JPH0130478B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプラスミド移入による宿主微生物の形
質転換方法、とりわけグラム陽性またはグラム染
色性不定の好熱性細菌の形質転換方法に係る。 プラスミド移入による形質転換方法は、宿主微
生物に対し、該微生物が元来保有していなかつた
新たな形質を付与する為に用いられる公知の一般
的な方法である。しかしながら好熱性細菌に対し
て、このような方法が適用可能であることはこれ
まで一切報告されていなかつた。 好熱性細菌に対し、所望の遺伝形質、すなわち
有用物質生産能を付与できれば、その高増殖速
度、耐熱性酵素生産能、培養時の常温菌ならびに
バクテリオフアージによる汚染障害の除去、冷却
用ユーテリテイ・コストの低減など工業的利用に
多くの有利性を与える。 また、この目的のための形質転換操作すなわち
宿主菌のプロトプラスト化、供与プラスミドの移
入および細胞壁再生の各操作を好熱性細菌の生育
温度範囲内の温度で実施することができれば、そ
の操作中の汚染障害を低減することができ、純粋
な転換株を容易に造成しうる。 本発明者らは、上記の形質転換操作を好熱性細
菌を受容菌として行えば、供与プラスミドが昇温
条件でも安定に宿主細菌内に保持され得ること、
供与プラスミドが担つていた遺伝形質を宿主細菌
内で発現しうることを確認した。すなわち本発明
によれば、冒頭の特許請求の範囲に記載の通り、
プラスミド移入による形質転換方法において、宿
主微生物としてグラム陽性の好熱性細菌を使用す
る方法が提供される。 本発明で宿主微生物として用いられるグラム陽
性またはグラム染色性不定の好熱性細菌には40℃
以上で生育・増殖の可能な好熱性細菌が含まれ、
とくにバシラス属に属する細菌が好適である。 ここに「グラム染色性不定」なる語句を用いた
のは、たとえばバシラス属細菌中でも、グラム染
色性が不定のもの、あるいは変動するものがある
ことから、これらを包含させるためである。ただ
し、細胞の表層構造は、グラム陽性細菌のもの、
すなわち、細胞壁とその内側に膜があり、外膜の
ない構造と変りない。 これらを例示すると、バシラス・ステアロサー
モフイラス（Bacillus stearothermophilus）
ATCC12980 CU12（生育温度範囲：最低30〜45
℃、最高65〜75℃）が挙げられる。このほか、バ
シラス・コアギユランス（B. Coagulaos、同：
最低15〜25℃、最高65−75℃）およびバシラス・
ブレビス（B. brevis、同：最低10〜35℃、最高
40〜60℃）なども利用可能である。しかしなが
ら、このような例示は本発明を限定するためのも
のと解釈されるべきでない。 また上記形質転換中の主な操作は、各操作間に
介在する分離操作を除き、約40℃ないし約70℃の
範囲の温度で行われることが好ましく、とくに48
℃を中心とする温度範囲で行われることが好適で
ある。このようにすることによつて該高温で生育
し得ない他の微生物による汚染を有効に防止しう
る。 さらに、上記好熱性細菌内に移入される有用物
質生産生要素としてのプラスミドは、その構成
DNA中に所望の有用物質生産遺伝子を含むこと
によつて特徴付けられる。またこのプラスミドに
は通常、選択マーカーとして必要な薬剤耐性を担
わせてあるが、これは当該薬剤耐性を発現する有
用物質を生産する意義をも併せて有している。 上記の要件を備えていれば、上記形質転換に利
用しうるプラスミドはその起源・由来を問わな
い。たとえば後記実施例１においてはスタフイロ
コツカス・アウレウス（Staphylococcus
aureus）由来のpUB110プラスミドをバシラス・
サチリス（Bacillus subtilis）内に保持させて
おいたものを用いたが、これは前者が後者内で容
易に増巾させうるという実験上の便宜からであつ
て、先代宿主菌がバシラス・サチリスであつた点
にこだわつて限定的に解釈されるべきでない。 また、実施例２における先代宿主が同じくバシ
ラス・サチリスに属するものであることも同様な
理由に基づくものである。 ここでは先づ、エツシエリキア・コリ由来の公
