JPS6147192A - ストレプトマイセス属の菌株に使用するための二機能性クローニングベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は１選択可能であって、適度に高いコピー数を有
する新規な組換えＤＮＡクローニングベクターに関し、
更に詳しくは、プラスミドトＪＬ１９２の〜２．５　ｋ
ｂ　Ｋ、ｎ■複制起源含有制限フラ〆メントと、感受性
を有する非制限宿主細胞に導入（ｔｒａｎｓ　　ｆｏｒ
ｍ　）したとき、該宿主細胞に少くとも１個の抗生物質
に対する耐性を付与し得る１またはそれ以上のＤＮＡセ
グメントとを含む組換えＤＮＡクローニングベクターに
関するものである。本発明のベクターは、突然変異を生
じたストレプトマイセス属の菌株（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｔｅｓ　）のレプリコンであって、それを含むプラ
ス“ミドのコピー数がｐＪＬ１９２内に存在する野生型
のレプリコンを含んでいるプラスミドのコピー数よりも
多くなる様に作用するレプリコンを含有している口車発
明はまた。前記のベクターを含有している形質転換体に
関するものである。　・ 従来技術 選択可能であって、適度に高いコピー数を［スるプラス
ミド（約５０コピー／細胞）は、ストレプトマイセスお
よび関連の宿主細胞に用いられる。

これまで、適度に高いコピー数のベクターが一般に欠ｙ
口してし′〈たために、ストレプトマイセスにおける組
換えＤＮＡ技術の発展と開発は特に遅れ、困難なものと
なっていた。これまで、細胞当り数百コピーという極め
て高いコピー数のベクターや。

細胞当り１〜５コピーという低いコピー数のベクターは
入手可能であった。適度に高いコピー数のプラスミドに
よれば、その様なプラスミドに遺伝子を担持させること
により、この遺伝子にコードされているタンパク質の生
産収率を、低コピー数のプラスミドに担持されている遺
伝子による発現の場合のそれよりも高くすることができ
る。また。

適度に高いコピー数のプラスミドは、高いコピー数のプ
ラスミドの場合に起こり易い致死発現（ｌｅｔｈａｌｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　）　　の問題を伴なうことなく、
ストレプトマイセス菌株にクローンされている。転写ま
たは翻訳効率の悪い遺伝子を発現させるのに便利である
。

本発明に係るベクターは、適度に高いコピー数で存在し
、ストレプトマイセスおよびその他の菌株のいずれの宿
主においても機能し、かつ選択可能であるが故に、当該
技術分野における著しい進歩を示すものである。

本発明に係るベクターは、比較的小さく、多方面に利用
でき、耐性を付与しようとする抗生物質に対して感受性
を宵し、突然変異レプリコンが自己複製に関する充分な
情報を提供するあらゆるストレプトマイセス細胞を形質
転換し得ると共に。

選択可能である。天然の抗生物質の内、７０％以上がス
トレプトマイセス株によって生産されるため、この工業
的に重要な微生物に適用できるクローニング系およびベ
クター類の開発が望まれている。本発明は、かかるベク
ターを提供し、これにより、既知の抗生物質の収量を上
げる九めに、または、新規抗生物質および抗生物質誘導
体を生産するために、遺伝子をストレプトマイセス中ヘ
クローンすることを可能にするものである。

このベクターはまた。ＤＮＡをストレプトマイセス宿主
細胞にクローニングするためのビヒクルを提供すると共
に、形質転換体の簡便な選択を可能ならしめるものであ
る。形質転換は極めて低い確率で起こる現象であるので
、何十億もの細胞のうちからプラスミドＤＮＡを獲得し
た細胞を決定するためには、このような機能試験が実際
上必須である。該ベクターには非選択性ＤＮＡ配列を挿
入することができ、形質転換により、このベクターと所
望の特定のＤＮＡ配列を含有する細胞を。

適当な表現型の選択に基いて分離することができるので
、上記のことは極めて重要である。

本明細書中に記載した発明の理解を助けるために、以下
に用語を定義する。

組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
のＤＮＡセグメン七を付加することのできる。もしくは
それらが既に付加されたＤＮＡ分子からなる自律的複製
本であって、プラスミドを含むがこれに限定されない。

形質転換：、、ＤＮＡを宿生受容細胞中に導入し、その
遺伝子型を変化させ、その結果該受容細胞に変化をもた
らすこと。

形質転換体：形質転換された宿生受容細胞。

感受性宿主細胞：ある特定の抗生物質耐性を付与するＤ
ＮＡセグメントなしでは、該抗生物質の存在下において
生育できない宿主細胞。

制限フラグメント：１または１以上の制限酵素の作用に
よって生じた直線状ＤＮＡ。

挿入異性体：受容体ＤＮＡの２またはそれ以上の適合し
得る部位の内の１つの部位にＤＮＡフラグメントが挿入
されることにより、あるいは、受容体Ｄ　Ｎ　Ａのある
部位における２つの相異なる方向の内の１万の方向にＤ
ＮＡフラグメントが挿入されることにより形成される２
またはそれ以上の組換えＤＮＡ分子の内の１つ。

レプリコン：　ＤＮＡのＭ裂を制御（コントロール）し
たり、許容したりするＤＮＡ配列。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏＪｉ　）の復製起源（レプリコン）
二大腸菌内に於けるプラスミド、あるいは他のベクター
の復製を制御したり、許容したりするＤＮＡ配列。

ストレプトマイセスのＭ製起源（レプリコン）：ストレ
プトマイセスにおけるプラスミドまたは他のベクターの
Ｗ！Ｍを制御したり、許容したりするＤＮＡ配列。

ＡＰ　：アンビシリン耐性表現型。

ＴｃＳ：テトラサイタリン感受性表現型。

Ｎｍ：ネオマイシン耐性表現型。

Ｔ−二チオストレプトン耐性表現型。

ｋｂ　：キラ塩基対部ち１０００塩基対。

本発明の詳しい記述 本発明は、適度に高いコピー数を有する組換えＤＮＡク
ローニングベクターであって、：ａ）プラスミドｐＪＬ
　１９２の〜２．５　ｋｂ　Ｋ、ｎｊ複製起源含有制限
フラグメントと、　ｂ）　ｇ受性を有する非制限宿主細
胞に導入した時、少くとも１個の抗生物質に対する耐性
を付与し得る１またはそれ以上のＤＮＡセグメント、と
を含有するクローニングベクターを提供するものである
。

本発明は１し上記のベクターによって形質転換された形
質転換体をも包含するものである。

本発明のベクターは、１またはそれ以上の抗生物質耐性
付与Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを、プラスミドｐＪＬ１９
２　　の〜２，５ｋｂ複裂起源含有制限フラグメントと
ライゲート（結合）することにより組立てられる。次い
で、得られたベクターを、大腸菌プラスミドの、複製起
源を含有し、抗生物質耐性を付与し得る機能的な制限フ
ラグメントにライケートすることにより、大腸菌および
ストレプトマイセスの両者で選択可能であって、自己複
製可能な二機能性ベクターを得ることができる。

プラスミドｐＪＬ　ｌ　９２は、ノーザン・リージョナ
ル・リサーチ・ラボラトリイ、ペオリア、イリ、／　イ
ス６１５　Ｑ　４　（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ　　Ｒｅ５ｅｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｐ
ｅｏｒｉａ　、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　６１６０４　）　
Ｉｃ寄託され、その一部となっている菌株、大腸菌Ｋ１
２　　Ｃ６Ｃ６００Ｒｋ−−／ｐＪＬ１９２から常法通
り単離することができる。この菌株は１Ｍプラスミドの
好ましい供給源および保管体として寄託番号ＮＲＲＬ−
１５０４０の下、誰でも入手可能でアル。プラスミドｐ
ＪＬ１９２　　の制限サイト地図を添付図面の第１図に
示す。本出願の目的からして、第１図、および以後の全
ての□□□面は等縮尺で描かれていない。

多くの異なった、プラスミドＰＪＬ１９２のストレフト
マイセス複製起源含有フラグメントを組立てることがで
きるが１本発明を例示するために本明細書中に記載した
フラグメントは、全て〜２．５ｋｂ　ＫｐｎＩ制限フラ
グメントを含有していることを特徴とするものである。

この〜２．ｓ　ｋ勢に、ｎＩ制限フラグメントは、プラ
スミドＰＪＬ１９２０）τ＜、ｎ１酵素による完全消化
によって生成するフラグメントであり、適度に高いコピ
ー数（細胞当り４０〜５０コヒー）の誘導体プラスミド
を生産することが見出された、プラスミド、ＪＬＩ９２
は、細胞当り１〜５という低いコピー数を有するプラス
ミドとして知られているストレプトマイシスプ５スミド
５ＣＰ２＊からの〜５．ｇ　ｋｂＥｃ、Ｒｒ−５ａｌ■
レプリコンフラグメントを含有している。

この〜５．９　ｋｂＥｃｏＲＩ−５ａｌ　ｉ　５ＣＰ２
＊複製起源含有フラグメントを切断して本発明の〜２．
ｓ　ｋｂＫ、ｎ■制限フラグメントとする際に、５ｃｐ
２＊のコピー数を制御している制御配列に実質的な突然
変異が起こるのであろうと思われる。

ストレプトマイセスにとって望ましいクローニングベク
ターは、ストレプトマイセス内で発現され得るプラスミ
ド複製機能と、抗生物質耐性に関する２つのマーカー（
これらの各耐性マーカー内に特異な制限酵素認識部位が
含まれていることが好ましい）とを含有している必要が
ある。理想的なりローニングベクターの組立ては、プラ
スミドｐＪＬ　ｌ　９２の〜２．５　ｋｂＫｐｎ　Ｌ複
製起源含有制限フラグメントに、１またはそれ以上の抗
生物質耐性付与ＤＮＡフラグメント（本明細書中で例示
するクロく１例えば、プラスミド、　Ｌ　Ｒ２のチオス
トレプトン耐性付与〜１，６　ｋｂＢａｍＨＩ　　制限
フラグメントおよびプラスミドＰＬＲ４のネオマイシン
耐性付与〜３．４　ｋ　ｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメン
ト）を独立にライゲートすることにより行ない、この様
にして本発明で例示したベクターを形成することができ
る。プラスミドＰＬＲｚ＊よびＰＬＲ４は、それぞれチ
オストレプトンおよびネオマイシン耐性付与フラグメン
トの供給源であってアメリカ特許第４．４１６，９９４
号に係る物質であり、該特許の方法に従って組立てるこ
とができる。これらのプラスミド　ＢＲ２およびｐ　Ｌ
　Ｒ４は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）内で機能的である故に
、以後の操作のために増幅し、単離する上で好都合であ
る。

組立てを便利Ｊ４かつ簡単にするためにこれらのチオス
トレプトン耐性付与〜ｌ、　５　ｋｂ　Ｒａｍ　ＨＩ　
フラグメントとネオマイシン耐性付与〜３．４ｋｂＢａ
ｍＨＩフラグメントとをプラスミドＰＪＬ　１９２の〜
２．５ＫＰｎＩｋｂ復製起源含有フラグメントにライ・
ゲートし１本発明の例示プラスミドを組立てる。

