JPH0453518B2 - - Google Patents

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1983-02-25

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1992-08-26

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Description

請求の範囲１ペルオキシダーゼ酵素、酸化剤および化学発
光性の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジ
オンの発光反応に基づくルミネツセンスもしくは
発光分析法であつて、発光反応が一般式：〔式中、ＲはＨ，CNまたは

【式】であり、ＸはCOOHもしくはOHを表わし、かつ
破線（‐‐‐‐）は二重結合を表わすか、または、Ｘ
はCOOHを表わし、かつ破線に二重結合がなく
て４位と５位が飽和していることを示す〕の６−
ヒドロキシベンゾチアゾールを添加することによ
り増強されることを特徴とする前記分析法。２ (a) ペルオキシダーゼ酵素と、 (b) 一般式：〔式中、ＲはＨ，CNまたは

【式】であり、ＸはCOOHもしくはOHを表わし、か
つ破線（‐‐‐‐）は二重結合を表わすか、また
は、ＸはCOOHを表わし、かつ破線は二重結
合がなくて４位と５位が飽和していることを示
す〕の６−ヒドロキシベンゾチアゾールと、 (c) 化学発光性の２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオンとからなるルミネツセンスもしくは発光分析に使
用する分析用キツト。明細書本発明は増強ルミネツセンス（Iuminescent
assay）もしくは発光分析（luminometrie
assay）、特にイムノアツセイに関し、さらに分
析を容易化するよう設計した診断用キツトに関す
るものである。イムノアツセイは、臨床試験室において最も広
く使用されている分析技術の１つである。現在、
イムノアツセイの大部分は、放射性同位元素、特
に沃素−125を標識として使用する。しかしなが
ら、放射性同位元素は多くの主たる欠点を有す
る。第１に、標識法は、高度の放射能を有し、し
たがつて極めて危険な試薬の使用を含んでいる。
第２に、放射能標識した物質の保存寿命は、しば
しばその性質により放射性同位元素が連続的に減
衰するだけでなく放射能標識された蛋白質がしば
しば不安定であるため、比較的短かいものであ
る。第３に、感度良くかつ迅速に検出しうる試薬
を与える程充分に蛋白質を標識するのはしばしば
困難である。第４に、放射能標識された物質の処
分が不便である。これらの欠点は、放射能標識に対する実現可能
な代替物の探索を要求している。標識として適す
るためには、物質は少なくとも次の３つの要件を
満たさねばならない：ａたとえば抗原または抗体のようなリガンドに
付着した際、迅速かつ極めて少量で検出できね
ばならない。ｂたとえば抗原または抗体のようなリガンドに
対し、測定に影響を与えることなく、付着させ
うるものでなければならない。ｃ付着された後、リガンドの性質を有意に変化
させてはならない。最も有望な代替標識化合物としての幾つかは、
反応に関与してルミネツセンス光を発光しうる物
質、または適当に処理するとルミネツセンス反応
に関与しうる化合物を生成する物質のいずれかで
ある。ルミネツセンス反応（ルミネツセンス光を
発光する化学反応）は一般に充分な持続時間を有
して、発光を検出しかつ測定することを可能に
し、それにより標識物質の定量を可能にするもの
である。他方、ルミネツセンスの測定は迅速な方
法であつて、一般に放射能を測定するために数分
間を必要とするものと異なり、数秒間で完了する
ことができる。ルミネツセンスは、３種の主たるルミネツセン
スもしくは発光免疫分析方式で使用されている：ａ有機ルミネツセンスもしくは有機発光分析。
この場合、ルミネツセンス反応に直接に関与す
る（すなわち励起状態に変換され、次いで光子
を放出して非励起状態に復帰する）化学ルミネ
ツセンスもしくは生物ルミネツセンス化合物を
使用して、たとえば蛋白質、ホルモン、ハブテ
ン、ステロイド、核酸、代謝物、抗原および／
または抗体のようなリガンドを標識する。適す
る化合物の例はルミノールおよびイソルミノー
ルを包含する；ｂルミネツセンス触媒もしくはコフアクターイ
ムノアツセイ。この場合、ルミネツセンス反応
の触媒もしくはコフアクターを標識として使用
する。適する触媒の例はベルオキシダーゼ酵素
である。ｃ酵素結合イムノアツセイ。この場合、ルミネ
ツセンス反応を使用して、適する基質に対する
酵素標識の作用によつて生成された生成物を決
定する。この種の免疫分析の例は抗体結合した
グルコースオキシダーゼの測定であつて、酵
素／抗体試薬をグルコーズと反応させて過酸化
水素を生成させ、次いで制御条件下でルミノー
ルを添加してルミネツセンス反応を開始させる
ことにより生成された過酸化水素の量を測定す
る。上記イムノアツセイの感度は、標識または
標識の生産物を検出する下限によつて一部決定
される。ルミネツセンスまたは発光免疫分析の
場合、この方式の感度はルミネツセンス反応に
おいて標識物質の単位量当りに放出される光に
一部依存する。本発明の一目的は、増強した感
度を有するルミネツセンスもしくは発光免疫分
析を提供することであり、標識物質または標識
の生産物を改良されたルミネツセンス反応を介
して測定することにより達成される。本発明の改良されたルミネツセンス反応は、イ
ムノアツセイ標識またはその生産物の測定におい
て特に有用であるが、決してこの用途のみに限定
されない。したがつて、さらに本発明の目的は、
向上した感度を有するルミネツセンスもしくは発
光分析（イムノアツセイもしくはその他の分析）
を提供することであり、本発明の改良されたルミ
ネツセンス反応を分析過程に組み入れることによ
り達成される。イムノアツセイでなく、本発明のルミネツセン