知pMB9プラスミドに対し、バシラス・ライケニ
フオルミス（染色体DNA中にペニシラナーゼ産
生遺伝子を含む誘導株）から抽出した該ペニシリ
ナーゼ産生遺伝子DNA断片を、挿入・接続して
混成プラスミドとしこれを用いてエツシエリキ
ア・コリのセルフ・クローンニングを行なつた。
このクローニング株からペニシリナーゼ産生能を
有するプラスミドを選択して、そのDNA断片を
公知のpUB110プラスミド内に組み込み、バシラ
ス・サチリスの形質転換に利用した。 之とは別に、高熱環境の自然界から分離した未
同定の細菌よりプラスミドを抽出し、これによる
バシラス・サチリスの二段階の形質転換を経て、
新規プラスミドpTB53（後述）を得た。 このプラスミドpTB53と、さきのpUB110内に
組込んだペニシリナーゼ産生DNA断片とを接合
して新規混成プラスミドとし、これを前述の先代
宿主に移入させてその形質転換を行なう。 これらの事実は、本発明が種々多様な利用態様
を有することを裏付けるものである。 以下、本発明の概要を、使用微生物、薬剤およ
び手法などを例示して、より具体的に記載する。
なお、例示は理解の便宜のため、たとえば、公的
寄託機関から容易に入手しうるもの、公刊文献記
載の方法あるいは市販の薬剤を挙げて行つたが、
必ずしも限定的に解釈されるべきでなく、目的・
機能などにおいて実質上等価であれば、例示した
以外のものに関しても同様に適用しうるものであ
ることに留意すべきである。 ここでは、宿主微生物（受容菌）として、代表
的なグラム陽性好熱性細菌であるバシラス・ステ
アロサーモフイラス（Bacillus．
stearothermophilus）ATCC12980を選んだ。な
お本菌は40゜から70℃までの範囲の温度で生育・
増殖し、菌体内に潜在性（Cryptic）のプラスミ
ドpBS01を保有している。またその自然突然変異
株CU12は、その染色体DNA内にストレプトマイ
シン耐性（以下Sm^rと略記する）部位を有し、か
つ潜在性プラスミドpBS01が除去された株であ
る。 一方、供与プラスミドとしては、先ずバシラ
ス・サチリス（Bacillus subtilis）より抽出し
たスタフイロコツカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシン
耐性（以下Km^rと略記）のpUB110（ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ社（Bethesda
Research Laboratories Inc.）より入手可能）を
用いる。これをリゾチーム処理によつてプロトプ
ラスト化した上記バシラス・ステアロサーモフイ
ラスと共存させ、スクロース含有高張培地におい
て、ポリエチレングリコール（以下PEGと略記
する）で凝集させ、ついで寒天含有高張培地にお
いて細胞壁を再生させ、移入を完了する。ここ
で、再生培地中にカナマイシンを共存させてスク
リーンを行ないKm^r・Sm^rのバシラス・ステアロ
サーモフイルス形質転換株を造成する。 上記操作中、分離操作以外の工程、少くともプ
ロトプラスト化、凝集および再生の各工程を40℃
以上70℃以下の温度で行なえば容易かつ安全に、
純粋な目的の形質転換株を得ることができる。 なお、他の供与プラスミドとしては次のように
して調製したものを用いることもできる。すなわ
ち、先ずバシラス・ライケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）ATCC9945A
FDO120株由来のペニシリナーゼ産生遺伝子を含
む染色体DNA断片をエシエリキア・コリ
（Escherichia coli）内でクローンニングし、次
いでクローン化された遺伝子を他のベクター・プ
ラスミドpTB53に組み込んでバシラス・サチリ
ス内に移入させる。この形質転換によつてバシラ
ス・サチリス内に生じた新規複合プラスミド
pTTB32を用いて、前記と同様な操作によりバシ
ラス・ステアロサーモフイラスのペニシリナーゼ
産生形質転換株を得る。 このように、バシラス・ステアロサーモフイラ