挿入されたＤＮＡフラグメントの方向性に基き、所望の
２方向の組換えプラスミドが得られる。即ち、プラスミ
ド、ＢＲ２の〜１．６　ｋｂＢａｍＨＩフラグメントを
プラスミドＰＪＬＩ　９２の〜１．６ｋｂＫＰｎ■制限
フラグメントに挿入することにより１例示のプラスミド
ＰＨＪＬ２２００　およびＰＨＪＬ２２０１が得られ；
同様に、〜３．４ｋｂＢａｍＨＩ　フラグメントを　Ｈ
ＪＬ２２００に挿入することにより、例示プラスミドＰ
ＨＪＬ２２０２およびＰＨＪＬ２２０３が得られる。

本明細書中に例示した抗生物質チオストレプトび〜３．
４　ｋ　ｂ　Ｂ　ａｍＨｆ　制限フラグメントであるが
。

当業者には、チオストレプトンおよびネオマイシンに対
する耐性を付与する他のＤＮＡセグメントら を組立て、これを個別に、または組み合わせて使△ 用することができるであろう。プラスミドＰＬＲ２の他
のチオストレプトン耐性付与ＤＮＡセグメントには１例
えば〜１３　ｋｂＰｓｃｉ制限フラグメント２よび〜ｌ
　ｋｂ　Ｂｃｌ　■制限フラグメントがあるＯプラスミ
ド複製機能の他のネオマイシン耐性付与ＤＮＡセグメン
トには１例えば〜３，５Ｐｓｔ制限フラグメントおよび
〜３．４　ｋｂ　ＢａｍＨ■制限フラグメントの５ａｃ
ｌｌ−Ｋｐｎ［フラグメントのうち、大きし１万のフラ
グメントがあるｂさらに、上記のまたＣよ上記とは異な
る抗生物質５例えばクロラムフェニコール、ハイクロマ
イシン、ビオマイシン、タイロシンおよびエリスロマイ
シン等の抗生物質に対する耐性を付与するその他のＤＮ
Ａセグメントも。

組立てて使用することができる。さらに、上記の抗生物
質耐性付与ＤＮＡセグメントの様々な機能的誘導体も、
あるヌクレオチドを付加、脱離または置換することによ
って組立てることができる。

これらの誘導体、もしくはこれら以外の抗生物質耐性付
与ＤＮＡセグメント番、本明細書中で例示した抗生物質
耐性付与ＤＮＡセグメントの代りに〜２，５ｋｂＫＰｎ
ｉ　　制限フラグメントにライゲーションすることによ
っても、本発明の範囲内に含まれるプラスミドを得るこ
とができる。

本発明に係るストレプトマイセス内で機能的なベクター
、例えばＰＨＪＬ２２００およびｐ）ｌＪＬ２２０２と
１例えば　ＢＲ３２２−ＢＲ３２５−ｐ　ＢＲ３２８Ｐ 等の、種々の大腸菌プラスミドの機能的な復製起源−含
有、並びに抗生物質耐性−付与制限フラグメントとをラ
イゲートすることにより、大腸菌およびストレプトマイ
セスの両者において選択可能な、二機能性の自己復製ベ
クターを作り出すことができる。これらの二機能性の組
立て物は、プラスミド　ＪＬ１９２の〜２．５ｋｂＫｐ
ｎＩ複製起源含有制限フラグメント、ストレプトマイセ
スに抗生物質耐性を付与する１またはそれ以上のＤＮＡ
セグメント、大腸菌内で機能的なレブリン、並びに大腸
菌に抗生物質耐性を付与するＤＮＡセグメントからなる
。本発明において開示したプラスミドＰＨＪＬ２０１は
、約９．９ｋｂの小さい二機能性プラスミドであり、そ
のクローニングベクターとしての用途には何ら関与しな
い、極く小さい余分の配列を有している。プラスミドｐ
ＨＪＬ２０１は、比較的サイズが小さく１機能的な組立
て物であり、更に、２個のＢａｒｒＩＨＩ制限部位を臀
しているため。

その内の１個を他の抗生物ｆｊＩｌｉｌ性マーカー、あ
るいはヘテロローガスな（異質の）ＤＮＡの挿入に利用
することができるので、望ましいクローニングベクター
である。当業者には、プラスミドｐＪＬ１９２をに、。

■　消化すれば、プラスミドｐＨＪＬ２０１が容易に得
られるということが理解できるであろう。

その上、プラスミドＰｆ（ＪＬ２０１％ＰＨＪ　Ｌ２１
０および、ＨＪＬ２１１で代表される本発明の二機能性
組立て物は、ストレプトマイセスよりも大腸菌内に於い
て、そのプラスミドの増幅および操作を迅速かつ簡便に
行うことができるので、特に好都合である。即ち、大腸
菌宿主系で所望の組換えＤＮＡ法を行なった後、このプ
ラスミドをストレプトマイセス宿主細胞内に導入（トラ
ンスホーム）することができる。あるいはまた、特定の
ストレプトマイセスＤＮＡを取出し、（必要ならば）プ
ラスミドの形に再構成し、次いでストレプトマイセスま
たは関連の宿主細胞に導入してもよい。本発明のベクタ
ーはストレプトマイセス内で完全に選択可能であるため
、組換えクローンの同定を効率良く行なうことができる
。

プラスミドＰＪＬ１９２．　　ＰＢＲ３２２およびＰＢ
Ｒ３２５等の様々なレプリコン制限フラグメントおよび
種々の抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメントを。

ライゲーションを容易なものにするために修飾すること
ができる。例えば、〜２．５　ｋｂ　ＫＰｎＩレプリコ
ンフラグメント、同じく特定の耐性付与ＤＮＡセグメン
トに分子リンカ−を付加し、ＰＪ、後のライゲーション
における特異部位を生成させることができる。更に、複
製起源含有制限フラグメントを、あるヌクレオチドの付
加、除去または置換によって修飾することにより、その
性質を変え、ＤＮＡのライゲーションのための様々な制
限部位を供給することができる。当業者はヌクレオチド
の化学および遺伝子暗号等について理解しているので、
ある目的のために、どのヌクレオチドが交換可能であり
、どのＤＮＡ修飾法が望ましいかを仰っている。

本発明に係る組換えＤＮＡクローニングベクターは、そ
の用途をストレプトマイセスの単一の種または菌株に限
るものではない。逆に２本ベクターは広範囲の適用が可
能で、多くのストレプトマイセス類の宿主細胞、特にア
ミノグリコシド、マクロライド、β−ラクタム、ポリエ
ーテルおよびグリコペプチドのような抗生物質を産生ず
る経済的重要性のある非制限菌株に導入することができ
る。こうした非制限菌株は、当業者周知の常法〔ロモフ
スカヤ（Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａ）等、１９８０、マイク
ロバイオロジカルレビューズ（ＭｉｃｒａｂｉｏＪｏｇ
ｉｃａＪＲｅｖｉｅｗｓ）４４　：　２０６　］により
、ストレプトマイセス類から容易に選択１分離される。

非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形質転換
の際プラスミドＤＮＡを切断したり劣化させるンとがな
い。本発明においては、本発明に係るベクターのいかな
る制限サイトも切断しない制限酵素を含んでいる宿主細
胞もまた非制限ヰとみなすこととする。

アミノグリコシド抗生物質を産生し１本発明に係るベク
ターを特に有用に使用でき、形質転換できるストレプト
マイセス類の非制限的な菌株の好ましい宿主細胞には１
例えば以下の菌株に由来する非制限細胞が含まれる： ストレプトマイセス・カナマイセチカス（Ｓｃｒｅｐｃ
。

ｍｙｃｅｓ　Ｋａｎａｍｙｃｅｃｉｃｕｓ　）　（カナ
マイシン類）、ＩＳ、タレストマイセ＋　；Ｉｙ　ス（
Ｓ　、　ｃｈｒｅｓ　ｔｏｍｙｃｅｃ　ｉｃｕｓ）（ア
ミノシジン）、Ｓ、グリセオフアシス（Ｓ、ｇｒｉｓｃ
。

ｆｌａｖｕｓ　）（抗生物質ＭＡ１２６７）、Ｓ−ミク
ロスポレウス（Ｓ、ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ　）（抗
生物質５Ｆ−７６７）、Ｓ、リボシジフイカス（Ｓ、ｒ
ｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ　）　（抗生物質５Ｆ７３３
）、ｓ、フラボペルシカ７、　（Ｓ、　ｆｌａｖｏｐｅ
ｒｓｉｃｕｓ　）（スペクチ／？イシン）、Ｓ、スペク
タビリス（Ｓ、、　５ｐｅｃｃａｂｉｌｉｓ）（アクチ
ノスペクタシン）、Ｓ、ｌＪモザス・ホルマ・パ０モ？
イシナス（Ｓ　、　ｒｉｍｏｓｕｓｆｏｒｍａ　　ｐａ
ｒｏｍｏ　−ｍγｃｉｎｕｓ　）バロモマイシン類、カ
テヌリン）％Ｓ、フラデイエ・バー・イタリカス（５、
ｆｒａｄｉａｅｖａｒ、　　１ｔａｌｉｃｕｓ　）　（
アミノシジン）、Ｓ、プルエンシス−バー・ブノｌｚエ
ンシス（Ｓ、ｂｌｕｅｎｓｉｓ　ｖａｒ。

ｂｌｕｅｎｓ　ｉｓ　）（プルエンソマイシン）、Ｓ、
カテニュ−Ｌ／　（Ｓ　、　ｃａｃｅｎｕｌａｅ　）（
カナメリン）、Ｓ。

オリボレテイキュリ・バー・セルロフイラス（Ｓ。

ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ　　ｖａｒ　　ｃｅＪｌｕ
ｌｏｐｈｉｌｕｓ　）（デストマイシンＡ）、Ｓ、　？
ネブラリウス（Ｓ、ｃｅｎｅｂｒａ−ｒｉｕｓ）　（ト
ブラマイシン、アブラマイシン）、５゜５　ヘンチュー
Ｌ／　（Ｓ、　１ａｖｅｎｄｕｌａｅ　）　（ネオマイ
シン）、Ｓ、アルボグリセオラス（Ｓ　、　ａｌｂｏｇ
ｒｉｓｅｏｌｕｓ　）（ネオマイシン類）、　Ｓ、γル
ブス拳バー畳メタマイシヌス（Ｓ　、　ａｌｂｕｓ　ｖ
ａｒ、　ｍｅｔａｍｙｃｉｎｕｓ　）（、％タマイシン
）、Ｓ、バイグロスコピカス、バー・サガミエンシｘ　
（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　　ｖａｒ、　ｓａ
ｇａｍｉ　−ｅｎｓｉｓ　）　（スペクチノマイシン）
、Ｓ、ビキニエンシス（Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ　
）　　（７，トブラマイシン）、Ｓ、グリセウス（Ｓ６
ｇｒｉｓｅｕｓ　）（ストレプトマイシン）、Ｓ、エリ
スロクロモゲネス・バー・ナルトエンシス（Ｓ　、ｅｒ
ｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ｖａｒ。