ス反応を組み入れ得る分析の例は次のものを包含
する：ａ不溶性のペルオキシダーゼ−エラスチン調製
物からのペルオキシダーゼの放出に基づくエラ
スターゼ分析ｂ共固定化されたグルコースオキシダーゼとペ
ルオキシダーゼとに基づくグルコース分析ｃペルオキシダーゼ酵素、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン、６−ヒドロキシベ
ンゾチアゾール、またはたとえば過酸化水素の
ような酸化剤の分析。この場合、これら物質は
標識でも標識の生産物でもない。したがつて、広義における本発明によれば、ル
ミネツセンス反応がペルオキシダーゼ酵素、酸化
剤、６−ヒドロキシベンゾチアゾールと化学発光
性２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
との間で生ずる増強されたルミネツセンスもしく
は発光分析が提供される。好ましくは、この分析はイムノアツセイであ
る。本発明は、驚ろくことに、或る種の６−ヒド
ロキシベンゾチアゾールを公知の２，３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオン／酸化剤／ペルオ
キシダーゼ系へ添加すると、生ずるルミネツセン
ス反応の感度が著しく増強されるという知見に基
づいている。本明細書において、「増強」という用語は、本
発明のルミネツセンス反応の全発光および／また
は本発明のルミネツセンス反応における信号／バ
ツクグランド比が、６−ヒドロキシベンゾチアゾ
ールの不存在下で２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオン／酸化剤／ペルオキシダーゼ系に
より達成されるものよりも大きいことを意味す
る。このように「増強」されたルミネツセンス反
応を組み込んだ分析のみが本発明の範囲内であ
る。本発明の格別の利点は、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾールの添加によりもたらされる増強が、ペ
ルオキシダーゼ酵素を用いる反応に対し特異的で
あることである。本発明による化学発光性２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン（DPD）は、化学ル
ミネツセンス反応において励起状態まで変換され
かつ次いで光を放出して非励起状態まで復帰する
ような任意のDPDとすることができる。好ましくは、２，３−ジヒドロ−１，４−フタ
ラジンジオンは、一般式：〔式中、R₄はアミノもしくは置換アミノであ
り、R₂，R₃およびR₄のそれぞれは水素、適宜置
換されたC₁−C₆アルキルもしくはアルケニル、
ヒドロキシル、C₁−C₆アルコキシル、カルボキ
シル、アミノもしくは置換アミノであり、または
R₂はアミノもしくは置換アミノでありかつR₁，
R₃およびR₄のそれぞれは水素、適宜置換された
C₁−C₆アルキルもしくはアルケニル、ヒドロキ
シル、C₁−C₆アルコキシル、カルボキシル、ア
ミノもしくは置換アミノであり、またはR₁およ
びR₂は一緒になつてベンゾ基のアミノもしくは
置換アミノ誘導体でありかつR₃およびR₄のそれ
ぞれは水素、適宜置換されたC₁−C₆アルキルも
しくはアルケニル、ヒドロキシル、C₁−C₆アル
コキシル、カルボキシル、アミノまたは置換アミ
ノである〕を有する。本明細書において、置換アミノはアミドを包含
する。化学発光性DPDが本発明のルミネツセンス反
応に関与する型式は、問題とする分析の種類に依
存する。フタラジンジオンを標識として使用す
る、たとえば有機ルミネツセンスもしくは有機発
光免疫分析のような分析の場合、化学発光性
DPDは２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン
ジオンの置換アミノ誘導体であり、この場合アミ
ノ基はたとえば蛋白質、ホルモン、ハブテン、ス
テロイド、核酸、代謝物、抗原もしくは抗体のよ
うなリガンドに結合される。アミノ基はリガンド
に直接に結合することができ、或いは架橋アーム
を介して結合することができる。適する架橋アー
ムは、たとえば英国特許第2008247A号および米
国特許第4104029号公報に記載されたように、当
業者に周知されている。好適な架橋アームはヘミ
コハク酸、ヘミグルタル酸、ヘミマレイン酸、カ
ルボキシメチル、グルクロン酸、メルカプト酢酸
およびカルボキシルメチルの誘導体から得られる
ものを包含する。アミノ基は、任意適当な周知の
方法でリガンドへ結合することができ、これらの
方法も英国特許第2008247A号および米国特許第
4104029号公報に記載されている。好適な結合方
法は、混合無水物、カルボジイミドおよび／また
は活性エステルの使用を含む。フタラジンジオンを標識として用いる分析に使
用するのに適した化学発光性DPDはアミノ基が
リガンドに結合されている２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオンの任意の置換アミノ誘
導体とすることもできるが、好適物質は５−アミ
ノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
ン（ルミノール）および６−アミノ−２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオン（イソルミノ
ール）であり、それぞれの場合アミノ基はリガン
ド、特に抗体に結合されている。フタラジンジオンを標識として用いる以外の分
析の場合、化学発光性DPDは、特にリガンドと
して結合されていない上記好適種類の２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオンである。この
場合、化学発光性DPDは溶液中に遊離されてい
ても、或いはマトリツクス上に固定化されていて
も良い。特に好適な物質はルミノールおよびイソ
ルミノールである。本発明による６−ヒドロキシベンゾチアゾール
