特許第
1461877号明細書（1977）に記載されている。
これらの物質の酸化のための最適PHはフエニ
ル基中の置換基の性質に左右され、特別のPH
要件に適合するようにアクリジニウム塩を調
製することができる。 (c) ジアリールオキサレート ジアリールオキサレート、例えばビス（ト
リクロロフエニル）オキサレートは、ペルオ
キシオキサレート中間体を経て過酸化水素と
の化学ルミネセンス酸化反応を受ける。例え
ば、シエルマン（Sherman、P.A.）、ホルト
ベツカー（Holtbecker、J.）及びライアン
（Ryan、D.E.）著、アナリテイカル・アプリ
ケイシヨンズ・オブ・パーオキシオキサレー
ト・ケミルミネセンス（Analytical
Applications of Peroxyoxalate
Chemiluminescence、パーオキシオキサレ
ート化学ルミネセンスの分析への応用）、
Anal.Chem.Acta.、97巻21頁（1978）：ザイ
ツ（Seitz、W.R.）及びニアリイ（Neary.
M.R.）著、リーセント・アドバンシス・イ
ン・バイオルミネセンス・アンド・ケミルミ
ネセンス・アツセイ（Recent Advances in
Bioluminescence and Chemiluminescence
Assay、生物ルミネセンス分析及び化学ルミ
ネセンス分析における最近の進歩）、
Methods Biochem.Anal.、23巻161頁
（1976）；及びウイリアムス（Williams、D.
C.）及びザイツ（Seitz、W.R.）著、オート
メイテド・ケミルミネセンス・メソツド・フ
オー・デイターミニング・ザ・リデユース
ド・フオーム・オブ・ニコチンアマイド・ア
デニン・ダイニユクレオタイド・カツプル
ド・トウ・ザ・メジヤーメント・オブ・ラク
テート・デハイドロゲナーゼ・アクテイビテ
イ（Automated Chemiluminescence
Method for Determining the Reduced
Form of Nicotinamide Adenine
Dinucleotide Coupled to the
Measurement of Lactate Dehydrogenase
Activity、ラクテート脱水素酵素活性測定と
結合した、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド測定用の自動化化学ルミネセン
ス法）、Anal.Chem.、48巻1478頁（1976）参
照。 過酸化物を分析するため、トリエチルアミ
ンを含む酢酸エチル／メタノール／水性緩衝
液（PH範囲４〜10）系中にビス（トリクロロ
フエニル）オキサレートが使用された。この
反応（増感ケミルミネセンス）における発光
剤として蛍光性分子であるペリレンが、その
安定性及び好ましい発光効率及び発光波長範
囲のため、使用された。ウイリアムス
（Williams、D.C.）ハフ（Huff、G.G.）及び
ザイツ（Seitz、W.R.）著、エバリユエイシ
ヨン・オブ・パーオキシレート・ケミルミネ
センス・フオー・デイターミネイシヨン・オ
ブ・エンザイム・ジエネレイテイド・パーオ
キサイド（Evaluation of Peroxylate
Chemiluminescence for Determination of
Enzyme Generated Peroxide、酵素による
生成過酸化物の測定用パーオキシレート化学
ルミネセンスの評価）、Anal.Chem.、48巻
1003頁（1976）、参照。検出限界は７×10-8
モル／リツトル（mol／Ｌ）であり、直線応
答範囲は10-3mol／Ｌ過酸化水素にまで及
ぶ。ビス（トリクロロフエニル）オキサレー
ト系が過酸化物の検出に対してルミノール
（前記事実参照）程鋭敏でないが、背景化学
ルミネセンスが比較的低く、尿酸のような妨
害物質に対する感度が低いという利点を有す
る。 (d) 他の化学ルミネセンス系 本発明に使用しうる、公知の他の化学ルミ
ネセンス分析系は下記のものを含む； (i) アルカリ性PHで酸化されて黄色化学ルミ
ネセンスを生ずるロフイン〔ラヅイゼフス
キイ（Radzizewski、B.）著、ウンターズ
ーフング・イーバー・ヒドロベンズアミ
ド・アラリン・ウント・ロフイン
（Untersuchung u¨ber Hydrobenzamid、
Ararin und Lophinヒドロベンズアミド、
アラリン及びロフインについての化学分
析）、Chem.Ber.、10巻70頁（1977）； (ii) 酸性PHで酸化されて黄赤色化学ルミネセ
ンスを生ずるシロキセン〔イルデイ
（Erdey、L.）、ケミルミネセンス・インデ
イケイタース（Chemiluminescence
indicators）、Indicators、ビシヨツプ（E.
Bishop）編集、英国オツクスフオードの
パージヤモン・プレス（Pergamon
Press）、1972年709〜732頁参照）；及び (iii) 多価フエノール、例えばピロガロール及
び没食子酸〔スラウインスカ
（Slawinska、D.）及びスラウインスカ、
J.著、ケミルミネセント・フロー・メソツ
ド・フオー・デイターミネイシヨン・オ
ブ・ホルムアルデハイド
（Chemiluminescent flow method for
determination of formaldehydeホルムア
ルデヒドの測定用ケミルミネセンス流動
法）、Anal.Chem．47巻2101頁（1975）。 ２ 生物ルミネセンス分析系 臨床上有用な物質の多くの分析法は、ニコチ
ンアデニンジヌクレオチド／還元型（NAD+／
NADH）及びアデノシントリホスフエート
（ATP）のような共通因子を含む反応に基づ
く。記載した生物ルミネセンス反応はこのよう
な共通因子に関する従来の分光分析または比色
分析に対する鋭敏な代替法を提供する。 ほたる及びつちぼたるは最も良く知られた生
物ルミネセンス生物であるが、ほとんどは海に
生存する生物であり、顕微鏡的細菌及びプラン
クトンから多くの種類の魚に雑多に及ぶ。若干
の生物ルミネセンス系が知られており、本発明
の試験装置に使用しうる、そのような系の若干
の例を以下に示す。系をまず生物ルミネセンス
源である生物により論じ、次にメカニズムをま
とめる。 (a) ほたる（Photinius） ほたるのルミネセンスが最も詳細に研究さ
れた生物ルミネセンス系であることは疑いな
い。発光反応は酵素ルシフエラーゼ、ルシフ
エリン、Mg2+、ATP及び分子状酸素を必要
とする。ルシフエラーゼは、発光と共にルシ
フエリンのような基質の酸化を触媒する酵素
に関する総称である。ルシフエリンは、適切
な環境中で酸化されて電子的に励起された一
重線状態を生じうる環元された化合物に関す
る総称である；光は該化合物が基底状態にも
どる際に生ずる。 開始反応は、Mg2+及びATPの存在でルシ
フエリンをルシフエリルアデニレートに迅速
に変換し、ルシフエリルアデニレートはルシ
フエラーゼの存在で分子状酸素と結合して励
起状態のオキシルシフエリルアデニレート−
酵素錯体を生成する反応である。発光後、基
底状態の錯体は解離して酵素、アデノシン−
燐酸（AMP）、オキシルシフエリン及び二酸
化炭素を生成する。その際二酸化炭素はルシ
フエリンのカルボキシル基から誘導される。
反応はPH7.8のグリシン緩衝液中で25℃で最
もよく実施される。放出される光の色は、ほ
たるの種類により異なるが、ルシフエリンの
構造はすべての種類について同一である。最
大放出の強度及び波長はPH、イオン濃度、温
度、及びZn2+またはCd2+の塩化物の存在の
変動により変化する。 反応はATPに対して特異的でない；他の
ヌクレオチド、例えばシチジン−5′−トリホ
スフエート、イノシン−5′−トリホスフエー
ト及びイソ−ATPは発光を刺激することが
できる。反応においてMg2+をマンガン陽イ
オンに代えてもよい。ある種の陰イオンは反
応を抑制する（SCN−＜Ｉ−＜NO3−＜Br
−＜Cl−）。プロカイン及びリドカインのよ
うな麻酔剤も抑制剤であり、この事実が分析
法の基礎を形成した。 (b) 海洋細菌 ルミネセンス海洋細菌のほとんどの研究
は、ベネケア・ハーベイイ（Benecckea
Harveyi）〔フオトバクテリウム・フイツシ
エリ（Photobacterium fischeri）MAV株〕
及びビブリオ・フイツシエリ（Vibrio
Fischeri）の２種に集中している。試験管内
では、ルミネセンスに必要な成分は、FMN
リダクターゼ、長鎖脂肪族アルデヒド（Ｒ−
CHO）、酸素、及び細菌ルシフエラーゼによ
るNADHまたはNADPHの酸化によりFMN
から生成した還元フラビンモノヌクレオチド
FMNH2である。反応中に生ずる全体の光
は、基質（O2−FMNH2及びＲ−CHO）が
制限量で存在する場合、各基質の量に比例す
る。このことはルシフエラーゼについても真
実である。それというのは過剰のFMNH2は
発光の速度に比較して著しく早く自動酸化さ
れ、FMNH2はルシフエラーゼがその触媒サ
イクルを終る時までにFMNに再変換されて
いた。従つて、他の反応体と同様にルシフエ
ラーゼは試験管内反応において一度作用する
だけである。しかしながら、FMNH2を繰返
し添加するとルシフエラーゼは何度も作用す
ることができる。アルデヒドは対応するカル
ボン酸に酸化される。炭素原子数８個以上の
鎖長（Ｒ）を有する脂肪族アルデヒド（Ｒ−
CHO）だけが反応に有効である。 微生物ルシフエラーゼ活性はFMNH2に対
して高度に特異的であるが、酵素も他のフラ
ビン及びフラビン類縁体に対して弱い活性を
示す。ルシフエラーゼはｐ−クロロ水銀安息
香酸のようなチオール試薬及びリシル基、シ
ステイン基及びヒスチジニル基と反応する試