ｎａｒｕｃｏｅｎｓｉｓ　）　（ストレプトマイシン）
、Ｓ、プルエンシス シン）％Ｓ、ガルブス（Ｓ　、　ｇａｌｂｕｓ　）（ス
トレプト？（シン）、　５．５メウス（Ｓ、ｒａｍｅｕ
ｓ　）（ストレプトマイシン）、Ｓ、オリバセウス（Ｓ
　、　ｏｌ　１ｖａｃｅｕｓ　）（ストレプトマイシン
）、Ｓ、マシュエンシス（Ｓ　、　ｍａｓｈｕ６ｎｓ　
ｉ　ｓ　）　（ストレプトマイシン）、Ｓ、バイグロス
コピカス・バー・リモネウス（Ｓ、ｈｙｇｒｏ−ｓｃｏ
ｐｉｃｕｓ　　ｖａｒ、　Ｊｉｍｏｎｅｕｓ　）　（バ
リダマイシン類）。

Ｓ、リモファシエンス（Ｓ　、　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎ
ｓ　）　（デストマイシン）、Ｓ、バイグロスコピカス
・ホルマ・グレボサ：ｘ、　（Ｓ　、　ｈｙｇｒｏｓｃ
ｏｐｉｃｕｓ　　ｆｏｒｍａ　ｇｌｅｂｏ−ｓｕｓ　）
　（グレボマイシン）、Ｓ、フラデイエ（Ｓ。

ｆｒａｄｉａｅ　）　（ハイブリマイシン類、ネオマイ
シン類）％ｓ、＋Ｌ　　ａシンカス（Ｓ　、ｅｕｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ　）（抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、
アクアカナス（Ｓ、　ａｑｕａｃａｎｕｓ　）　（Ｎ−
メチルハイグＣ１？イシンＢ）、Ｓ、クリスタリヌｘ　
（Ｓ　、ｃｒｙｓ＋ａＨｉｎｕｓ　）（ハイグロマイシ
ンＡ）、’Ｓ・ノボリドエンシス（Ｓ、ｎｏｂｏｒｉｃ
ｏｅｎｓｉｓ　）　（ハイグａ？（シン）、ｓ。

ハイグロスコピ力ｘ　（Ｓ　、　ｈｙｇｒｏｓｊｏｐｉ
Ｃｕｓ　）　（／％イグロマイシン類）、Ｓ、アトロフ
ァシェンス（Ｓ。

ａｃｒｏｆａｃｉｅｎｓ　）　（ハイグロマイシン）、
ｌＳ、カスガスピナス（Ｓ　、　ｋａｓｕｇａｓｐｉｎ
ｕｓ　）　（カスがマイシン）。

Ｓ、カスがエンシス（Ｓ　、　ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ
　）　（カスガマイラン類）、Ｓ、ネトロブシス（Ｓ　
、　ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ）（抗生物質ＬＬ−ＡＭ３１）
、ｓ、リビダス（Ｓ。

１ｉｙｉｄｕｓ　）　（リビドマイシン類）、Ｓ、ホフ
エンシス（Ｓ、　ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ　）　（セルドマ
イシン顎合体）。

およびＳ、カナメ（Ｓ　、　ｃａｎｕｓ）　（リボシル
パロマミン）。

マクロライド抗生物質を産生し１本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプトマ
イシス・ケレステイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　
ｃａｅｌｅｓｔｉｓ　）　（抗生物質Ｍ１８８）、５．
プラテンシス（Ｓ　、　ｐｌａｃｅｎｓｉｓ　）（プラ
テンマイシン）、Ｓ、ロツチェイ・バー・ボルビリス（
Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ　　ｖａｒ、　　ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ
　）　（抗生物質Ｔ２６３６）、Ｓ、ベネス１　Ｌ／、
　　（Ｓ　、　ｖｅｎｅ−ｚｕｅｌａｅ　）　（メチマ
イシン類）、Ｓ、グリセオフアシス（Ｓ、　ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓ　）　（プントリン）、Ｓ、ナルボネ７
　シフ、　（５、ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ　）　’（ジ
ョサマイシン、ナルレボマイシン）、Ｓ、フンジシジカ
ス（Ｓ。

ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ　）　（抗生物質ＮＡ−１８
１）、Ｓ−グリセオフアシｘ　シス（Ｓ　、　ｇｒｉｓ
ｅｏｆａｃｉｅｎｓ　）　（抗生物質ｐＡ１３　ａＡ、
Ｂ　）％Ｓ、ロゼオシトレウス（Ｓ、ｒｏｓｅｏｃｉ（
ｒｅｕｓ　）　（フイボサイクリン）、Ｓ。

プルネオグリセロ　ス（ｓ　、　ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓ
ｃｅｕｓ　）　（７ルボサイタリン）、Ｓ、ロゼオクロ
モゲネス（Ｓ。

ｅｒｏｓｅｏｅｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）（アルボマイ
セチン）、Ｓ、シネワク０モゲネｘ　（Ｓ　、　ｃｉｎ
ｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ、ｓ　）　（シネ０フイシ
ンＢ）％Ｓ、アルプス（Ｓ　、ａｌｂｕｓ　）（アルボ
マイセチン）、Ｓ、フエレウス（Ｓ　、　ｆｅｌｌｅｕ
ｓ）（アルゴマイシン、ピクロマイシン）、Ｓ、ロッチ
ェイ（Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ）（ランカシジン、　；ｊ？　
Ｌ／　！Ｊ　’）　ン）　ｓＳ、ビオラセオニゲ／Ｌ／
　（Ｓ、ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ　Ｘ５　ンカシジ
ン）、Ｓ、グリセウス（Ｓｏｇｒｉｓｅｕｓ　）　（ボ
レリジン）ｂ”−メゼウス（Ｓ　１ｍａｉｚｅｕｓ、　
）　’（インゲラマイシン）、Ｓ、アルプス・バーーコ
イルマイセチカＸ　（Ｓ、ａｌｂｕｓ　　ｖａｒ、ｃｏ
ｉｌｍｃｅｃｉｃｕｓ　）（：ｌレイマイシン）、Ｓ、
ミカｏ７ア’／　：ｒ−：／　ス（Ｓ　、ｍｙｃａｒｏ
ｆａｃｉ　−ｅｎｓ　）　（アセチルロイコマイシン、
ニスピノマイシン）、Ｓ、ハイグロスコピ力ｘ　（Ｓ　
、　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉ−ＣＵＳ　）　（ツリマイシ
ン、レロマイシン、マリドマイシン、タイロシン、カル
ボマイシン）、Ｓ、グリセオスピ５　＋）　ス（５、ｇ
ｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌ　ｉｓ　）　（し０フィシ’、
）、５．ラベンジュレ’（Ｓ　、　ＪａｖｅｎｄｕＪａ
ｅ　）（ｙルドガマ（シン）、ｓ、リモサス（Ｓ、　ｒ
ｉｒｎｏｓｕｓ　）（二１−　）　ラフ（’ｉン）　％
Ｓ、テｔし９　工（Ｓ、ｄｅｌｔａｅ　）（デルタマイ
シンｍ）、Ｓ、ファンジシジヵス・バー・エスピ／　７
（＋ｆカス（Ｓ　、　ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａ
ｒ。

ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｃｉｃｕｓ　）　（ｘスピンマイ
シン類）、Ｓ＋フルジシジヵス（Ｓ　、　ｆｕｒｄｉｃ
ｉｄｉｃｕｓ　）　（ミテカフイシン）、Ｓ、７ンボ７
７　’ｉ　Ｘ　シス（Ｓ　、ａｍｂｏｆａｃｉ　−ｅｎ
ｓ　）　（フォロマシジンＤ）、５．ユーロシティヵス
（Ｓ、ｅｎｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　）　（ｌ　ｆマイシン
）、Ｓ　、　りｌＪセオラｘ　（Ｓ、　ｇｒｉｓｅｏＪ
ｕｓ）（り１７　＋オマイシン）　。

Ｓ、フラボクロモゲネス（Ｓ　、　ｆＪａｖｏｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓ）（アマロマイシン、シンコマイシン類
）、Ｓ、フィムブリアタＸ　（ｊ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕ
ｓ）（７７ｏマ（シン）。

Ｓ、ファシキュラ７．　（Ｓ　、　ｆａｓｃｉｃｕｌｕ
ｓ）（７７ｏ　？　（シン）、Ｓ、エリスレウｘ　（Ｓ
、　ｅｒ７ｔ、ｈｒｅｕｓ　）　（ｘ　リスロマイシン
類）、Ｓ、アンチビオチヵス（Ｓ。

ａｎｃｉｂｉｏｃｉｃｕｓ　）（オレアンドマイシン）
、Ｓ、オリボクロモゲネス（Ｓ　、　ｏＪ　ｉｖｏｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）（オＬ／　７ンドマイシン）、
Ｓ、スピニクロモゲネス・バ一スラガオエンシス（Ｓ、
　ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ｖａｒ。

ｓｕｒａｇａｏｅｎｓｉｓ　）　　（クジマイシン類）
、Ｓ、キタサトｘン’ｉｘ　（Ｓ、ｋｉｃａｓａｔｏｅ
ｎｓｉｓ　）　（ｏイコマイシン）、Ｓ、ナルボネンシ
ス・パー拳ジョサマイセチカス（Ｓ　、　ｎａｒｂｏｎ
ｅｎｓｉｓ　　ｖａｒ、　ｊｏｓａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ
　）（ロイコマイシンＡ３％ジョサマイシン）、Ｓ、ア
ルボグリセ第５　ス（Ｓ　、　ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌ
ｕｓ　）（ミコノマイシン）、Ｓ、ビキニエンシｘ　（
Ｓ　、　ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）（チャルコマイシン
）、、５．サーラタス（Ｓ　、　ｃｉｒｒａｔｕｓ）（
シラマイシン）％Ｓ、ジャカルテンシス（Ｓ。

ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ　）（ニダマイシン）、Ｓ、
ユーリサーｖ　ス（Ｓ　、　ｅｕｒｙｃｈｅｒｍｕｓ　
）（アンゴラマイシン）％Ｓ、フラデイｘ　（Ｓ、　ｆ
ｒａｄｉａｅ　）　（タイｏ　シン、ラクテノシン、マ
クロシン）、Ｓ、コ゛シキエンシス（Ｓ　、　ｇｏｓｈ
ｉｋｉｅｎｓｉｓ　）（パンダマイシン）、Ｓ、グリセ
オフラプス（Ｓ、　ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ　）（７
キユマイシン）、５．／）Ｌ／ステシイ（Ｓ　、　ｈａ
ｌｓｃｅｄｉｉ）（力／Ｌ／ボイシン）、ｓ、？ンダｘ
　（Ｓ　、　ｔｅｎｄａｅ　）（力／Ｌ／ボマイシン）
、Ｓ、ｖりｏ７．ポレウｘ　（Ｓ　、　ｍａｃｒｏｓｐ
ｏｒｅｕｓ　）（カルボマイシン）％Ｓ、サーモトレラ
ンス（Ｓ。