スを代表とするグラム陽性またはグラム染色性不
定の好熱性細菌は、種々多様な供与プラスミドを
受容して形質転換を受け、供与プラスミドが担つ
ていた形質を発現し、かつその細胞内で供与プラ
スミドを安定に維持しながら、高温で増殖しうる
ものである。 上述のように本発明方法に従つて形質転換を受
けた宿主好熱性細菌は供与プラスミドの形質を受
けついで、そのプラスミドのDNA遺伝子に含ま
れていた有用物質産生能を発現する。この有用物
質は菌体外に代謝排出されるものおよび菌体内に
蓄積されるものを含み、各種の酵素、ホルモン、
有機酸、抗生物質などが例示される。 また高等生物真核細胞起源のDNAおよび真核
細胞DNAから転写されたRNAを素材にして化学
的または酵素的に合成したDNAを供与プラスミ
ド内に組み込み、あるいは転写させることによ
り、真核細胞起源の各種ホルモン、インターフエ
ロンなども生産させることができる。 さらに菌の生育・増殖の結果として、基質中に
含有させた物質をさらに有用な物質に変換させる
ために利用することも可能である。ここに微生物
学的に変換することのできる有機化合物と、その
反応例を挙げると次の通りである。 すなわち、種々の脂肪族、脂環式、芳香族ある
いはヘテロ環式化合物、たとえば、テルペン類、
ステロイド類、アルカロイド類、糖類、アミノ
酸、核酸、ペプチド類、天然産もしくは半合成抗
生物質類、その他各種有機化合物類における酸
化、還元、縮合、開裂、転移、異性化、各種置換
基の導入脱離など、従来生物学的反応として利用
されてきた反応手段が全て本発明形質転換方法に
よつて得られた転換株を利用して可能となる。 以下実施例によつて、本発明方法をより詳細に
説明する。 実施例 １ (1) プラスミドDNAの調製： 形質転換実験に用いる供与DNAとして、次
記の薬剤耐性プラスミドを調製する。 (i) カナマイシン耐性（Km^r）プラスミド
pUB110 (ii) カナマイシンおよびテトラサイクリン耐性
（Km^r、Tc^r）プラスミドpTB19（後述）、お
よび (iii) これらより得た誘導体プラスミド。 上記のうち、いずれを移入しても好熱性細菌
の形質転換株が得られるが、先ずその代表例と
してpUB110について記述する。 pUB110をプラスミドとして保持するバシラ
ス・サチリス（Bacillus subtilis）168株を１
のＬ培地（ペプトン１％、酵母エキス0.5％、
NaCl0.5％、PH7.0に調整）中、37℃で約５時間
振とう培養を行ない、対数増殖期の菌体を集菌
後、リゾチーム−SDS処理によつて溶菌させ、
NaClを最終濃度1Mになるように添加した後４
℃で一夜放置する。この液を30000×ｇ、30分
間の遠心分離にかけ、上澄液を得る。この上澄
液をセシウム・クロライド−エチジウム・ブロ
マイド（CsCl−EdBr）平衡密度勾配超遠心法
に付して、pUB110プラスミドDNAを分画採
取する。 得られた画分にブタノールを添加してEdBr
を抽出除去したのち、トリス・バツフアー
（10mMトリス・塩酸バツフアー、PH7.5、
0.1mM EDTA.Na）中で透折し、プラスミド
DNA溶液とする。 (2) 薬剤耐性プラスミド移入による好熱性細菌の
形質転換： 好熱性細菌の一例としてカナマイシン感受性
（以下Km^sと略記する）のバシラス・ステアロ
サーモフイラスATCC12980CU12を選び、これ
をLGS培地（ペプトン１％、酵母エキス0.5％、
NaCl0.5％、グルコース0.25％、スクロース
0.15M、PH7.2）20mlに接種し、55℃で振とう
培養を行ない、対数増殖中期（OD660≒0.4）
まで生育させたのち、遠心集菌し、次に１mlの
SMM−LG培地（スクロース0.33M、マレイン
酸0.02M、MgCl₂0.02M、ペプトン１％、酵母
エキス0.5％、NaCl0.5％、グルコース0.25％、
PH6.5）に懸濁させる。この懸濁液に対し最終
濃度が1μｇ／mlになるようにリゾチームを加
え、48℃で20分間ゆるやかに振とうしたのち、
5000×ｇ、７分間遠心して生じたプロトプラス
トを分離する。これを１mlのSMM−LG培地