薬に対して特に鋭敏である。揮発性麻酔剤、
リボフラビン及びシアン化物、並びに銅、鉄
及び他の重金属も酵素を抑制する。 フラビンモノヌクレオチドリダクターゼ
（フラビンリダクターゼ、NAD（Ｐ）Ｈデヒ
ドロゲナーゼ、またはNAD（Ｐ）Ｈ−FMN
オキシドリダクターゼ）は試験管内で細菌ル
シフエラーゼと関係していると思われる。ビ
ブリオ・フイツシエリ及びベネツケア・ハー
ベイイから単離されたFMNリダクターゼ
は、約PH５〜PH10の比較的広いPH範囲にわた
つてNADH酸化に多少の活性を示す。リボ
フラビン、FAD並びにFMNの異性体及び類
縁体はFMNリダクターゼの基質として作用
しうる。 (c) くらげ（Aequorea） くらげ（Aequorea）の生物ルミネセンス
系はCa2+と反応して青色ルミネセンスを生
ずる蛋白質・発色団錯体（“光蛋白”と言わ
れる）から成り、最大波長は溶解酸素とは無
関係に469nｍである。この光蛋白は、Ca2+
の存在で蛋白質によつて酸化されて発光しな
がらオキシルシフエリンを生ずる発色団成分
（ルシフエリン）と密接に関係する種特異性
蛋白質から成る。消費された光蛋白は「青色
螢光蛋白」と言われる。くらげ系を触媒しう
るCa2+以外の金属イオンはSr2+、Ba2+及び
すべてのランタニド系元素である。 (d) 反応メカニズム 要するに、臨床化学系に使用するのに適当
な生物ルミネセンス系は、下記のように図示
することができる； (i) 結合したピリジン−ヌクレオチド NADH＋FMNリダクターゼ ―――――――→ FMNH2＋NAD+FMNH2＋Ｒ−CHO＋O2 ルシフエラーゼ ――――――――→ Mg2+FMN＋Ｒ−CO2H＋光 (ii) 結合したアデニン−ヌクレオチド ルシフエリン＋ATP＋O2 ルシフエラーゼ ――――――――→ Mg2+ADP＋CO2＋光 (iii) 酵素−基質系 ルシフエリン＋O2ルシフエラーゼ ――――――――→ 光 (iv) “予装入”系の活性化 予装入蛋白Ca2+ ―――→ 青色−螢光性蛋白＋光 ３ ルミネセンス免疫分析 特異結合分析技術の開発により、液体媒体中
で極めて低濃度でみられる、診断、医学、環境
及び工業に重要な種々の有機物質を測定するた
めの有用な分析法が提供された。特異結合分析
は、リガンド、即ち結合されうる被測定分析物
とこれに対する結合相手との特異的反応に基づ
くものである。リガンド及びその結合相手の一
方が抗体であり、他方が対応するハプテンまた
は抗原である場合、その分析は免疫分析として
知られている。 従来の特異結合分析技術では、分析すべき液
体媒体の試料を種々の試薬組成物と混合する。
このような組成物は、標識、この場合にルミネ
センス標識と結合した結合成分を含む標識複合
体を含む。標識複合体中の結合成分は試薬組成
物の、もし存在するならば他の成分及び分析下
の媒体中のリガンドと関係する。これは２種、
即ち結合種及び遊離種の結合成分が結合されて
いない結合反応系を形成する。遊離種に匹敵す
る結合種を生ずる標識複合体の相対的量または
割合は試料中の検出すべきリガンドの存在（ま
たは量）の関数である。 結合種の標識複合体が遊離種の標識複合体の
存在で、標識を検査するため使用する手段によ
つて本質的に識別されない場合、結合種及び遊
離種は分析を遂行するために、物理的に分離し
なければならない。この種の分析法は、従来、
「不均一系」と言われる。標識複合体の結合種
及び遊離種を相互の存在で識別しうる場合、分
離工程を回避することができ、この分析法は
「均一系」と言われる。 次に記載するルミネセンス免疫分析は、分析
化学に適用しうる分析法の例である。 (a) ルミネセンス免疫分析 ルミネセンス標識(L)、例えばルミノール、
イソルミノール、ルシフエラーゼまたはルミ
ノール誘導体を使用する免疫分析は既に報告
されている。一般的図式は下記のとおりであ
り、式中、Agは抗原であり、Abは抗体であ
る； Ag＋Ag−Ｌ＋AbAb：Ag＋Ab ：Ag−LAg−Ｌ＋発光原性共反応体→光 ラジオイムノアツセイに比べて、ルミネセ
ンス免疫分析（LIA）は酵素免疫分析と関連
した多数の利点を有する。即ち、(1)試薬は安
価で安定であり、(2)分析は迅速であり、自動
化でき、(3)分離工程を必要とせず（均一系）、
放射線照射の危険が避けられ、更に、これら
の方法では標識を極めて鋭敏に検出しうると
いう利点が得られる〔ウイスダム
（Wisdom、G.B.）著エンザイム−イミユノ
アツセイ（Enzyme−immunoassay）Clin.
Chem.、22巻1243頁（1976）参照〕。 不均一系及び均一系ルミネセンス免疫分析
は既に記載されている。ルミノール−IgG複
合体のルミネセンス活性は、抗体に結合した
場合に変化しないことは、既に報告されてい
る〔ハーシユ（Hersch、L.S.）ら著、ア・
ルミノール−アシステイド・コンペテイテイ
ブ−バインデイング・イミユノアツセイ・オ
ブ・ヒユーマン・イミユノグロブリン・ジイ
（Ａ Luminol−Assisted Competitive−
Binding Immunoassay of Human
Immunoglobulin Ｇルミノールを用いた人
体免疫グロブリンＧの競合結合免疫分析）、
Anal.Biochem.、93巻267頁（1979）参照〕。
これに反して、イソルミノール−ビオチン複
合体のルミネセンス活性は、アビジン、即ち
ビオチンに対して特異的な結合蛋白に結合す
る場合に10倍に増加する。発光量のこの向上
は、蛋白質によつて媒介される化学ルミネセ
ンス効率の増大に帰する〔シユレーダー
（Schroeder、H.R.）、フオーゲルハツト
（Vogelhut、P.O.）、キヤリコ（Carrico、R.
J.）ら著、コンペテイテイブ・プロテイン・
バインデイング・アツセイ・フオー・ビオチ
ン・モニタード・バイ・ケミルミネセンス
（Competitive Protein Binding Assay for
Biotin Monitored by Chemiluminescence
化学ルミネセンスにより検査されたビオチン
の競合蛋白結合分析）、Anal.Chem.、48巻
1933頁（1976）参照）〕。また、チロキシン標
識複合体を使用する、化学ルミネセンスによ
つて検査されるチロキシン（T4）に関する
不均一系競合結合免疫分析は既に記載されて
いる。シユレーダら著、イミユノアツセイ・
フオー・シーラム・サイロキシン・モニター
ド・バイ・ケミルミネセンス
（Immunoassay for Serum Thyroxine
Monitored by Chemiluminescence化学ル
ミネセンスにより検査された血清チロキシン
の免疫分析）、J.Immunol.Methods.、25巻
275頁（1979）参照。 (b) ルミネセンス酵素免疫分析 ペルオキシダーゼ（POD）のような酵素
に関するルミネセンス分析は、酵素免疫分析
における酵素複合体の定量に利用されたフア
クターである従来の比色分析より著しく鋭敏
である。ペルオキシダーゼ−コルチソル複合
体のルミネセンス定量に関するコルチソルの
ルミネセンス酵素免疫分析はラジオイムノア
ツセイのそれと同等の感度を有する〔アラカ
ワ．Ｈ、マエダ．M.及びツジ．A.著、ルミ
ノール−ペルオキシダーゼの化学ルミネセン
ス反応によるコルチソルの酵素免疫分析、分
析化学26巻322頁（1977）参照〕。 この種の分析を図式で示すと、下記のとお
りであり、式中、Agは抗原であり、Abは抗
体である： Ag＋Ag−POD＋AbAb：Ag＋Ab ：Ag−PODAg−POD＋発光原性共反応体→
光 (c) ルミネセンスコフアクター免疫分析 若干の研究者は最近、生物ルミネセンス反
応を使用して定量したリガンドーコフアクタ
ー（コフアクター＝CF）複合体を使用して、
特異結合反応を検査する酵素法を研究した。
キヤリコ（Carrico、J.R.）、ユング
（Yeung、K.K.）シユレーダー（Schroeder、
H.R.）ら著スペシフイク・プロテイン−バ
インデイング・リアクシヨンス・モニター
ド・ウイズ・リガンド−ATP・コンジユゲ
イツ・アンド・フアイアフライ・ルシフエラ
ーゼ（Specific Protein−binding Reaction
Monitored With Ligand−ATP
Conjugates and Firefly Luciferase リガ
ンド−ATP複合体及びほたるルシフエラー
ゼにより検査された特異蛋白結合反応）、
Anal.Biochem.、72巻95頁（1976）；キヤリ
コ（Carrico、R.J.）クリストナー
（Christner、J.E.）、ボグスラスキイ
（Boguslaski、R.C.）及びユング（Yeung、
K.K.）著ア・メソツド・フオー・モニタリ
ング・スペシフイク・バインデイング・リア
クシヨンズ・ウイズ・コフアクター・レイベ
ルド・リガンヅ（Ａ Method for
Monitoring Specific Binding Reactions
With Cofactor Labeled Ligands標識リガ
ンドコフアクターによる特異結合反応の検査
方法）、Anal.Biochem.、72巻271頁（1976）、
及びシユレーダー、キヤリコ、ボグスラスキ
イ及びクリストナー著、スペシフイク・バイ
ンデイング・リアクシヨンズ・モニタード・
ウイズ・リガンド−コフアクター・コンジユ
ゲイツ・アンド・バクテリアル・ルシフエラ
ーゼ（Specific Binding Reactions
Monitored With Ligand−cofactor
Conjugates and Bacterial Luciferaseリガ
ンド−コフアクタ複合体及び細菌ルシフエラ
ーゼにより検査された特異結合反応）Anal.
