JPH0229315B2 - - Google Patents
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- JPH0229315B2 JPH0229315B2 JP56032810A JP3281081A JPH0229315B2 JP H0229315 B2 JPH0229315 B2 JP H0229315B2 JP 56032810 A JP56032810 A JP 56032810A JP 3281081 A JP3281081 A JP 3281081A JP H0229315 B2 JPH0229315 B2 JP H0229315B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は好熱性細菌用ベクター・プラスミドに
関し、より特定的にいえば、グラム陽性またはグ
ラム染色性不定の好熱性細菌内へ移入させて、か
つ該好熱細菌内で複製させることの可能な有用物
質生産性要素であるベクター・プラスミドに係
る。 ここに「グラム染色性不定」なる語句を用いた
のは、たとえばバシラス属細菌中でも、グラム染
色性が不定のもの、あるいは変動するものがある
ことから、これらを包含させるためである。ただ
し細胞の表層構造は、グラム陽性細菌のもの、す
なわち、細胞壁とその内側に膜があり、外膜のな
い構造と変りない。 55℃以上の温度で生育・増殖の可能な好熱性細
菌は、取扱い上の安全性、高増殖速度、耐熱性酵
素生産および培養時の冷却コストの低減などの見
地から、工業的利用に関し数多くの利点を有して
いるが、その一層の利用を可能とする適当な宿主
菌とベクター・プラスミドとの組合せは今まで報
告されていなかつた。 ことに遺伝子工学的手法により有用物質の生産
を目的とするためには、所望の性質（コピー数、
薬剤耐性の種類、各種制限酵素による切断点位置
など）によつて特徴付けられたベクター・プラス
ミドの発見・造成と、その宿主細菌内への移入の
可能性、該菌体内での安定な維持複製の可能性を
確認することが、これまで強く要望されていた。 これを達成する目的で、ビンガム（Bingham，
A.H.A）らは公知のプラスミドpAB124（テトラ
サイクリン耐性：Tcr）を保持する、バシラス・
ステアロサーモフライス（Bacillus
stearothermophilus）を発見したが、この
pAB124を用いることによる好熱性細菌の形質転
換には成功していない。（Bingham，A.H，A.
ら、J.Gen.Microbiol.114：401―408，1979およ
び119：109―115，1980参照）。 本発明者らは、このpAB124（Tcr）と極めて類
似したプラスミドpTB20（Tcr）を別個に分離し
ているが、これを用いた好熱性細菌の形質転換に
は未だに成功していない。但し、バシラス・サチ
リス（Bacillus subtilis）の形質転換は可能で
あつた。 本発明者らは、ここに好熱性細菌を形質転換し
うる、ベクター・プラスミドを高温環境の自然界
から分離した細菌より抽出・取得することに成功
した。該細菌は同定していないが、該プラスミド
はカナマイシン耐性（以下Kmrと略記）および
テトラサイクリン耐性（Tcr）を保有し、これを
公知のバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）
168株（trp C2）に保持させたものは、同pTB19
（Kmr，Tcr）保持株として、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託済である（微工研条寄第
109号）。 さらに、本発明者らは、該ベクター・プラスミ
ドが好熱性細菌内に移入可能であり、かつ該菌体
内において安定に維持・複製可能であることを確
認した。 また、本発明者らは、該ベクター・プラスミド
を切断・再結合させて、より利用性の高い小型の
ベクター・プラスミドを取得し、これらがすべて
上記好熱性細菌内で安定に維持・複製され得るこ
とも確認した。したがつて本発明におけるベクタ
ー・プラスミドとは、これらの小型のベクター・
プラスミド、および各種のエンドヌクレアーゼに
よる切断点間を所望の遺伝形質を担つている
DNA断片によつて接続した、いわゆる誘導体ベ
クター・プラスミドを包含する。 それゆえ、このプラスミドを好熱性細菌内に移
入させてその形質転換を行えば、上記所望の遺伝
形質を発現させ得るものである。 また、本発明によれば、好熱性細菌内に元々存
在はしていたが薬剤耐性など特殊な選択マーカー
を有しないプラスミドと、新たに好熱性細菌内に
形質転換法により移入された薬剤耐性を有し、か
つ有用物質生産性要素でもあるプラスミドとを、
該好熱性細菌内で組換えを誘起させて造成した新
規プラスミドも提供される。 このプラスミドも、上記の菌体外でその遺伝子
の組換えを受け所望の遺伝形質を担つたプラスミ
ドと同様な有用性を有することは言う迄もない。
また、後述の参考例で詳細に述べるように、この
菌体内組換え体が、高温でも安定に複製・維持さ
れることが確認された。 上述のように、本発明によつて提供されるベク
ター・プラスミドは好熱性細菌を形質転換して、
該好熱性細菌に所望の有用物質生産能を賦与する
ものである。 この有用物質には各種の酵素、ホルモン、有機
酸、抗生物質などが含まれる。また高等生物真核
細胞起源のDNAおよび真核細胞DNAから転写さ
れたRNAを素材として化学的あるいは酵素的に
合成されたDNAをベクター・プラスミド内に組
み込みあるいは転写させることにより、真核細胞
起源のホルモン、インターフエロンなども生産さ
せることができる。 また菌の生育・増殖の結果として、基質中に含
有させた物質をさらに有用な物質に変換させるこ
とも可能である。ここに微生物学的に変換するこ
とのできる有機化合物と、その反応例を挙げる
と、次の通りである。 すなわち、種々の脂肪族、脂環式、芳香族ある
いはヘテロ環式化合物、たとえば、テルペン類、
ステロイド類、アルカロイド類、糖類、アミノ
酸、核酸、ペプチド類、天然産もしくは半合成抗
生物質類、その他各種有機化合物類における酸
化、還元、縮合、開裂、転移、異性化、各種置換
基の導入脱離など、従来生物学的反応として利用
されてきた反応手段を全て本発明ベクター・プラ
スミドに組み込んで利用することができる。 以下、実施例によつて本発明をより詳細に説明
する。 実施例 (1) 薬剤耐性を示す好熱性細菌の分離とプラスミ
ドの検索： 高温環境から採取した試料を５mlのＬ培地
（ペプトン１％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、
PH7.2に調整）に入れ、55℃で４時間振とう培
養する。この培養液100μを薬剤（カナマイ
シン25μｇ／mlあるいはテトラサイクリン25μ
ｇ／ml）を含む1.5％寒天Ｌ培地（ペプトン１
％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、PH7.0に調
整）上に拡げ55℃に20時間保温する。生じたコ
ロニーより鈎菌し、その細菌を純粋分離したの
ち、Ｌ培地中、55℃で約５時間振とう培養を行