で洗浄、さらに遠心分離（5000×ｇ、７分）を
行なつたのち、再度１mlのSMM−LG培地に
懸濁させ、これをプロトプラスト懸濁液として
用いる。 次に(1)記載の手法によつて調製したプラスミ
ドDNA溶液50μとSMM液（スクロース
0.33M、マレイン酸0.02M、MgCl₂0.02M、PH
6.5）の２倍濃度液50μとの混液に対し、上述
のプロトプラスト懸濁液0.5mlを加え、その後
直ちに、あらかじめ48℃に保温しておいた
PEG6000液（SMM液中の40％溶液）を1.5ml添
加する。これをゆるやかに混合して、プロトプ
ラストを凝集させるとともに、プラスミド
DNAのプロトプラスト内への移入を誘起させ
る。PEG添加２分後に、５mlのSMM−LG培
地を加え、混和後、5000×ｇ、７分間遠心し
て、プロトプラストを分離する。 これを牛血清アルブミン（BSA）0.01％を含
有するSMM−LG培地１mlに懸濁させ、更に
90分間、48℃でゆるやかに振とうして、プラス
ミド上にコードされている薬剤耐性遺伝子の発
現を促進させる。 このプロトプラスト懸濁液100μを、カナ
マイシン20μ／mlを含有する重層用再生寒天
培地（寒天0.6％、バクト・トリプトン１％、
酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、カザミノ酸0.01
％、KH₂PO₄0.15％、K₂HPO₄0.35％、
MgCl₂0.02M、グルコース0.5％、スクロース
0.2M、BSA0.02％、PH7.3）のあらかじめ50℃
に保温しておいたもの３mlと混合し、先に準備
しておいたカナマイシン20μｇ／mlを含む下層
用再生培地（重層用再生寒天培地の寒天濃度の
みを２％に変えたもの）25mlの上に一様に広げ
て固化させる。このプレートを５日〜７日間48
℃に保温すると多数のコロニーが出現するの
で、これを鈎菌し、各クローンを純粋に分離す
る。得られる形質転換株はいずれも用いた受容
菌とは異なつて、カナマイシン耐性（Km^r）
であり、この形質を担うプラスミドpUB110を
菌体内に保持している。またカナマイシンを含
まない再生寒天培地を用いて上記と同様の操作
を行ない、プロトプラストの再生株数を測定す
ると、再生株当約１×10^-4の頻度でカナマイシ
ン耐性となつた形質転換株が得られる。 (3) 形質転換株の安定性： 前記(2)に従つて得る形質転換株を用いてカナ
マイシン耐性遺伝形質の安定性についての検定
結果を下記第１表に示す。安定性試験の手法は
次の通りである。先づ、カナマイシン5μｇ／
mlを含むＬ培地で48℃にて転換株を前培養した
のち、Ｌ培地で希釈し、初発菌数約50細胞／ml
になるようLG培地（グルコース0.25％を含む
Ｌ培地）に接種し、48℃、55℃、60℃および65
℃でそれぞれ約20世代培養する。その後、LG
寒天培地（寒天1.5％を含むＬ培地）上でコロ
ニーを形成させ（48℃）、各コロニーをカナマ
イシン5μｇ／ml含有LG寒天培地に移植し、同
培地上（48℃）での生育の有無を観察すること
により安定性を検定する。 【表】 上記結果より、48℃および55℃では安定である
が60℃および65℃では不安定であることが確認で
きる。 実施例 ２ 実施例１、(2)に記載の好熱性細菌の形質転換の
ために移入するプラスミドDNAを得るため次記
手法による実験を行う。 (1) ペニシリナーゼ産生の遺伝情報を有する染色
体DNAの調製： ペニシリナーゼの構成性生産菌であるバシラ
ス・ライケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）ATCC9945A FD0120C01株を
１のＬ培地中37℃で約５時間振とう培養して
対数増殖期の菌体を集め、SSC液
（NaCl0.15M、クエン酸ナトリウム0.015M、PH
７）で洗浄し、これを20％のスクロースを含む
TEバツフアー（トリスヒドロキシルアミノメ
タン−HCl0.02M、PH7.6、EDTA・Ma₂1ｍＭ）
10mlに懸濁させる。この懸濁液中に10ml／mlの
リゾチームを添加し、37℃で10分間保つたの