Biochem.、72巻283頁（1976）参照。 リガンドは例えばNAD+の酵素活性誘導体
に共有結合した。アルコールデヒドロゲナー
ゼ及びエタノールで還元した後、これらの複
合体を細菌ルシフエラーゼ系を使用して発光
によつて定量的に測定することができる。リ
ガンド−NADHの発光はリガンドに特異的
に結合する蛋白質によつて抑制することがで
きる。こうして、遊離及び結合した標識リガ
ンドを分離することなく（均一系）、特異結
合反応を分析することができる。ATPをほ
たるルシフエラーゼを用いて極めて低濃度で
測定することができるので、このコフアクタ
ーでリガンドを標識する可能性もこれらの研
究者によつて研究された。この種の分析は下
記の式で示される（Ag＝抗原、Ab＝抗体）。 Ag＋Ag−CF＋AbAb：Ag＋Ab：Ag−CF Ag−CF＋発光原性共反応体→光 (d) ルミネセンス酵素−多重免疫分析 多くの場合使用する酵素標識(E)がオキシド
レダクターゼ、例えばデヒドロゲナーゼであ
るから、NADH−依存性細菌ルミネセンス
系を使用することによる酵素多重免疫分析技
術を使用して、薬剤を検査することも示唆さ
れた〔スタンレイ（Stanley P.E.）著、アプ
リケイシヨン・オブ・アナリテイカル・バイ
オルミネセンス・トウ・ザ・エンザイム・マ
ルテイプライド・イミユノアツセイ・テクニ
ツク（Application of Analytical
Bioluminescence to the Enzyme
Multiplied Immunoassay Technique酵素
多重免疫分析技術への分析植物ルミネセンス
の応用）、リクイド・シンチレーシヨン・カ
ウンテイング（Liquid Scintillation
Counting）５、ジヨンソン（P.Johnson）及
びクルツク（M.Crook）編集、ロンドンの
ヘイドン・アンド・サン（Heyden and
Son）1978年79頁参照〕。 ４ ルミネセンス酵素分析 Boc−及びＺ−アラニルアラニルフエニルア
ラナミド−４−アミノフタルヒドラジドを使用
してα−チモトリプシンのアミダーゼ活性の分
析法が開発された。合成基質は、酵素によつて
加水分解するとイソルミノールを放出する。そ
の化学ルミネセンスを測定することにより、イ
ソルミノール生成を測定する。ルミネセンス基
質の動力学的恒数をα−チモトリプシンで測定
し、50mg程度の低い酵素レベルを測定した。同
様のルミネセンス基質、色原体基質及び螢光基
質の比較が提示されている。フランチニ
（Hranchini、B.R.）ら著、センシテイブ・エ
ンザイム・アツセイ・ベイスド・オン・ザ・プ
ロダクシヨン・オブ・ケミルミネセント・リー
ビング・グループス（Sensitive Enzyme
Assays Based on the Production of
Chemiluminescent Leaving Groupsルミネセ
ンス残基の生成に基づく増感酵素分析）、
Anal.Biochem.、111巻87頁（1981）参照。 下記の実施例は本発明の好ましい実施態様を示
す。 実施例 本発明による装置を使用して化学ルミネセンス
の増感迅速写真測定の達成方法を説明する。写真
フイルム上での化学ルミネセンス標識の検出限界
が予め判つていないので、高度に鋭敏な酸化系に
おいて免疫反応を究極的に検査するため、検出限
界を調べた。 装置の構造 化学ルミネセンスを検査するため、ポラロイド
カメラ〔ニユーヨーク州ロチエスターのグラフイ
ク・ポラロイド・バツク・グラフレクス社
（Graphic Polaroid Back Graflex、Inc.）〕を改
造した。簡単に言えば、レンズ・フイクスチヤー
を除去し、摺動金属板をシヤツタとして取り付け
た。この上に薄い澄明プラスチツク板及び６mm×
50mmのガラス反応管を収容する12個の直径6.5mm
の穴の列を有するアルミニウムブロツクが配置さ
れた。アルミニウムの蓋を室光を遮蔽するため使
用した。各管上の蓋に円錐形にほられた穴には、
針案内部材として役立つ１mmの穴を有するプラス
チツク板によつて適切に保持されるゴム隔壁を付
けた。カメラに10000ASAの速度を有する青増感
ポラロイド・ポラ・スコープ（Polaroid Pola
Scope）フイルム、410型（8.3×10.8cm）を装填
した。 実験操作 50ｍMNaOH中のミクロペルオキシダーゼ
2.5μM及び種々の濃度の７−〔Ｎ−（４−アミノブ
チル）−Ｎ−エチル〕−アミノナフタレン−１，２
−ジルボン酸ヒドラジド（ABENH）を含む反
応組成物を反応管中に140μずつ分け、次にこ
の反応管をフイルム上の個々の遮光ウエルに置い
た。次に、シヤツタを開放した。PH7.5の10ｍＭ
トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（ト
リスHCl）中の過酸化水素20μを気密の50μの
注射器から各管中に手で注入して発光を開始させ
た。最後の注射後、すべての反応について発光を
【表】 黒色背景上の白色の鮮明なコントラストによ
り、肉眼による鋭敏な測定ができた。発光反応の
下のフイルム面積が最大に露光されると、
ABENHの濃度増加と共に斑点の寸法の直線的
増加が観察された。第７図は第１表に示したデー
タのグラフである。 反応からの光は、フイルム上約５mmの点源とし
て本質的に挙動する。限定する不透明な円筒形キ
ヤビテイはスポツト拡大でアンブレラ効果を生じ
た。この新しい特徴により、被分析物の肉眼によ
る定量を容易に行なうことができた。 実施例 この実施例で報告する実験では、化学ルミネセ
ンス試薬系をある濃度範囲の過酸化水素（H2O2）
にさらして、本発明の装置を使用して定量的応答
を生ずる能力を評価した。種々の臨床的に重要な
被分析物に応答してH2O2を生成する広範な酵素
系が知られている。本例はその例として比較を含
むが、この比較は特定の被分析物に限定されるも
のではない。 装置の構造 本例の実験は、実施例に記載したように構成
した装置を使用して行なつた。 実験操作 50ｍＭのNaOH（PH13）中にABENH2.5μM及
びミクロペルオキシダーゼ2.5μMを含む溶液の一
定量の装置のきれいな試験管中に分配した。次
に、反応開始試薬H2O2を注入するため装置をシ
ールした。シヤツタを開放し、種々のH2O2濃度
を含む10ｍＭトリス−HClの一定量（20μ）を
次に試験管中に注入した。前例と同様に発光が終
了した後だけ、シヤツタを閉じた。 結 果 現像すると、写真は、黒色背景上に白色斑点を
示した。最大露光に達すると、この斑点の寸法は
被分析物の濃度と共に増大した。第２表に示した
濃度は反応の最後の160μにおける濃度である。 【表】 【表】 得られたデータは、本発明により製造した装置
は存在する過酸化水素の濃度範囲に応答して定量
的に検出しうるシグナルを提供することを示す。 本発明を詳細に説明したが、本発明の範囲を逸
脱することなく、細部に多くの変更を行なうこと
ができる。
被分析物の定量的ルミネセンス分析に使用する分
析装置の分野に関する。 従来、尿や血液のような液体中の特殊な成分を
測定するため種々の試験組成物及び方法が開発さ
れた。このような従来の試験系は、測定すべき被
分析物に直接応答するか、または被分析物応答系
の生成物と組合せ、反応する１種以上の呈色性レ
ドツクス指示薬を試薬組成物中に含む型のもので
あつた。重要な分析中間体ATP、NAD(H)及び過
酸化物に対するルミネセンス分析の極めて高い感
度及び適用性から、臨床化学における分析手段と
して化学ルミネセンス及び生物ルミネセンスの開
発がなされた。分析用ルミネセンスの優れた観察
はホワイトヘツド（Whitehead）らのClin.
Chem.、25巻1531〜1546頁（1979）にある。 最近までに、個別に構成された装置またはルミ
ネセンスの特別の要件に適合するように変更した
市販の装置を使用して大多数のルミネセンス測定
がなされた。変更された市販の装置は、光度計、
蛍光計及びシンチレーシヨンカウンターを含む
（ホワイトヘツドの前掲文献参照）。 ルミネセンスを測定するため尽力された別のア
プローチは、発光反応によつて放出される光に写
真フイルムを露光することである。種々の系中の
向上剤、抑制剤、触媒及び酸化剤を検出するため
化学ルミネセンス反応を他のものによつてフイル
ム上で監視した。イサクソン（Isacsson）ら著、
Analytica Chem.Acta.、68巻339頁（1974）；バ
ブコ（Babko）ら著J.Anal.Chem.U.S.S.R.、20
巻1150頁（1965）；ルコフスカヤ（Lukovskaya）
ら著、J.Anal.Chem.U.S.S.R.、26巻1492頁
（1971）；バブコ（Babko）ら著Zavod.Lab.、29
巻404頁（1963）；及びバブコ（Babko）ら著
Ukri Khim.、Zh.29巻57頁（1963）参照。しかし
ながら、どの文献も装置を記載していない。 また、写真フイルムで包囲した密封容器中に試
料及び化学ルミネセンス試薬を注入し、フイルム
の露光度を濃度の函数として測定することも示唆
された〔ザイツ（Seitz、W.R.）ら著、Anal.