ない、対数増殖期の菌体を集菌後、リゾチーム
―SDS処理によつて溶菌させ、NaClを終濃度
1Mになるように添加して一夜放置する。 この液に30000×ｇ，30分の遠心を施し、上
澄を得、この上澄をセシユームクロライド―エ
チジウムブロマイド（CsCl−EdBr）平衡密度
勾配遠心法にかけることによりプラスミド
DNAを分画採取する。 このプラスミドDNA溶液を１％アガロース
ゲル（トリスヒドロキシアミノメタン0.089M，
ホウ酸0.089M，EDTA−Na22.5mM溶液を用
いて作成したもの）の電気泳動にかけると、２
種のプラスミドが検出される。このうち、分子
量の小さいものをpTB18、大きいものを
pTB19（17.2Mdal）と命名した。 (2) 好熱性細菌より分離したプラスミドによるバ
シラス・サチリス（Bacillus subtilis）168株
の形質転換： 上記１）で得られるpTB18，pTB19の混液
を用い、バシラス・サチリスのいわゆるコンピ
テント（competent）な（DNA取り込み能を
有する）細胞を受容菌として形質転換を行う。 形質転換法の選択は薬剤含有の1.5％寒天Ｌ
培地上で37℃にて行う。薬剤はカナマイシン
（5μｇ／ml）またはテトラサイクリン（25μ
ｇ／ml）を用いる。この選択、操作により、両
薬剤に耐性を有する形質転換株を得る。 この形質転換株からプラスミドを調製し、ア
ガロースゲル電気泳動で検定すると、pTB19
のみを保持していることが確認される。この事
はpTB19が両薬剤耐性の遺伝子をコードされ
ていることを示すものである。 (3) 薬剤耐性プラスミドpTB19の小型化、誘導
体の造成： カナマイシンおよびテトラサイクリン耐性の
プラスミドpTB19（Kmr，Tcr）を制限エンド
ヌクレアーゼEcoR1で切断したのち、T4DNA
リガーゼで再結合して得られるプラスミドによ
つて、バシラス・サチリス168株の形質転換を
行なう。 各形質転換株よりプラスミドを調製し、必要
最小限のEcoR1処理断片より成る、カナマイシ
ンおよびテトラサイクリン耐性のプラスミド
pTB53（Kmr，Tcr，11.2Mdal）を選択する。 (4) pTB19（Kmr，Tcr）およびpTB53（Kmr，
Tcr）の各種エンドヌクレアーゼによる切断点
地図： 両プラスミドを各種エンドヌクレアーゼによ
り切断後、0.7％、１％または1.5％アガロース
ゲル電気泳動にかけることにより、それぞれ第
１図ａ，ｂに示す切断点地図を作成することが
できる。 (5) pTB19（Kmr，Tcr）またはpTB53（Kmr，
Tcr）による好熱性細菌バシラス・ステアロサ
ーモフライス（Bacillus
stearothermophilus）の形質転換： 好熱性細菌の代表例としてカナマイシン感受
性（Kms）のバシラス・ステアロサーモフラ
イスATCC12980、CU12株を選び、これを
LGS培地（ペプトン１％，酵母エキス0.5％，
NaCl0.5％，グルコース0.25％，スクロース
0.15M，PH7.2）20mlに接種し、55℃で振とう
培養を行ない、対数増殖中期（OD660≒0.4）
まで生育させたのち、遠心集菌し、次に１mlの
SMM−LG培地（スクロース0.33M，マレイン
酸0.02M，MgCl20.02M，ペプトン１％，酵母
エキス0.5％，NaCl0.5％，グルコース0.25％，
PH6.5）に懸濁させる。この懸濁に対し最終濃
度が1μｇ／mlになるようにリゾチームを加え、
48℃で20分間ゆるやかに振とうしたのち、5000
×ｇ，７分間遠心して生じたプロトプラストを
分離する。これを１mlのSMM−LG培地で洗
浄、さらに遠心分離（5000×ｇ，７分）を行な
つたのち再度１mlのSMM−LG培地に懸濁さ
せ、これをプロトプラスト懸濁液として使用す
る。 次に上記(1)(3)において得られるpTB19およ
びpTB53をそれぞれ含むプラスミドDNA溶液
各50μとSMM液（スクロース0.33M，マレイ
ン酸0.02M，MgCl20.02M，PH6.5）の２倍濃度
液50μとの混液に対し、上述のプロトプラス
ト懸濁液を加え、その後直ちに、あらかじめ48
℃に保温しておいたポリエチレングリコール
（PEG）6000液（SMM液中の40％溶液）を1.5
ml添加する。これをゆるやかに混合して、プロ
トプラストを凝集させるとともにプラスミド
DNAのプロトプラスト内への移入を誘起させ
る。PEG添加２分後に、５mlのSMM−LG培
地を加え、混和後、5000×ｇ，７分間遠心し
て、プロトプラストを分離する。 これを牛血清アルブミン（BSA）0.01％を含
むSMM−LG培地１mlに懸濁させ、更に90分
間、48℃でゆるやかに振とうしてプラスミド上
にコードされている薬剤耐性遺伝子の発現を促
進させる。 このプロトプラスト懸濁液100μを、カナ
マイシン20μｇ／mlを含有する重層用再生寒天
培地（寒天0.6％，バクト・トリプトン１％，
酵母エキス0.5％，NaCl0.5％，カザミノ酸0.01
％，KH2PO40.15％，K2HPO40.35％，グルコ
ース0.5％，MgCl20.02M，スクロース0.02M，
BSA0.02％，PH7.3）のあらかじめ50℃に保温
しておいたもの３mlと混合し、先に準備してお
いたカナマイシン20μｇ／mlを含む下層用再生
培地（重層用寒天培地の寒天濃度のみを２％に
変えたもの）25mlの上に一様に広げて固化させ
る。このプレートを５日〜７日間48℃に保温す
ると多数のコロニーが出現するので、これを鈎
菌し、各クローンを純粋に分離する。得られる
形質転換株はいずれも用いた受容菌とは異なつ
て、カナマイシン耐性（Kmr）であり、この
形質を担うプラスミドpTB19またはpTB53を
菌体内に保持している。 またこれらの形質転換株から前記(1)の方法に
従つてpTB19およびpTB53をそれぞれ調製・
確認することができる。 さらにpTB19を保持する形質転換株をカナ
マイシン（5μｇ／ml）またはテトラサイクリ
ン（5μｇ／ml）を含むLGS培地にて、55℃，
60℃および65℃のいずれの温度で培養しても増
殖可能である。このことは、これらの薬剤耐性
遺伝子が転換株内で充分に、その形質を発現し
ていることを意味する。 (6) バシラス・ステアロサーモフイラスの形質転
換の他の例： 前記(5)に記載のpTB19（Kmr，Tcr）または
pTB53（Kmr，Tcr）によるバシラス・ステア
ロサーモフイラスの形質転換法は、これらのプ
ラスミドによる形質転換法に限らず、これらの
プラスミドから誘導した、所望の遺伝子DNA
が組み込まれた他のプラスミドによる形質転換
にも利用することができる。 その一例としてペニシリナーゼ産生遺伝子を
担つたプラスミドpTTB32による形質転換法を
次に記述する。 (i) ペリシリナーゼ生産遺伝情報を有する染色
体体DNAの調製： ペニシリナーゼの構成性生産菌である、バ
シラス・ライケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）ATCC9945A CO1株を１
のＬ培地中37℃で約５時間振とう培養して対
数増殖期の菌体を集め、SSC液
（NaCl0.15M，クエン酸ナトリウム0.015M，
