JPH01304885A - 新規クローニングベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はストレプトマイセス属に属する２種の微生物即
ち、ストレプトマイセス・エスピーＳ〜５１４−１６（
ＦＥＲＭ　０Ｐ−１６１９）およびストレプトマイセス
・エスピー＾Ｔ［：Ｃ２１２７４由来の３種のプラスミ
ドｐＥＮｌｏＯ，ｐＥＮ２００．　ｐＥＮ３Ｑｏ、およ
びそれらあるいはその複製に必要な領域を含むＤＮＡ断
片と、適当な選択マーカーを含有するＤＮＡ断片とを連
結したクローニングベクターに関する。本発明のプラス
ミドは、ストレプトマイセス・サンナネンシス（ＳＬｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　５ａｎｎａｎｅｎｓｉｓ）菌種中
で自律複製できるので、ストレプトマイセス属菌種にお
ける新たな宿主−ベクター系の確立が期待される。

従来の技術 ストレプトマイセス属菌種における遺伝子組換え技術は
、近年急速に発展している〔に、Ｆ、Ｃｈａｔｅｒら；
カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジイ・
アンド・イムノロシイ（［：ｕｒｒｅｎｔ　ｔｏｐｉｃ
ｓｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ）、　９６　　＋６９−９５（１９８２）
　’］　。

しかし、これまで報告され、繁用されているベクター、
たとえばρＩＪ４１（少コピー数ベクター）［Ｃ０Ｊ、
　Ｔｈｏｍｐｓｏｎら；ジーン（Ｇｅｎｅ）　２０　、
５ｌ−６２（１９８２）］は宿主域が極端にせまく、ま
た多コピー数ベクターｐｌＪ７０２　［Ｅ、にａｔｓ　
；ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジ
イ（Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　　１２９．２７０３−２７１
４（１９８３）　］は比較的広宿主域と言われているが
、ストレプトマイセス・サンナネンシスのように、この
ベクターの導入が不可能な放線菌も多く、また構造的に
不安定であることなどいくつかの問題をかかえている。

発明が解決しようとする課題 ストレプトマイセス・サンナネンシスは、抗生物質サン
ナマイシン（Ｓａｎｎａｍｙｃｉｎ）　Ｃジャーナル・
オブ・アンチバイオテ４ックス（Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｓ）３２（１０）、　１０６１．　（１９７９）］
生産菌として知られている。

従来、放線菌の遺伝子組換え技術の進展にともない、種
々の抗生物質の生合成遺伝子がクローン化され、遺伝子
レベルでの解析が進んでいる。しかし、サンナマイシン
生産菌であるストレプトマイセス・サンナネンシスで自
律複製可能なベクターが開発されていないため、サンナ
マイシンの生合成遺伝子のクローン化、解析は進んでい
ない。

サンナマイシンの生合成系を解明するために、ストレプ
トマイセス・サンナネンシスの宿主−ベクター系の開発
が望まれている。

また、これを可能にする新規なベクターは、従来用いら
れているベクターの宿主域を越えたものになるため、広
くストレプトマイセス属菌種の宿主−ベクター系の開発
に用いつると期待できる。

課題を解決するための手段 本発明者は、サンナマイシンの生合成経路を解明し、該
抗生物質の生産に関与する遺伝子をクローニングするた
めに、ストレプトマイセス・サンナネンシスで自律複製
可能なベクターを種々検討した。その結果、ストレプト
マイセス属に属する２！１の微生物より、ストレプトマ
イセス・サンナネンシス菌種中で自律複製可能な３種の
プラスミドを得た。さらに、該プラスミドにチオペプシ
ン耐性を発現するＤＮＡ断片を組み込むことにより、ベ
クターマーカーとしてチオペプシン耐性を発現するクロ
ーニングベクターを構築した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、ストレプトマイセス属菌由来のプラスミドで
、ストレプトマイセス・サンナネンシス菌種中で自律複
製可能なプラスミドを提供する。

具体的には、ストレプトマイセス・エスピーＳ−’５１
４−１６（ＦεＩＩＭ　ＢＰ−１６１９＞由来のプラス
ミドｐＩ３Ｎ１００゜１ＢＮ２００およびストレプトマ
イセス・エスピー＾ＴＣＣ２１２７４由来のプラスミド
ｐＢＮ３００があげられる。これらのプラスミドは、プ
ラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）　１２　。

１９（１９８４）に記載の方法で分離することができる
。

プラスミドｐ［！Ｎ　１００は、大きさが４．６キロベ
ース（にｂ）の環状ＤＮＡであり、第１表に示すような
制限酵素に対する感受性部位を有し、［ｌａｍＨ［、Ｃ
Ｊ！ａ［。