Chem.、46巻188〜202頁、殊に191〜192頁
（1974）参照〕。 フオーゲルハツト（Vogelhut）の米国特許第
4231754号明細書は、被分析物の存在に応答して
反応生成物を生ずる第一試薬系及び前記反応生成
物の存在に応答してルミネセンスを生ずる第二試
薬系を混入した単一の固体担体手段から成る、試
料中の被分析物の測定用試験装置を開示してい
る。この試験装置は更に、前記担体手段と物理的
に結合し、化学ルミネセンス系の発する光に応答
する光応答層を含む。 カバノー（Cavanaugh）の米国特許第3923462
号明細書は、環境空気中のオゾンまたは汚染物質
の自動検出装置を開示している。遮光容器に空気
の試料を導通して、オゾンの存在で発光する物
質、例えばローダミンＢと反応させるか、または
通常では発光する（例えば黒色光で）が、オゾン
の存在では消光する物質と反応させる。容器中の
写真フイルムは化学ルミネセンス系から離して置
かれ、露光される。ルミネセンス反応にさらされ
ると、フイルムの粒子密度は増加する。フイルム
が緻密である程、多量の汚染物質が存在すること
を示す。しかしながら、粒子密度に依存するに
は、精巧な装置または色差の小さい色相間の評価
を必要とする。 本発明のルミネセンス検出装置は、簡単で安価
な成分を使用し、ナノモル濃度で存在する反応成
分の検出用ルミネセンスを定量的に肉眼で好適に
読取ることができる。測定は迅速であり、生ずる
画像は永久記録となる。免疫分析を含めてルミネ
センス分析を写真フイルム上で監視することがで
き、外部動力源を必要としない。読取り機器（反
射計またはデンシトメータ）も必要に応じて含ん
でいてもよい。 本発明によれば、 (i) 主軸に沿つて複数の対向端部を有し、第一の
端部が液体試薬及び試料を反応室中に導入する
ものであり、他の端部が所定寸法の光透過孔を
形成するものであり、被分析物含有試料との接
触に応答して発光する組成物を保有するのに適
当な反応室； (ii) 前記の第一の端部において液体を前記反応室
中に導入するカニユールを入れ、反応室を閉鎖
する閉鎖部材； (iii) 光応答性画像形成層； (iv) 光応答性画像形成層が孔を形成する端部から
所定の距離で、好ましくは反応室の主軸に実質
的に垂直に配置されて、孔から発する光にさら
されるように、光応答性画像形成層と反応室と
を関連させる装置；及び (v) 光応答性画像形成層を周囲の光に露光される
のを防止する部材 から成ることを特徴とする液体試料中の被分析物
を定量的に検出するルミネセンス検出装置が提供
される。 孔から放出される光は、接触する画像形成層の
帯域を露光する。放出される光の量は試料中の被
分析物の量に比例する。低い被分析物濃度でさ
え、光は画像形成層の「基底帯域」を露光する。
この「基底帯域」は孔と同じ領域を有する。被分
析物濃度が増加すると、完全に露光されるまでこ
の「基底帯域」の露光が増加する。ルミネセンス
検出系中の試薬の濃度を調節することによつて基
底帯域を完全に露光するのに有効な被分析物濃度
を選択することができる。これより高い被分析物
濃度は、孔から画像形成層上の直径のより大きい
領域を露光するルミネセンスを起す。従つて、露
光される帯域は基底帯域または孔の領域より大き
い寸法を有する。この範囲における被分析物濃度
は露光される帯域の直径に比例する。 反応室は１個以上の要素から成つていてよい。
例えば、反応室は、多重ウエルを予め形成した、
一般にプラスチツク製の段階希釈板または組織培
養板中のウエルであつてよい。ルミネセンス試薬
を直接ウエル中に置き、板の頂部にカバーをし、
試薬及び試料をウエル中にカバーを通して導入す
る。また、反応室は反応容器ハウジング及び反応
容器から成つていてよい。反応容器ハウジングは
例えば垂直に穿孔された円筒形凹所を有する不透
明なブロツクであつてよい。この場合の反応容器
は円筒形凹所中にきれいにはまるガラス試験管で
あつてよい。 いずれの実施態様においても、反応室は試薬及
び試料を導入する第一の端部を有する。この端部
は、液体導入用カニユールの貫通しうる閉鎖部材
によつて閉鎖される。この閉鎖部材は、反応室と
一体であるか、または別個の要素、例えば隔壁で
あつてよい。第一の実施態様の例として、反応室
はゴムまたは他の弾性材料製の反応容器ハウジン
グから成つていてよい。第一の端部を、全体の一
部として形成されている、弾性材料の薄い隔膜に
よつて閉鎖する。閉鎖部材が別個に構成されてい
る場合、これは血液試料の収集用の排気容器と共
に一般に使用されるような隔壁または栓であるの
が好ましい。 光応答性画像形成層は写真フイルムであるのが
好ましい。これは、黒白またはカラーフイルムで
あつてよい。フイルムは、便宜上、自己現像フイ
ルムであるのが好ましい。 装置全体の機械的要素は、光応答性画像形成層
が反応室の主軸に対して実質的に垂直に、孔を形
成する端部から所定の距離に、孔から発する光に
さらされるように配置されるように、光応答性画
像形成層と反応室を関連させるのに充分な構造を
提供するものである。このような構造は、例えば
光応答性画像形成層を受容する水平室とその上に
反応室を垂直に保持するキヤリツジを有する基台
によつて得られる。基台は場合により、更に反応
室と光応答性画像形成層との間に設置したシヤツ
タを含んでいてよい。このような基台は、更に光
応答性画像形成層が周囲の光にさらされないよう
に遮蔽する作用をする。この実施態様は第１図〜
第４図の説明のため選択したものである。 第１図に示したように、一般に１０で示したル
ミネセンス検出装置は不透明な反応容器ハウジン
グ１２、反応容器１４及び光応答性画像形成層１
６から成る。本体２０を有する不透明な反応容器
ハウジング１２は複数の円筒形側壁２２を有し、
そのそれぞれが容器受容室２４を形成する。各容
器受容室２４は、注射針２６を光を通さないで導
入するのに適当な手段によつて閉鎖されている。
容器受容室２４は底部でも開口して、所定の形及
び寸法の孔１８を形成する。光応答性画像形成層
１６は、孔１８から所定の距離に、孔から発する
光にさらされるように配置されている。 容器受容室２４の頂部は、本体２０と連続して
全体的に不透明な単一要素を形成する一体構造の
閉鎖部材３４によつて閉鎖することができる。或
いは、第２図に示したように、容器受容室２４の
頂部は、容器受容室２４中にぴつたりはまつて着
脱可能の遮光閉鎖部材を形成する着脱可能の隔壁
３５で閉鎖することもできる。いずれの実施態様
でも、容器受容室２４の閉鎖部材は、光を通さな
いまま、反応容器１４中に液体を導入するため皮
下注射針２６の貫通しうる特性を有する材料から
成る。反応容器ハウジング１２は、明確な形をと
るのに適当な任意の材料から作られる。このよう
な材料は不透明なプラスチツク、ゴム、金属また
は公知材料であつてよい。 第１図に関して、反応容器１４は反応容器ハウ
ジング１２中に設置される。反応容器１４は、反
応容器ハウジング１２の円筒形側壁２２内に同軸
に嵌合する側壁４２及び側壁４２と連続している
底部４６から成る。底部４６は丸くなつていて
も、平坦であつてもよく、反応容器１４が保有す
る反応溶液４８から発生する光をほとんど散乱し
ないような特徴を有する。反応容器１４はその上
端で空所４４によつて制限される。従つて、容器
受容室２４中に挿入された針は空所４４を通して
反応容器１４中に液体を導入することができる。
反応容器１４は、目的のルミネセンス反応溶液を
入れるのに適当な、任意の透明または半透明材料
から作るべきである。このような材料は光学的に
澄明なガラス、石英、プラスチツクまたは他の公
知材料であるのが好ましい。反応容器１４は光学
的に澄明な試験管であるのが便利である。 特に、第１図の下部及び第３図の拡大図に関し
て、光応答性画像形成層１６は、孔１８から発す
る光に露光されるように孔１８に対面する感光性
表面５０を有する。周囲の光による感光性表面５
０の露光を防止する不透明な支持体５６は、光応
答性画像形成層と積層関係にある。光応答性画像
形成層１６は適当な手段によつて反応容器ハウジ
ング１２の孔１８から所定の距離に保持される。
この手段の実施態様を次に詳述する。 本発明のこの実施態様は、不透明な反応容器ハ
ウジング１２と光応答性画像形成層１６との間に
シヤツタ６０（第１図だけ）を含む。シヤツタ板
６２（第１図だけ）はシヤツタガイド６４中で、
光応答性画像形成層１６に対して平行に摺動する
（第１図に矢印で示した側方運動）。シヤツタ板６
２を開放方向に移動させて、画像形成層１６の感
光性表面５０と孔１８から発する光との間で光接
触を行わせる。 更に、孔１８と感光性表面５０との間の距離の
限定を更に可能にするスペーサ７０が設けられて
いる。スペーサ７０は、距離を限定するため所定
の高さのスペーサ壁７４を有する光学的澄明体７
２を有する。スペーサ７０の光学的澄明体７２は
光散乱特性を有しないのが好ましい。 別の実施態様（図示せず）では、不透明な反応
容器ハウジング上にカメラを設置して、孔が孔１
８から所定の距離に保持された光応答性画像形成
層、この場合写真フイルムを、場合によりシヤツ
タを含めて、所望のルミネセンスを光学的に澄明
に透過するのに適当なレンズ系によつて露光する
ようにすることができる。 第４図は、画像形成層１６の光応答表面５０上
の露光領域の増加状態を略示する同心円８０を想
像線で示す。不透明な支持体５６の一部も示され
ている。反応容器中で前記被分析物の存在に応じ
て光を生ずるのに有効な組成物と試料を反応さ
せ、その光応答性画像形成層上で生じた任意の露
光部分の直径を測定することから成る、試料中の
被分析物の定量的検出方法により、装置を使用す
る。 本発明の別の好ましい実施態様を第５図及び第
６図に示すが、第１図〜第４図に示す実施態様に
おける要素と同等の要素を、同じ番号に記号
「ａ」を付して示す。 第５図及び第６図に示したように、一般に１０
ａで示したルミネセンス装置は不透明な反応容器
ハウジング１２ａ、反応容器１４ａ及び光応答性
画像形成層１６ａから成る。本体２０ａを有する
不透明な反応容器ハウジング１２ａには、複数の
円筒形側壁２２ａが設けられており、この円筒形
側壁２２ａは、側壁２２ａと連続している底部４
６ａと一緒に反応容器１４ａを形成する。底部４
６ａは透明または半透明でなければならない。各
容器受容室２４ａは注射針２６ａを光を通さない
で導入するのに適当な手段によつて頂部を閉鎖さ
れている。この実施態様では、孔１８ａは底部４
６ａによつて与えられる。光応答性画像形成層１
６ａは、孔１８ａから所定の距離に、孔から発す
る光にさらされるように設置されている。 反応容器１４ａの頂部は、不透明な一体構造の
閉鎖部材３４ａによつて閉鎖することができ、こ
の閉鎖部材３４ａは本体２０ａを連続して被覆し
て単一のシールを形成し、好ましくは接着剤によ
つて固定される。閉鎖部材は、フイルムへの光の
透過を増加する光反射性内表面を積層して有して
いてもよい。一体構造の閉鎖部材３４ａは、光を
透過しないまま、反応容器１４ａ中に液体を導入
するため皮下注射用針２６ａを貫通しうる特性を
有する材料から成る。反応容器ハウジング１２ａ
は、明確な形をとるのに適当な任意の材料から作
られる。このような材料は不透明なプラスチツ
ク、ゴム、金属または他の公知材料であつてよ
い。 光応答性画像形成層１６ａは、孔１８ａから発
する光にされされるように孔１８ａに対面する感
光性表面５０ａを有する。周囲の光による感光性
表面５０ａの露光を防止する不透明な支持体５６
ａは、光応答性画像形成層１６ａと積層関係にあ
る。光応答性画像形成層１６ａは、露光されない
であろう感光性表面５０ａの部分上に例えばクラ
ンプまたは両面接着剤（図示せず）を使用して、
反応容器ハウジング１２ａの底に固定することに
よつて孔１８ａから所定の距離に保持される。 この好ましい実施態様の変形として、反応容器