PH７）で洗浄し、これを20％のスクロースを
含むTEバツフアー（トリスヒドロキシルア
ミノメタン―HCl0.02M，EDTA Na21mM，
PH7.6）10mlに懸濁させる。この懸濁液中に
10mg／mlのリゾチームを添加し、37℃で10分
間保つたのち、１％のラウロイル・ザルコシ
レート（lauroyl sarcosylate）液（0.1M
EDTA−Na2液に溶解させたもの）20mlを加
え、更にプロナーゼ（10mg／ml）も添加し、
50℃に液が透明になるまで保つ。この液に
CsCl−EdBr平衡密度超遠心法を施し、染色
体DNAを分画採取する。このDNA画分を集
め、ブタノールを添加してEdBrを抽出除去
したのち、TSバツフアー（トリスヒドロキ
シルアミン0.02M，NaCl0.15M，PH8.0）中
で透析し、染色体DNA溶液とする。 (ii) ベクターDNAの調製： ペニシリナーゼ生産を支配する遺伝子領域
をクローニングするため、その担体（ベクタ
ー）となるテトラサイクリン耐性（Tcr）プ
ラスミドの一種pMB9（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ社より入手可能）の
DNAを次のようにして調整する。 先ず、pMB9をプラスミドとして保有する
エシエリキア・コリ（E.Coli）C600株を１
のグルコース・カザミノ酸・無機塩培地（グ
ルコース0.2％，NH4Cl0.1％，K2HPO40.6
％，KH2PO40.3％，NaCl0.5％，MgSO4・
7H2O0.01％，CaCl20.0015％，カザミノ酸２
％，PH7.2）に接種し、37℃で３時間振とう
培養したのち170μｇ／mlになるようにクロ
ラムフエニコールを添加し、更に37℃で16時
間培養を継続する。この操作によりpMB9プ
ラスミドの細胞内含量が高められる。培養
後、集菌し、リゾチーム・SDS処理により溶
菌させ、以後(1)に記載の手法に従つてプラス
ミドpMB9のDNA溶液を得る。 (iii) 染色体DNA断片のベクターへの挿入： (i)記載の方法によつて得られる染色体
DNA溶液および(ii)記載の方法によつて得ら
れるプラスミドpMB9，DNA溶液各10μｇを
とり、そのおのおのにEcoR1を37℃で１時間
作用させてDNA鎖を切断する。65℃，５分
間の熱処理後、両反応液を混合し、ATP，
ジチオスレイトール，MgCl2存在のもとで、
T4DNAリガーゼにより10℃，24時間にわた
り、DNA鎖の連結反応を行なう。 これに65℃，５分間の熱処理を施したの
ち、反応液に２倍容のエタノールを加えて連
絡反応終了後のDNAを沈澱採取する。 (iv) ペニシリナーゼ遺伝子を担つたプラスミド
によるエシエリキア・コリの形質転換： テトラサイクリン感受性（Tcs）でアンピ
シリン感受性（Aps）のエシエリキヤ・コリ
C600株をＬ培地10mlに接種し、37℃で振と
う培養を行ない対数増殖中期まで生育させた
のち、集菌し、これを永冷下0.1M MgCl2，
0.1M CaCl2各溶液に順次懸濁させることに
よつて、いわゆるコンピテント細胞を調製す
る。この細胞懸濁液に(iii)記載の手法で得られ
るDNAの溶解液を加えて氷冷下30分間反応
させ、直ちに42℃，２分間の熱処理をしたの
ち、再び氷冷下に30分間放置してDNAを細
胞内に取り込ませる。 次に、この細胞懸濁液の一定量を新たなＬ
培地に接種し、37℃，２時間の振とう培養を
行なつたのち、集菌・洗浄し、再懸濁液をテ
トラサイクリン20μｇ／mlおよびアンピシリ
ン20μｇ／mlを含有するＬ寒天培地（寒天1.5
％）に広げ、37℃に保温する。２日後に生じ
るコロニーより鈎菌し、各クローンを純粋に
分離する。得られる形質転換株は、いずれも
受容菌と異なり、テトラサイクリン，アンピ
シリンの両薬剤に耐性であるとともに、ペニ
シリナーゼを生産する。 この形質転換株に対し、(ii)記載の操作を施
してプラスミドDNAを調製し、これにEco
R1を37℃で１時間作用させてDNA鎖を切断
する。このDNA溶液を１％アガロースゲル
電気泳動にかけると、ベクター・プラスミド
pMB9（3.5Mdal）に新たな2.8MdalのDNA
断片が組み込まれていることが確認できる。
このことはペニシリナーゼ生産を支配する遺
伝子領域が、2.8MdalのDNA断片上にあり、
これがベクター・プラスミドpMB9に組み込
まれて新規プラスミドpTTE11が生じること
を裏付けるものである。 (v) ペニシリナーゼ生産遺伝子を担つたプラス
ミドによるバシラス・サチリスの形質転換： 先ず、前記(iv)記載の方法に従つて得られる
エシエリキア・コリの形質転換株より、ペニ
シリナーゼ産生遺伝子を担つたプラスミド
pTTE11を公知方法によつて調製する。また
前記(3)によつてpTB53（Kmr，Tcr）を調製
する。 これらのプラスミドpTB53および
pTTE11の各10μｇをとり、おのおのにEco
R1を37℃で１時間作用させてDNA鎖を切断
する。 65℃，５分間の熱処理によつてEcoR1を失
活させたのち、両反応液を混合し、T4DNA
リガーゼにより10℃，24時間にわたつて
DNA鎖の連結反応を行う。65℃，５分間の
熱処理ののち、反応液に２倍容量のエタノー
ルを加えてDNAを沈澱採取し、それをSSC
液に溶解さDNA溶液とする。このDNAを供
与DNAとし、バシラス・サチリス168株由来
の株を受容菌として、前記(2)記載と類似の方
法で形質転換を行なう。 形質転換株の選択は、ペニシリナーゼ生産
活性の有無を検定して行ない、この形質転換
株（Pease+）から公知方法によつてプラス
ミドを調製し、EcoR1法によつてプラスミド
DNAを切断、アガロースゲル電気泳動にか
けると、ベクター・プラスミドpTB53
（11.2Mdal）に、プラスミドpTTE11の一部
でペニシリナーゼ生産遺伝子が含まれている
DNA断片が組み込まれていることを確認で
きる。この新規複合プラスミドをpTTB32と
命名した。 (vii) ペニシリナーゼ遺伝子を担つた複合プラス
ミドによる好熱性細菌バシラス・ステアロサ
ーモフライスの形質転換： 前記(5)と全く同様な方法で、バシラス・ス
テアロサーモフライスATCC12980Cu12株
に、上記複合プラスミドpTTB32を供与
DNAとする形質転換を行ない、対応する形
質転換株（Kmr）を得る。これには、ペニ
シリナーゼ生産能が新たに賦与されている。 (viii) 各種形質転換株によるペニシリナーゼの生
産量： ペニシリナーゼ生産菌の野生型元株である
バシラス・ライケニフオルミスATCC9945A
FD0120，その変異株でペニシリナーゼの構
成性生産菌株であり、かつ上記クローニング
実験の親株として用いるCO1株、更にペニシ
リナーゼ生産遺伝子を担つたプラスミドによ
る各種形質転換株について、そのペニシリナ
ーゼ生産量を比較すると第１表に示す結果が
得られる。 なお、ペニシリナーゼ生産量は、各菌株を
Ｌ培地に接種し、表中に示す温度で培養し、
対数増殖期後期の培養液について求めたもの
である。 【表】 参考例 (1) 潜在性プラスミドpBS02を保持する好熱性細
菌バシラス・ステアロサーモフイラスの、カナ
マイシン耐性プラスミドpUB110による形質転