ＨｉｎｄＩ［１右よびＰｓｔ［によって切断されない。

ｐｉ！Ｎ１００は、−細自当りのコピー数が約１６０コ
ピーのプラスミドである。

第１表　ｐＢＮｌｏｏの制限酵素による切断特性制限酵
素　切断箇所　生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｂｃｊ
！　Ｉ　　　　　３　　　　３．１．１．２．０．３Ｂ
ｇＩ１１１　　　　１　　　　４．６ＢｓｔＥ［Ｉ　　
　　２　　　　４．３．０．３ＥｃｏＲＩ　　　　　１
　　　　４．６にｐｎｌ　　　　　３　　　　２．１．
２．Ｇ、　０．５Ｉ’ｖｕ　ＩＴ　　　　　１　　　　
４．６Ｓａｃ　１　　　　１　　　　４．６ ＳａｆＧＩ　　　　４　　　　２，７．１，１．０．５
．０．４Ｓｓｔｌｌ　　　　　ｌ’　　　４．６Ｘｂａ
　Ｉ　　　　　ｌ　　　　　４．６ブラスミドＰＥＮ２
００は、大きさが１０．７Ｋｂの環状ＤＮＡであり、第
２表に示すような制限酵素に対する感受性部位を有し、
ＩＪａＩ、旧ｎｄｌＩｌおよびｐｓｔ　Ｉによって切断
されない。ρ［ＥＮ２００は、−細胞当りのコピー数が
約４０コピーのプラスミドである。

第２表　ρ１ｉＮ２００の制限酵素による切断特性［］
ａｍＨ１４５，８，３，１，ＩＪ、　０．６ＢｃＩ！Ｉ
　　　　　３　　　　４．５．４．１．２．１ＢｇβＩ
Ｉ　　　　　２　　　　８．２，２．５ＢｓｔＥ■　　
　　３　　　　７，９．１．９．０．９ＥｃｏＲｌ　　
　　　１　　　　１Ｇ、　７Ｋｐｎｌ　　　　　３　　
　　９．４．０．９．０．４Ｍβｕｌ　　　　　３　　
　　５．６．３．１．２．０Ｐｖｕ１１　　　　３　　
　　９．９．０．６．０．２Ｓａｃ　ｌ　　　　　１　
　　　１０．７プラスミドρＥＮ３００は、大きさが８
．７Ｋｂの環状ＤＮＡであり、第３表に示すような制限
酵素に対する感受性部位を有し、ＢｃβＩ、ＢにβＩＩ
、　（Ｊ！ａｌ。

［１ｃｏＲＩ　、　ＨｉｎｄＩＩＩ；　Ｐｓｔ　Ｉおよ
びＰｖｕ　ＩＩによって切断されない。ρ［ＥＮ３００
は、−細胞当りのコピー数が約１０コピーのプラスミド
である。

第３表　ρＥＮ３００の制限酵素による切断特性制限酵
素　切断箇所　生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）ｎａｍ
ＨＩ　　　　ｌ　　　　　８．３Ｋｐｎ　１　　　　１
　　　　８．３ １．１！ｔ＋Ｉ　　　　４　　　　４．２．２．２．１
．２．０．７０．１ Ｓｍａ　！　　　　　１　　　　８．３上記の３種のプ
ラスミドは、ストレプトマイセス・サンナネジシス菌種
中で自律複製可能なプラスミドであるが、該プラスミド
の存在を識別しうる適当なベクターマーカーを有してい
ない。ストレプトマイセス・サンナネジシス菌種におけ
る宿主−ベクター系を確立するためには、その存在を識
別しうる適当なベクターマーカーを有するクローニング
ベクターの方が望ましい。このようなりローニングベク
ターは、」１記のプラスミドの自律複製能を利用し、適
当なベクターマーカーを挿入することにより得ることが
できる。

ベクターマーカーとしては、ストレプトマイセス・サン
ナネジシス菌種中で迫伝形質が発現し、宿主にその性質
を付与できるものであればよい。

例えば、ストレプトマイシン、ネオマイシン、チオペプ
チンなどに対する耐性遺伝子などがあげられる。また、
宿主が栄養要求性変異株であれば、その要求性を相補す
るような遺伝子でもよい。

ストレプトマイセス・サンナネジシス菌種中で自律複製
可能で、ベクターの存在を識別しうるベクターマーカー
を有する組換え体クローニングベクターとしては、上記
のρＢＮ１００．　ｐＥＮ２００またはρＩ’：Ｎ３０
０の自律複製能を利用し、チオペプチン耐性遺伝子をベ
クターマーカーとして挿入した組換え体クローニングベ
クターｐｆＥＮ１０１．　ｐＥＮ２０１．　ｐＥＮ３０
１があげられる。該プラスミドは、ｐＢＮＩｏｏ、　ｐ
ＥＮ２００またはｐＢＮ３００の自律複製能を欠損しな
いような制限酵素感受性部位で切断し、そこへｐｌＪ７
０２　［ジャーナル・才ブ・ジェネラル・マイクロバイ
オロジイ（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　１２
９．２７０３−２７１４　（１９８３））由来のチオベ
プチン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入することによ
り構築される。

プラスミドｐ［１Ｎ１０１は、ｐＥＮｌｏｏを制限酵素
Ｂｃｊ！１で部分消化し、ρＩＪ７０２由来のチオペブ
チン耐性遺伝子を挿入することにより構築した大きさが
５．７Ｋｂの環状ＤＮＡであり、第４表に示すような制
限酵素に対する感受性部位を有する。また、ＢａｍＨＩ
　。