ハウジングに結合される画像形成層を選択的に露
光するためシヤツタ機構を有するカートリツジ状
フイルムパツクを代用することができる。酸化
剤、例えば、過酸化水素の注入によりルミネセン
ス反応の開始直前にシヤツタを開放することがで
きる。シヤツタを含めてフイルムパツクを次に取
り出し、フイルムを現像することができる。この
実施態様の変形として、各反応容器の下に選択し
た直径の穴を配置したシヤツタを設けることがで
きる。穴を有するこのようなシヤツタはダンパと
して作用することができる。即ち、より小さい穴
は、基底帯域の寸法を減少し、それに比例して露
光領域の直径増加を減少し、これにより高濃度ま
で測定が可能になる。 どの実施態様でも、また装置の要素をどのよう
に変形しても、ある種のルミネセンス反応系は試
薬配合物の製造時に洗浄工程を必要し、他の系は
これを必要としない。例えば、ルミネセンス免疫
分析は一般に種々の試薬の導入工程の間に洗浄工
程を必要とする。このような着脱可能の隔壁とし
て、これらの場合に、反応容器ハウジング用のユ
ニツトアセンブリより一層望ましい変形がありう
る。また、ルシフエラーゼを使用するアデノシン
三燐酸（ATP）の分析は、洗浄工程を必要とし
ないので、一体のシールを介してその分析を付加
することができる。 ルミネセンス系 ルミネセンスとは、化学反応の結果である可視
または不可視光線の放出であると簡単に定義する
ことができる。化学ルミネセンスでは、励起状態
の分子を生ずるエネルギー源が化学反応のエネル
ギーであり、励起状態から基底状態への減衰は光
の放出（ルミネセンス）を伴なう。分析的には、
最も興味をひいたルミネセンスは化学ルミネセン
ス及び生物ルミネセンスである。後者は、触媒蛋
白がルミネセンス反応の効率を高める生物学的系
に見られる特殊な形の化学ルミネセンスに与えら
れた名称である。 １ 化学ルミネセンス分析系 要約すれば、溶液中の有機化学ルミネセンス
の機構は下記の３工程を含む：即ち、(a)中間体
キー化合物を生ずる予備反応、(b)中間体キー化
合物の化学エネルギーを励起エネルギーに変え
る励起工程、及び(c)化学反応で生成した励起生
成物から光の放出。化学ルミネセンスを増強す
るため蛍光化合物を添加する反応では、有効な
エネルギー移動が起り、生ずる化学ルミネセン
スは「増感化学ルミネセンス」として知られて
いる。 化学ルミネセンス反応系は酸化剤（通常過酸
化水素）を必要とし、この酸化剤は前記(a)工程
で、中間体キー化合物を生成する予備反応によ
つて生成されるものであつてもよい。反応系は
更に、触媒、例えばミクロペルオキシダーゼ、
ヘム、ヘモグロビンまたはコバルトを必要とす
る。更に、反応系は、触媒の作用によつて中間
体キー化合物（過酸化水素）から励起エネルギ
ーを受け取る化学発光原化合物
（chemilumingenic compound）を必要とす
る。化学発光原化合物が高エネルギー励起状態
から基底状態にもどる場合に、検出しうる光の
形でエネルギーが放出される。 この項に記載する化学ルミネセンス系はすべ
て、一般に予備反応で生ずる過酸化水素を検出
しうるという共通の特徴を有する。被分析物に
応答して光を生ずるのに有効な組成物は、試料
中の被分析物の存在に応答して反応生成物、例
えば過酸化水素のような酸化剤を生ずる酵素を
少なくとも１種含むものであるのが好ましい。
この酵素は特にオキシダーゼ、例えば臨床分析
に使用されることの知られているもの、例えば
グルコースオキシダーゼまたはコレステロール
オキシダーゼである。他の系で生成または使用
される他の公知酸化剤は、過沃素酸塩、次亜塩
素酸塩、フエリシアン酸塩または過マンガン酸
塩を含む。生成した過酸化水素はペルオキシダ
ーゼのような、過酸化物活性化物質と反応す
る。 ペルオキシダーゼ類は一般に、鉄ポルフイリ
ンを含む複合蛋白である。ペルオキシダーゼは
西洋わさび、バレイシヨ、いちじくの樹液及び
かぶら（植物ペルオキシダーゼ）；ミルク（ラ
クトペルオキシダーゼ）；及び白血球（ベルド
ペルオキシダーゼ）中に産生する。ペルオキシ
ダーゼはまた、微生物中に産生し、発酵によつ
て産生される。ある種の合成ペルオキシダーゼ
類、例えばテオレル（Theorell）及びマーリ
イ（Maehly）著Acta.Chem.Scand.、４巻422
〜434頁（1950）に開示されているペルオキシ
ダーゼも、H2O2検出系に使用するのに申し分
ない。過酸化物活性化物質は過酸化物の還元を
触媒する点で酵素様である。ヘモグロビン及び
その誘導体は、酵素ペルオキシダーゼの挙動に
類似して挙動するので、このような「過酸化物
活性」物質の代表例である。酵素でないが、過
酸化物活性を示す他の物質は、チオシアン酸
鉄、タンニン酸鉄、フエロシアン化鉄、シリカ
ゲルに吸着されたクロム塩（例えば硫酸クロム
カリウム）等である。 数種の化学ルミネセンス系が従来知られてお
り、以下に本発明の検出系に使用される若干の
系の例を挙げるが、これらは本発明の範囲を限
定するものではない。使用する化学ルミネセン
ス化合物の性質により下記の系が挙げられる。 (a) ジアシルヒドラジド 式： 〔式中R1及びR2の一方は水素であり、他方
は−NR3R4基（式中R3及びR4はそれぞれ独
立に水素または炭素原子数１〜６個の直鎖ア
ルキル基から選択される）を表わす〕を有す
る環状ジアシルヒドラジドから強い化学ルミ
ネセンスが得られる。好ましい化合物の１つ
は、R1が−NH2であり、R2が−Ｈであるル
ミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン）である。別の好
ましい化合物は、R1が−Ｈであり、R2が−
NH2であるイソルミノール（６−アミノ−
２，３−ジヒドロフタラジン−７，４−ジオ
ン）である。環構造中の置換はルミネセンス
に著しく影響する、即ちルミネセンスを著し
く増加または減少する。ヘテロ環式環が置換
されている場合、光の完全な損失が起る。シ
ユレーダー（Schroeder、H.R.）ら著、スペ
シフイツク・プロテイン・バインデイング・
リアクシヨンス・モニタード・バイ・ケミル
ミネセンス、イミノアツセイス（Specific
Protein Binding Reactions Monitored by
Chemluminescence、Immunoassays化学ル
ミネセンスにより検査された特異蛋白結合反
応、免疫分析）；クリニカル・ラボラトリ
イ・テクニクス・フオー・ザ・1980
（Clinical Laboratory Techniques for the
1980′s）Alan R.Liss、Inc.（ニユーヨーク州
ニユーヨーク市）189〜204頁（1980）参照。 発光の点でルミノールより一層有効な、ル
ミノールの融合類縁体が判明した。その１例
は式： を有する化合物であり、この化合物はマツク
カプラ（McCapra、F.）著、ザ・ケミルミ
ネセンス・オブ・オルガニツク・コンパウン
ズ（The Chemiluminescence of organic
compounds、有機化合物の化学ルミネセン
ス）、Q.Rev.（ロンドン）、20巻485頁
（1966）、及びシユレーダー（Schroeder、H.
R.）及びイーガー（Yeager、F.M.）著ケミ
ルミネセンス・イールズ・アンド・デイテク
シヨン・リミツツ・オブ・イソルミノール・
デリバテイブス・イン・ベアリアス・オキシ
デイシヨン・システムス
（Chemiluminescence Yields and
Detection Limits of Isoluminol
Derivatives in Various Oxidation
Systems、種々の酸化系におけるイソルミノ
ール誘導体の化学ルミネセンス収率及び検出
限界）Anal.Chem.、50巻1114頁（1978）に
論じられている。 ルミノールにおける発光の効率、波長及び
最適PHは反応条件に著しく左右される。一般
に、過酸化水素は最も一般に使用される酸化
剤である。触媒は例えばFe（CN6）3-及び
Cu2+である〔ザイツ（Seitz、W.R.）及びニ
ーリイ（Neary、M.P.）著、ケミルミネセ
ンス（Chemiluminescence、化学ルミネセ
ンス）及びビオルミネセンス
（Bioluminescence、生物ルミネセンス）、
Anal.Chem.46巻188頁（1974）参照〕。使用
する他の酸化剤は次亜塩素酸塩、沃素、過マ
ンガン酸塩及び適当な触媒の存在で酸素を含
む。恐らくこの反応に最も有効な触媒はヘム
であり、最良の媒体は炭酸塩緩衝液である。
化学ルミネセンスに最適のPHは触媒及び酸化
剤により若干変動するが、ほとんどの酸化系
について最適PHは約PH11である。ルミノール
のルミネセンスは式１の化学論に従う。 式1. 一重励起状態で形成されるアミノフタル酸
イオンが反応における発光体であることが判
つている〔ホワイト（White、E.H.）、及び
バーシイ（Bursey、M.M.）、ケミルミネセ
ンス・オブ・ルミノール・アンド・リレイテ
ド・ヒドラジド（Chemiluminescence of
luminol and related hydrazides、ルミノー
ル及び同族ヒドラジドの化学ルミネセン
ス）：ザ・ライト・エミツシヨン・ステツプ
（The light emission step、発光工程）、J.
Am.Chem.Soc.、86巻941頁（1964）参照〕。
過酸化水素／ミクロペルオキシダーゼ系を用
いるルミノールの検出限界は１ピコモル／
である。 (b) アクリジニウム塩 ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニ
ウム硝酸塩）は、金属イオン触媒の存在で塩
基性溶液中で過酸化物で酸化すると発光す
る。反応は、ルミノール反応を触媒しない若
干の金属イオン、例えばPb2+で触媒され、
ルミノールでは可能でない分析用途に対する
基礎を提供する。 過酸化水素による化学ルミネセンス酸化を
受けるアクリジニウムフエニルカルボキシレ
ートは、ブリユツセル（1978）の生物及び化
学ルミネセンスの分析への応用に関する国際
シンポジウムの講演におけるマツクカプラ
（McCapra、F.）、タツト（Tutt、D.）及び
トツピング（Topping、R.M.）のザ・ケミ
ルミネセンス・オブ・アクリジニウム・フエ
ニル・カルボキシレート・イン・ジ・アツセ
イ・オブ・グルコース・アンド・ハイドロジ
エン・パーオキサイド（The
Chemiluminescence of Acridinium Phenyl
Carboxylates in the Assay of Glucose
and Hydrogen Peroxide、グルコース及び
過酸化水素分析におけるアクリジニウム フ
エニル カルボキシレートの化学ルミネセン
ス）及びマツクカプラらの英国特許第
1461877号明細書（1977）に記載されている。
これらの物質の酸化のための最適PHはフエニ
ル基中の置換基の性質に左右され、特別のPH
要件に適合するようにアクリジニウム塩を調
製することができる。 (c) ジアリールオキサレート ジアリールオキサレート、例えばビス（ト
リクロロフエニル）オキサレートは、ペルオ
キシオキサレート中間体を経て過酸化水素と
の化学ルミネセンス酸化反応を受ける。例え
ば、シエルマン（Sherman、P.A.）、ホルト
ベツカー（Holtbecker、J.）及びライアン
（Ryan、D.E.）著、アナリテイカル・アプリ
ケイシヨンズ・オブ・パーオキシオキサレー
ト・ケミルミネセンス（Analytical
Applications of Peroxyoxalate
Chemiluminescence、パーオキシオキサレ
ート化学ルミネセンスの分析への応用）、
Anal.Chem.Acta.、97巻21頁（1978）：ザイ
ツ（Seitz、W.R.）及びニアリイ（Neary.