ｃｈｅｒｍｏｃｏｌ　ｅｒａｎｓ　）（カルボマイシン
）、およびＳ＋アルヒレチキュリ（Ｓ　、ａｌｂｉｒｅ
ｔｉｃｕｌｉ）（カルボマイシン）。

β−ラクタム抗生物質を産生じ１本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプトマ
イセス、リップマユ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ、ｅｓ　　
Ｉ　ｉｐｍａｎｉ　ｉ）　（Ａ　Ｉ　５８８４、ＭＭ４
５５０、ＭＭ１３９０２　）、５．り５ブ１）’ｆ５ス
ｃＳ、ｃｌａｖｕＪｉｇｅｒｕｓ　）　（ＡＩ　６８８
６Ｂ、クラプラン酸）％５．５り９１ｈデ：ｙ−５ン７
．　（Ｓ　、　Ｉａｃｃａｍｄｕｒａｎｓ　）（セファ
マイシンＣ）、Ｓ、グリセ＋７　ス（Ｓ　、　ｇｒｉｓ
ｅｕｓ）（セファマイシンＡ、、Ｂ）、５．ハイグロス
コピ力Ｘ　（Ｓ　、　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　）
（デアセトキシセファロスポリ／　Ｃ）　ｓ　Ｓ　＊ワ
ダヤ７　、Ｔ−ンシｘ　（Ｓ　０ｗａｄａｙａｍａｅｎ
ｓｉｓ　）　（ＷＳ−３４４２−Ｄ）、Ｓ、チャートレ
ウシｘ　（Ｓ、ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ　）（Ｓ　Ｆｌ
　６２３　）、　Ｓ　、へ？Ｃ１モ／Ｉ／　７７　ｘ　
（Ｓ　、＊　ｈｅｔｅｒｏｍｏＪｐｈｕｓ　）およびＳ
、パナｘンシｘ　（Ｓ、ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ　）（（
：２０８１Ｘ）　；Ｓ、：／ナルネンシス；　（Ｓ、ｃ
ｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ　）％Ｓ、フイ：／ブ！Ｊ　
７　タフ、　（Ｓ　、　ｆｉｍｂｒｉａｃｕｓ）、Ｓ、
ハルステジ（ｓ。

ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　）％Ｓ、ｏツチエッチ　Ｓ　、ｒ
ｏｃｈｅｉ）およびＳ、ピリドクロモゲネス（Ｓ　、　
ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（セファマイシ
ンＡ、Ｂ）Ｓ、カトレヤ；　（Ｓ　、ｃａｔｔｌｅｙａ
（チェナマイシン）；およびＳ、オリバセウス（Ｓ。

ｏｌ　１ｖａｃｅｕｓ　）　、　Ｓ　、フラボビレンス
（Ｓ　、　ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎら５．７５ハス（Ｓ、
ｆｌａｖｕｓ　）％Ｓ、フルボビリシス（Ｓ　、ｆｕｌ
ｖｏｖｉｒｉｄｉｓ　）　、　Ｓ　、アルゲンｙ−オラ
ス（Ｓ。

ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ　）およびＳ、シオヤエンシｘ
　（Ｓ　、５ｉｏｙａ−ｅｎｓｉｓ　）（ＭＭ　４５５
０およびＭＭ１３９０２）。

ポリエーテル抗生物質を産生し、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主ｍｙｃｅｓａｌｂｕｓ
　）（Ａ２０４．　Ａ２８６９５　ＡおよびＢ。

サリノマイシン）、Ｓ・ハイグリスコピカス（Ｓ・ｈｙ
ｇｒｏｓｅｏｐｉｃｕｓ　Ｘ　Ａ　２１　Ｂ　、　　ｘ
　メ　リシｈ−，ＤＥ３９３６、Ａ１２０Ａ、Ａ２８６
９５ＡおよびＢ、エテロマイシン、ジアネマイシン）、
Ｓ、グリセウス（Ｓｏｇｒｉｓｅｕｓ　）（タリンリキ
シン）、Ｓ、コングｏパタス（Ｓ　、　ｃｏｎｇｌｏｂ
ａｔｕｓ　）（イオノマイシン）、Ｓ。

ニーｐシジカス・バーｅアステロシジカス（Ｓ。

ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　　ｖａｒ、　ａｓｔｅｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ　）　（う（）−０マイシン）、Ｓ、ラサ
リｚンシス（Ｓ　、　１ａｓａｌ　１ｅｎｓｉｓ（ラサ
ロシド）、Ｓ、リボシジフイカス（Ｓ。

ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ　）（ｏノマイシン）、Ｓ
、カカオ・バー・アンエンシス（Ｓ、ｃａｃａｏｉ　　
ｖａｒ、ａｓｏｅｎｓｉｓ）（ラインセリン）％Ｓ、シ
ナモネンシン（Ｓ　、ｃｉｎａｍｏ−ｎｅｎｓｉｓ　）
（モネンシン）、Ｓ、オーレオファシェンス（５、ａｕ
ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ　）　（ナラジン）、Ｓ、ガリナ
リウス（Ｓ　＊　ｇ＠　Ｉ　Ｉ　１　ｎａ　ｒ　ｉｕ　
ｌ　）（ＲＰ　３０５０４　）　ｈ　Ｓ　−ｏングウツ
デンシス（Ｓ　、　ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓｉｓ　）（
ラインセリン）、ｓ、７ラベオラｘ　（Ｓ　、　ｆｌａ
ｖｅｏｌｕｓ　）（ＣＰ　３８９３６）、Ｓ、Ａタビリ
ｘ　（Ｓ、ｍｕｃａｂｉｌｌｉｓ）（Ｓ−１１７４３ａ
）、およびＳ、ビオラセオニゲル（Ｓ。

ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ　）（＝ゲリシン）。

上記の代表的なストレプトマイセス宿主細胞に加えて、
本発明のベクターは、大腸菌を形質転換するのにも有用
である。この様に１本発明は広範囲に適用でき、有用で
あって、様々な生物の宿主細胞を形質転換することがで
きる。

本発明のあらゆる態様が利用できるが、本発明の組換え
ＤＮＡクローニングベクターおよび形質転換体の円、幾
つかのものが好ましい。即ち、好適なベクターは、プラ
スミドＰＨＪＬ２２００、、ｐＨＪＬ２２０２、ｐＨＪ
Ｌ２０１．ｐＨＪＬ２１０およびｐＨＪＬ２１１であり
、好適な形質転換体は、ストレプトマイセス・グリセオ
フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ　　ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓ　　）　／　ＰＨＪＬ２２００％Ｓ　、
グリセオフスカス／　ＰＨＪＬ２２０２、Ｓ、リビダン
ス（Ｓ　、ｌ１ｖｉｄａｎｓ　）　／　ｐＨＪＬ　２Ｑ
　ｌ、Ｓ、リビダンス／Ｐ）ｌＪＬ２１０．Ｓ、リビダ
ンス／ＰＨＪＬ２１１．Ｓ。

グリセオフスカス／ＰＨＪＬ２０１．　　ｓ、グリセオ
フスカス／ＰＨＪＬ２１０．　　Ｓ、グリセオフスカス
／Ｐ）ｌＪＬ２１１．　　Ｓ、フラデイエ・（二Ｓ　、
ｆｒａｄｉａｅ７）ＰＨＪＬ２０１．　　　Ｓ、フラデ
イエ／ＰＨＪＬ２１０゜Ｓ、フラデイエ／ＰＨＪ　Ｌ２
１１．　　大腸菌に１２Ｃ５Ｑ　Ｑ　Ｒｋ−Ｍｋ−／ｐ
ＨＪ　Ｌ２０１．大腸菌Ｋｌ　２０６００　Ｒｋ−Ｍｋ
−／ｐＨＪ　Ｌ　２１０および大腸菌に１２ｃｓｏｏｉ
ｔｋ−Ｍｋ−／ｐＨＪＬ２１１である。以上の好適なグ
ループの中でも、プラスミドｐＨＪＬ２０１、、ｐＨＪ
Ｌ２１０およびｐＨＪ　Ｌ２１１．並びに、形質転換体
Ｓ、グリセオフスカス／　ｐＨＪ　Ｌ２０Ｘ、　Ｓ　、
グリセオフスカス／　ｐＨＪ　Ｌ２１０．　Ｓ−グリセ
オフスカス／　ｐＨＪ　Ｌ２１１．　　大腸菌Ｋ１２Ｃ
６００Ｒｋ−Ｍｋ　−／ｐＨＪＬ２０１．大腸菌に１２
Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ−／ｐＨＪＬ２１０および大腸菌に
１２Ｃ６００Ｒ−に−Ｍｋ−／ＰＨＪＬ２１１　　が最
も好適である。

本発明のベクターは大腸菌およびストレプトマイセス内
で機能的な複製起源を含有しているので。

宿主の選択に柔軟性がある。従って、クローンされたＤ
ＮＡ配列を大腸菌内にシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）して
新しいプラスミドを組立て、物理的に分析し。

更に、制限部位のマツピングを行い１次いで、再度スト
レプトマイセスにシャトルして機能分析を行い、菌株の
改善を図ることができる。プラスミドの増幅および操作
はストレプトマイセスよりも。

大腸菌内での方がより速く、簡便に行うことができるこ
とから、このことは特に有利な点である。

例えば、本発明のベクターは、大腸菌Ｋ　１２に入れ、
スペクチノマイシンまたはクロラムフェニコールの存在
下で増殖させることにより常法により増幅させることが
できる。このことは、ストレプトマイセス宿主細胞系に
おいては不可能である。

更に、全てのプラスミドベクターは大腸菌に１２内で発
現される耐性マーカーを含有しているので組換え体の選
択は容易である。従って、大量のプラスミドＤＮＡを都
合良く単離でき、しかも、それを、同一の操作をストレ
プトマイセスで行なう場合よりも短時間で行なうことが
できる。

本発明に係る組換えＤＮＡりｏ　−ユングベクターおよ
び形質転逃体は、広範囲な効用を有し、ストレプトマイ
セスおよび関連微生物に使用するための好適なりローユ
ングビヒクルの必要性を満たすものである。その上、抗
生物質に対する耐性を付与する本発明に係るベクターの
能力は、形質転換体を選択する機能的手段を提供するこ
とにもなる。このことは、ベクターＤＮＡを獲得した特
定の細胞を決定し選択することが実際上必要であるが故
に重要である。その存在をＮ認するための機能的な試験
法のない他のＤＮＡセグメントもまた。

本発明に係るベクター上に挿入することができ。

この非選択性ＤＮＡを含有する形質転換体を、適当な抗
生物質を選択することによって分離できる。

このような非選択性ＤＮＡセグメントは、プラスミドの
機能、維持、並びに複製に必要な領域の内部以外ならど
の部位へも挿入することができる。

これには、抗生物質修飾酵素、抗生物ｆｔ１ｌｌＩ性、
抗生物質生合成を特定する遺伝子およびあらゆる型の調
節遺伝子が含まれるが、これらに限定される訳ではない
。

さらに詳細に述べると、ある遺伝子を含む非選択性のＤ
ＮＡセグメントを１例えば、例示プラスミドｐＨＪＬ２
１０の単一のＢａｍＨｉ制限サイトに挿入することがで
きる。、かかる挿入によって、ネオマイシン耐性遺伝子
が不活性化されるので％組換えプラスミドを含６ストレ
プトマイセス形質転換体を容易に同定することができる
。即ち、この場合まずチオストレプトン耐性によって選
択し。

次にネオマイシン耐性でないチオストレプトン耐性形質
転換体を同定する。同様に、所望のＤＮＡセグメントを
例えば、単一のＣ１ａ■制限サイトに挿入してチオスト
レプトン耐性遺伝子を不活性化する。従って、この岨換
えプラスミドを持つ形質転換体もまた。まずネオマイシ
ン耐性で選択し。