１１ｉｎｄ、［ＩＩおよびＰｓｔ　Ｉによって切断され
ない。

Ｂｃｊ！　Ｉ　　　　　４　　　　３．１．１．２．１
．１．　Ｏ１３Ｂｇｉ’■　　　　１５．７ ＢｓｔεＩＩ　　　　　２　　　　５．４．０．３ＩＪ
ａｌ　　　　　１　　　　５，７ ＥｃｏＲＩ　　　　　１　　　　５．７にｐｎｌ　　　
　　３　　　　３．２．２．０．０．５ＰｖｕＩＩ　　
　　　２　　　　３．８．１．９Ｓａｃ　！　　　　　
１　　　　５．７ＳａｉＧＩ　　　　５　　　　２．７
．１．７．１．４．０．５．０．４ＳｓｔＩＩ　　　　
　２　　　　４．９．０．８プラスミドｐ［ｉＮ２旧は
、ｐＥｉＮ２００を制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化し、
ρ１Ｊ７０２由来のチオペブチン耐性遺伝子を挿入する
ことにより構築した大きさが１１．８にｂの環状ＤＮＡ
であり、第５表に示すような制限酵素に対する感受性部
位を有する。また、Ｈｉｎｄ［ｎおよびＰｓｔ　［によ
って切断されない。

第５表　ρＢＮ２０１の制限酵素による切断特性制限酵
素　切断箇所　生じるＯＮ＾断片の長さ（Ｋｂ）Ｂａｍ
ｌｌｌ　　　　　４　　　　６．８．３．１．１．３．
０．６Ｂｃｊ！　１　　　　４　　　　４．５．４．１
．２．１．１．ＩＢｇＪ！■　　　　２　　　　８．２
．３．６０ｓｔＢＩＩ　　　　　　　　　３　　、　　
　　　　９．０．　１．９．　０．９Ｃｊ！ａｌ　　　
　　ｌ　　　　　１１．８εｃｏＲＩ　　　　　ｌ　　
　　　１１．８Ｋｐｎｌ　　　　　３　　　　９．４．
１．５．０．９ＭＪ！ｕｌ　　　　　３　　　　５．６
．４．２．２．０ＰｖｕＩｌ　　　　　４　　　　７．
６．３，４．０．６．０．２Ｓａｃｌ　　　　　１　　
　　１１．８Ｓｍａ　Ｉ　　　　　４　　　　３．８．
３．３．２．６．２．１プラスミドρεＮ３０１は、ｐ
Ｈ１Ｎ３００を制限酵！ＢａｍＨＩで切断し、ｐｌＪ７
０２由来のチオペブチン耐性遺伝子を挿入することによ
り構築した大きさが１０．　ＩＫｂの環状ＤＮＡであり
、第６表に示すような制限酵素に対する感受性部位を有
する。また、１３ｃｊ！Ｉ、ＢｇＡ’Ｕ　、　ＢｃｏＲ
Ｉ　、　１ｌｉｎｄ’ｌ［ＩおよびＰｓｔ　［ｌこよっ
て切断されない。

第６表　ｐεＮ３０１の制限酵素による切断特性Ｒａｍ
ｔｌｌ　　　　　２　　　　８．３．　１．８ＣＩｌａ
ｌ　　　　　１　　　　１０．１Ｋｐｎ　Ｉ　　　　　
ｌ　　　　　１０．　ＩＭＪｕｌ　　　　　５　　　　
３．２．２．８．２．２．１．２．０．７ＰｖｕＩＩ　
　　　　１　　　　１０．１０．２．０．２．０．１．
０．１ Ｓｍａｌ　　　　　２　　　　６．４．３．７上記の３
種°のプラスミド′は、ストレプトマイセス・サンナネ
ンシス菌種中で自律複製可能なプラスミドであり、宿主
に導入することにより、チオペプチン耐性を発現するの
で、該ベクターの存在が容易に識別できる。

ｐＥＮｌｏｌ、　ｐＥＮ２０１およびｐＢＮ３０１はそ
れぞれストレプトマイセス・リビダンスＴに２３に導入
し、工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和
６２年１２月１５日イ寸でそれぞれストレプトマイセス
・リビダンスεＮ−１０１（ＦεＲＭ　０Ｐ−１６２０
）、ストレプトマイセス・リビダンスεＮ−２０１（Ｆ
ＥＲ３１０Ｐ−１６２１）、ストレプトマイセス・リビ
ダンスＥ！ＮＮ−３０１（ＦＥＲ０Ｐ−１６２２）とし
て寄託されている。

本発明のプラスミドは、ストレプトマイセス・サンナネ
ンシス菌種の他に、下記の放線菌にも導入可能である。

（Ｓ、　ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ） ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ、　ｇｒｉｓｅｕ
ｓ）ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄ
ａｎｓ）ストレプトマイセス・レティクリ（Ｓ、　ｒｅ
ｔｉｃｕｒｉ）ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓ、
　ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）ば、より有効である。このよう
な制限解除様は、Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａらの方法〔マイ
クロバイオロジカル・レビｓ−（！Ｊｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ）、　４４　、２０６（＋
９８０）：］に従って得ることができる。