M.R.）著、リーセント・アドバンシス・イ
ン・バイオルミネセンス・アンド・ケミルミ
ネセンス・アツセイ（Recent Advances in
Bioluminescence and Chemiluminescence
Assay、生物ルミネセンス分析及び化学ルミ
ネセンス分析における最近の進歩）、
Methods Biochem.Anal.、23巻161頁
（1976）；及びウイリアムス（Williams、D.
C.）及びザイツ（Seitz、W.R.）著、オート
メイテド・ケミルミネセンス・メソツド・フ
オー・デイターミニング・ザ・リデユース
ド・フオーム・オブ・ニコチンアマイド・ア
デニン・ダイニユクレオタイド・カツプル
ド・トウ・ザ・メジヤーメント・オブ・ラク
テート・デハイドロゲナーゼ・アクテイビテ
イ（Automated Chemiluminescence
Method for Determining the Reduced
Form of Nicotinamide Adenine
Dinucleotide Coupled to the
Measurement of Lactate Dehydrogenase
Activity、ラクテート脱水素酵素活性測定と
結合した、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド測定用の自動化化学ルミネセン
ス法）、Anal.Chem.、48巻1478頁（1976）参
照。 過酸化物を分析するため、トリエチルアミ
ンを含む酢酸エチル／メタノール／水性緩衝
液（PH範囲４〜10）系中にビス（トリクロロ
フエニル）オキサレートが使用された。この
反応（増感ケミルミネセンス）における発光
剤として蛍光性分子であるペリレンが、その
安定性及び好ましい発光効率及び発光波長範
囲のため、使用された。ウイリアムス
（Williams、D.C.）ハフ（Huff、G.G.）及び
ザイツ（Seitz、W.R.）著、エバリユエイシ
ヨン・オブ・パーオキシレート・ケミルミネ
センス・フオー・デイターミネイシヨン・オ
ブ・エンザイム・ジエネレイテイド・パーオ
キサイド（Evaluation of Peroxylate
Chemiluminescence for Determination of
Enzyme Generated Peroxide、酵素による
生成過酸化物の測定用パーオキシレート化学
ルミネセンスの評価）、Anal.Chem.、48巻
1003頁（1976）、参照。検出限界は７×10-8
モル／リツトル（mol／Ｌ）であり、直線応
答範囲は10-3mol／Ｌ過酸化水素にまで及
ぶ。ビス（トリクロロフエニル）オキサレー
ト系が過酸化物の検出に対してルミノール
（前記事実参照）程鋭敏でないが、背景化学
ルミネセンスが比較的低く、尿酸のような妨
害物質に対する感度が低いという利点を有す
る。 (d) 他の化学ルミネセンス系 本発明に使用しうる、公知の他の化学ルミ
ネセンス分析系は下記のものを含む； (i) アルカリ性PHで酸化されて黄色化学ルミ
ネセンスを生ずるロフイン〔ラヅイゼフス
キイ（Radzizewski、B.）著、ウンターズ
ーフング・イーバー・ヒドロベンズアミ
ド・アラリン・ウント・ロフイン
（Untersuchung u¨ber Hydrobenzamid、
Ararin und Lophinヒドロベンズアミド、
アラリン及びロフインについての化学分
析）、Chem.Ber.、10巻70頁（1977）； (ii) 酸性PHで酸化されて黄赤色化学ルミネセ
ンスを生ずるシロキセン〔イルデイ
（Erdey、L.）、ケミルミネセンス・インデ
イケイタース（Chemiluminescence
indicators）、Indicators、ビシヨツプ（E.
Bishop）編集、英国オツクスフオードの
パージヤモン・プレス（Pergamon
Press）、1972年709〜732頁参照）；及び (iii) 多価フエノール、例えばピロガロール及
び没食子酸〔スラウインスカ
（Slawinska、D.）及びスラウインスカ、
J.著、ケミルミネセント・フロー・メソツ
ド・フオー・デイターミネイシヨン・オ
ブ・ホルムアルデハイド
（Chemiluminescent flow method for
determination of formaldehydeホルムア
ルデヒドの測定用ケミルミネセンス流動
法）、Anal.Chem．47巻2101頁（1975）。 ２ 生物ルミネセンス分析系 臨床上有用な物質の多くの分析法は、ニコチ
ンアデニンジヌクレオチド／還元型（NAD+／
NADH）及びアデノシントリホスフエート
（ATP）のような共通因子を含む反応に基づ
く。記載した生物ルミネセンス反応はこのよう
な共通因子に関する従来の分光分析または比色
分析に対する鋭敏な代替法を提供する。 ほたる及びつちぼたるは最も良く知られた生
物ルミネセンス生物であるが、ほとんどは海に
生存する生物であり、顕微鏡的細菌及びプラン
クトンから多くの種類の魚に雑多に及ぶ。若干
の生物ルミネセンス系が知られており、本発明
の試験装置に使用しうる、そのような系の若干
の例を以下に示す。系をまず生物ルミネセンス
源である生物により論じ、次にメカニズムをま
とめる。 (a) ほたる（Photinius） ほたるのルミネセンスが最も詳細に研究さ
れた生物ルミネセンス系であることは疑いな
い。発光反応は酵素ルシフエラーゼ、ルシフ
エリン、Mg2+、ATP及び分子状酸素を必要
とする。ルシフエラーゼは、発光と共にルシ
フエリンのような基質の酸化を触媒する酵素
に関する総称である。ルシフエリンは、適切
な環境中で酸化されて電子的に励起された一
重線状態を生じうる環元された化合物に関す
る総称である；光は該化合物が基底状態にも
どる際に生ずる。 開始反応は、Mg2+及びATPの存在でルシ
フエリンをルシフエリルアデニレートに迅速
に変換し、ルシフエリルアデニレートはルシ
フエラーゼの存在で分子状酸素と結合して励
起状態のオキシルシフエリルアデニレート−
酵素錯体を生成する反応である。発光後、基
底状態の錯体は解離して酵素、アデノシン−
燐酸（AMP）、オキシルシフエリン及び二酸
化炭素を生成する。その際二酸化炭素はルシ
フエリンのカルボキシル基から誘導される。
反応はPH7.8のグリシン緩衝液中で25℃で最
もよく実施される。放出される光の色は、ほ
たるの種類により異なるが、ルシフエリンの
構造はすべての種類について同一である。最
大放出の強度及び波長はPH、イオン濃度、温
度、及びZn2+またはCd2+の塩化物の存在の
変動により変化する。 反応はATPに対して特異的でない；他の
ヌクレオチド、例えばシチジン−5′−トリホ
スフエート、イノシン−5′−トリホスフエー
ト及びイソ−ATPは発光を刺激することが
できる。反応においてMg2+をマンガン陽イ
オンに代えてもよい。ある種の陰イオンは反
応を抑制する（SCN−＜Ｉ−＜NO3−＜Br
−＜Cl−）。プロカイン及びリドカインのよ
うな麻酔剤も抑制剤であり、この事実が分析
法の基礎を形成した。 (b) 海洋細菌 ルミネセンス海洋細菌のほとんどの研究
は、ベネケア・ハーベイイ（Benecckea
Harveyi）〔フオトバクテリウム・フイツシ
エリ（Photobacterium fischeri）MAV株〕
及びビブリオ・フイツシエリ（Vibrio
Fischeri）の２種に集中している。試験管内
では、ルミネセンスに必要な成分は、FMN
リダクターゼ、長鎖脂肪族アルデヒド（Ｒ−
CHO）、酸素、及び細菌ルシフエラーゼによ
るNADHまたはNADPHの酸化によりFMN
から生成した還元フラビンモノヌクレオチド
FMNH2である。反応中に生ずる全体の光
は、基質（O2−FMNH2及びＲ−CHO）が
制限量で存在する場合、各基質の量に比例す
る。このことはルシフエラーゼについても真
実である。それというのは過剰のFMNH2は
発光の速度に比較して著しく早く自動酸化さ
れ、FMNH2はルシフエラーゼがその触媒サ
イクルを終る時までにFMNに再変換されて
いた。従つて、他の反応体と同様にルシフエ
ラーゼは試験管内反応において一度作用する
だけである。しかしながら、FMNH2を繰返
し添加するとルシフエラーゼは何度も作用す
ることができる。アルデヒドは対応するカル
ボン酸に酸化される。炭素原子数８個以上の
鎖長（Ｒ）を有する脂肪族アルデヒド（Ｒ−
CHO）だけが反応に有効である。 微生物ルシフエラーゼ活性はFMNH2に対
して高度に特異的であるが、酵素も他のフラ
ビン及びフラビン類縁体に対して弱い活性を
示す。ルシフエラーゼはｐ−クロロ水銀安息
香酸のようなチオール試薬及びリシル基、シ
ステイン基及びヒスチジニル基と反応する試
薬に対して特に鋭敏である。揮発性麻酔剤、
リボフラビン及びシアン化物、並びに銅、鉄
及び他の重金属も酵素を抑制する。 フラビンモノヌクレオチドリダクターゼ
（フラビンリダクターゼ、NAD（Ｐ）Ｈデヒ
ドロゲナーゼ、またはNAD（Ｐ）Ｈ−FMN
オキシドリダクターゼ）は試験管内で細菌ル
シフエラーゼと関係していると思われる。ビ
ブリオ・フイツシエリ及びベネツケア・ハー
ベイイから単離されたFMNリダクターゼ
は、約PH５〜PH10の比較的広いPH範囲にわた