次にチオストレプトン耐性でないネオマイシン耐性形質
転換体を同定することによって、容易に同定できる。従
って、ストレプトマイセスおよび関連細胞における抗生
物質耐性による選択能によって、目的とする特定の非選
択性ＤＮＡを含有するごく少数の細胞を効率的に分離で
きるようになる。

上述の抗生物質耐性についての機能試験は、さらに、制
御（コントロール）因子１次は生合成因子として作用し
、個々の抗生物１Ｍ耐性遺伝子の発現を指令するＤＮＡ
セグメントの位置決定にも使用される。プロモーター、
アテニュエーター、リプレッサー、インデューサー、リ
ボゾーム結合サイト等を含む（これらに限定される訳で
はない）上記セグメントは、ストレプトマイセスおよび
関連微生物の細胞における他の遺伝子の発現の制御に使
用される。

本発明の抗生物質耐性付与ベクターは、結合したＤＮＡ
セグメントが宿主細胞中で幾世代にも渡って安定に維持
されることを保証するためにも有用である、抗生物質耐
性付与フラグメントと共有結合し、ストレプトマイセス
または大腸菌のいずれかの中で増殖するこれら遺伝子あ
るいはＤＮＡフラグメントは、非形質転換細胞にとって
は有毒な濃度の抗生物質にこの形質転換体をさらすこと
によって維持できる。そうすることにより、ベクターを
失い、従って共有結合したあらゆるＤＮＡを失った形質
転換体は生育できず、培地から除去される。

このように、本発明に係るベクターは、クローンしたＤ
ＮＡあるいは発現産物が宿主細胞にとって致死的なもの
でない限り、所望のいかなるＤＮＡ配列をも安定化し維
持することができる。

本発明に係るクローニングベクターおよび形質転換体に
よれば、今日ストレプトマイセス忘よび関連細胞内で生
産されている数多くの生成物の収量を向上させるために
遺伝子をクローンすることができる。こうした生成物の
例として、ストレプトマイシ′７．タイロシン、セファ
ロスポリン類。

アクタプラニン、アボパルシン、ナラジン、モネンシン
、アブラマイシン、トフラマイシン、エリスロマイシン
、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、バンコマ
イシンおよヒタイコマイシン等が挙げられるが、これら
に限定される訳ではない。さらに本発明は、商業的に重
要な蛋白質類。

例えばヒトインシュリン、ヒトプロインシュリン。

グルカゴン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン、鳥
類成長ホルモン、牛成長ホルモン、原成長ホルモン、イ
ンターロイキンＩおよびインターロイキン■等、商業的
に重要な工程および物質につながる代謝経路における薄
紫機能、または遺伝子の発現を改善する制御因子、を暗
号化しているＤＮＡ配列をクローンし、特性化し、再構
成するのに有用な選択可能なベクターを提供する。これ
らの望ましいＤＮＡ配列とは１例えばストレプトマイシ
ン、セファロスポリン、タイロシン、アクタプラニン、
アボパルシン、ナラジン、モネンシン。

アブラマイシン、トブラマイシン、テトラサイクリン、
クロラムフェニコール、エリスロマイシン。

タイコマイシン釘よびバンコマイシン誘導体等の誘導抗
生物質の合成を触媒する酵素、または抗生物質もしくは
他の生成物の生合成を仲介し増強させる酵素をコードし
ているＤＮＡを含むが、これらに限定される訳ではない
。

前記の如（ＤＮＡセグメントを、ストレプトマイセスお
よび大腸菌に挿入し、安定化し、シャトル操作すること
ができるので、ストレプトマイセスが産生ずる抗生物質
の収量と利用性の向上を目的とする遺伝子組換え操作を
容易に行うことができる。更に、プラスミドｐＪＬ１９
２の〜２．５ｋｂＫＰｎ■複製起源含有フラグメントは
高いコピー数のプラスミドを与えるので、転写または翻
訳効率の低いＤＮＡ配列の殆んど全てのものを１本発明
のベクターに容易にクローンし、ストレプトマイセスと
大腸菌の間でシャトル操作することができる。

大腸菌に１２Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ−／ｐＪＬ１９２（Ｎ
ＲＲＬ１５０４０）は、幾つかの異なる培地のどれかを
用いて楢々の方法で培養できる。培地中の好ましい炭水
化物源としては、例えば、グルコースおよびグリセリン
が含まれ、窒素源としては例えばアンモニウム塩、アミ
ノ酸混合物およびパフトン類が含まれる。栄養燕機塩類
もまた添加され、これにはマグネシウム、ナトリウム、
カリウム。

アンモニウム、カルシウム、リンｒａ％塩素および硫酸
イオンなどを放出し得る通常の塩類が含まれる。他の微
生物の発育と増殖に必要であるように。

必須微潰元素もまた添加する。こうした微量元素は、通
常、他の培地成分の添加に付随する不純物の形で供給さ
れる。

大腸門Ｋ１２ＣＲ６００Ｒｋ−Ｍｋ　／ＰＪＬＩ９２は
、約６．５〜７．５という比較的広いｐＨ領域に渡って
約２５℃〜４２℃の温度範囲におし）て好気的培養条件
下に発育させることができる。しかしながら。

プラスミドＰＪＬ１９２を最大量生産するためには。

培地のｐＨを約７，２で培養を開始し、約３７℃の温度
に維持するのが望ましい。上記の条件で大腸菌細胞を培
養すれば、プラスミドｐＪＬ１９２８常套の技術によっ
て単離することができる貯蔵体としての細胞が得られる
。

図面の説明 第１図はプラスミドｐＪＬ１９２の制限サイト地図であ
る。

第２図はプラスミドｐＨＪＬ２２００およびｐ）ＩＪ　
Ｌ２２０１　の制限サイトおよび機能地図である。

第３図はプラスミドｐ’ＨＪ　Ｌ　２２’　０２および
ｐＨＪＬ２２０３の制限サイトおよび機能地図である。

第４図はプラスミドＰＨＪＬ２０１の制限サイトおよび
機能地図である。

第５図はプラスミドｐＨＪＬ２００．ｐＨＪＬ２０２、
　ＰＨＪＬ２０１　ｐＨＪＬ２０４　　忘よびＰＨＪＬ
２０５　　の制限サイトおよび機能地図である。

第６因はプラスミドＰＨＪＬ２１０およびｐＨＪＬ２１
１の制限サイトおよび機能地図である。

以下に実施例を挙げ１本発明の詳細な説明する。

本発明の説明、および本発明の組立てに用いた実際の方
法を適宜記述した。

実施例１　大腸菌夏’　１２　Ｃ６００Ｒｋ−Ｍ　ｋ−
／ＰＪＬ１９２の培ｇ！２よびプラスミドｐＪＬ１９２
の単離 大腸菌１（１２Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ−／ｐ　Ｊ　Ｌｌ　
９２（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５０４０）の細菌コロニー１
個を。

水溶液１７？中ニ、ハクト（Ｂａｃｃｏ））リプトンｌ
ｏＬバクト酵母エキス５ｇおよびＮａＣｇｌＯｇを含有
しく　ＰＨ７，５）、、さらにアンピシリン２５μｇｌ
ｕｔを含んでいるＬＢ培地に、通常の微生物学的手法に
従って接種した。この培養物を３７℃で一夜インキュヘ
ー）（、り。翌朝、　ｌ　ｒｎＭ　Ｍｇ　５０４．０．
２饅グルコース、、３−４％ＣＡＡ（カザミノ酸。

Ｄｉｆｃｏ　）　、　２μｇ／ｌｅｌ　Ｂ　１　（チア
ミン−Ｈ（Ｊ、Ｓｉｇｍａ　）および添加物を補充した
Ｍ９培地〔ミラー　（Ｍｉ　ｌｉ　ｅ　ｒ　）ら、１９
７９．エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジエネ
ティックス（Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎｅｃｉｃｓ　）、　：Ｉ−
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイズ（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ　）　＋ニアー／ｌ／ド・スフリング・ハーバ−
、ニューヨーク〕５００ｍ１に、上記の一夜培養物５　
ｍｌを接種した。培養物を、激しく振盪しながら３７℃
で一夜インキユベートシ、翌朝得た一夜培養物の標本を
、補充したＭ９培地に、希釈率１／１０〜１１５０で接
種し。

激しく振盪しながら３７℃で２−〜３時間インキ２　　
　・ ユベートした。青色フィルターを用いて測定した培養物
の濁り度は約３００〜４００　Ｋｊｅｔｃ単位セあった
。この培養物に多口ラムフェニコール（１５０−１７５
μｇ／ｗｌ　）を加えて、激しい振盪下でのインキュベ
ーションを更に一夜Ｍけた。

′４℃において５分間％７．５０　Ｏｒｐｍで遠心して
細菌細胞を収獲し、次い去ｓＶ（，１５ＭＮａＣｌ’１
、ＩＭＮａＥＤＴＡ　　ｐＨ８，０）２０Ｄ、’ｘｌで
２回洗浄した。このペレットを、ＴＳ溶液（２５％スク
ロース、５０ｍＭ）リス、　ｐｆ（ｓ　）　ニ１０５ｅ
ｌｆ　（１ｍ重置）の割合で懸濁し、氷上に置いた。こ
の懸濁液にリゾｆ−ム（５Ｑ　ｍＭ　）リスー’ＨＣＪ
ｐ’Ｈ７，１３中５１１９／ｄ）を２ｘｌ／ｆｃ湿重簗
）７）割合で加え。

５分間、氷の上で冷やした。次いで、、２５ＭＥＤＴＡ
（ＰＨ８，０”）を１６　ｍｌ／　Ｉ　（湿重量）の割
合で加え、更に５分間冷却し７’ｃｏ’溶菌溶液（，４
％デオキシ：ｌＬ／　−ト、１％Ｂｒ１ｊ　′５８．　
５０ｍＭ　トリスおよび、０６２５　ＭＥＤＴＡ、　ｐ
Ｈ８）−１６ｉｘｌ／　ｌ　（湿重量）を加え、得られ
た混合物を３“７℃で１≦−３０分間インキュベートし
た。ツルポール（５ｏｒｖａｌｌ）ＳＳ３４　　ロータ
ー内で、４℃にｉいて２１．０θＯｒｐｍ　で１５−３
０分間遠心することにより、ＤＮＡを回収した。上滑を
とり、゛これに、１容量の３ＭＮａ、０Ａｃ（ｐＨ８）
および、６４　容量のインレロパノールを加えた。４℃
で遠心しく　ｉｏ、０００ｒｐｍｘ１０分間）、得られ
たＤＮＡペレットを、１容置のＴＥ　（Ｉ　ＱｍＭ　ト
リＸ、１ｍＭＥＤＴＡ、Ｐ）Ｉ８　）に懸濁した。この
プラスミドＤＮＡｙＥ：％既知の手法に従い、ヨウ化プ
ロピジウムを含有する塩化セシウム密度勾配中で遠心し
て平衡化することにより、精製した。

実施例２　ストレプトマイセス−機能的プラスミドｐＨ
ＪＬ２２００、ｐＨＪＬ２“２０１、ｐＨＪＬ２２０２
およびｐＨＪＬ２２０３の組立て Ａ、プラスミドＰＪＬ１９２のＫＰｎ■消化、および〜
２．５ｋｂ複製起源含有制限フラグメントの単離プラス
ミドＰＪＬＩ９２　ＤＮＡ約２０　μＩＶ（２０μｇ）
。

ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、７ｆ’１９／肩ｔ）５μ
ｇ。

水１９μＪ、　Ｋ　　Ｉ（８単位／μｇ”）制限酵素＊
ｌｕｇｎ および反応邂ツクス＊＊５μｅを３７℃で２時間インキ
ュベートした後、７０℃において１０分間加熱し１反応
を藤了させた。０．１容量の３ＭＮａ０Ａｃ（ＰＨ８）
＝次いで２容量の１００％エタノールで処理してＤＮＡ
を沈殿させた。この沈殿処理は。

−２０℃で一葆あるいは一７０℃（ドライアイス上）で
少くとも１５分間冷却してもよい。このＤＮＡ沈殿を７
０％冷エタノールで１回洗浄した後。

乾燥し、ＴＥ　（ｌ　Ｑ　ｍＭ　）リス、ｌ　ｍＭＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８，０）５０μｅに懸濁した。得られたＤＮ
Ａを。

実質上、マニアチイス（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ　）らの方
法〔１９８２、モレキュラー・クローニング％ｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣＪｏｎｉｎｇ　）　、＝ｒ−／ｌ／ド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリイズ、コールド・スプリ
ング・ハーバ−、ニューヨーク）に従い、水平アガロー
スゲル上、１ＸＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリ；ｘ、　−
ＨＣｌ。

ＰＨ８，３、８９ｍＭホウ＠、２．５ｍＭＥＤＴＡ）中
で１ｉ！気泳動させた。

分離したフラグメントを臭化エチジウム染色でゲル上の
位置決めをし、紫外線照射下で螢光性のバンドを観察し
た。所望の〜２．５ｋｂバンドに隣接する位置から薄片
を切り出し、その間隙にＤＥＡＥ−セルｎ−ス（ワット
？　ン（ｗｈａｃｍａｎ）　Ｄ　Ｅ　−８１）濾紙をお
いた。この濾紙に、ＤＮＡが完全に結合するまでＤＮＡ
を電気泳動させた。この沖舐をとり出してｌｏｏｍＭＫ
Ｇｇ　およびＩＱｍＭトリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８）中
で１回洗浄し、溶離緩衝液（ＩＭ　ＮａＣ４，１０ｍＭ
、）すｘ−ＨｃＪ、ｐ）Ｉｓ）中で激しく振り混ぜるこ
とにより、拡散させた。

シリコーン処理したバイレツ・リス・ウールで沖過して
濾紙を除き、ｆ！５液を直接、２容駈のエタノールで処
理してＤＮＡを沈殿させるか、あるいは。

ｌ容量の水で希釈して力）らエタノール沈殿に付すこと
により％ＤＮＡを沈殿させた。ドライアイス上で１時間
、あるいは−２０℃で一覆処理する沈殿法ニよってもよ
い。沈殿させた後、フラグメントをＴＥ緩衝液１００−
５００μｅに再溶解し、以後のライゲーションに供した
。

＊ 制限酵素類およびそれに関する指示は、下記の供給源か
ら得た： ニューイングランド・バイオ・ラボラトリイズ（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏ　　Ｌａｂｓ、）Ｉｎｃ、
３２　　トザー・ロードａ　／’＜　ハリイ（Ｔｏｚｅ
ｒ　Ｒｏａｄ　　Ｂｅｖｅｌｙ）　。

マサチューセッツ０１９１５ べ−リーガーーマンハイム・バイオケミカルス（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ　）、７９４１キヤツスルウエイ・ドライブ
（Ｃａｓｔｌｅｗａｙ　　Ｄｒｉｖｅ）Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ
　　５０８１６インデイアナポリス、インディアナ４６
２５０ ベサスダ・リサーチ・ラボラトリイズ（Ｂｅｃｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　
Ｉ　ｎｃ　０．８７１７グローブモント・サークル（Ｇ
ｒｏｖａｎｏｎｔ　　Ｃ１ｒｃｌｅ　）Ｐ　、Ｏ。

Ｂｏｘ５７７、ガイザースバーグ、メアリーランド＃に
、ｎ■制限酵素のための反応ミックスは、以下の組成物
から調製された： ５ＱｍＭ　Ｎａ（Ｊ ６０ｍＭ）すｘ　−ＨＣｇ、　　ｐＨ７，５６０ｍＭ　
Ｍ　ｇ　ＣＩ　２ ６０ｍＭ２−メルカプトエタノール Ｂ、プラスミドＰＬＲ２のチオストレプトン耐性−付与
フラグメントの消化と単離 アメリカ特許第４．４１６．９９４号によってその組立
て万が開示されているプラスミドＰＬＲ２ＤＮＡ約２０
μｇを、このプラスミドを４箇所で切り開く制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ＊で消化する。こうして生成するＢａｍＨＩ−
末端を、マニアナイスら（１９８２年）つ５記述した如
く、クレノー（１（Ｊｅｎｏｗ　）ポリメラーゼ■でう
める（　ｂＮＪｅｄｉｎ）。次に、これらの平滑末端フ
ラグメントをＫｐｎｌりンカー（配列：ｐＣＧＧＴＡＣ
ＣＧの、自己相補性オリゴヌクレオチドからなるりンカ
ーであって、コラボラテイブ・リサーチ（ＣｏＮａｂｏ
ｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　）　、　Ｉｎｃ。

１２８スプリング・ストリート（Ｓｐｒｉｎｇ　５ｔｒ
ｅｅｔ）。

レキシントン、マサチューセッツ０２１７３から入手可
能である〕と結合させてプラスミドｐＪＬ１９２の〜２
．　ｓ　ｋｂ　Ｉ（、ｎＩ（Ｉａ起源含有フラグメント
とライゲーションするための、　Ｋ　ｐ　ｎ　（開裂部
位を供給する。ＰＬＲ２から得たＤＮＡフラグメント２
０μｇを、５−りん酸化合成オリゴヌクレオチドｐｃＧ
ＧＴＡｃｃＧ２００ピコモルの存在下、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液（２ＱｍＭ）リス、　ｐＨ７，６゜Ｑ、　５
　ｍＭＡＴＰ、１０ｍｈ４　　Ｍｇ（Ｊ２　、５　ｍＭ
ジチオツ・トレイトール）２０μｌ中で、２０−２２℃
において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ＃１０単位で一夜処理す
る。次いで、この溶液を７０℃で１０分間加熱してライ
ゲーションを終止させる。Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ消化してりン
カーを開裂させ、に、ｎＩ末端を存するフラグメントを
１％ＡＧＨによって分離する（アガロースゲル電気泳動
）、最初にゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線でフ
ラグメントの位置を定め、次いで濾紙から目的物を溶離
する。という前記実施例２Ａの方法に従って、〜１．５
ｋｂフラグメントをゲルから単離する。

＊ＢａｍＨＩ制限酵素のための反応ミックスは。

以下の組成物で調製した： ｌ、５Ｍ　ＮａＣ１ ６０ｍＭ　　トリｘ　−Ｈ（Ｊ　、　ｐＨ７，９５０ｒ
ｎＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ（１２ ＊＊Ｔ４ＤＮＡ　　！Ｊガーゼは下記の供給源から入手
し得る： ニューイングランド・バイオ・ラボラトリイズ。

Ｉｎｃ、３２）ｆ−・ロード・ベバリイ、マサチューセ
ッツ　０１９１５ ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズＰ、Ｏ，Ｂｏｘ５
７７　ガイザースバーグ、メアリーランド２０７６０ベ
ーりンガー・マンハイム・バイオケミカルスフ９４１キ
ヤツスルウエイ・ドライブＰ、０．Ｂｏｘ５０８１６イ
ンデイアナポリス、インディアナ（４６２５０）Ｃ−プ
ラスミドｐＨＪＬ２２００およびＰＨＪＩ−２２０１を
生成させるためのライゲージプラスミドＰＪＬ１９２Ｄ
ＮＡの〜２．５ＡＫＰｎ■フラグメント（実施例２Ａ）
約２０μｇ、プラスミドＰＬＲ２ＤＮＡの〜１，５　ｋ
ｂ　ＢａｍＨＩ　７５グメント（実施例２Ｂ）２０μｔ
Ｆ、５Ｘキナーゼ／リガーゼ緩衝液（実施例４Ｂ）１０
μＪ、ｇよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μＪＶ１６℃で４時
間インキュベートする。次いで、このライゲーション生
成物を、Ｉ［接ストレプトマイセス菌株の形質転換に用
いることができる。プラスミドＰＨＪＬ２２００および
Ｐｉ（Ｊ　Ｌ２２０Ｘ　　の制限サイトおよび機能地図
を添付の第２図に示す。

Ｄ、プラスミドｐＨＪＬ２２００のＢｃｌ工部分消化プ
ラスミドＰＪＬ１９２．ＫＰｎＩ制限酵素および反応ミ
ックスの代りにプラスミドｐＨＪＬ２２００゜Ｂｃｌｌ
■制限酵素および反応ミックスゝを用いる外は実施例２
Ａと実質上同様にして所望の消化を行う。なお、反応温
度は５０℃であり、また、２回のフェノール抽出％３回
のエーテル抽出の後、エタノール沈殿に付して反応を終
了させ、得られた沈殿を水に懸濁し、以後のＡＧＥ処理
に供する。

＊ＢｃｌＩ制限酵素の九めの反応ミックスは以下の成分
からｍ’ｌＪ！ｔ、たニ ア５０ｍＭＫ（Ｊ ６０ｍＭ　トリＸ−ＨＣ１，ｐ）１７．４（２５℃）１
００　ｍＭ　ＭｇＣｌ２ １　Ｑ　ｍＭジチオトレイトール Ｅ、プ５　スｆｉ　）’ｐＬＲ１ノ〜３．４　ｋｂ　Ｂ
ａｍＨＩ　７ラグメントの消化および単離 プラスミドｐＪＬ１９２およびに、ｎ１制限酵素の代り
に、アメリカ特許ｆｇ４．４１６．９９４号でその組立
て方法が開示されているプラスミドｐＬＲ４およびＢ　
ａ　ｍ　ＦＩ　Ｉ制限酵素を用いる以外は、実質上。

実施例２人と同様にして所望の消化を行う。

Ｆ、プラスミドｐＨＪＬ２２０２　およびｐＨＪＬ２２
０３を生成させるためのライゲーション実質上、実施例
２Ｃと同様にして所望のライゲーションを行う。〜３．
４　ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ　’ネオマイシン耐性付与フラ
グメントは、プラスミドｐＨＪＬ２２００の２つのＢａ
ｍＨ１部位のいずれにも、どちらの方向性によってもラ
イゲートし得るので。

所望の表現型を持った。４つの方向性の組換えプラスミ
ドが得られる。プラスミドｐＨＪＬ２２０２およびｐＨ
ＪＬ　２２０３の制限サイトおよび機能地図を添付のＩ
Ｊ３図に示す。

実施例３　ストレプトマイセス・グリセオフスカス／Ｐ
ＨＪＬ２２００およびＳ、グリセオフスカス／ｐＨＪＬ
　２２０２の組立て Ａ、プロトプラストを調製するための、培養物の増゛殖 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ　）％ロックビレ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　
）　、ｙｌ　７１Ｊ　−５ン）−２０８５２のパーマネ
ント・ストック・カルチャー・コレクションに寄託され
、その一部を構成しており、寄託番号ＡＴＣＣ２３９１
６の下、誰でも入手可能である菌株、Ｓ、グリセオフス
カス（Ｓ。