換： バシラス・ステアロサーモフイラス
ATCC12980，Cu12由来のS2株からのプラスミ
ド抽出を常法（セシウム・クロライド―エチジ
ウム・ブロマイド（CsCl−EdBr）平衡密度勾
配超遠心法）に従つて行うと、分子量約19.8×
106のプラスミドが確認できる。しかし、この
プラスミドpBS02は潜在性であり、薬剤耐性な
ど選択に利用可能な情報（選択マーカー）を担
つているものではなかつた。 このため、バシラス・サチリスより抽出した
スタヒロコツカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシ
ン耐性プラスミドpUB110（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ社（Bcthesda Research
Laboratories Inc.）より入手可能）を供与
DNAとし、潜在性プラスミドpBS02を保持す
るバシラス・ステアロサーモフイラスS2株を
受容菌とする形質転換実験をプロトプラスト法
により行う。 この方法では、先ず上記S2株をLGS培地20
mlに接種し、55℃で振とう培養を行ない、対数
増殖中期（OD660≒0.4）まで生育させたのち、
遠心集菌し、次に１mlのSMM−LG培地に懸
濁させる。この懸濁液に対し最終濃度が1μ
ｇ／mlになるようにリゾチームを加え、48℃で
20分間ゆるやかに振とうしたのち、5000×ｇ，
７分間遠心して生じたプロトプラストを分離す
る。これを１mlのSMM−LG培地で洗浄、さ
らに遠心分離（5000×ｇ，７分）を行なつたの
ち、再度１mlのSMM−LG培地に懸濁させ、
これをプロトプラスト懸濁液として用いる。 次に、前記プラスミドpUB110のプラスミド
DNA溶液50μとSMM液の２倍濃度液50μ
との混液に対し、上述のプロトプラスト懸濁液
0.5mlを加え、その後直ちに、あらかじめ48℃
に保温しておいたPEG6000液（SMM液中の40
％溶液）を1.5ml添加する。これをゆるやかに
混合して、プロトプラストを凝集させるととも
に、プラスミドDNAのプロトプラスト内への
移入を誘起させる。PEG添加後２分後に、５
mlのSMM−LG培地を加え、混和後、5000×
ｇ，７分間遠心して、プロトプラストを分離す
る。 これをBSA0.1％を含有するSMM−LG培地
１mlに懸濁させ、更に90分間、48℃でゆるやか
に振とうしてプラスミド上にコードされている
薬剤耐性遺伝子の発現を促進させる。 このプロトプラスト懸濁液100μをカナマ
イシン20μｇ／mlを含有する、あらかじめ50℃
に保温しておいた重層用再生寒天培地３mlと混
合し、先に準備しておいた下層用再生培地25ml
の上に一様に広げて固化させる。このプレート
を５日〜７日間48℃に保温すると多数のコロニ
ーが出現するので、これを鈎菌し、各クローン
を純粋に分離する。 (2) 形質転換株から調製する組換えプラスミド： 上記(1)によつて得られる形質転換株から実施
例1.(1)記載の方法に従つてプラスミドの抽出・
調製を行う。得られるプラスミドについて、ア
ガロースゲル電気泳動による検定を行なうと、
カナマイシン耐性を担つたプラスミドpUB110
（3.0Mdal）と、このS2元株内にもともと保持
されていた潜在性プラスミドpBS02
（19.8Mdal）とはいずれも存在せず、代りに分
子量の大きくなつた組換えプラスミドpBSK1
（21.5Mdal）が認められる。 この新たに得られるプラスミドpBSK1を用
いてバシラス・ステアロサーモフイラスの形質
転換を、上記(1)に準じて行うと、カナマイシン
耐性となつた形質転換株が得られる。この事実
はプラスミドpBSK1がカナマイシン耐性遺伝
子をコードしていることを示している。 また、潜在性プラスミドpBS02とカナマイシ
ン耐性を担う組換えプラスミドpBSK1につい
て、実施例1.(4)に記載の方法に準じて制限エン
ドヌクレアーゼBamHIに関する切断点地図を
作成すると、それぞれ第２図ａ，ｂが得られ
る。 これにより、pBS02のBamHI処理断片
（5.6Mdal）内に、pUB110プラスミドのカナマ
イシン耐性を担う部分（1.7Mdal）が組換えに
より挿入されていることが確認される。 (3) カナマイシン耐性を担うプラスミドpUB110
およびpBSK1の好熱性細菌内での安定性： pUB110プラスミドのみを保持する好熱性細
菌バシラス・ステアロサーモフイラスS2株と
pBSK1プラスミドのみを保持する同一株につ
いて、プラスミドの安定性試験を次のようにし
て行なう。 先ず、これらの株を、カナマイシン5μｇ／
mlを含むＬ培地において、48℃で前培養したの
ち、Ｌ培地で希釈し、初発菌数約50細胞／mlに
なるようにLG培地（グルコース0.25％を含む
Ｌ培地）に接種し、48℃，55℃，60℃および65
℃で、それぞれ約20世代培養する。その後、
LG寒天培地（寒天1.5％を含むＬ培地）上でコ
ロニーを形成させ（48℃）、各コロニーをカナ
マイシン5μｇ／mlを含有するLG寒天培地に移
殖し、同培地上（48℃）での生育の有無を観察
することにより安定性を検定し、第１表に示す
結果を得る。 【表】 上表より、pUB110は60℃以上の温度で不安
定となるのに対し、pBSK1はいずれの温度
（48℃〜65℃）でも安定に維持され得るもので
あることが判る。 すなわち、前記の所期目的を達成したプラス
ミド、カナマイシン耐性を担い、高温（65℃）
に至るまで安定な組換えプラスミドpBSK1が
造成されていることが確認される。
関し、より特定的にいえば、グラム陽性またはグ
ラム染色性不定の好熱性細菌内へ移入させて、か
つ該好熱細菌内で複製させることの可能な有用物
質生産性要素であるベクター・プラスミドに係
る。 ここに「グラム染色性不定」なる語句を用いた
のは、たとえばバシラス属細菌中でも、グラム染
色性が不定のもの、あるいは変動するものがある
ことから、これらを包含させるためである。ただ
し細胞の表層構造は、グラム陽性細菌のもの、す
なわち、細胞壁とその内側に膜があり、外膜のな
い構造と変りない。 55℃以上の温度で生育・増殖の可能な好熱性細
菌は、取扱い上の安全性、高増殖速度、耐熱性酵
素生産および培養時の冷却コストの低減などの見
地から、工業的利用に関し数多くの利点を有して
いるが、その一層の利用を可能とする適当な宿主
菌とベクター・プラスミドとの組合せは今まで報
告されていなかつた。 ことに遺伝子工学的手法により有用物質の生産
を目的とするためには、所望の性質（コピー数、
薬剤耐性の種類、各種制限酵素による切断点位置
など）によつて特徴付けられたベクター・プラス
ミドの発見・造成と、その宿主細菌内への移入の
可能性、該菌体内での安定な維持複製の可能性を
確認することが、これまで強く要望されていた。 これを達成する目的で、ビンガム（Bingham，
A.H.A）らは公知のプラスミドpAB124（テトラ
サイクリン耐性：Tcr）を保持する、バシラス・
ステアロサーモフライス（Bacillus
stearothermophilus）を発見したが、この
pAB124を用いることによる好熱性細菌の形質転
換には成功していない。（Bingham，A.H，A.