ち、１％のラウロイル・ザルコシレート
（lauroyl sarcosylate）液（0.1M、EDTA・
Ma液に溶解させたもの）20mlを加え、更にプ
ロナーゼ（10mg／ml）も添加し、50℃に液が透
明になるまで保つ。この液にCsCl−EdBr平衡
密度勾配超遠心法を施し、染色体DNAを分画
採取する。このDNA画分を集め、ブタノール
を添加してEdBrを抽出除去したのち、TSバツ
フアー（0.02Mトリスヒドロキルアミン、PH
8.0、0.15MNaCl）中で透折し、染色体DNA溶
液とする。 (2) ベクターDNAの調製： ペニシリナーゼ生産を支配する遺伝子領域を
クローニングするため、その担体（ベクター）
となるテトラサイクリン耐性（Tc^r）プラスミ
ドの一種pMB9のDNAを次のようにして調製
する。 先づ、pMB9（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ社より入手可能）をプラスミドとして
保有するエシエリキア・コリ（E.coli）C600株
を１のグルコース・カザミノ酸・無機塩培地
（グルコース0.2％、NH₄Cl0.1％、K₂HPO₄0.6
％、KH₂PO₄0.3％、NaCl0.5％、MgSO₄・
7H₂O0.01％；CaCl₂0.0015％、カザミノ酸２
％、PH7.2）に接種し、37℃で３時間振とう培
養したのち170μｇ／mlになるようにクロラム
フエニコールを添加し、更に37℃で16時間培養
を継続する。この操作によりpMB9プラスミド
の細胞内含量が高められる。培養後、集菌し、
リゾチーム・SDS処理により溶菌させ、以後実
施例１(1)の手法に従つてプラスミドpMB9の
DNA溶液を得る。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入： (1)記載の方法によつて得られる染色体DNA
溶液および(2)記載の方法によつて得られるプラ
スミドpMB9、DNA溶液各10μｇをとり、その
おのおのに制限酵素EcoR1を37℃で１時間作用
させてDNA鎖を切断する。65℃、５分間の熱
処理後両反応液を混合し、ATP、ジチオスレ
イトール、MgCl₂存在のもとで、T4DNAリガ
ーゼにより10℃、24時間にわたり、DNA鎖の
連結反応を行う。 これに65℃、５分間の熱処理を施したのち、
反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応
終了後のDNAを沈澱採取する。 (4) ペニシリナーゼ遺伝子を担つたプラスミドに
よるエシエリキア・コリの形質転換 テトラサイクリン感受性（以下Tc^sと略記す
る）かつアンピシリン感受性（以下Ap^sと記載
する）のエシエリキヤ・コリC600株をＬ培地
10mlに接種し、37℃で振とう培養を行ない対数
増殖中期まで生育させたのち集菌し、これを氷
冷下0.1M MgCl₂、0.1M CaCl₂各溶液に順次
懸濁させることによつて、いわゆるコンピテン
ト（competent）な（DNA取込み能を有する）
細胞を調製する。この細胞懸濁液に(3)記載の手
法で得られるDNAの溶解液を加えて氷冷下30
分間反応させ、直ちに42℃、２分間の熱処理を
したのち、再び氷冷下に30分間放置してDNA
を細胞内に取り込ませる。 次に、この細胞懸濁液の一定量を新たなＬ培
地に接種し、37℃、２時間の振とう培養を行な
つたのち、集菌・洗浄し、再懸濁液をテトラサ
イクリン20μｇ／mlおよびアンピシリン20μ
ｇ／mlを含有するＬ寒天培地（寒天1.5％）に
広げ、37℃に保温する。２日後に生じたコロニ
ーより鈎菌し、各クローンを純粋に分離する。
得られる形質転換株は、いずれも受容菌と異な
り、テトラサイクリン、アンピシリンの両薬剤
に耐性であるとともにペニシリナーゼを生産す
る。 この形質転換株に対し、(2)記載の操作を施し
てプラスミドDNAを調製し、これにEcoR1を
37℃、１時間作用させてDNA鎖を切断する。
このDNA溶液を１％アガロースゲル（トリス
ヒドロキシアミノメタン0.089M、ホウ酸
0.089M、EDTA−Na₂2.5ｍＭ溶液を用いて作