上記のプラスミドを宿主微生物に導入するには、に、　
Ｆ、　Ｃｈａ’ｔｅｒらの方法〔カレント・トピックス
・イン・マイクロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ
　（（：ｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　ｌ
Ｊｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ）９６、６９−９５　（１９８２）］に従い、
プロトプラストを調製してプラスミドを導入する（詳し
くは実施例に示す）。

以下に実施例を示す。

実施例１．・ プラスミドｐＥＮ　１００．ρ１ＥＮ２００およびρＥ
Ｎ３００の採取（＋）　　培　　養 ストレプトマイセス・エスピー＾Ｔ（：Ｃ２１２７４ｔ
たはストレプトマイセス・エスピーＳ５−５１４−１６
（ＦＥＲ０Ｐ−１６１９）を４ｍｌのＹ　Ｅ　Ｍ　Ｅ培
地〔酵母エキス（デイフコ社！ａ）３．０ｇ、バタトペ
ブトン　（デイフコ社ａ！り　５．０ｇ、　麦芽エキス
　（デイフコ社製）３．０ｇおよびグルコース１０．０
ｇを純水ｉｆに溶解してρ１４７．２に調整し、１２０
℃で２０分間高圧滅菌した培地〕に接種して、３０℃で
２〜３日振盪培養した。次いでその全量を５００ｍ１の
ＳにＮｏ。

２培地〔スタビロースＫ（松谷化学工業社製）２０ｇ。

グルコース５ｇ、酵母エキス　（大五栄養化学社！！り
　５ｇ、ペプトン（極東製薬社製）３ｇ、に１１２ＰＯ
４０，２ｇおよびＭｇ５Ｌ・７Ｈ２００，６ｇを純水１
１に含み、ｐＨ７，６に調整し１２０℃で２０分間高圧
滅菌した培地〕に接種して、さらに３０℃で２〜３日間
振盪培養し、培養液を得た。

（２）　　プラスミドの単離 上記のようにして得た培養液を、遠心分離（１０分間、
４℃、１２．００Ｏｒｐｍ）　して細胞を回収した。

５ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム（生化学工業社製）を含
む４０〜５０ｍ１のリティック溶液［１０，３％シュー
クロース、　２５ｍ１Ｊ）リス　（ヒドロキシメチル）
アミノメタン（以下トリスと略ず）−塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）、　２５ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリ
ウム（ＨＯＴ＾）〕を加え、３７℃で３０分間インキュ
ベーションした後、２％のドデシル硫酸ナトリウムを含
有する０、３規定の水酸化す）　＋７ウム液３０ｍ１を
加え、室温で１０分間放置した。次に７５℃で１０分間
加温し、水槽に浸して冷却後、４分の３容のフェノール
・クロロホルムＣ５００ｇのフェノールと５００ｍ１の
クロロホルムおよび８００ｍｇの８−ハイドロキシキノ
リン　（東京化成工業社製）をよく混合後、２００ｍ１
の脱イオン水を加えてよく振って得た下層を用いる〕を
加えて激しく３０秒間攪拌した。遠心分離（１０分間、
１５℃、　１２．０００ｒｐｍ）によって得られる上層
部分を採取し、その１０分の１容量の３１４酢酸ナトリ
ウム溶液を加え、続い−ご２％のトライトンｘ１００を
含む等量のイソプロピルアルコールを加え、よく混ぜ、
室温で３０分間放置後、４℃、　８．００Ｏｒｐｍで５
分間遠心した。

得られるベレットをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ　）　’Ｊス
ス−酸緩衝液（ｐＨ８，０）、　１ｍＭ　ＥＤＴ＾１２
０ｍ１に溶解し、それに８０℃で１０分間熱処理したＲ
Ｎ＾分解酵素（リボヌクレアーゼへタイプ１人、シグマ
社製）を終濃度２０■／ｍｌになるように加えて３７℃
で３０分間インキュベーションした。次いで２ｍｌの３
Ｍ酢酸ナトリウムと、２０ｍ１のイソプロピルアルコー
ルを加えて混合後、４℃に３０分間放置して冷却遠心分
離（５分間、４℃、　８．　ＯＯＯｒｐｍ＞を行いペレ
ツトを得た。これをＴＥ緩衝液に溶解し、さらに臭化エ
チジウムを、終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌになるように加
えた溶液８ｍｌに、８．００ｇの塩化セシウムを加えて
１０５，０００　Ｘｇ、　　２０℃で４０時間遠心した
。