ら、J.Gen.Microbiol.114：401―408，1979およ
び119：109―115，1980参照）。 本発明者らは、このpAB124（Tcr）と極めて類
似したプラスミドpTB20（Tcr）を別個に分離し
ているが、これを用いた好熱性細菌の形質転換に
は未だに成功していない。但し、バシラス・サチ
リス（Bacillus subtilis）の形質転換は可能で
あつた。 本発明者らは、ここに好熱性細菌を形質転換し
うる、ベクター・プラスミドを高温環境の自然界
から分離した細菌より抽出・取得することに成功
した。該細菌は同定していないが、該プラスミド
はカナマイシン耐性（以下Kmrと略記）および
テトラサイクリン耐性（Tcr）を保有し、これを
公知のバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）
168株（trp C2）に保持させたものは、同pTB19
（Kmr，Tcr）保持株として、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託済である（微工研条寄第
109号）。 さらに、本発明者らは、該ベクター・プラスミ
ドが好熱性細菌内に移入可能であり、かつ該菌体
内において安定に維持・複製可能であることを確
認した。 また、本発明者らは、該ベクター・プラスミド
を切断・再結合させて、より利用性の高い小型の
ベクター・プラスミドを取得し、これらがすべて
上記好熱性細菌内で安定に維持・複製され得るこ
とも確認した。したがつて本発明におけるベクタ
ー・プラスミドとは、これらの小型のベクター・
プラスミド、および各種のエンドヌクレアーゼに
よる切断点間を所望の遺伝形質を担つている
DNA断片によつて接続した、いわゆる誘導体ベ
クター・プラスミドを包含する。 それゆえ、このプラスミドを好熱性細菌内に移
入させてその形質転換を行えば、上記所望の遺伝
形質を発現させ得るものである。 また、本発明によれば、好熱性細菌内に元々存
在はしていたが薬剤耐性など特殊な選択マーカー
を有しないプラスミドと、新たに好熱性細菌内に
形質転換法により移入された薬剤耐性を有し、か
つ有用物質生産性要素でもあるプラスミドとを、
該好熱性細菌内で組換えを誘起させて造成した新
規プラスミドも提供される。 このプラスミドも、上記の菌体外でその遺伝子
の組換えを受け所望の遺伝形質を担つたプラスミ
ドと同様な有用性を有することは言う迄もない。
また、後述の参考例で詳細に述べるように、この
菌体内組換え体が、高温でも安定に複製・維持さ
れることが確認された。 上述のように、本発明によつて提供されるベク
ター・プラスミドは好熱性細菌を形質転換して、
該好熱性細菌に所望の有用物質生産能を賦与する
ものである。 この有用物質には各種の酵素、ホルモン、有機
酸、抗生物質などが含まれる。また高等生物真核
細胞起源のDNAおよび真核細胞DNAから転写さ
れたRNAを素材として化学的あるいは酵素的に
合成されたDNAをベクター・プラスミド内に組
み込みあるいは転写させることにより、真核細胞
起源のホルモン、インターフエロンなども生産さ
せることができる。 また菌の生育・増殖の結果として、基質中に含
有させた物質をさらに有用な物質に変換させるこ
とも可能である。ここに微生物学的に変換するこ
とのできる有機化合物と、その反応例を挙げる
と、次の通りである。 すなわち、種々の脂肪族、脂環式、芳香族ある
いはヘテロ環式化合物、たとえば、テルペン類、
ステロイド類、アルカロイド類、糖類、アミノ
酸、核酸、ペプチド類、天然産もしくは半合成抗
生物質類、その他各種有機化合物類における酸
化、還元、縮合、開裂、転移、異性化、各種置換
基の導入脱離など、従来生物学的反応として利用
されてきた反応手段を全て本発明ベクター・プラ
スミドに組み込んで利用することができる。 以下、実施例によつて本発明をより詳細に説明
する。 実施例 (1) 薬剤耐性を示す好熱性細菌の分離とプラスミ
ドの検索： 高温環境から採取した試料を５mlのＬ培地
（ペプトン１％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、
PH7.2に調整）に入れ、55℃で４時間振とう培
養する。この培養液100μを薬剤（カナマイ
シン25μｇ／mlあるいはテトラサイクリン25μ
ｇ／ml）を含む1.5％寒天Ｌ培地（ペプトン１
％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、PH7.0に調
整）上に拡げ55℃に20時間保温する。生じたコ
ロニーより鈎菌し、その細菌を純粋分離したの
ち、Ｌ培地中、55℃で約５時間振とう培養を行
ない、対数増殖期の菌体を集菌後、リゾチーム
―SDS処理によつて溶菌させ、NaClを終濃度
1Mになるように添加して一夜放置する。 この液に30000×ｇ，30分の遠心を施し、上
澄を得、この上澄をセシユームクロライド―エ
チジウムブロマイド（CsCl−EdBr）平衡密度
勾配遠心法にかけることによりプラスミド
DNAを分画採取する。 このプラスミドDNA溶液を１％アガロース
ゲル（トリスヒドロキシアミノメタン0.089M，
ホウ酸0.089M，EDTA−Na22.5mM溶液を用
いて作成したもの）の電気泳動にかけると、２
種のプラスミドが検出される。このうち、分子
量の小さいものをpTB18、大きいものを
pTB19（17.2Mdal）と命名した。 (2) 好熱性細菌より分離したプラスミドによるバ
シラス・サチリス（Bacillus subtilis）168株
の形質転換： 上記１）で得られるpTB18，pTB19の混液
を用い、バシラス・サチリスのいわゆるコンピ
テント（competent）な（DNA取り込み能を
有する）細胞を受容菌として形質転換を行う。 形質転換法の選択は薬剤含有の1.5％寒天Ｌ
培地上で37℃にて行う。薬剤はカナマイシン
（5μｇ／ml）またはテトラサイクリン（25μ
ｇ／ml）を用いる。この選択、操作により、両
薬剤に耐性を有する形質転換株を得る。 この形質転換株からプラスミドを調製し、ア
ガロースゲル電気泳動で検定すると、pTB19
のみを保持していることが確認される。この事
はpTB19が両薬剤耐性の遺伝子をコードされ
ていることを示すものである。 (3) 薬剤耐性プラスミドpTB19の小型化、誘導
体の造成： カナマイシンおよびテトラサイクリン耐性の
プラスミドpTB19（Kmr，Tcr）を制限エンド
ヌクレアーゼEcoR1で切断したのち、T4DNA
リガーゼで再結合して得られるプラスミドによ
つて、バシラス・サチリス168株の形質転換を
行なう。 各形質転換株よりプラスミドを調製し、必要
最小限のEcoR1処理断片より成る、カナマイシ
ンおよびテトラサイクリン耐性のプラスミド
pTB53（Kmr，Tcr，11.2Mdal）を選択する。 (4) pTB19（Kmr，Tcr）およびpTB53（Kmr，
Tcr）の各種エンドヌクレアーゼによる切断点
地図： 両プラスミドを各種エンドヌクレアーゼによ
り切断後、0.7％、１％または1.5％アガロース
ゲル電気泳動にかけることにより、それぞれ第
１図ａ，ｂに示す切断点地図を作成することが
できる。 (5) pTB19（Kmr，Tcr）またはpTB53（Kmr，
Tcr）による好熱性細菌バシラス・ステアロサ
ーモフライス（Bacillus
stearothermophilus）の形質転換： 好熱性細菌の代表例としてカナマイシン感受