成したもの）の電気泳動にかけると、ベクタ
ー・プラスミドpMB9（3.5Mdal）に新たな
2.8MdalのDNA断片が組み込まれていること
が判明する。このことはペニシリナーゼ生産を
支配する遺伝子領域が、2.8MdalのDNA断片
上にあり、これがベクター・プラスミドpMB9
に組み込まれて新規プラスミドpTTE11が生じ
たことを裏付けるものである。ここで、
2.8MdalのDNA断片を取り込んだ細胞だけが
コロニーとして選択されてきたことを意味す
る。 (5) バシラス属細菌内でベクターとして利用可能
なプラスミドpTB19およびpTB53の調製： 先づ、高温環境の自然界から分離した試料
を、５mlのＬ培地に入れ、55℃で４時間振とう
培養する。この培養液100μを、薬剤（カナ
マイシン25μｇ／mlあるいはテトラサイクリン
25μｇ／ml）を含む1.5％寒天Ｌ培地上に拡げ、
55℃に20時間保温する。生じたコロニーより鈎
菌し、その細菌を純粋分離したのち、Ｌ培地
中、55℃で約５時間振とう培養を行ない、対数
増殖期の菌体を集菌後、リゾチーム−SDS処理
によつて溶菌させ、NaClを終濃度1Mになるよ
うに添加して一夜放置する。 この液に30000×ｇ、30分の遠心を施し、上
澄を得、この上澄をセシユーム・クロライド・
エチジユーム・ブロマイド（CsCl−EdBr）平
衡密度勾配超遠心法にかけることによりプラス
ミドDNAを分画採取する。 このプラスミドDNA溶液を１％アガロース
ゲル電気泳動にかけると、２種のプラスミドが
検出される。このうち分子量の小さいものを
pTB18大きいものをpTB19（17.2Mdal）と命名
した。 上記pTB18およびpTB19の混液を用い、バ
シラス・サチリス168株のいわゆるコンピテン
トな（DNA取込み能を有する）細胞を受容菌
として常法による形質転換を行う。 形質転換株の選択は薬剤含有の1.5％寒天Ｌ
培地上、37℃で行なう。薬剤はカナマイシン
（5μｇ／ml）またはテトラサイクリン（25μ
ｇ／ml）を用いる。 この選択により、両薬剤に耐性を有する形質
転換株を得る。本株は微生物工業技術研究所に
寄詫済である。（微工研菌寄第5895号＜微工研
条寄第109号＞） この形質転換株からプラスミドを調製し、ア
ガロースゲル電気泳動で検定すると、pTB19
のみを保持していることが確認できる。このこ
とはpTB19が両薬剤耐性の遺伝子をコードさ
れていることを示すものである。 このカナマイシンおよびテトラサイクリンに
耐性を有するプラスミドpTB19（Km^r、Tc^r）
を制限エンドヌクレアーゼEcoR1で切断したの
ち、T4DNAリガーゼで再結合して得られるプ
ラスミドによつて、バシラス・サチリスト168
株を形質転換する。 各形質転換株よりプラスミドを調製し、必要
最小限のEcoR1処理断片より成つている、カナ
マイシンおよびテトラサイクリン耐性のプラス
ミドpTB53（Km^r、Tc^r、11.2Mdal）を選択す
る。 pTB19およびpTB53を各種エンドヌクレア
ーゼにより切断後、0.7％、１％または1.5％ア
ガロースゲル電気泳動にかけることにより、そ
れぞれ添付図面ａ，ｂに示す切断点地図を作成
することができる。 (6) ペニシリナーゼ生産遺伝子を担つたプラスミ
ドによるバシラス・サチリスの形質転換： 先づ、前記(4)によつて得られるエツシリキ
ア・コリの形質転換株より、ペニシリナーゼ産
生遺伝子を担つたプラスミドpTTE11を公知方
法によつて調製する。また、前記(5)によつて
pTB53（Km^r、Tc^r）を調製する。 これらのプラスミドpTB53およびpTTE11
の各10μｇをとり、おのおのにEcoR1を37℃で
１時間作用させてDNA鎖を切断する。65℃、
５分間の熱処理によつてEcoR1を失活させたの
ち、両反応液を混合し、T4DNAリガーゼによ
り10℃、24時間にわたつてDNA鎖の連結反応
を行う。65℃、５分間の熱処理ののち、反応液
に２倍容量のエタノールを加えてDNAを沈澱
採取し、それをSSC液に溶解させDNA溶液と
する。このDNAを供与DNAとし、バシラス・