つてNADH酸化に多少の活性を示す。リボ
フラビン、FAD並びにFMNの異性体及び類
縁体はFMNリダクターゼの基質として作用
しうる。 (c) くらげ（Aequorea） くらげ（Aequorea）の生物ルミネセンス
系はCa2+と反応して青色ルミネセンスを生
ずる蛋白質・発色団錯体（“光蛋白”と言わ
れる）から成り、最大波長は溶解酸素とは無
関係に469nｍである。この光蛋白は、Ca2+
の存在で蛋白質によつて酸化されて発光しな
がらオキシルシフエリンを生ずる発色団成分
（ルシフエリン）と密接に関係する種特異性
蛋白質から成る。消費された光蛋白は「青色
螢光蛋白」と言われる。くらげ系を触媒しう
るCa2+以外の金属イオンはSr2+、Ba2+及び
すべてのランタニド系元素である。 (d) 反応メカニズム 要するに、臨床化学系に使用するのに適当
な生物ルミネセンス系は、下記のように図示
することができる； (i) 結合したピリジン−ヌクレオチド NADH＋FMNリダクターゼ ―――――――→ FMNH2＋NAD+FMNH2＋Ｒ−CHO＋O2 ルシフエラーゼ ――――――――→ Mg2+FMN＋Ｒ−CO2H＋光 (ii) 結合したアデニン−ヌクレオチド ルシフエリン＋ATP＋O2 ルシフエラーゼ ――――――――→ Mg2+ADP＋CO2＋光 (iii) 酵素−基質系 ルシフエリン＋O2ルシフエラーゼ ――――――――→ 光 (iv) “予装入”系の活性化 予装入蛋白Ca2+ ―――→ 青色−螢光性蛋白＋光 ３ ルミネセンス免疫分析 特異結合分析技術の開発により、液体媒体中
で極めて低濃度でみられる、診断、医学、環境
及び工業に重要な種々の有機物質を測定するた
めの有用な分析法が提供された。特異結合分析
は、リガンド、即ち結合されうる被測定分析物
とこれに対する結合相手との特異的反応に基づ
くものである。リガンド及びその結合相手の一
方が抗体であり、他方が対応するハプテンまた
は抗原である場合、その分析は免疫分析として
知られている。 従来の特異結合分析技術では、分析すべき液
体媒体の試料を種々の試薬組成物と混合する。
このような組成物は、標識、この場合にルミネ
センス標識と結合した結合成分を含む標識複合
体を含む。標識複合体中の結合成分は試薬組成
物の、もし存在するならば他の成分及び分析下
の媒体中のリガンドと関係する。これは２種、
即ち結合種及び遊離種の結合成分が結合されて
いない結合反応系を形成する。遊離種に匹敵す
る結合種を生ずる標識複合体の相対的量または
割合は試料中の検出すべきリガンドの存在（ま
たは量）の関数である。 結合種の標識複合体が遊離種の標識複合体の
存在で、標識を検査するため使用する手段によ
つて本質的に識別されない場合、結合種及び遊
離種は分析を遂行するために、物理的に分離し
なければならない。この種の分析法は、従来、
「不均一系」と言われる。標識複合体の結合種
及び遊離種を相互の存在で識別しうる場合、分
離工程を回避することができ、この分析法は
「均一系」と言われる。 次に記載するルミネセンス免疫分析は、分析
化学に適用しうる分析法の例である。 (a) ルミネセンス免疫分析 ルミネセンス標識(L)、例えばルミノール、
イソルミノール、ルシフエラーゼまたはルミ
ノール誘導体を使用する免疫分析は既に報告
されている。一般的図式は下記のとおりであ
り、式中、Agは抗原であり、Abは抗体であ
る； Ag＋Ag−Ｌ＋AbAb：Ag＋Ab ：Ag−LAg−Ｌ＋発光原性共反応体→光 ラジオイムノアツセイに比べて、ルミネセ
ンス免疫分析（LIA）は酵素免疫分析と関連
した多数の利点を有する。即ち、(1)試薬は安
価で安定であり、(2)分析は迅速であり、自動
化でき、(3)分離工程を必要とせず（均一系）、
放射線照射の危険が避けられ、更に、これら
の方法では標識を極めて鋭敏に検出しうると
いう利点が得られる〔ウイスダム
（Wisdom、G.B.）著エンザイム−イミユノ
アツセイ（Enzyme−immunoassay）Clin.
Chem.、22巻1243頁（1976）参照〕。 不均一系及び均一系ルミネセンス免疫分析
は既に記載されている。ルミノール−IgG複
合体のルミネセンス活性は、抗体に結合した
場合に変化しないことは、既に報告されてい
る〔ハーシユ（Hersch、L.S.）ら著、ア・
ルミノール−アシステイド・コンペテイテイ
ブ−バインデイング・イミユノアツセイ・オ
ブ・ヒユーマン・イミユノグロブリン・ジイ
（Ａ Luminol−Assisted Competitive−
Binding Immunoassay of Human
Immunoglobulin Ｇルミノールを用いた人
体免疫グロブリンＧの競合結合免疫分析）、
Anal.Biochem.、93巻267頁（1979）参照〕。
これに反して、イソルミノール−ビオチン複
合体のルミネセンス活性は、アビジン、即ち
ビオチンに対して特異的な結合蛋白に結合す
る場合に10倍に増加する。発光量のこの向上
は、蛋白質によつて媒介される化学ルミネセ
ンス効率の増大に帰する〔シユレーダー
（Schroeder、H.R.）、フオーゲルハツト
（Vogelhut、P.O.）、キヤリコ（Carrico、R.
J.）ら著、コンペテイテイブ・プロテイン・
バインデイング・アツセイ・フオー・ビオチ
ン・モニタード・バイ・ケミルミネセンス
（Competitive Protein Binding Assay for
Biotin Monitored by Chemiluminescence
化学ルミネセンスにより検査されたビオチン
の競合蛋白結合分析）、Anal.Chem.、48巻
1933頁（1976）参照）〕。また、チロキシン標
識複合体を使用する、化学ルミネセンスによ
つて検査されるチロキシン（T4）に関する
不均一系競合結合免疫分析は既に記載されて
いる。シユレーダら著、イミユノアツセイ・
フオー・シーラム・サイロキシン・モニター
ド・バイ・ケミルミネセンス
（Immunoassay for Serum Thyroxine
Monitored by Chemiluminescence化学ル
ミネセンスにより検査された血清チロキシン
の免疫分析）、J.Immunol.Methods.、25巻
275頁（1979）参照。 (b) ルミネセンス酵素免疫分析 ペルオキシダーゼ（POD）のような酵素
に関するルミネセンス分析は、酵素免疫分析
における酵素複合体の定量に利用されたフア
クターである従来の比色分析より著しく鋭敏
である。ペルオキシダーゼ−コルチソル複合
体のルミネセンス定量に関するコルチソルの
ルミネセンス酵素免疫分析はラジオイムノア
ツセイのそれと同等の感度を有する〔アラカ
ワ．Ｈ、マエダ．M.及びツジ．A.著、ルミ
ノール−ペルオキシダーゼの化学ルミネセン
ス反応によるコルチソルの酵素免疫分析、分
析化学26巻322頁（1977）参照〕。 この種の分析を図式で示すと、下記のとお
りであり、式中、Agは抗原であり、Abは抗
体である： Ag＋Ag−POD＋AbAb：Ag＋Ab ：Ag−PODAg−POD＋発光原性共反応体→
光 (c) ルミネセンスコフアクター免疫分析 若干の研究者は最近、生物ルミネセンス反
応を使用して定量したリガンドーコフアクタ
ー（コフアクター＝CF）複合体を使用して、
特異結合反応を検査する酵素法を研究した。
キヤリコ（Carrico、J.R.）、ユング
（Yeung、K.K.）シユレーダー（Schroeder、
H.R.）ら著スペシフイク・プロテイン−バ
インデイング・リアクシヨンス・モニター
ド・ウイズ・リガンド−ATP・コンジユゲ
イツ・アンド・フアイアフライ・ルシフエラ
ーゼ（Specific Protein−binding Reaction
Monitored With Ligand−ATP
Conjugates and Firefly Luciferase リガ
ンド−ATP複合体及びほたるルシフエラー
ゼにより検査された特異蛋白結合反応）、
Anal.Biochem.、72巻95頁（1976）；キヤリ
コ（Carrico、R.J.）クリストナー
（Christner、J.E.）、ボグスラスキイ
（Boguslaski、R.C.）及びユング（Yeung、
K.K.）著ア・メソツド・フオー・モニタリ
ング・スペシフイク・バインデイング・リア
クシヨンズ・ウイズ・コフアクター・レイベ
ルド・リガンヅ（Ａ Method for
Monitoring Specific Binding Reactions
With Cofactor Labeled Ligands標識リガ
ンドコフアクターによる特異結合反応の検査
方法）、Anal.Biochem.、72巻271頁（1976）、
及びシユレーダー、キヤリコ、ボグスラスキ
イ及びクリストナー著、スペシフイク・バイ
ンデイング・リアクシヨンズ・モニタード・
ウイズ・リガンド−コフアクター・コンジユ
ゲイツ・アンド・バクテリアル・ルシフエラ
ーゼ（Specific Binding Reactions
Monitored With Ligand−cofactor
Conjugates and Bacterial Luciferaseリガ
ンド−コフアクタ複合体及び細菌ルシフエラ
ーゼにより検査された特異結合反応）Anal.