は、ペルオキシダーゼ／酸化剤／２，３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオンのルミネツセンス
反応を促進する任意の６−ヒドロキシベンゾチア
ゾール（置換もしくは未置換のもの）である。し
かしながら、好ましくは６−ヒドロキシベンゾチ
アゾールは、一般式：〔式中、ＲはＨ、CNまたは適宜置換されたチ
アゾールであり、X₁−X₃のそれぞれはＨ、適宜
置換されたC₁−C₆アルキルもしくはアルケニル、
ヒドロキシル、置換ヒドロキシル、C₁−C₆アル
コキシル、カルボキシル、アミノもしくは置換ア
ミノである〕を有する。本発明の分析の特に好適な具体例において、
X₁−X₃のそれぞれはＨまたはC₁−C₆アルキルで
あり、かつＲはＨ、CNまたは一般式：〔式中、X₄はCOOHであり、X₅−X₇のそれぞ
れはＨまたはC₁−C₆アルキルであり、またはX₄
およびX₅は一緒になつて０でありかつX₆−X₇の
それぞれはＨまたはC₁−C₆アルキルである〕のチアゾール置換基である。特に好ましくは、
X₁−X₃のそれぞれおよび必要に応じX₅−X₇のそ
れぞれはＨである。これらの好適な６−ヒドロキ
シベンゾチアゾールは、特に化学発光性DPDが
ルミノールまたはイソルミノールである場合、特
に高レベルの感度向上を与えることが判明した。２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
ン、特にルミノールのルミネツセンス反応を触媒
する任意のペルオキシダーゼ酵素〔インターナシ
ナル・ユニオン・オブ・バイオケミストリーによ
りドーナー、過酸化水素、オキシドレダクターゼ
（EC No.１、11、１、７）として定義される〕
を、本発明のルミネツセンス反応に使用すること
ができる。例としては、植物ペルオキシダーゼが
包含される。好ましくは、酵素は西洋ワサビのペ
ルオキシダーゼ（EC No.１、11、１、７）であ
る。ペルオキシダーゼ酵素が本発明のルミネツセン
ス反応に関与する型式は、問題とする分析の種類
に依存する。ペルオキシダーゼを標識として使用
する分析、特に免疫分析の場合、これはたとえば
蛋白質、ホルモン、ハブテン、ステロイド、核
酸、代謝物、抗原または抗体のようなリガントに
結合される。一般に、ペルオキシダーゼは架橋ア
ームを介してリガンドに結合される。適する架橋
アームおよび結合方法は、化学発光性DPDにつ
き上記したものである。ペルオキシダーゼを標識として使用する以外の
分析の場合、酵素は溶液中で遊離型であつても、
或いはマトリツクス上に固定されるかリガンドに
結合されなくても良い。２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
ン、特にルミノールもしくはイソルミノールと反
応してDPDを励起させ、ルミネツセンス反応に
おいて光を発する任意の酸化剤を、本発明のルミ
ネツセンス反応に使用することができる。特に好
適な酸化剤は、過硼酸イオンおよび過酸化水素で
ある。リガンド用の標識として２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオンまたはペルオキシダー
ゼ酵素を用いる分析、特にイムノアツセイにおい
ては、既知量の酸化剤を一般に適当な原料からの
反応混合物へ加える。しかしながら、或る種の他
の分析においては、存在させる酸化剤、一般に過
酸化水素の量は未知である。この第２の種類の分
析において、標識は基質から酸化剤への変換に関
与する物質、特にしばしば、たとえばグルコース
オキシダーゼもしくは乳酸デヒドロゲナーゼのよ
うな酵素である。たとえば、この場合、本発明の
ルミネツセンス反応を使用して、ルミネツセンス
反応混合物における酸化剤濃度の測定により標識
リガンドの量を決定する。本発明のルミネツセンス反応からの発光は、主
としてペルオキシダーゼ、酸化剤、６−ヒドロキ
シベンゾチアゾールおよび化学発光性DPDの選
択に委存するが、たとえば温度、PH、試薬濃度、
混合速度および光測定方法のような二次的フアク
タによつて決定される。本発明の方式の感度を最
大化させるには、これらの二次的フアクタを調整
して、再現可能かつ容易に測定しうる方法で、で
きるだけ高い信号／バツクグランド比にて最大の
発光を得ねばならない。選択される条件は、一般にペルオキシダーゼの
酵素もしくは触媒活性、反応の速度論、使用する
装置、信号／バツクグランド比および必要とする
感度を包含する妥協点である。今回、最適結果を得るには、本発明のルミネツ
センス反応を10〜50℃の範囲の温度かつ６〜10の
範囲、特にしばしば７〜９の範囲のPHという緩和
な条件下で行なうべきであることを見出した。本
発明の方法に対する適当な緩衝物質は燐酸塩、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−ア
ミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、
酢酸塩、炭酸塩および硼酸塩である。一般に、測定すべき物を例外として、ルミネツ
センス反応混合物における試薬の濃度は一定に保
たれる。たとえば可変フアクタは標識リガンド、
標識の生産物、酸化剤または未結合ペルオキシダ
ーゼの濃度である。本発明のルミネツセンス反応に使用するには次
の試薬濃度が特に適している：ペルオキシダーゼ 0.1μg−5000mg／酸化剤 10μmol−300mmol／６−ヒドロキシベンゾチアゾール
0.01mmol−4mmol／化学発光性DPD 0.5μmol／200mmol／本発明のルミネツセンス反応を行なうに際し、
４種の必須試薬の幾つか（ただし少なくとも１種
を省く）を試験管中に入れる。次いで、ルミネツ
センス反応を、残余の必須試薬を試験管へ添加す
ることにより開始させる。発光された光を、たと
えば光電子増倍管のような標識測定装置により定
量し、その信号を記録計、オシロスコープまたは
計測器に供給してそこに表示または記録する。さ
らに、或る場合には光を肉眼により観察し、或い