性（Kms）のバシラス・ステアロサーモフラ
イスATCC12980、CU12株を選び、これを
LGS培地（ペプトン１％，酵母エキス0.5％，
NaCl0.5％，グルコース0.25％，スクロース
0.15M，PH7.2）20mlに接種し、55℃で振とう
培養を行ない、対数増殖中期（OD660≒0.4）
まで生育させたのち、遠心集菌し、次に１mlの
SMM−LG培地（スクロース0.33M，マレイン
酸0.02M，MgCl20.02M，ペプトン１％，酵母
エキス0.5％，NaCl0.5％，グルコース0.25％，
PH6.5）に懸濁させる。この懸濁に対し最終濃
度が1μｇ／mlになるようにリゾチームを加え、
48℃で20分間ゆるやかに振とうしたのち、5000
×ｇ，７分間遠心して生じたプロトプラストを
分離する。これを１mlのSMM−LG培地で洗
浄、さらに遠心分離（5000×ｇ，７分）を行な
つたのち再度１mlのSMM−LG培地に懸濁さ
せ、これをプロトプラスト懸濁液として使用す
る。 次に上記(1)(3)において得られるpTB19およ
びpTB53をそれぞれ含むプラスミドDNA溶液
各50μとSMM液（スクロース0.33M，マレイ
ン酸0.02M，MgCl20.02M，PH6.5）の２倍濃度
液50μとの混液に対し、上述のプロトプラス
ト懸濁液を加え、その後直ちに、あらかじめ48
℃に保温しておいたポリエチレングリコール
（PEG）6000液（SMM液中の40％溶液）を1.5
ml添加する。これをゆるやかに混合して、プロ
トプラストを凝集させるとともにプラスミド
DNAのプロトプラスト内への移入を誘起させ
る。PEG添加２分後に、５mlのSMM−LG培
地を加え、混和後、5000×ｇ，７分間遠心し
て、プロトプラストを分離する。 これを牛血清アルブミン（BSA）0.01％を含
むSMM−LG培地１mlに懸濁させ、更に90分
間、48℃でゆるやかに振とうしてプラスミド上
にコードされている薬剤耐性遺伝子の発現を促
進させる。 このプロトプラスト懸濁液100μを、カナ
マイシン20μｇ／mlを含有する重層用再生寒天
培地（寒天0.6％，バクト・トリプトン１％，
酵母エキス0.5％，NaCl0.5％，カザミノ酸0.01
％，KH2PO40.15％，K2HPO40.35％，グルコ
ース0.5％，MgCl20.02M，スクロース0.02M，
BSA0.02％，PH7.3）のあらかじめ50℃に保温
しておいたもの３mlと混合し、先に準備してお
いたカナマイシン20μｇ／mlを含む下層用再生
培地（重層用寒天培地の寒天濃度のみを２％に
変えたもの）25mlの上に一様に広げて固化させ
る。このプレートを５日〜７日間48℃に保温す
ると多数のコロニーが出現するので、これを鈎
菌し、各クローンを純粋に分離する。得られる
形質転換株はいずれも用いた受容菌とは異なつ
て、カナマイシン耐性（Kmr）であり、この
形質を担うプラスミドpTB19またはpTB53を
菌体内に保持している。 またこれらの形質転換株から前記(1)の方法に
従つてpTB19およびpTB53をそれぞれ調製・
確認することができる。 さらにpTB19を保持する形質転換株をカナ
マイシン（5μｇ／ml）またはテトラサイクリ
ン（5μｇ／ml）を含むLGS培地にて、55℃，
60℃および65℃のいずれの温度で培養しても増
殖可能である。このことは、これらの薬剤耐性
遺伝子が転換株内で充分に、その形質を発現し
ていることを意味する。 (6) バシラス・ステアロサーモフイラスの形質転
換の他の例： 前記(5)に記載のpTB19（Kmr，Tcr）または
pTB53（Kmr，Tcr）によるバシラス・ステア
ロサーモフイラスの形質転換法は、これらのプ
ラスミドによる形質転換法に限らず、これらの
プラスミドから誘導した、所望の遺伝子DNA
が組み込まれた他のプラスミドによる形質転換
にも利用することができる。 その一例としてペニシリナーゼ産生遺伝子を
担つたプラスミドpTTB32による形質転換法を
次に記述する。 (i) ペリシリナーゼ生産遺伝情報を有する染色
体体DNAの調製： ペニシリナーゼの構成性生産菌である、バ
シラス・ライケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）ATCC9945A CO1株を１
のＬ培地中37℃で約５時間振とう培養して対
数増殖期の菌体を集め、SSC液
（NaCl0.15M，クエン酸ナトリウム0.015M，
PH７）で洗浄し、これを20％のスクロースを
含むTEバツフアー（トリスヒドロキシルア
ミノメタン―HCl0.02M，EDTA Na21mM，
PH7.6）10mlに懸濁させる。この懸濁液中に
10mg／mlのリゾチームを添加し、37℃で10分
間保つたのち、１％のラウロイル・ザルコシ
レート（lauroyl sarcosylate）液（0.1M
EDTA−Na2液に溶解させたもの）20mlを加
え、更にプロナーゼ（10mg／ml）も添加し、
50℃に液が透明になるまで保つ。この液に
CsCl−EdBr平衡密度超遠心法を施し、染色
体DNAを分画採取する。このDNA画分を集
め、ブタノールを添加してEdBrを抽出除去
したのち、TSバツフアー（トリスヒドロキ
シルアミン0.02M，NaCl0.15M，PH8.0）中
で透析し、染色体DNA溶液とする。 (ii) ベクターDNAの調製： ペニシリナーゼ生産を支配する遺伝子領域
をクローニングするため、その担体（ベクタ
ー）となるテトラサイクリン耐性（Tcr）プ
ラスミドの一種pMB9（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ社より入手可能）の
DNAを次のようにして調整する。 先ず、pMB9をプラスミドとして保有する
エシエリキア・コリ（E.Coli）C600株を１
のグルコース・カザミノ酸・無機塩培地（グ
ルコース0.2％，NH4Cl0.1％，K2HPO40.6
％，KH2PO40.3％，NaCl0.5％，MgSO4・
7H2O0.01％，CaCl20.0015％，カザミノ酸２
％，PH7.2）に接種し、37℃で３時間振とう
培養したのち170μｇ／mlになるようにクロ
ラムフエニコールを添加し、更に37℃で16時
間培養を継続する。この操作によりpMB9プ
ラスミドの細胞内含量が高められる。培養
後、集菌し、リゾチーム・SDS処理により溶
菌させ、以後(1)に記載の手法に従つてプラス
ミドpMB9のDNA溶液を得る。 (iii) 染色体DNA断片のベクターへの挿入： (i)記載の方法によつて得られる染色体
DNA溶液および(ii)記載の方法によつて得ら
れるプラスミドpMB9，DNA溶液各10μｇを
とり、そのおのおのにEcoR1を37℃で１時間
作用させてDNA鎖を切断する。65℃，５分
間の熱処理後、両反応液を混合し、ATP，
ジチオスレイトール，MgCl2存在のもとで、
T4DNAリガーゼにより10℃，24時間にわた
り、DNA鎖の連結反応を行なう。 これに65℃，５分間の熱処理を施したの
ち、反応液に２倍容のエタノールを加えて連
絡反応終了後のDNAを沈澱採取する。 (iv) ペニシリナーゼ遺伝子を担つたプラスミド
によるエシエリキア・コリの形質転換： テトラサイクリン感受性（Tcs）でアンピ
シリン感受性（Aps）のエシエリキヤ・コリ
C600株をＬ培地10mlに接種し、37℃で振と
う培養を行ない対数増殖中期まで生育させた