サチルスのマーバーグ（Marburg）168株由来
の株を受容菌として以下の方法で形質転換す
る。 すなわち、先ず受容菌を培地１（K₂HPO₄1.4
％、KH₂PO₄0.6％、（NH₄）₂SO₄0.2％、クエン
酸ナトリウム0.1％、MgSO₄・7H₂O0.02％、グ
ルコース0.5％、カザミノ酸0.02％、トリプト
フアン50μｇ／ml）２mlに、10⁸細菌／ml程度接
種し、37℃で４時間振とう培養する。この培養
液100μを培地（培地中のカザミノ酸含
有量を0.01％に、トリプトフアン含有量を5μ
ｇ／mlに変え、更にMgSO₄・7H₂O含有量を
5μMとしたもの）１mlに移し、更に90分間培
養を続けコンピテストな菌を得る。このコンピ
テントな菌の懸濁液0.9mlと供与DNA溶液0.1ml
を混合し、37℃、30分間振とう培養したのち、
遠心集菌し、Ｌ培地に再懸濁させ37℃で２時間
培養を続ける。この培養液を適当に希釈後、カ
ナマイシン5μｇ／mlを含有するＬ寒天培地上
に広げ37℃に２日間保つ。 生じたコロニーより鈎菌し、各クローンを純
粋に分離したのち、ペニシリナーゼ生産活性の
有無を検定して、目的の形質転換株を得る。こ
の形質転換株から公知方法によつてプラスミド
を調製し、(4)記載と同様の方法（EcoR1法）に
よつてプラスミドDNAを切断、アガロースゲ
ル電気泳動により検出すると、ベクター・プラ
スミドpTB53（11.2Mdal）に、プラスミド
pTTE11の一部でペニシリナーゼ生産遺伝子を
含んでいるDNA断片が組み込まれていること
を確認できる。この新規複合プラスミドを
pTTB32と命名した。 (7) ペニシリナーゼ遺伝子を担つた複合プラスミ
ドによる好熱性細菌バシラス・ステアロサーモ
フイラスの形質転換： 実施例１記載と全く同様な方法で、バシラ
ス・ステアロサーモフイラスATCC12980CU12
を受容菌、前記５）で得られる複合プラスミド
pTTB32を供与DNAとして形質転換株（Km^r）
を得る。これには、ペニシリナーゼ生産能が新
たに賦与されている。 (8) 各種形質転換株によるペニシリナーゼの生産
量： ペニシリナーゼ生産菌の野生型元株であるバ
シラス・ライケニフオルミスATCC9945A
FD0120、その変異株でペニシリナーゼの構成
性生産菌株であり、かつ上記クローニング実験
の親株として用いるCO1株、更にペニシリナー
ゼ生産遺伝子を担つたプラスミドによる各種形
質転換株について、そのペニシリナーゼ生産量
を比較すると、第２表に示す結果を得る。なお
ペニシリナーゼ生産量は、各菌株をＬ培地に接
種し、表中に示す温度で培養し、対数増殖期後
期の培養液について求める。 【表】 【表】 実施例 ３ 実施例２に記載の手法に準じ、下記の菌株を元
株として、バラシス・ステアロサーモフイラス
ATCC 12980CU12の形質転換を行ない、転換株
の酵素産生能をよう素でんぷん法で検定すると、
いずれについてもアルフア・アミラーゼの産生を
認める。 使用菌株： １ バシラス・セリウスATCC21768−21772、 ２ バシラス・ライケニフオルミスATCC27811、 ３ バシラス・サチラスATCC6051a。

【図面の簡単な説明】

図面ａおよびｂは本発明方法において供与プラ
スミドの一種として使用したpTB19および
pTB53の各種エンドヌクレアーゼによる切断点
地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 好熱性細菌のプラスミドの移入による形質転
   換方法であつて、該好熱性細菌がバシラス・ステ
   アロサーモフイラス、該プラスミドが有用物質生
   産要素であり、少なくとも該好熱性細菌のプロト
   プラスト化、プラスミドの移入および細胞壁再生
   の各操作を、シユークロース含有培地中50℃を中
   心とする温度範囲で行なうことを特徴とする方
   法。 ２ 該プラスミドが、該バシラス・ステアロサー
   モフイラス中で複製可能で、17.2Mdalで、第１
   図ａに示す通りの制限酵素切断点を有する
   pTB19であることを特徴とする特許請求の範囲
   １に記載の方法。