は写真版上に記録することもできる。しかしなが
ら、好ましくはこの光を英国特許出願第
2025609A号明細書に記載された種類のルミノメ
ータで定量する。本発明のルミネツセンス反応は３種の主な種類
のイムノアツセイに使用することができ、それぞ
れの特徴はリガンドに付着される標識の種類であ
る。これら標識は次のものである：ａアミノ基がリガンドに結合されている２，３
−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンの置換
アミノ誘導体。ｂペルオキシダーゼ酵素、およびｃ上記ａおよびｂに記載した種類以外の物質、
および一般に本発明のルミネツセンス反応によ
り測定しうる物質への基質の変換に関与するた
とえばグルコースオキシダーゼまたは乳酸デヒ
ドロゲナーゼのような酵素（一般に過酸化水素
もしくはペルオキシダーゼ）。上記のイムノアツセイにおいて、分析すべき物
質またはこの物質に対する抗体の標識が可能であ
る。使用する標識の種類に応じて、分析は異質で
あつても同質であつても良い。前者の場合、たと
えば血清のような複合液を分析することもできる
が、後者の場合には予備的な抽出もしくは精製工
程が必要である。典型的な異質および同質のルミネツセンスもし
くは発光免疫分析を下記に説明する：１異質ルミネツセンスもしくは発光免疫分析この種の免疫分析においては、分析すべき物質
をこれに対する抗体と反応させる。次いで、遊離
抗体を結合抗体から分離する。抗体、分析すべき
物、または分離後に遊離もしくは結合部分と反応
しうる他の分子を標識することにより、反応を定
量化する。２競合的異質ルミネツセンス免疫分析この場合は、分析すべき物質の未知量を、標識
と結合した前記物質の既知量およびこれに対する
抗体の既知所定量と混合する。抗体に対する標識
物質と未標識物質との間の競合反応を生ぜしめ
る。抗体と未標識物質との間ならびに抗体と標識
物との間の複合体を、遊離の標識物質および未未
標識物質から分離する。抗体に結合した標識物質の量は、分析される溶
液中の未標識物質の量に相関する。これらの量
は、抗体に結合した標識の量を測定するか、或い
は残留する遊離の標識物質の量を測定することに
より決定することができる。ペルオキシダーゼが
標識でありかつ抗体がガラス試験管の壁部を介し
て固相に結合されている種類の分析の例は、英国
特許第2044927A号公報に記載されている。３「２部位」異質発光免疫分析この種の免疫分析においては、分析すべき物質
を先ずこれに対する未標識抗体へ結合させ、これ
を次いでたとえばプラスチツクのような固相支持
体に結合させる。次いで、複合体（抗体と物質と
の間）を標識抗体で処理する。次いで、得られた固体複合体における標識抗体
の分析を、溶液から固体複合体を分離し、次いで
分離された固体複合体に存在する標識の量を決定
するか、または溶液中に溶解した残留標識抗体に
存在する標識の量を測定して行なうことができ
る。この種の免疫分析の他の具体例において、分析
すべき物質を標識抗体および未標識の固体支持抗
体へ順次に結合させるか、或いは標識抗体と未標
識抗体との両者に一工程で結合させることもでき
る。４同ルミネツセンスもしくは発光免疫分析これは、標識が２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオンのアミノ誘導体もしくは置換アミ
ノ誘導体である免疫分析に適用することができ
る。これは、問題とする遊離の標識物質（または
それに対する抗体）から発光される異なる強度の
光または問題とする結合した標識物質（またはそ
れに対する抗体）から発光される光の波長に依存
する。一例において、（プロゲステロン−イソルミノ
ール誘導体）複合体とヘム触媒と過酸化水素との
反応から発する光の強度は抗プロゲステロンIgG
の存在下で行なわれる同じ反応よりも低い強度で
あることが判明した。したがつて、この分析においては、未知のプロ
ゲステロン試料を先ず既知量の抗プロゲステロン
IgGと一緒に培養する。平衡に達した後、既知量
の（プロゲステロン−イソルミノール誘導体）複
合体を加え、次いで既知量のヘムおよび過酸化水
素を加える。発光した光を測定し、未知試料に存
在するプロゲステロンの量を標識曲線から決定す
る。（未知試料に存在するプロゲステロンが多い
程、遊離のIgGが平衡においてより少なく残存し
かつルミネツセンス反応における光収率がより低
い）このようにして、プロゲステロンの測定を分離
工程の必要なしに達成することができる。上記全ての免疫分析において定量、検出または
位置決定工程を、本発明のルミネツセンス反応と
することができる。上記免疫分析に使用する抗体は市販されている
か、或いは公知の免疫学的技術により調製するこ
とができる。これらの抗体は抗体の複合混合物で
あつても、或いは１種もしくはそれ以上のモノク
ローナル抗体であつても良い。一般に、少量の抗
体しか必要とされず、その活性に適切なPH、イオ
ン強度および温度に維持される。限定しないが次の種類の物質に対する抗体を、
本発明のルミネツセンス反応を用いる免疫分析に
有用に使用することができる：たとえばインシユ
リン、α−フエトプロテインおよびフエリチンの
ような蛋白質；成長ホルモン、上皮小体ホルモ
ン、卵胞刺戟ホルモン、黄体ホルモン、甲状腺刺
戟ホルモン、向副賢皮質ホルモン、グルカゴン、
プロラクチンおよびカルシトニンのようなホルモ
ン；たとえばエストリオール、プロゲステロンお
よびコルチゾールのようなハプテン／ステロイ
ド；たとえばジゴキシンのような薬物；たとえば
細胞表面抗原および発癌性胚芽抗原のような抗
原；ならびにたとえば耳下腺炎ウイルス抗体、ひ
と免疫グロブリンＧ（IgG）、うさぎIgG、羊IgG、
モルモツトIgG、ロバIgGおよびひと免疫グロブ
リンＥおよびＭのような抗体が包含される。本発明のルミネツセンス反応は、上記の免疫分
析以外の分析にも使用することができる。これら
は次のものを包含する：１不溶性ペルオキシダーゼエラスチン調製物か
らのペルオキシダーゼの放出に基づくエラスタ