ｇｒｉｓｅ。ｆｕｓｃｕｓ　）　ヲ＝　４−グリシ、全
補充し７１（ＴＳＢ＊中において、液中条件下、３０℃
で２０時間増殖させることにより、常法通り栄養接種物
を調製した。Ｓ、グリセオフスカスのプロトプラスト化
は時間がかかるが、一般に次の様にして行われる。

ＹＭＸ寒天（０，３％酵母エキス、０．３％麦芽エキ　
　、ス、０．２％デキストロースおよび２％寒天を含有
する平板上にＳ、グリセオフスカスを直線接種する。約
４８時間後、１個の細菌コロニーを１ＯＵＩｌのＴ　Ｓ
　Ｂ＊に接種し；ホモジナイズ（均質化）シ。

次いで３０℃で一夜インキユベートスる。次いで、−夜
培養物４ｘｌをホモジナイズし１．４％グリシンを補充
したＴ　Ｓ　Ｂ　１００ばを加え、３０℃で一夜培養す
る。次の日の午後に、得られたばかりの一夜培養物を用
いて上記操作を繰返し１行う。翌朝。

この培養物に５０％（Ｖ／Ｖ）グリセリン５０　ｔ、ｘ
ｌを加え、試料１５１１Ｉｌを一２０℃で凍結する。こ
の凍結細胞は６力月間保存することができ、それを形質
転換に用いることができる。水を張ったビーカー内にチ
ューブを入れ、室温に放置することにより、凍結細胞を
解凍する。ベンチ・トップ（ｂｅｎｃｈｔｏｐ　）遠心
器内に細胞を収穫し、１０．３％スクロース１０ゴ中で
３回洗浄する。この細胞ペレットを、リゾチーム（１′
ＩＩｇＺ肩ｌ）を補充したＰ培地〔ホップウッドおよび
ライト（Ｈｏｐｗｏｏｄ　ａｎｄ　Ｗｒ　ｉｇｈｃ　）
。

、１９７８．ジャーナル・オブｄモレキュラー・アンド
・ジェネラル・ジェネティックス（ＪｏＭｏｌｅ−ｃｕ
Ｊａｒ　　ａｎｄ　　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ）　１６２　：　３０７　）１０Ｉｌｌに懸濁し、３
０℃で２時間インキュベートする。遠心してプロトプラ
ストをペレット化し、得られたペレットを、洗浄の度に
Ｐ培地１ｏＩｔｌ中で渦巻かせ１次いで該ペレットをピ
ペットで溶液に加えることにより、３回洗浄する。最終
的に得られたペレットをＰ培地２ｍｌに懸濁し、以後の
形質転換に供する。

＊トリブチカーゼ・ンイ・ブロスは、ジフコ・ラボラト
リイズ、デトロイト、ミシガンまたは、バルチモア・バ
イオロジカル・ラボラトリイズ（Ｂａｌｃｉｍｏｒｅ　
　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　）、　ｐ。

０、Ｂｏｘ　２４３　ｂコツキースビレ、メアリーラン
ド２１０３１から入手可能である。

Ｂ、形質転換 ライゲーション緩衝液中のプラスミドＤ　Ｎ　Ａ約１０
μｌとＳ、グリセオフスカスのプロトプラスト約１５０
μｇとを試験管内で軽く混合する。この混合物に、５０
％ＰＥＧ１００Ｏ（ポリエチレングリコール、　Ｓｉｇ
ｍａ　）　７）　Ｐ培地中温合物約１０１μｇを加え、
ピペットを用いて混合す、る。１〜２分間経過した後、
Ｐ培地を加えて容量をｌ　ｍｌにする。形質転換し几則
胞をＲ２培地中にプレートシ。

３０℃で一夜インキユベートする。再生してきたプロト
プラストに、チオストレプトン４００μＶｍｅを含んだ
Ｒ２オーバーレイ（上掛け）３ｇｔを積層し、３０℃で
少くとも４日間インキュベートする。得られたＳ、グリ
セオフスカス／　ｐＨＪ　Ｌ２２００チオストレプトン
耐性コロニーは既卸の方法で単離して培養し、実施例３
Ｃの記載に従って常法通り同定することができる。次い
でこの形質転換体培養物を用いて引き続きプラスミドＤ
ＮＡを生産。

単離する。

Ｓ、グリセオフスカス／ＰＨＪＬ２２０２　形質転換体
は、再生するプロトプラストに、ネオマイシン５０ｆｉ
ｇ／ｍｌ　　とチオストレプトン４００μｇ／ｗｌとを
補充したＲ２オーバーレイを積層することにより、チオ
ストレプトン耐性およびネオマイシン耐性に関して選択
することができる。得られたグリセオフスカス／ＰＨＪ
Ｌ２２０２チオストレプトンおよびネオマ、イシン耐性
コロニ・−を既仰の方法で単離し、実施例３Ｃで示した
方法に従って同定する。

Ｃ，Ｓ、グリセオフスカス形質転換体の分析得られた形
質転換体をチオストレプトン（４０Ｉｌｌｍｌ）を補充
したＹＭＸ寒天（０，３％酵母エキス、０．３％麦芽−
１−１−ス、０．２％デキストロースおよび２％寒天）
上で培養し、単独のコロニ一群を得る。これらのコロニ
ーを、チオストレプトン（４０μｇ／ｌｘｌ　）を含ん
だＴＳｕ培養物１０＋ｔｉ？ＩＣ接種する。この培養物
をロータリー・シェーカー（ｒｏｔａｒｙ　　５ｈａｋ
ｅｒ　）　　中でホモジナイズし、３０℃で一夜増殖さ
せる。

この培養物をホモジナイズし、チオストレプトン（４０
ｊｉｇ／Ａ１１ｌ）　ヲ補充Ｌ７’ｃ　２００　ｔｔｔ
ｌｃＱ　Ｔ　Ｓ　Ｂ　ｇよび０．７４％グリシンに加え
％３０℃で１〜２日間増殖サセす。ンルボールＧ　Ｓ　
Ａ中、　１０．０００　ｒ　Ｐｍで１５分間遠心して細
胞を収穫する。この細胞を２５％スクロースおよびリゾ
チーム（５Ｗｆ／／ｙｔｔｌ）を含有するＴ　Ｅ　Ｌ　
００　ｄに懸濁する。３７℃で１時間インキュベーショ
ンした後、、２５ＭＮａＥＤＴＡ（ＰＨ８，０）５０屑
ｌを加える。試料２５ゴを２０％ｗ／ｖＳＤＳ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム）１ゴを入れたツルポール・チューブ
に移し、室温で２０〜３０分間、静かに混合して細胞を
溶菌する。５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ４８Ｈ１を加えた後、室温
で３０分間、静かに混合し、細胞を１主時間氷上に置く
。ツルボール、ローター内で、１５．００　Ｏｒｐｍで
２０分間遠心してＤＮＡを回収する。上清を集め１．６
４容量のインプロパツールを加えてＤＮＡを沈殿させ。

１０．０００　ｒＰｍで２０分間遠心する。上清をデカ
、トシ、得られたＤＮＡペレットを風乾してＴＥ緩衝液
１０ｍ１に懸濁する。次いでこれを、実施例１で述べた
如（ＣｓＣ４平衡化グラディエンドにより、精製するこ
ともできる。

実施例４（■）プラスミドＰＨＪＬ２００、ｐＨＪＬ２
０１、ＰＨＪＬ２０２、ｐＨＪＬ２０３　、ＰＨＪＬ２
０４、およびｐＨＪ’Ｌ　２０５並びに（ＩＩ）これら
プラスミドによる大腸菌Ｋ　１２　　Ｃ６００Ｒｋ”Ｍ
　ｋ−ｆ）形’Ｘｋ換体の組立て ■、プラスミドの組立て Ａ、プラスミドＰＪＬ１９２のＫＰｎ１部分消化以下の
消化を行った。実施例１の方法に従い、水２５μ１％Ｂ
５Ａ３μｇ　−１０ｘＫ　ｐ　ｎ　Ｉ制限緩衝液５μｅ
およびＫ　ｐ　ｎ　Ｉ酵素２μ４を混合し、３７℃でイ
ンキュベートすることにより、プラスミドｐＪＬ１９２
ＤＮＡ約１３μｇ（約３．２５μｇ）を調製した。１５
．３０．６０．９０および１２０分の間隔をあけて１０
μｅづつをとり、水４０μｌと混合し、７０℃で１０分
間加熱した。このプロトコールによって、ＫＰｎＩ制限
酵素で開裂されなかった分子からｈ　Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ制
限酵素で完全に消化された分子に至るまでの、あらゆる
可能な反応生成物を生産することができる。これらの各
部分に、　ｌ／ｌ　Ｏ容量（７）　３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ
　、ｐＨＢ　　および２容ｌのエタノールを加えてＤＮ
Ａを沈殿させ％−７０℃−？Ｘ時間、凍結した。

Ｂ、ライゲーション 各沈殿を集め、２回洗浄して風乾し、次いで水２０μｅ
に懸濁した。各懸濁液から６μｌをとり、５ｘキナーゼ
／リガーゼ緩衝液＊２０μＪ、０．６６ＭＡＴＰ％ｐＨ
７，４４０μｌ、水３３μｌおよびＴ４ＤＮＡＩＪｆｆ
−ゼ（ベーリンガー・マンハイム〜１単位／μｍ１μｅ
を含む溶液と混合し、１５℃で７２時間インキュベート
し、自己環化を促進した。インキュベーションし念後、
各懸濁液から５０μｅとり、温度を７０℃に上げて１０
分間保ち。

反応を終止させた。これらの懸濁液から上記の如くにし
て沈Ｒ５：析出させ、１５μｌの水に懸濁した口 ＊５ｘキナーゼ／リガーゼ緩衝液は、下記の構成４分か
ら調製された： ２５０　ｍＭ　）すｘ　−’ＨＣｌ　、　ＰＨ７，’　
８２５％グリセリン ２５　ｍＭジチオトレイトール ５０ｍＭＭｇｃｅ２ 実施例５ 大腸菌　Ｋ１２　　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−／ｐＨＪＬ２
０１゜大腸菌　ｔ（１２Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−／ｐＨＪ
Ｌ２００゜大腸菌　Ｋ１２　　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−／
ＰＨＪＬ２０２大腸菌　Ｋ１２　　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ
−／ＰＨＪＬ２０３大腸菌　Ｋ　ｌ　２　　Ｃ６００Ｒ
ｋ　−Ｍ　ｋ　−／　ｐ　ＨＪ　Ｌ　２０４およｄ大腸
菌に１２　　Ｃ６００’Ｒｋ−Ｍｋ　−／ＰＨＪＬ２０
５の組立て Ａ、凍結コンピテント大腸菌に１２　Ｃ６００’Ｒｋ−
Ｍｋ−の調製 ＡＴＣＣに寄託されている苗株であって、寄託番号ＡＴ
Ｃ’Ｃ’３３５２５の下で広く入手可能な、大腸菌に１
２　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−の−夜培養物を、調製したば
かり°のＬ−ブロス〔ミラー（ＭｉＩＪｅｒ）。