のち、集菌し、これを永冷下0.1M MgCl2，
0.1M CaCl2各溶液に順次懸濁させることに
よつて、いわゆるコンピテント細胞を調製す
る。この細胞懸濁液に(iii)記載の手法で得られ
るDNAの溶解液を加えて氷冷下30分間反応
させ、直ちに42℃，２分間の熱処理をしたの
ち、再び氷冷下に30分間放置してDNAを細
胞内に取り込ませる。 次に、この細胞懸濁液の一定量を新たなＬ
培地に接種し、37℃，２時間の振とう培養を
行なつたのち、集菌・洗浄し、再懸濁液をテ
トラサイクリン20μｇ／mlおよびアンピシリ
ン20μｇ／mlを含有するＬ寒天培地（寒天1.5
％）に広げ、37℃に保温する。２日後に生じ
るコロニーより鈎菌し、各クローンを純粋に
分離する。得られる形質転換株は、いずれも
受容菌と異なり、テトラサイクリン，アンピ
シリンの両薬剤に耐性であるとともに、ペニ
シリナーゼを生産する。 この形質転換株に対し、(ii)記載の操作を施
してプラスミドDNAを調製し、これにEco
R1を37℃で１時間作用させてDNA鎖を切断
する。このDNA溶液を１％アガロースゲル
電気泳動にかけると、ベクター・プラスミド
pMB9（3.5Mdal）に新たな2.8MdalのDNA
断片が組み込まれていることが確認できる。
このことはペニシリナーゼ生産を支配する遺
伝子領域が、2.8MdalのDNA断片上にあり、
これがベクター・プラスミドpMB9に組み込
まれて新規プラスミドpTTE11が生じること
を裏付けるものである。 (v) ペニシリナーゼ生産遺伝子を担つたプラス
ミドによるバシラス・サチリスの形質転換： 先ず、前記(iv)記載の方法に従つて得られる
エシエリキア・コリの形質転換株より、ペニ
シリナーゼ産生遺伝子を担つたプラスミド
pTTE11を公知方法によつて調製する。また
前記(3)によつてpTB53（Kmr，Tcr）を調製
する。 これらのプラスミドpTB53および
pTTE11の各10μｇをとり、おのおのにEco
R1を37℃で１時間作用させてDNA鎖を切断
する。 65℃，５分間の熱処理によつてEcoR1を失
活させたのち、両反応液を混合し、T4DNA
リガーゼにより10℃，24時間にわたつて
DNA鎖の連結反応を行う。65℃，５分間の
熱処理ののち、反応液に２倍容量のエタノー
ルを加えてDNAを沈澱採取し、それをSSC
液に溶解さDNA溶液とする。このDNAを供
与DNAとし、バシラス・サチリス168株由来
の株を受容菌として、前記(2)記載と類似の方
法で形質転換を行なう。 形質転換株の選択は、ペニシリナーゼ生産
活性の有無を検定して行ない、この形質転換
株（Pease+）から公知方法によつてプラス
ミドを調製し、EcoR1法によつてプラスミド
DNAを切断、アガロースゲル電気泳動にか
けると、ベクター・プラスミドpTB53
（11.2Mdal）に、プラスミドpTTE11の一部
でペニシリナーゼ生産遺伝子が含まれている
DNA断片が組み込まれていることを確認で
きる。この新規複合プラスミドをpTTB32と
命名した。 (vii) ペニシリナーゼ遺伝子を担つた複合プラス
ミドによる好熱性細菌バシラス・ステアロサ
ーモフライスの形質転換： 前記(5)と全く同様な方法で、バシラス・ス
テアロサーモフライスATCC12980Cu12株
に、上記複合プラスミドpTTB32を供与
DNAとする形質転換を行ない、対応する形
質転換株（Kmr）を得る。これには、ペニ
シリナーゼ生産能が新たに賦与されている。 (viii) 各種形質転換株によるペニシリナーゼの生
産量： ペニシリナーゼ生産菌の野生型元株である
バシラス・ライケニフオルミスATCC9945A
FD0120，その変異株でペニシリナーゼの構
成性生産菌株であり、かつ上記クローニング
実験の親株として用いるCO1株、更にペニシ
リナーゼ生産遺伝子を担つたプラスミドによ
る各種形質転換株について、そのペニシリナ
ーゼ生産量を比較すると第１表に示す結果が
得られる。 なお、ペニシリナーゼ生産量は、各菌株を
Ｌ培地に接種し、表中に示す温度で培養し、
対数増殖期後期の培養液について求めたもの
である。 【表】 参考例 (1) 潜在性プラスミドpBS02を保持する好熱性細
菌バシラス・ステアロサーモフイラスの、カナ
マイシン耐性プラスミドpUB110による形質転
換： バシラス・ステアロサーモフイラス
ATCC12980，Cu12由来のS2株からのプラスミ
ド抽出を常法（セシウム・クロライド―エチジ
ウム・ブロマイド（CsCl−EdBr）平衡密度勾
配超遠心法）に従つて行うと、分子量約19.8×
106のプラスミドが確認できる。しかし、この
プラスミドpBS02は潜在性であり、薬剤耐性な
ど選択に利用可能な情報（選択マーカー）を担
つているものではなかつた。 このため、バシラス・サチリスより抽出した
スタヒロコツカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシ
ン耐性プラスミドpUB110（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ社（Bcthesda Research
Laboratories Inc.）より入手可能）を供与
DNAとし、潜在性プラスミドpBS02を保持す
るバシラス・ステアロサーモフイラスS2株を
受容菌とする形質転換実験をプロトプラスト法
により行う。 この方法では、先ず上記S2株をLGS培地20
mlに接種し、55℃で振とう培養を行ない、対数
増殖中期（OD660≒0.4）まで生育させたのち、
遠心集菌し、次に１mlのSMM−LG培地に懸
濁させる。この懸濁液に対し最終濃度が1μ
ｇ／mlになるようにリゾチームを加え、48℃で
20分間ゆるやかに振とうしたのち、5000×ｇ，
７分間遠心して生じたプロトプラストを分離す
る。これを１mlのSMM−LG培地で洗浄、さ
らに遠心分離（5000×ｇ，７分）を行なつたの
ち、再度１mlのSMM−LG培地に懸濁させ、
これをプロトプラスト懸濁液として用いる。 次に、前記プラスミドpUB110のプラスミド
DNA溶液50μとSMM液の２倍濃度液50μ
との混液に対し、上述のプロトプラスト懸濁液
0.5mlを加え、その後直ちに、あらかじめ48℃
に保温しておいたPEG6000液（SMM液中の40
％溶液）を1.5ml添加する。これをゆるやかに
混合して、プロトプラストを凝集させるととも
に、プラスミドDNAのプロトプラスト内への
移入を誘起させる。PEG添加後２分後に、５
mlのSMM−LG培地を加え、混和後、5000×
ｇ，７分間遠心して、プロトプラストを分離す
る。 これをBSA0.1％を含有するSMM−LG培地
１mlに懸濁させ、更に90分間、48℃でゆるやか
に振とうしてプラスミド上にコードされている
薬剤耐性遺伝子の発現を促進させる。 このプロトプラスト懸濁液100μをカナマ
イシン20μｇ／mlを含有する、あらかじめ50℃
に保温しておいた重層用再生寒天培地３mlと混
合し、先に準備しておいた下層用再生培地25ml
の上に一様に広げて固化させる。このプレート
を５日〜７日間48℃に保温すると多数のコロニ
ーが出現するので、これを鈎菌し、各クローン
を純粋に分離する。 (2) 形質転換株から調製する組換えプラスミド： 上記(1)によつて得られる形質転換株から実施
例1.(1)記載の方法に従つてプラスミドの抽出・
調製を行う。得られるプラスミドについて、ア