ーゼの分析この分析においては、固体のエラスチン−ペル
オキシダーゼ複合体を、種々の量のエラスターゼ
と共に培養する。所定時間の後、未反応の複合体
を遠心分離により除去し、上澄液を未結合ペルオ
キシダーゼにつき分析する。上澄液に存在する未結合ペルオキシダーゼの量
は、試験試料中のエラスターゼ活性に相関する。２合成ペプチド基質からのイソルミノールの放
出に基づくプロテナーゼの分析この分析においては、固定化された合成ペプチ
ド基質、すなわちアフイーゲル10−Ala−Ala−
Ala−Phe−イソルミノールを、種々の量のプロ
テナーゼで処理する。所定時間の後、未反応基質
を遠心分離により除去し、上澄液をイソルミノー
ルにつき分析する。上澄液中に存在するイソルミ
ノールの量は試験試料におけるプロテナーゼ活性
に相関する。３共固定化グルコースオキシダーゼとペルオキ
シダーゼとに基づくグルコースの分析この分析においては、グルコースオキシダーゼ
とペルオキシダーゼとを支持体、たとえばセフア
ローズまたはプラスチツクチユーブに共固定化さ
せる。これへ、ルミノールおよび６−ヒドロキシ
ベンゾチアゾールの溶液を加える。最後に、グル
コースの溶液を加え、発光を記録する。この発光
は、溶液中のグルコース量に直接に相関する。本発明の分析およびルミネツセンス反応の主た
る用途は、臨床試験および外科手術である。この
種の試験および／または外科手術においては、所
定の分析法で使用すべき物質を分析用キツトの形
態で得ることが一般的である。したがつて、本発明はさらに本発明の増強ルミ
ネツセンスもしくは発光分析に使用するための分
析用キツトを提供し、これは：ａペルオキシダーゼ酵素、ｂ６−ヒドロキシベンゾチアゾールおよび、ｃ化学発光性２，３−ジヒドロ−１，４−フタ
ラジンジオンから構成されている。さらに、この試験キツトは酸化剤をも含有する
が、多くの場合この物質は別途に供給しても或い
は分析すべき物質であつても良い。好ましくは、ペルオキシダーゼ酵素、酸化剤、
６−ヒドロキシベンゾチアゾールおよび化学発光
性DPDは、本発明の分析に使用するのに好適な
ものとして上記したものである。本発明の分析用
キツトにおける特に好適な具体例において、ペル
オキシダーゼ酵素および化学発光性DPDの少な
くとも一方を、分析すべき物質に対する抗体へ結
合させる。必要に応じ、分析用キツトはさらに分析すべき
物質の既知量を含有する１種もしくはそれ以上の
分析溶液および／または好適緩衝溶液の１種もし
くはそれ以上をも含有することができる。さら
に、便利には分析用キツトは、この分析を実施す
る過程で発する光を測定するための装置と一緒に
使用するのに適した反応容器をも含むことができ
る。さらに、試薬の充分な混合を確保するのに使
用するため、混合装置をこの分析用キツトに含ま
せることもできる。本発明のルミネツセンス分析、ルミネツセンス
反応および分析用キツトを、添付図面を参照して
実施例につき説明する。第１図はペルオキシダーゼ標識された抗AFP
の希釈曲線であり、第２図は蛍ルシフエリンの存在下および不存在
下におけるAFPに結合され、抗体被覆ビーズに
固定化されたうさぎ抗−ひとAFP／HRPの発光
を示すグラフであり、第３図はAFPのルミネツセンス測定と比色測
定とに関する信号／バツクグランド比の比較であ
り、第４図はT₄のルミネツセンス測定および比色
測定においてT₄濃度を増加させた場合の発光お
よび吸光変化の比較である。材料および方法試薬西洋ワサビペルオキシダーゼ〔HRP；純度
（A403対A250の比）；RZ約1.0〕は、英国・エセ
ツクス州・ロムフオード在、ヒユー・アンド・ヒ
ユー社から得、これを2.6cm×40cmのAcA34カラ
ム（英国・サリー州・サウス・クロイドン社・
LKBインストル−メント社）を用いてゲル過
により精製した。0.15モル／ NaClを含有す
る0.015モル／燐酸塩緩衝液（PH7.2）を用いて
カラムを溶出させた。得られた精製ペルオキシダ
ーゼは約3.0のRZを有した。 α−フエトプロテイン（AFP）、うさぎ抗−ひ
とAFP（No.100−008）およびうさぎ抗−ひと
AFP／HRP複合体は、サリー州・ピルフオード
ロード・ウエストバイフリート・ウエイブリツジ
在、ブロケードハウスのダコプロダクツ・メリ
カ・ブロケード社から入手した。チロキシン（T₄）、うさぎ抗−T₄被覆ビンおよ
びT₄／HRP複合体は、英国・セサツクス州・レ
ベス在・ベーリンガ社から入手した。風疹ウイルス（ひと）被覆したビーズおよび抗
ひとIgG（やぎ）／HRP複合体は、ハンプシヤー
州・バシングストーク・ブライト・ヒル・パレー
ド在のアボツト・ラボラトリース社、診断薬部門
から入手した。Ｄ−蛍ルシフエリン（４，５−ジヒドロ−２−
（６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリル）−４−
チアゾールカルボン酸、製品No.9504、合成結晶
物）、牛血清アルブミン（BSA；製品番号
A4503）および２−アミノ−２−メチル−１，３
−プロパンジオール（AMP；製品番号A9754）
は、英国・ドルセツト州・プール在・シクマ・ケ
ミカル社から入手した。ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン）およびイソルミノー
ル（６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオン）は、英国・ドルセツト州・プー
ル在・フアンシーロード、シグマ・ケミカル社か
ら入手した。ルミノールの一ナトリウム塩は、上
記したように調製した〔ハム等、アナリチカル・
レターズ、1979第12巻、第535頁〕。７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカ
ルボン酸ヒドラジド〔式においてR₁およびR₂
は一緒になつてジメチルアミノ置換されたベンゾ
基であり、R₃およびR₄はＨである）は、ベーリ
ンガー・マンハイム社から入手した。Ｎ−（６−アミノヘキシル−Ｎ−エチル）イソ