この密度勾配遠心により、共有結合で得られた環状ＤＮ
Ａは、紫外線ランプを照射することによって蛍光を発す
る特異的なバンドとして検出された。注射針を使ってこ
のバンドを取り出し、ｌｌ緩衝液で飽和したイソアミル
アルコールと共に数回振ることによって文化エチジウム
を除去した後、３倍容量のＴＥ緩衝液を加え、次いでそ
の１０分の１容吊の３Ｍ１Ｗ：ｌ’ｉ！す）　ＩＪウム
と、等容量のイソプロピルアルコールを混合して、水冷
下３０分間放置した。４℃で５分間、１２．００Ｏｒｐ
ｍ遠心してペレットを回収し、それをさらに冷７０％エ
タノールで洗浄して、真空下乾煙した。０．３ｍ１のＴ
Ｅ緩衝液に溶解して一２０℃で保存した。この操作によ
ってｐεＮ１００が２００〜３００ｕｇ、　ｐＥＮ２０
０が１００〜１５０μｇおよびρＥＮ３００が５０〜６
０μｇ得られた。

実施例２゜ （１）　　ｐｌＪ７０２からのチオペプチン耐性遺伝子
を含むＤＮＡ断片の取得 実施例１と同様の方法で調製したρ１Ｊ７０２６．５Ｍ
ｇをＢｃｌｌで完全消化〔反応液容量３０ｄ、　Ｍ緩衝
液使用、５０℃で２時間反応、Ｍ緩衝液の組成について
は、「マニュアル　フォー　ジェネティック　エンジニ
アリング」（コールド　スプリング　ハーバ−ラボトリ
ー）　ｐ２２８　（１９８０）による。コし、フェノー
ル・クロロホル！・を等遣加えて、３０秒間激しく攪拌
し、５分間、！５〜２０℃、　１２．　ＯＱＯｒｐｍで
遠心した。得られた上清をさらに同様の操作を行い同様
に上清を採取した。

（２）　　クローニングベクターｐＥＮ１０１の構築実
施例１で得られたρεＮＩＱＯ１，ｂｇを制限酵素口ｃ
Ｒｔ　　Ｏ，５単位を含む５０ｄの反応液（ｌｌ緩衝液
を使用）に溶解し、３７℃で１０分間反応して部分消化
後、０．５ＭのＢＵＴ＾を加えて反応を停止した。これ
に５０Ｍのフェノール・クロロホルムを加えて、３０秒
間激しく振盪した後、１５〜２０℃で５分間、１２．０
０Ｏｒｐｍで遠心して上清を１）だ。５ＩＬ１の一酢酸
ナトリウムおよび５５ｍのイソプロピルアルコールを加
えて、水冷下３０分間放置した後、４℃、５分間、　１
２．００Ｏｒｐｍで遠心してＤＮＡペレットを得た。こ
れに脱イオン水を加えて９０頭とし、１０−のＩＭ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）を加え、次いで１．５単
位のアルカリ性フｔスファターゼ（ベーリンガー社製１
分子生物学用）を加えて、３７℃で４５分間インキコベ
ートした。　１００ｍのフェノール・クロロホルムを加
えて３０秒間激しく攪拌した後、１５〜２０℃、５分間
、　１２．００Ｏｒｐｍで遠心し、上清を得た。この操
作をもう一度行った上清と、（１）で得たチオペブチン
耐性遺伝子を含むＤ　Ｎ　Ａ断片の上清を混合し、さら
に１０分の１容量の３Ｍ酢酸す）　ＩＪウムと等容量の
イソプロピルアルコールを加え混合し、水冷下３０分間
放置した。再び４℃、５分間、　１２．００Ｏｒρｍで
遠心して得られるペレットを冷７０％エタノールで洗浄
９、真空乾燥した。これに２０４のライゲーション緩衝
液Ｃ６，６ｍＭ’塩化マグネシウム、　　ｌｏｍＭジチ
オスライトール（牛丼化学薬品社製）および０．８ｍＭ
アデノシン）　ＩＪフォスフェート　（シグマ社５！ｌ
）を含有する６６ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６
）：］を加え、さらにＴ４ライゲース　（ベーリンガー
社製）を１単位加えて、１５℃で一晩インキユベートし
た。

この反応液に、８０４のＰ−メディウ１４〔シュークロ
ースｌＯ，３ｇ、　Ｋ２ＳＯ４２５ｍｇ、　ＭｇＣｊ！
　２・６１１２０２０３　ｍｇおよび微徹金属元素液０
．２ｍｌを脱イオン水と混合して９０ｍ１とし、これに
ｌＯｍ　Ｉの０．２５！Ｊ　ＴＥＳ　［Ｎ−）リス（ヒ
ドロキシメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン
酸〕緩衝液（ｐ１１’　　７．２）、０．５ｍｌの５Ｍ
塩化カルシウム、　　１ｍｌの０．５％ＫＨ，Ｐ口、を
加えたもの。いずれの溶液も高圧滅菌しておく；以下Ｐ
−溶液という。］を加え、これにに、　Ｆ、　Ｃｈａｔ
ｅｒらの方法〔カレント・トピックス・イン・マイクＰ
バイオロジイ・アンド・イトノロシイ　９６．．６９−
９５　（１９８２）］によって得たストレプトマイセス
・リビダンスＴＫ−２３株のプロトプラスト懸濁液５０
ｍを加え、静かに混合後、１分間室温で放置した。６０
０−のＴ−メディウム〔Ｐ−溶液の中に２５％容量のポ
リエチレングリコール１０００　（牛丼化学社：！Ａ）
を、混合したもの；以下Ｔ−溶液という〕を加えて攪拌
後、Ｐ−溶液で１０〜１０００倍に希釈した。