ガロースゲル電気泳動による検定を行なうと、
カナマイシン耐性を担つたプラスミドpUB110
（3.0Mdal）と、このS2元株内にもともと保持
されていた潜在性プラスミドpBS02
（19.8Mdal）とはいずれも存在せず、代りに分
子量の大きくなつた組換えプラスミドpBSK1
（21.5Mdal）が認められる。 この新たに得られるプラスミドpBSK1を用
いてバシラス・ステアロサーモフイラスの形質
転換を、上記(1)に準じて行うと、カナマイシン
耐性となつた形質転換株が得られる。この事実
はプラスミドpBSK1がカナマイシン耐性遺伝
子をコードしていることを示している。 また、潜在性プラスミドpBS02とカナマイシ
ン耐性を担う組換えプラスミドpBSK1につい
て、実施例1.(4)に記載の方法に準じて制限エン
ドヌクレアーゼBamHIに関する切断点地図を
作成すると、それぞれ第２図ａ，ｂが得られ
る。 これにより、pBS02のBamHI処理断片
（5.6Mdal）内に、pUB110プラスミドのカナマ
イシン耐性を担う部分（1.7Mdal）が組換えに
より挿入されていることが確認される。 (3) カナマイシン耐性を担うプラスミドpUB110
およびpBSK1の好熱性細菌内での安定性： pUB110プラスミドのみを保持する好熱性細
菌バシラス・ステアロサーモフイラスS2株と
pBSK1プラスミドのみを保持する同一株につ
いて、プラスミドの安定性試験を次のようにし
て行なう。 先ず、これらの株を、カナマイシン5μｇ／
mlを含むＬ培地において、48℃で前培養したの
ち、Ｌ培地で希釈し、初発菌数約50細胞／mlに
なるようにLG培地（グルコース0.25％を含む
Ｌ培地）に接種し、48℃，55℃，60℃および65
℃で、それぞれ約20世代培養する。その後、
LG寒天培地（寒天1.5％を含むＬ培地）上でコ
ロニーを形成させ（48℃）、各コロニーをカナ
マイシン5μｇ／mlを含有するLG寒天培地に移
殖し、同培地上（48℃）での生育の有無を観察
することにより安定性を検定し、第１表に示す
結果を得る。 【表】 上表より、pUB110は60℃以上の温度で不安
定となるのに対し、pBSK1はいずれの温度
（48℃〜65℃）でも安定に維持され得るもので
あることが判る。 すなわち、前記の所期目的を達成したプラス
ミド、カナマイシン耐性を担い、高温（65℃）
に至るまで安定な組換えプラスミドpBSK1が
造成されていることが確認される。
第１図ａ，ｂは本発明実施例のベクター・プラ
スミドpTB19およびpTB53の各種制限エンドヌ
クレアーゼによる切断点地図であり、第２図ａ，
ｂはバシラス・ステアロサーモフイラスS2株に
保持されていた潜在性プラスミドpBS02およびそ
の組換えプラスミドpBSK1の制限エントヌクレ
アーゼBamHIによる切断点地図である。
スミドpTB19およびpTB53の各種制限エンドヌ
クレアーゼによる切断点地図であり、第２図ａ，
ｂはバシラス・ステアロサーモフイラスS2株に
保持されていた潜在性プラスミドpBS02およびそ
の組換えプラスミドpBSK1の制限エントヌクレ
アーゼBamHIによる切断点地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 17.2Mdalで、図に示す通りの制限酵素切断
点を有し、50℃を中心とする温度範囲でプロトプ
ラスト状態のバシラス・ステアロサーモフイラ
ス、バシラス・コアギユランスおよびバシラス・
ブレビスより選ばれたグラム陽性またはグラム染
色性不定の好熱性細菌へ移入可能、かつその中で
複製可能な有用物質生産要素であることを特徴と
するプラスミドpTB19。 ２ 11.2Mdalで、図に示す通りの制限酵素切断
点を有し、50℃を中心とする温度範囲でプロトプ
ラスト状態のバシラス・ステアロサーモフイラ
ス、バシラス・コアギユランスおよびバシラス・
ブレビスより選ばれたグラム陽性またはグラム染
色性不定の好熱性細菌へ移入可能、かつその中で
複製可能な有用物質生産要素であることを特徴と
するプラスミドpTB53。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56032810A JPS57146799A (en) | 1981-03-06 | 1981-03-06 | Vector plasmid for thermophilic bacterium |
| CA000397585A CA1206108A (en) | 1981-03-06 | 1982-03-04 | Process for transforming microorganism by means of plasmid introduction |
| GB8206511A GB2095286B (en) | 1981-03-06 | 1982-03-05 | New vectors and a process for transforming certain microorganisms |
| EP82301150A EP0060663A3 (en) | 1981-03-06 | 1982-03-05 | A process for transforming certain microorganisms, vectors and their production, and a process for producing certain substances using said vectors |
| US06/356,150 US4695546A (en) | 1981-03-06 | 1982-03-08 | Transforming Bacillus stearothermophilus with plasmid vector pTB 19 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56032810A JPS57146799A (en) | 1981-03-06 | 1981-03-06 | Vector plasmid for thermophilic bacterium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57146799A JPS57146799A (en) | 1982-09-10 |
| JPH0229315B2 true JPH0229315B2 (ja) | 1990-06-28 |
Family
ID=12369180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56032810A Granted JPS57146799A (en) | 1981-03-06 | 1981-03-06 | Vector plasmid for thermophilic bacterium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57146799A (ja) |
-
1981
- 1981-03-06 JP JP56032810A patent/JPS57146799A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57146799A (en) | 1982-09-10 |
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