ルミノールは、フインランド国・LKB社から入
手した。ツイーン２０は、英国・ブツクス州・コルンブ
ルツク在・コツホーライト・ラボラトリース社か
ら入手した。２，2′−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾ
リン−６−スルホネート）（APTS）は、英国・
サセツクス州・レベス在・ベーリンガー社から入
手した。エラスチン・エラスターゼおよびグルコースオ
キシダーゼは、ドルセツト州・シグマ・ケミカル
社から入手した。臭化シアノゲンは、ギリングハ
ム在・アルドリツヒ・ケミカル社から入手した。６−ヒドロキシベンゾチアゾールは、バーミン
グハム大学、化学部からの寄贈物として入手し
た。２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール
およびデヒドロルシフエリンは、メソツド・オ
ブ・エンチモロジー、第LV巻、「ビオルミネ
ツセンスおよびケミルミネツセンス」、エム・デ
ルカ編、アカデミツク・プレス社・ロンドン・
1978、第15−28頁に記載された方法で調製した。オキシルシフエリンは、ビトラー等、アーク・
ビオケミカル・ビオフイジオロジー、1957、第72
巻、第358頁の方法により調製した。他の全ての試験はできる限り分析級のものと
し、英国・ドルセツト州・プール在・BDH社に
より供給された。新たにフラスコ蒸留した水を、
さらにアンバライトMB−１混合イオン交換樹脂
（英国・ドルセツト州・プール在・BDH社）の
2.6cm×40cmカラムに通して精製した。分析装置化学ルミネツセンス反応は、10mm×10mmの４ml
容量のプラスチツク使い捨てキユベツト（英国・
ライセスターLE3・1UQ在・ダブリユー・サルス
テツド社）で行なつた。発光した光は、上記（カ
ーター等、英国特許第2025609A号）のルミノメ
ータにより定量し、この場合数個のキユベツトを
光電子増培管の光電陰極の前に正確かつ再現性を
もつて順次に配置するよう変更した。結果は、迅
速ポテンシヨメータのチヤート記録器（オランダ
国・アインドホーベン在・フイリツプ社、
PM8202型、0.25秒未満のフルスケールデフレク
シヨン時間）に記録した。実施例１ペルオキシダーゼのルミネツセンス分析最初の実験においては、10μの蛍ルシフエリ
ン（1mmol／のMgCl₂を含有する0.1mol／
のAMD緩衝液（PH8.9）における0.01−1.0g／）
と、10μのルミノール（0.0003−30g／水）
と、10μのH₂O₂（３−300mmol／水）と、
10μのHRP（0.15mol／のNaClと2g／の
BSAと0.5g／のツイーン20とを含有する
0.015mol／の燐酸塩緩衝液（PH7.2）における
0.05−5000mg／）とを、それぞれ混合すること
なく10mm×10mmのプラスチツクキユベツトの別々
の隅に設置した。次いで、１mlの緩衝液
（0.1mol／グリシン−NaOH PH8.6〜12.5、
0.1mol／グリシルグリシン−NaOH PH7.5〜
9.0、トリスーHCl、PH7.2〜8.5または0.1mol／
のAMP、PH7.5〜9.5）を注入することによりル
ミネツセンス反応を開始させ、そして発光ピーク
を測定した。上記の分析法を用いるこの分析に使用した試薬
の濃度を最適化させた後、低いHRP濃度を測定
するため簡単な分析法を用いた。ナトリウムミノ
ール（50mg）と過酸化水素（62μ、30％ｗ／
ｖ）とを、塩化カリウム（0.15mol／）を含有
するトリス（0.01mol／、PH8.0）緩衝液の200
mlへ加えた。この溶液を使用する数時間前に調製
し、そしてこれを使用してルミネツセンス反応を
開始させた。トリス緩衝液（0.01mol／、PH
8.0）における10μの蛍ルシフエリン（１mg／
ml）をキユベツトの１隅に設置し、10μの抗−
AFP−HRP複合体を他の隅に設置した。ルミノ
ール／H₂O₂試薬（0.9ml）を注入して反応を開始
させた。30秒後の発光または発光ピークを測定し
た。実施例２実施例１の簡単な手順を反復したが、ただし蛍
ルシフエリンの代りにDMSO中の６−ヒドロキ
シベンゾチアゾールを使用した。実施例３実施例１の簡単な手順を反復したが、ただし蛍
ルシフエリンの代りにDMSO中の２−シアノ−
６−ヒドロキシベンゾチアゾールを使用した。実施例４実施例１の簡単な手順を反復したが、ただしル
ミノールの代りにＮ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ
−エチルイソルミノールを使用した。実施例５実施例１の簡単な手順を反復したが、ただしル
ミノールの代りにイソルミノールを使用した。実施例６実施例１の簡単な手順を反復したが、ただしル
ミノールの代りに７−ジメチルアミノ−ナフタレ
ン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド（９−ジメ
チルアミノ−２，３−ジヒドロベンゾー〔ｆ〕−
フタラジン−１，４−ジオン）を使用し、かつフ
タラジンジオン／H₂O₂を使用前に10倍に希釈し
た。実施例７実施例１の簡単な手順を反復したが、ただし過
酸化水素の代りに過硼酸ナトリウムを使用した。実施例８抗−AFP／HRP複合体の分析ナトリウムルミノール（50mg）と過酸化水素
（62μ、30％ｗ／ｖ）とを、塩化カリウム
（0.15mol／）を含有する200mlのトリス
（0.01mol／，PH8.0）緩衝液へ加えた。この溶
液を使用の数時間前に調製し、これを使用してル
ミネツセンス反応を開始させた。トリス緩衝液
（0.01mol／、PH8.0）における10μの蛍ルシフ
エリン（１mg／ml）をキユベツトの１隅に置き、
かつ10μの抗−AFP／HRP複合体を他の隅に
置いた。ルミノール／H₂O₂試薬（0.9ml）を注入
して反応を開始させた。30秒後の発光または発光
ピークを測定した。ペルオキシダーゼ標識した抗−AFPの希釈曲
線を第１図に示す。この反応に関する信号／バツ