この希釈液１００ρをＲ５再生寒天培地〔シュークロー
ス　１０３ｇ、　Ｋ２Ｓ０１０．２５ｇ、　Ｍｇ［Ｒ２
・ｆｉ　ｆｌ　−０１０，１２ｇ、　グルコースｌｏｇ
、カザミノ酸（デイフコ社！！り　Ｉｇ、酵母エキス　
（デイフコ社製）５ｇ、微量金１４元素液２ｍｌ、　Ｔ
ＢＳ　５．７３ｇ。

水酸化ナトリウム２．５ｇを脱イオン水でＩｌとし、ｐ
Ｈ７，２に調整した。これを５等分し、４．４ｇのバタ
トアガー（デイフコ社製）を加え高圧滅菌する。これら
の１つに、３ｍｌの２０％グルタミン酸ナトリウｌ、溶
液３ｍｌの２％ＮａＮＬおよび０．８ｍｌの５１Ｊ　Ｃ
ａＣＲ２を加え、その２０ｍ１ずつをプレートにまき、
１時間半乾燥させ、作製したもの〕に塗布した。３０℃
で１５時間培養した後、あらかじめ４２℃に保っておい
た抗生物質チオペブチンを０．５ｍｇ　／　ｍ　ｌのく
度で含有する２、５ｍｌの軟寒天培地Ｃｏｇのニュート
リエンドブロス　（デイ７コ社５りと５ｇのバタトアガ
ーを１ｆ！の脱イオン水と共に高圧滅菌したもの〕を重
層し、さら３０℃で３〜４日間培養した。再生してきた
コロニーを、濃度２０μｇ／ｍｌのチオペブチンを含有
するＲ５再生寒天培地に移し、３０″Ｃ：で３〜４日間
、さらに培養した。生育してきたコロニーは、チオペプ
チン耐性遺伝子を有する組換え体プラスミドを保持して
いると考えられ、このプラスミドを実施例１に示した方
法で採取し、プラスミドｐＥＮｌｏｌと命名した。

（３）　　クローニングベクターｐＢＮ２０１の構築実
施例１で得られたｐＥＮ２００１．５■を反応液（ｉ、
（緩衝液を使用）５０ｕσ中で、制限酵ｆｆｉＤａｍｌ
ｌ１０．５単位と共に３７℃、１０分間インキュベート
し部分消化して、５Ｉの０．５Ｍ　ＥＤＴＡで反応を停
止させた。これに５０μＱのフェノール・クロロホルム
を加え、３０秒間激しく振盪した後、５分間、１５℃、
　１２．　ＯＯＯｒｐｍで遠心し上清を得た。

これに脱イオン水を加えて９０ｕＱとし、さらに１０ρ
のＩＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋　８．６）と、１．
５単位のアリカリ性フォスファターゼを加えて、３７℃
で４５分間インキュベートした。これに実施例２の（１
）で得たチオペブチン耐性遺伝子を含むＢｃβ［ＤＮＡ
断片と実施例２の（２）と同様の方法で結合させ、スト
レプトマイセス・リビダンスＴＫ２３を形質転換した。

得られた形質転換株の保有するプラスミドを単離し、プ
ラスミドｐＥＮ２旧と命名した。

（・１）　　クローニングベクターρＥＮ３０１の構築
実施例１で得られたｐＥＮ３００１．５μｇを５０頭の
反応液中（Ｉｌｌ緩衝液を使用）４単位の制限酵素Ｂａ
ｍ１ｌ　Ｉで３７℃、　２時間インキュベートし、完全
消化した。これにフェノール・クロロホルム５０頭を加
え激しり３０秒攪拌し、５分間、１５℃、１２．００Ｏ
ｒｐｍで遠心し上清を得た。再びフェノール・クロロホ
ルムを加え、同じ操作をして上清を得た。実施例２の（
２）に示した方法と同様の（１作を行い、得られた形質
転換株からプラスミドを単離し、プラスミド　ｐＥＮ３
旧と命名した。

実施例３゜ 実施例１および２で得られたプラスミドｐＥＮ１００゜
ＰＥＮ２００．ρＢ１１３００．ρεＮｌ０Ｉ、　ｐＥ
Ｎ２旧および　ρＥＮ３０１をそれぞれ、種々の制限酵
素で消化後アガロースゲル電気泳動にかけて解析し、第
１図から第６図に示すように制限酵素切断地図を作製し
た。

実施例４゜ ρＩＥＮＩＯ１，ｐＥＮ２０１およびｐＥＮ３月による
ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３の形質転換ｐ
ＥＮ１０１．　ｐＥＮ２０１およびｐＥＮ３０１をそれ
ぞれ保持するストレプトマイセス・リビダンスＴに２３
の形質転換株から、実施例１と同じ方法でプラスミドを
！ｌ’［し、それらのｌμｇを用いてストレプトマイセ
ス・リビダンスＴＫ２３を形質転換した。形質転換再生
の方法は実施例２の（２）記載の方法と全く同じ方法で
行った。再生してきたチオペブチン耐性を示す形質転換
株は全て形質転換に用いたプラスミドと同じ構造のもの
を保持していた。