Biochem.、72巻283頁（1976）参照。 リガンドは例えばNAD+の酵素活性誘導体
に共有結合した。アルコールデヒドロゲナー
ゼ及びエタノールで還元した後、これらの複
合体を細菌ルシフエラーゼ系を使用して発光
によつて定量的に測定することができる。リ
ガンド−NADHの発光はリガンドに特異的
に結合する蛋白質によつて抑制することがで
きる。こうして、遊離及び結合した標識リガ
ンドを分離することなく（均一系）、特異結
合反応を分析することができる。ATPをほ
たるルシフエラーゼを用いて極めて低濃度で
測定することができるので、このコフアクタ
ーでリガンドを標識する可能性もこれらの研
究者によつて研究された。この種の分析は下
記の式で示される（Ag＝抗原、Ab＝抗体）。 Ag＋Ag−CF＋AbAb：Ag＋Ab：Ag−CF Ag−CF＋発光原性共反応体→光 (d) ルミネセンス酵素−多重免疫分析 多くの場合使用する酵素標識(E)がオキシド
レダクターゼ、例えばデヒドロゲナーゼであ
るから、NADH−依存性細菌ルミネセンス
系を使用することによる酵素多重免疫分析技
術を使用して、薬剤を検査することも示唆さ
れた〔スタンレイ（Stanley P.E.）著、アプ
リケイシヨン・オブ・アナリテイカル・バイ
オルミネセンス・トウ・ザ・エンザイム・マ
ルテイプライド・イミユノアツセイ・テクニ
ツク（Application of Analytical
Bioluminescence to the Enzyme
Multiplied Immunoassay Technique酵素
多重免疫分析技術への分析植物ルミネセンス
の応用）、リクイド・シンチレーシヨン・カ
ウンテイング（Liquid Scintillation
Counting）５、ジヨンソン（P.Johnson）及
びクルツク（M.Crook）編集、ロンドンの
ヘイドン・アンド・サン（Heyden and
Son）1978年79頁参照〕。 ４ ルミネセンス酵素分析 Boc−及びＺ−アラニルアラニルフエニルア
ラナミド−４−アミノフタルヒドラジドを使用
してα−チモトリプシンのアミダーゼ活性の分
析法が開発された。合成基質は、酵素によつて
加水分解するとイソルミノールを放出する。そ
の化学ルミネセンスを測定することにより、イ
ソルミノール生成を測定する。ルミネセンス基
質の動力学的恒数をα−チモトリプシンで測定
し、50mg程度の低い酵素レベルを測定した。同
様のルミネセンス基質、色原体基質及び螢光基
質の比較が提示されている。フランチニ
（Hranchini、B.R.）ら著、センシテイブ・エ
ンザイム・アツセイ・ベイスド・オン・ザ・プ
ロダクシヨン・オブ・ケミルミネセント・リー
ビング・グループス（Sensitive Enzyme
Assays Based on the Production of
Chemiluminescent Leaving Groupsルミネセ
ンス残基の生成に基づく増感酵素分析）、
Anal.Biochem.、111巻87頁（1981）参照。 下記の実施例は本発明の好ましい実施態様を示
す。 実施例 本発明による装置を使用して化学ルミネセンス
の増感迅速写真測定の達成方法を説明する。写真
フイルム上での化学ルミネセンス標識の検出限界
が予め判つていないので、高度に鋭敏な酸化系に
おいて免疫反応を究極的に検査するため、検出限
界を調べた。 装置の構造 化学ルミネセンスを検査するため、ポラロイド
カメラ〔ニユーヨーク州ロチエスターのグラフイ
ク・ポラロイド・バツク・グラフレクス社
（Graphic Polaroid Back Graflex、Inc.）〕を改
造した。簡単に言えば、レンズ・フイクスチヤー
を除去し、摺動金属板をシヤツタとして取り付け
た。この上に薄い澄明プラスチツク板及び６mm×
50mmのガラス反応管を収容する12個の直径6.5mm
の穴の列を有するアルミニウムブロツクが配置さ
れた。アルミニウムの蓋を室光を遮蔽するため使
用した。各管上の蓋に円錐形にほられた穴には、
針案内部材として役立つ１mmの穴を有するプラス
チツク板によつて適切に保持されるゴム隔壁を付
けた。カメラに10000ASAの速度を有する青増感
ポラロイド・ポラ・スコープ（Polaroid Pola
Scope）フイルム、410型（8.3×10.8cm）を装填
した。 実験操作 50ｍMNaOH中のミクロペルオキシダーゼ
2.5μM及び種々の濃度の７−〔Ｎ−（４−アミノブ
チル）−Ｎ−エチル〕−アミノナフタレン−１，２
−ジルボン酸ヒドラジド（ABENH）を含む反
応組成物を反応管中に140μずつ分け、次にこ
の反応管をフイルム上の個々の遮光ウエルに置い
た。次に、シヤツタを開放した。PH7.5の10ｍＭ
トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（ト
リスHCl）中の過酸化水素20μを気密の50μの
注射器から各管中に手で注入して発光を開始させ
た。最後の注射後、すべての反応について発光を
【表】 黒色背景上の白色の鮮明なコントラストによ
り、肉眼による鋭敏な測定ができた。発光反応の
下のフイルム面積が最大に露光されると、
ABENHの濃度増加と共に斑点の寸法の直線的
増加が観察された。第７図は第１表に示したデー
タのグラフである。 反応からの光は、フイルム上約５mmの点源とし
て本質的に挙動する。限定する不透明な円筒形キ
ヤビテイはスポツト拡大でアンブレラ効果を生じ
た。この新しい特徴により、被分析物の肉眼によ
る定量を容易に行なうことができた。 実施例 この実施例で報告する実験では、化学ルミネセ
ンス試薬系をある濃度範囲の過酸化水素（H2O2）
にさらして、本発明の装置を使用して定量的応答
を生ずる能力を評価した。種々の臨床的に重要な
被分析物に応答してH2O2を生成する広範な酵素
系が知られている。本例はその例として比較を含
むが、この比較は特定の被分析物に限定されるも
のではない。 装置の構造 本例の実験は、実施例に記載したように構成
した装置を使用して行なつた。 実験操作 50ｍＭのNaOH（PH13）中にABENH2.5μM及
びミクロペルオキシダーゼ2.5μMを含む溶液の一
定量の装置のきれいな試験管中に分配した。次
に、反応開始試薬H2O2を注入するため装置をシ
ールした。シヤツタを開放し、種々のH2O2濃度
を含む10ｍＭトリス−HClの一定量（20μ）を
次に試験管中に注入した。前例と同様に発光が終
了した後だけ、シヤツタを閉じた。 結 果 現像すると、写真は、黒色背景上に白色斑点を
示した。最大露光に達すると、この斑点の寸法は
被分析物の濃度と共に増大した。第２表に示した
濃度は反応の最後の160μにおける濃度である。 【表】 【表】 得られたデータは、本発明により製造した装置
は存在する過酸化水素の濃度範囲に応答して定量
的に検出しうるシグナルを提供することを示す。 本発明を詳細に説明したが、本発明の範囲を逸
脱することなく、細部に多くの変更を行なうこと
ができる。
第１図は、本発明のルミネセンス検出装置の有
利な一実施態様の部分断面平面図、第２図は別の
閉鎖形式を示す、第１図と同様の実施態様の部分
断面図、第３図は第１図の下部の円３で囲んだ部
分の拡大図、第４図は第１図の画像形成層に同心
円形に露光された状態を示す４−４線拡大図、第
５図は本発明のルミネセンス検出装置の別の有利
な実施態様の分解部分等角投影図、第６図は第５
図の好ましい実施態様の６−６線断面図、第７図
は実施例で示したデータのグラフである。 １０，１０ａ……ルミネセンス検出装置、１
２，１２ａ……不透明な反応容器ハウジング、１
４，１４ａ……反応容器、１６，１６ａ……光応
答性画像形成層、１８，１８ａ……孔、２０，２
０ａ……本体、２２，２２ａ……円筒形側壁、２
４，２４ａ……容器受容室、２６，２６ａ……注
射針、３４，３４ａ……閉鎖部材、３５……隔
壁、４２…側壁、４６，４６ａ……底部、４８…
…反応溶液、４４……空所、５０，５０ａ……感
光性表面、５６，５６ａ……支持体、６０……シ
ヤツタ、６２……シヤツタ板、６４……シヤツタ
ガイド、７０……スペーサ、７２……光学的澄明
体、７４……スペーサ壁。
利な一実施態様の部分断面平面図、第２図は別の
閉鎖形式を示す、第１図と同様の実施態様の部分
断面図、第３図は第１図の下部の円３で囲んだ部
分の拡大図、第４図は第１図の画像形成層に同心
円形に露光された状態を示す４−４線拡大図、第
５図は本発明のルミネセンス検出装置の別の有利
な実施態様の分解部分等角投影図、第６図は第５
図の好ましい実施態様の６−６線断面図、第７図
は実施例で示したデータのグラフである。 １０，１０ａ……ルミネセンス検出装置、１
２，１２ａ……不透明な反応容器ハウジング、１
４，１４ａ……反応容器、１６，１６ａ……光応
答性画像形成層、１８，１８ａ……孔、２０，２
０ａ……本体、２２，２２ａ……円筒形側壁、２
４，２４ａ……容器受容室、２６，２６ａ……注
射針、３４，３４ａ……閉鎖部材、３５……隔
壁、４２…側壁、４６，４６ａ……底部、４８…
…反応溶液、４４……空所、５０，５０ａ……感
光性表面、５６，５６ａ……支持体、６０……シ
ヤツタ、６２……シヤツタ板、６４……シヤツタ
ガイド、７０……スペーサ、７２……光学的澄明
体、７４……スペーサ壁。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 液体試料中の被分析物を定量的に検出するル
ミネセンス検出装置において、 (i) 主軸に沿つて複数の対向端部を有し、第一の
端部が液体試薬及び試料を反応室中に導入する
ものであり、他の端部が所定寸法の光透過孔を
形成するものであり、被分析物含有試料との接
触に応答して発光する組成物を保有するのに適
当な反応室； (ii) 前記の第一の端部において液体を前記反応室
中に導入するカニユールを入れ、反応室を閉鎖
する閉鎖部材； (iii) 光応答性画像形成層； (iv) 光応答性画像形成層が、孔を形成する端部か
ら所定の距離で配置されて、孔から発する光に
さらされるように、光応答性画像形成層と反応
室とを関連させる装置；及び (v) 光応答性画像形成層を周囲の光に露光される
のを遮蔽する部材 から成ることを特徴とするルミネセンス検出装
置。 ２ 反応室が反応容器ハウジング及びその中に設
置される反応容器から成る特許請求の範囲第１項
記載の装置。 ３ 反応容器ハウジングが不透明である特許請求
の範囲第２項記載の装置。 ４ 反応容器が透明である特許請求の範囲第２項
記載の装置。 ５ 閉鎖部材が反応室の一体構造部分である特許
請求の範囲第１項記載の装置。 ６ 閉鎖部材が隔壁である特許請求の範囲第１項
記載の装置。 ７ 光応答性画像形成層が写真フイルムである特
許請求の範囲第１項記載の装置。 ８ 光応答性画像形成層が自己現像性写真フイル
ムである特許請求の範囲第１項記載の装置。 ９ 光応答性画像形成層と反応室とを関連させる
装置が光応答性画像形成層を受容する水平室を有
する基台とその上に設置される反応室の垂直保持
用キヤリツジから成る特許請求の範囲第１項記載
の装置。 １０ 基台が更に反応室と光応答性画像形成層と
の間に設置されるシヤツタを有する特許請求の範
囲第９項記載の装置。 １１ 基台が、光応答性画像形成層が周囲の光に
露光されるのを遮蔽する特許請求の範囲第９項記
載の装置。
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