クグランド比を第１表に示す。実施例９（比較）実施例８の手順にしたがつたが、ただし蛍ルシ
フエリンを使用しなかつた。この反応に関する信
号／バツクグランド比を第１表に示す。

【表】実施例 10 AFPの分析ａ(1) 500mlの広口ガラス瓶へ125mlのグリシン／
NaOH緩衝液（0.1mol／、PH8.8）と0.25g
のBSAとを加えた。次いで、この溶液をロ
ーラミキサで20℃にて２時間混合した。この
時間の後、瓶（およびその蓋）をグリシン緩
衝液（３×50ml）で洗浄して未結合のアルブ
ミンを除去し、最後に排液した。 (2) 1000個のポリスチレンビーズをリプソル
（登録商標、１％，500ml）で30分間洗浄し
た。蒸留水で洗浄した後、これらビーズを
200mlのグリシン緩衝液と共にブフナーフラ
スコに入れ、そして脱ガスした。 (3) グリシン緩衝液（400ml）を、予備被覆し
たガラス瓶に移し、そしてうさぎ抗−ひと
AFP（1.5ml）を加えた。溶液を充分に混合
し、次いで脱ガスしたビーズを加えた。全体
をローラミキサで20℃にて６時間混合した。 (4) ６時間後グリシン緩衝液−抗体溶液をデカ
ントし、ビーズを400mlのPBS（0.015mol／
燐酸塩、0.15mol／ NaCl、PH7.2）で
２回洗浄した。第２回のPBS洗液をデカン
トした後、PBSにおけるBSA（0.5％）の溶
液（400ml）を加えた。再び、全体をローラ
ミキサで20℃にて混合した。30分後、PBS
−アルブミル溶液を除去し、ツイーン20（登
録商標、0.01％）を含有する酢酸塩緩衝液
（0.1mol／、PH4.2、400ml）を加えた。10
分間混合し、次いで酢酸塩緩衝液を0.05％の
ツイーンを含有するPBS緩衝液（２×400
ml）で置換した。最後に、PBSをデカント
し、ビーズを紙上で20℃にて30分間乾燥さ
せた。これらビーズをねじ付き瓶に４℃で貯
蔵した。ｂ(1) PBSにおける充分抗体被覆したビーズ
（上記工程ａ）を、15〜30分間脱ガスした。 (2) AFPを含有する50μの標準物または試料
を0.95mlのPBS／BSA／ツイーン（燐酸塩
0.015mol／、NaCl 0.15mol／、BSA
0.2％、ツイーン２０ 0.05％、PH7.2）と共
にキユベツトへ加えた。この溶液を37℃まで
加温し、次いでビーズと共に１時間培養し
た。 (3) 次いで、溶液をデカントし、そしてビーズ
をPBS／ツイーンで洗浄した（200mlにて15
秒間、次いで200mlにて５分間）。 (4) 次いで、ビーズを09mlの１：1000希釈のう
さぎ抗−ひとAFP／HRP複合体と共に１時
間培養した（複合体はPBS／BSA／ツイー
ンで希釈し、そしてビーズへ加える前に37℃
まで加温した）。ｅ(1) 溶液を再びデカントし、そしてビーズを脱
イオン化した蒸留水で２分間洗浄した。水を
デカントした後、ビーズを注意深くキユベツ
トへ移した（キユベツト１個当り１個）。 (2) さらに、各キユベツトの隅へトリス緩衝液
（0.01mol／、PH8.0）における10μの蛍ル
シフエリン（１mg／ml）を入れた。 0.9mlのルミノール／H₂O₂溶液〔ナトリウムル
ミノール（50mg）、H₂O₂（62μ、30％ｗ／ｖ）、
トリス（0.01mol／、PH8.0、200ml）、塩化カリ
ウム（0.15mol／）〕を注入することにより、
ルミネツセンス反応を開始させた。30秒後の発光
を測定し、これを第２図に示す。AFP濃度を増
大させた信号／バツクグランド比の比較を第３図
に示す。実施例 11 （比較）実施例10の手順を反復したが、ただしルミネツ
センス反応に蛍ルシフエリンを使用しなかつた。
30秒後の発光を測定し、第２図に示す。実施例 12 （比較）実施例10の手順を反復したが、ただし次の比色
法によつてペルオキシダーゼ標識した抗AFPを
測定した。 ABTS（0.55g）を0.01％のツイーン２０を含有
する酢酸塩緩衝液（500ml，0.1ml／、PH4.2）
に溶解させた。過酸化水素（2.83ml 100容量部、
30％ｗ／ｖ）を蒸留水で10mlまで希釈した。この
保存溶液を４℃にて貯蔵した。使用直前に１mlの
H₂O₂溶液を100mlのABTS溶液と混合し、0.9ml
の得られた混合物を各ビーズ（実施例10の工程ｃ
(1)から得られたもの）と共に37℃にて撹拌しなが
ら30分間培養した。この培養時間の後、405nmに
おける吸光度を処理酵素基質溶液に対して測定し
た。AFP濃度を増大させた、信号／バツクグラ
ンド比の比較を第３図に示す。実施例 13 実施例10の分析を反復したが、ただし蛍ルシフ
エリンの代りにDMSO中の６−ヒドロキシベン
ゾチアゾールを使用した。実施例 14 実施例10の分析を反復したが、ただし蛍ルシフ
エリンの代りにDMSO中の２−シアノ−６−ヒ
ドロキシベンゾチアゾールを使用した。実施例 15 T₄の分析競合酵素結合免疫吸収分析を用いてT4を分析
した。未標識のT4（試料または標準物）とT4／
HRP複合体との混合物を、試験管に被覆された
所定量の抗T4と共に培養した。平衡に達した後、試験管を洗浄して未結合の成
分を除去し、次いでトリス緩衝液（（0.01mol／
、PH8.0）における10μの蛍ルシフエリン（１
mg／ml）を各試験管中に入れた。0.9mlのルミノ
ール／H₂O₂溶液〔ナトリウムルミノール（50
mg）、H₂O₂（62μ，30％ｗ／ｖ）、トリス
（0.01mol／、PH8.0、200ml）、塩化カリウム
（0.15mol／）〕を注入してルミネツセンス反応
を開始させた。30秒後の発光を測定した。T4濃
度を増加させた際の発光変化の比較を第４図に示
す。実施例 16 （比較）競合酵素結合した免疫吸収分析によりT4を分
析した。T4（試料または標準物）とT4／HRP複
合体との混合物を、試験管上に被覆された所定量
のうさぎ抗−T4と共に培養した。平衡に達しかつ過剰の試薬を除去した後、
9.1mmol／のABTSと1.47mmol／の過硼酸
ナトリウムとを含有する1.0mlの燐酸塩／クエン