この再生したコロニー数から、各々のプラスミドベクタ
ーによる形質転換効率を計算した。その結果を第７表に
示したが、いずれのベクターも高い形質転換効率であっ
た。

第７表　形質転換効率 実施例５゜ ρεＮｌ０Ｉ、　ｐＨＮ３０１によるストレプトマイセ
ス・サンナネンシスの形質転換 ｐＥＮｌｏｌ、　ＰＥＮ３０１を保持するストレプトマ
イセス・リビダンスＴに２３の形質転換株から、実施例
１と同様の方法でプラスミドを単離し、それらの１■を
２０ｄのＴＥ緩衝液に溶解した。Ｐｓｓ−メディウム（
Ｐ−溶液の０．２５Ｍ　ＴＢＳ緩衝液をｐＨ６，８に調
整した他は実施例２の（２）に示したＰ−溶液と同様な
方法で調製したもの；以下Ｐｓｓ−溶液という）８０−
を加えた。これにストレプトマイセス・リビダンスのプ
ロトプラストを調製したのと同様の方法で得たストレプ
トマイセス・サンナネンシスのプロトプラスト懸濁液１
００ρを混合し、室温で１分間放置した。さらに、４８
０−のＴ−溶液ＣＰｓｓ−溶液に、３０％容量のポリエ
チレングリコール４．０００　（牛丼化学社製）を混合
したもの〕を加えて混合した。Ｐｓｓ−溶液で適当に希
釈し、この１００４をストレプトマイセス・サンナエン
シス用再生寒天培地〔シュークロース１０３ｇ、酵母エ
キス（デイフコ社製０．５ｇ。

ペプトン（デイフコ社製）２．５ｇ、麦芽エキス（デイ
フコ社製）１．５ｇ、　カザミノ酸（デイフコ社製）Ｏ
，Ｉｇ　、　ソリュブルスターチ　（牛丼化学社製）１
０ｇ、グルコース５．０ｇ、にｚｓＯａ　Ｏ，２５ｇ、
微量金属元素液１ｍｌ、ＴεＳ５．７ｇを脱イオン水で
１１とし、ｐＨ６，６に調整する。これを５等分し、４
ｇのバタトアガー（デイフコ社製）を加え高圧滅菌する
。これらの１つに２．８ｍｌの５Ｍ　ＣａＣｌ２２ｍｌ
のＭｇＣＲａを加え、その２０ｍ１ずつをプレートにま
き、１２０分間乾燥させ作製したもの〕に塗布した。

３０℃で２０〜２４時間培養後、あらかじめ４２℃に保
っておいた抗生物質チオペプチンを４５Ｊ１ｇ／ｍｌの
濃度で含有する２、５ｍｌの軟寒天培地を重層し、さら
に３０℃で４〜６日間培養した。再生してきたチオペプ
チン耐性を示す形質転換株は、すべて形質転換に用いた
プラスミドを保持していた。ｐＥＮｌｏｌを用いて得ら
れた形質転換株からプラスミドを抽出し、これを用いて
再形質転換した。ここで得られた再生コロニーの数から
、形質転換効率を計算したところ、１ｕｇ当りのプラス
ミドから、２．７ＸＩＯ’個の形質転換株が得られた。

ＰＥＮ３０１を用いた場合は１０４〜ｌＯＳ個であった
。

発明の効果 本発明によれば、ストレプトマイセス・サンナネンシス
菌種中で自律複製可能なりローユングベクターを得るこ
とができ、ストレプトマイセス・サンナネンシス菌種に
おける宿主−ベクター系を提供することができる。また
、従来のストレプトマイセス属菌種用のベクターにはな
い新たな宿主域のベクターとして使用しつる可能性があ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第６図は、それぞれｐＢＮｌｏｏ、　ｐＨＮ２
００゜ＰＥＮ３００．・ρεＮｌ０１．　Ｐい２０１お
よびｐ［ＥＮ３０１の制限酵素切断地図を示す。図中、
矢印の範囲にチオペプチン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片
が存在□する。また、図中の各数字はそれぞれ下記の値
（にｂ）を表す。 第１図：　　１．０．００／４．６０２．０．１７　３
．０．７？４、０．８Ｂ　　５．１．４２　６．１．４
４？、　１．４８　　ｇ、　１．７８　９．２．０８！
０．２，２８　１１．２．５５　１２．２．５８１３、
２．８５　１４．３．００　１５．３．３６１６、３，
３９　１７．３．５０　１８．３．７２１９．４．０４
　２０．４．４３ 第２図：　　１．０．００／１０，７０　２．０．０５
　３．１．０２４、１．７７　５．１．９０　６．２．
０２？、２．８０　　ｇ、２．９５　９．３．１５１０
、３．１６　１１．３．１８　１２．３．２０１３．３
、？５　１４．４．５０　１５．５．０５１６．５．２
５　１７．５．４５　１８．５．４７１９、５．６７　
２０．５．８３　２１．６．３０２２．６．４５　２３
．７．９５　　２４．８．１０２５．９．６５　２６．
９．７５　　２７．１０．５５第３図：　　１．０．０
０／８．２８　２．０．２５　３．０．９５４．１．１
０　　５．３．０３　　６．３．２３７．３．３２　　
８１．４３　　９．４．２１１０、　４．５１　　　Ｉ
ｌ、　　４．６８　　１２．　５．２３１３、　５．３
５　　１４．　５．６５　　１５．　５．６７１６、　
７．４５　　１？、　　７．８４第４図：　　１．Ｏ，
０Ｏ１５，７０２，Ｏ，＋７　３．０．７７４．０．８
８　　５．１．４２　　６．１．４４７．１，４８　　
８．１．７８　　９．２．０８１０、　２．２Ｂ　　　
１１．　２．５５　　１２．　２，７９１３、　２．８
９　　１４．　３．３２　　　＋５．　３．４２＋６．
　３．６５　　１７．　３．６８　　１８．　３．９５
＋９．　４．１０　　２０．　４．４６　　２１．　４
．４９２２．４．６０　　２３．４．８２　　２４．５
．Ｉ４２５、　５．５３ 第５図：　　１．０．００／１１．８０　２．０．０５
　３．１．０２４．１．７？　　　５．１．９０　　６
．２．０２７．２．８０　　８．２．９５　　９．３．
１５１．０．　３Ｊ５　　１１．　３．９５　　１２．
　４．２５Ｉ３．４．２６　　１４．４．２８　　１５
．４Ｊ。 １（ｉ、４．８５　　１７．５．６０　　　＋８．６．
１５１９．６，３５　　２０．　６．５５　　２１．　
６．５７２２．６．７７　　２３．６．９３　　２４．
７．４０２５．７゜５５　　２６．９．０５　　２７．
９．２０２Ｂ、　　１０．７５　　２９．　１０．８５
　　３０．　１１．６５第６図：　　１．０．００／１
０．０９　２．０，２５　３．０．９５４．１．１０　
　５１．０３　　６．３．１８？、３．４８　８．３．
７１　９゜３．旧ＩＱ、　　４．２４　　１１．　４．
５Ｂ　　　１２．　４．６０１３．４．６５　　１４．
４．８３　　’　１５．　４．８４１６、　５．０４　
　１？、　　５．１３　　１８．　５．２４１９、　６
．０２　　２０．　６．３２　　２＋、　　６．４９２
２．７．０４　　２３．７．１６　　２４．７．４６２
５．７．４９　　２６．９．２６　　２７．９．６５特
許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第２図 第３図 第４図

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトマイセス属菌由来のプラスミドで、ス
   トレプトマイセス・サンナネンシス菌種中で自律複製可
   能なプラスミド。
2. （２）該プラスミドが、４．６キロベースの大きさで、
   制限酵素に対する感受性部位数が、Ｂｃｌ I ３、Ｂｇ
   ｌII１、ＢｓｔＥII２、ＥｃｏＲ I １、Ｋｐｎ I ３、
   ＰｖｕII１、Ｓａｃ I １、ＳａｌＧ I ４、ＳｓｔII１
   、Ｘｂａ I １であるプラスミドｐＥＮ１００、１０．
   ７キロベースの大きさで、制限酵素に対する感受性部位
   数が、ＢａｍＨ I ４、Ｂｃｌ I ３、ＢｇｌII２、Ｂｓ
   ｔＥII３、ＥｃｏＲ I １、Ｋｐｎ I ３、Ｍｌｕ I ３
   、ＰｖｕII３、Ｓａｃ I １、Ｓｍａ I ４であるプラス
   ミドｐＥＮ２００、または８．３キロベースの大きさで
   、制限酵素に対する感受性部位数が、ＢａｍＨ I １、
   Ｋｐｎ I １、Ｍｌｕ I ４、ＳａｌＧ I ９、Ｓｍａ I
   １、Ｓｐｈ I １であるプラスミドｐＥＮ３００から選
   ばれるプラスミドである請求項１記載のプラスミド。
3. （３）ストレプトマイセス・サンナネンシス菌種中で遺
   伝形質が発現される遺伝子を含むＤＮＡ断片をストレプ
   トマイセス・サンナネンシス菌種中で自律複製できるベ
   クタープラスミドに組み込んだ組換え体プラスミドで、
   かつストレプトマイセス・サンナネンシス菌種中で自律
   複製し、該導入遺伝子の発現に基づいてその存在を識別
   しうる組換え体クローニングベクター。
4. （４）該ＤＮＡ断片が薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片
   である請求項３記載のクローニングベクター。
5. （５）該ベクタープラスミドがｐＥＮ１００、ｐＥＮ２
   ００およびｐＥＮ３００から選ばれる請求項３〜４記載
   のクローニングベクター。
6. （６）該クローニングベクターが、ｐＥＮ１０１、ｐＥ
   Ｎ２０１またはｐＥＮ３０１から選ばれる組換え体クロ
   ーニングベクターである請求項３〜５記載のクローニン
   グベクター。