酸塩緩衝液（PH5.0）を加え、これを使用して25
℃にて60分間培養することにより各試験管におけ
る抗体−T4−HRP複合体の量を測定した。T4濃
度を増加させた際の420nmにおける吸光度変化の
比較を第４図に示す。実施例 17 抗−風疹IgGの分析抗風疹IgGを含有する試験試料を、風疹ウイル
ス（ひと）被覆した床と共にトリス緩衝液中で培
養した。洗浄して未反応成分を除去した後、ビー
ズを抗ひとIgG（やぎ）／HRP複合体と共に再び
トリス緩衝液中で培養した。この溶液をデカントし、そしてビーズを脱イオ
ン蒸留水で洗浄した。洗浄したビーズを水から取
出した後、これらをキユベツトへ移した（キユベ
ツト１個当り１個）。さらに、各キユベツトの隅へ燐酸塩緩衝液
（0.1mol／、PH8.0）における10μの蛍ルシフ
エリン（１mg／ml）を入れた。0.9mlのルミノー
ル／H₂O₂溶液〔ナトリウムルミノール（50mg）、
H₂O₂（62μ，30％ｗ／ｖ）、トリス（0.01mol／
、PH8.0、200ml）、塩化カリウム（0.15mol／
）〕を注入してルミネツセンス反応を開始させ
た。30秒後の発光を測定し、第２表に示す。抗風
疹IgG濃度を増加させた際の信号／バツクグラン
ド比の比較を第３表に示す。実施例 18 （比較）抗風疹IgGを含有する試験試料を、風疹ウイル
ス（ひと）で被覆したビーズと共にトリス緩衝液
中で培養した。洗浄して未反応成分を除去した
後、これらビーズを抗ひとIgG（やぎ）／HRP複
合体と共に再びトリス緩衝液中で培養した。この溶液をデカントし、ビーズを脱イオン蒸留
水で洗浄した。洗浄したビーズを水から取出した
後、これらをキユベツトへ移した（１キユベツト
当り１個）。各ビーズに結合した標識抗体の量を、クエン酸
塩−燐酸塩緩衝液中のｏ−フエニレンジアミン／
H₂O₂をキユベツトへ加えることにより測定した。
0.5時間後、反応を塩酸の添加により停止させ、
そして492nmにおける吸光度を測定した。その結
果を第２表に示す。抗風疹IgG濃度を増大させた
信号／バツクグランド比の比較を第３表に示す。

【表】

【表】実施例 19 エラスターゼの分析西洋ワサビのペルオキシダーゼを、ジー・シ
ー・サウンダース等の方法〔アナリチカル・バイ
オケスミストリー、1982、第126巻、第122頁〕に
より粉末化エラスチンへ結合させた。１mlのエラ
スチン−ペルオキシダーゼ懸濁物を洗浄し、かつ
CaCl₂（2mmol／）を含有する２mlの0.01mol／
トリス緩衝液（PH９）中にて37℃で0.5時間平
衡化させた。結合したトリス−CaCl₂緩衝液にお
けるエラスターゼ（０−100ng／ml）を加え、そ
してエラスチン−HRPと共に37℃で培養した。
60分後、未反応HRP複合体を遠心分離により除
去し、上澄液の一部を移した後、再遠心分離し
た。200μの上澄液を除去し、キユベツト中に
入れ、0.91mlのルミノール／H₂O₂／６−ヒドロ
キシベンゾチアゾール溶液〔ナトリウムルミノー
ル（50mg）、H₂O₂（62μ、30％ｗ／ｖ）、６−ヒ
ドロキシベンゾチアゾール（２ml，１mg／ml、
DMSO中）〕を添加することにより200mlのトリ
ス緩衝液（0.1mol／、PH8.0）において発光を
開始させた。30秒後の発光を測定した。実施例 20 実施例19の分析を反復したが、ただし６−ヒド
ロキシベンゾチアゾールの代りに２−シアノ−６
−ヒドロキシベンゾチアゾールを使用した。実施例 21 実施例19の分析を反復したが、ただし６−ヒド
ロキシベンゾチアゾールの代りに蛍ルシフエリン
を使用した。実施例 22 共固定化したグルコースオキシダーゼおよびペ
ルオキシダーゼに基づくグルコース分析グルコースオキシダーゼ（５mg、シグマ社）と
西洋ワサビのペルオキシダーゼ（５mg、シグマ
社）とを、フオードおよびデルカの方法〔アナリ
チカル・バイオケミストリー、1981、第110巻、
第43頁〕により臭化シアノーゲン活性化したセフ
アロース（英国、フアルマシア社）に共固定化さ
せた。この固定化した酵素を燐酸塩緩衝液
（0.1mol／、PH7.0）に懸濁させた。固定化酵素
の懸濁物（100mg／、50μ）を１mlのルミノ
ール水溶液（25mg／100ml）に加え、50μの６
−ヒドロキシベンゾチアゾール（１mg／ml、
DMSO中）をキユベツト中に含有させた。次い
で、グルコース含有溶液の10μ水性試料を加
え、キユベツトの内容物を混合し、そして発光を
記録した。発光ピークは50〜500nmolのグルコー
ズの範囲において直線であつた。或いは、グルコ
ースオキシダーゼとペルオキシダーゼとをプラス
チツク支持体の表面上に固定化することもできる
（たとえばレオン等、クリニカル・ケミストリー、
1977、第23巻、第1556頁）。実施例 23 実施例22の分析を反復したが、ただし６−ヒド
ロキシベンゾチアゾールの代りに２−シアノ−６
−ヒドロキシベンゾチアゾールを使用した。実施例 24 実施例22の分析を反復したが、ただし６−ヒド
ロキシベンゾチアゾールの代りに蛍ルシフエリン
を使用した。実施例 25 実施例１の簡単な分析を反復したが、ただし蛍
ルシフエリンの代りにオキシルシフエリンを使用
した。実施例 26 実施例１の簡単な分析を反復したが、ただし蛍
ルシフエリンの代りにデヒドロシフエリンを使用
した。

JP83500837A 1982-03-03 1983-02-25 増強ルミネツセンスおよび発光分析 Granted JPS59500252A (ja)

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GB8206263		1982-03-03
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JPH0453518B2 true JPH0453518B2 (ja)	1992-08-26

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