〒９７２、エクスヘリメンツ・イン・モレキュラー・ジ
エネテイツクｘ　（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　）　　コール
ドスプリングハーバ−舎うボラトリイズ、コールドスプ
リングハーバ−、ニューヨーク〕中、１：１０の割合で
継代培養し、３．７℃で１時間増殖させた。合計６６０
ＫＪｅｔ’を単位の細胞を収穫し、ｌ　ＯＯｍＭ　Ｎａ
Ｃ１２，５屑ｌで洗浄して１５０　ｍＭ　ＣａＣｊ１２
２．５　ｔｙｔｌに懸濁し、室温で２０分間インキュベ
ートした。遠・けして細胞を【■獲し、１５０　ｍＭ　
ＣａＣＪ２−１０％グリセリｙ　Ｏ，５ｘｔｌに懸濁し
、氷上で３−５分間冷やした後、凍結した。

使用するまで、この細胞懸濁液を液体窒素中に保管した
。保存ま友は保管は、生育能２よび共有結合的に環化し
たＤＮＡによる形質転換の頻度に悪影響を及ぼさなかっ
た。

Ｂ、形質転換 コンピテント細胞を水浴中で解凍し、この細胞、ｌ＊ｔ
に対し１．０５ｍ１の割合のＤＮＡ（実施例４Ｂおよび
６Ｃで得九もの１２．５１１ｇ）２ヨび、ｌＸ５ｓｃ（
，０１５Ｍ　　Ｎ＠ＣＪ、、００１５Ｍクエン酸ナトリ
ウム、　ｐＨ７）　３７．５μｅを混合した。この形質
転換混合物を氷上で２００分間冷し、４２℃で１時間熱
衝撃を与え、氷上で１０分間冷却した。次いでこの試料
をＬ−ブロス、８５ｘｌで希釈し、３７℃で１．５時間
インキュベートし、アンピシリン（５０μｇ／ｄ）を含
んだし一寒天上に広げ、３７℃で１８時間インキュベー
トした。得られた正しい表現型Ｒｓ （Ａ　　、Ｔ、＞を有Ｔるコロニーを、エツクノ１−ト
（Ｅｃｋｈａｒｄリ　らの壁内溶菌法（ｉｎ−ｔｈｅ−
ｗａｌｌ−Ｉｙｓｉｓ＞　　＜　１９７８．プラスミド
、１ｊ５８４）と実質上同様にして、プラスミドの大き
さに関し。

スクリーンした。この様にして得られたコロニーは、所
望の大腸菌Ｋ　ｌ　２　Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ　−／ｐＨ
Ｊ　Ｌ２０１、大腸菌Ｋ１２　　Ｃ５ＱＱＲｋ−Ｍｋ−
／Ｐ）ｉＪＬ２００、大腸菌Ｋ　ｌ　２　Ｃ６００Ｒｋ
−Ｍｋ−／ｐＨＪ　Ｌ２０２、大腸菌Ｋ１２　に６００
Ｒｋ−Ｍｋ−／ＰＨＪＬ２０３、大腸菌に１２　Ｃ６０
Ｃ６００Ｒｋ−／ｐＨＪＬ２０４および大腸菌に１２　
Ｃ６Ｃ６００Ｒｋ−−／ｐＨＪＬ２０５　形質転換体を
構成していた。既仰の方法に従ってアンピシリン耐性、
テトラサイタリン感受性のコロニーを単離して培養し、
これを用いて共有結合的に閉環したＤＮＡを精製し１次
いでこのＤＮＡを構成プラスミドの制限酵素分析並びに
ＡＧＥ分析によって常法通り同定した。次いで、この同
定した形質転換体を使用し、大腸菌に１２　　Ｃ６ｏＯ
Ｒｋ−Ｍｋ−／ｐＪＬ１９２の代りに所望のプラスミド
を含む菌体を用いる外は実施例１と同様の方法に従って
、プラスミドｐＩ（ＪＬ２０１−ＰＨＪＬ　２００、ｐ
ＨＪＬ２０２．ｐＨＪＬ２０３、ｐＩ−ＩＪＬ２０４お
よびＰＨＪＬ２０５を生産し、単離した。

プラスミドｐＨＪＬ２０１の制限サイトおよび機能地図
を添付の第４図に示す。プラスミドｐＨＪ　Ｌ２００、
　ｐＨＪ、Ｌ２０２．　ｐＨＪ　Ｌ２０３．　ｐＨＪＬ
２０４およびＰＨＪＬ２０５　　の制限サイトおよび機
能地図を添付のｊｇ５図に示す。

実施例６　プラスミドｐＨＪＬ２１０　　およびｐＨＪ
Ｌ２１１の組立て Ａ、プラスミドＰＨＪＬ２０１のＢａｍＨ１部分消化プ
ラスミドｐＨＪＬ２０１（実施例５の方法に従って開裂
したもの）約１０μ１（１０μｇ）、ＢＳＡ（ＩＭ９／
ｙｇｌ）　５ｔ１ｇ、水２９ｆｉｌ、ＢａｍＨＩ　制限
酵素（水で１：＋に希釈）ｌμｌ、およびＢａｍＨＩ反
応ミックス５μＩを３７℃で１５分間インキュベートし
た。７０℃で１０分間加熱して反応を終結させた。実施
例１の方法に従い、ＡＧＨによって、［線状プラスミド
分子の全長に相当する部分消化産物から、より短い、完
全消化産物を除き。

精製した。実施例４の方法と実質上同様にしてＤＮＡを
沈殿させｆｃ、得られたＤＮＡの沈殿を水２０μｅに懸
濁し１次のライゲーションに供した。

Ｂ、プラスミドＰＬＲ２の〜ｌ　ｋｂ　Ｂｃｌｌ制限フ
ラグメントの単離 大部分の大腸菌Ｋ１２株は自己のＤＮＡのある残基をメ
チル化する０例えば、ｄａｍ遺伝子によって指定される
メチラーゼは、ＤＮＡ配列、５０ＡｍｅＴＣ３中の指示
されたアデニンをＮ６位でメチル化する。この様にメチ
ル化することにより。

その認識配列がこのメチル化された配列で構成されてい
るか、あるいは、その様な配列を包含しているある種の
（全てではない）制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ
の開裂が妨害されることが分っている。本発明において
一般的に用いている制限酵素、Ｂｃｇｌは、ＢｃＪＩ認
識配列テする５ＴＧＡＴＣＡ３　がメチル化されていれ
ば、これを開裂しない。この様な問題を避ける之めに、
ＰＬＲ２は。

例えば、ＧＭ４８（ノーザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリイ、ペオリア、イリノイスに寄託され、そ
のパーマネント・ストック・カルチャー・コレクション
の一部となっている菌株）の如き大、ＩＪ、’［ｄａｍ
−株に導入（トランスフオーム）する必要がある。この
菌株は寄託第号ＮＲＲＬＢ−１５７２５の下、誰でも入
手できる。次いで、　ＢａｍＨＩ制限酵素の代りにＢｃ
ｌｌ　　制限酵素を用いる外は実施例２Ｂの方法と実質
的に同様にして所望の消化を行う。実施例１の方法に従
い、ＡＧＨによって〜１ｋｂＢｃＪＩ　　制限フラグメ
ントを精製する。

Ｃ，ライゲーション 実施例２Ｃの方法と実質的に同様にして所望のライゲー
ションを行う。様々なプラスミド組立て物が形成される
が、所望の組換えプラスミドは、ネオマイシンおよびチ
オストレプトン耐性表現型のものである。更に、〜１　
ｋｂ　Ｂｃｌｌ耐性付与フラグメントはどちらの方向を
もとり得るので、２つの方向性に係るプラスミドが生産
される。プラスミドｐＨＪＬ２１０およびｐＨＪＬ２１
１の制限サイトおよび機能地図を添付の＠５図に示す。

実施例７　大腸菌Ｋ　１２　　Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ　−
７ｐＨＪＬ２１０および大腸菌Ｋ　ｌ　２　（：６００
　Ｒｋ−Ｍｋ−／ＰＨＪＬ２１１の組立て プラスミドｐＨＪＬ２００．ｐＨＪＬ２０１、ｐＨＪＬ
２０２％ｐＨＪＬ２０３、ｐＨＪＬ２０４およびｐＨＪ
Ｌ２０５の代りにプラスミドｐ）ＩＪＬ２１０およびｐ
ＨＪＬ２１１を用いる外は、実施例５の方法と実質的に
同様にして所望の組立てを別々に行い５選択し１回収し
た。

実施例８　ストレプトマイシス・グリセオフスカス／　
ｐＨＪ　Ｌ２０１、Ｓ、グリセオフスカス／ｐＨＪＬ２
１０およびＳ、グリセオフスカス／ｐＨＪＬ２１１の組
立て プラスミドｐＨＪＬ２２００　　ではなくプラスミドｐ
ＨＪＬ２０１　を用い、また選択に際して、チオストレ
プトンの代りにネオマイシンを、最終的な平板中の濃度
が２μｇ／μｅとなるに充分なｔ、倉荷せしめたトップ
・アガーを使用する外は、実施例３の方法と実質的に同
様にして所望の組立てを個々に行い、選択し１回収した
。同様に、プラスミドｐＨＪＬ２２０２　　の代りにプ
ラスミドｐＨＪＬ２１０およびｐＨＪ　Ｌ２１１　　を
用いる外は実施例３の方法と実質的に同様にしてｐＨＪ
Ｌ　２１０およびｐＨＪＬ２１１の組立てを個々に行い
、選択し１回収した。

実施例９　ストレプトマイシス・リビダンス／ＰＨＪＬ
２０１％Ｓ、リビダンス／ＰＨＪＬ２１０　およびＳ、
リビダンス／ｐＨＪＬ２１１　の組立てＳ、グリセオフ
スカスの代りにＳ、リビダンス（Ｉ　１ｖｉｄａｎｓ　
）を用いる外は、実施例８の方法と実質的に同様にして
所望の組立てを個々に行い１選択し１回収した。Ｓ、リ
ビダンスは古くから存在し、良く昶られている菌株であ
って、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリ
イ、ペオリア、イリノイス６１６０４に寄託され、その
一部となっている菌株から、寄託番号ＮＲＲＬＨ−１５
８２６の下、誰でも入手できる。更に、Ｓ、リビダンス
のプロトプラスト化および増殖方法、並びにプロトプラ
ストおよび形質転換体の調製方法は１国際公開ｈｈＷ０
７９１０１１６９の実施例２（国際特許出願患ＰＣＴ／
ＢＧ　７９１０００９５　）に記載されている。次いで
、同定された形質転換体を使用し、実施例３Ｃの方法と
実質的に同様の、既知の方法により、プラスミドｐＨＪ
Ｌ２０１、ｐＨＪ　Ｌ２１０およびｐＨＪＬ２１１を生
産させ、単層した。

実施例１０　　ストレプトマイシス・フラディエ／ＰＨ
ＪＬ２０１．Ｓ、　　フ５デ（工／　ＰＨＪＬ２１１ｒ
よびＳ、フラディエ／　Ｐ）ｌＪＬ２１　Ｌの組立てス
トレプトマイシス・グリセオフスヵスの代りにＳ、フラ
ディエ（ｆｒａｄｉａｅ）を用いる外は。

実施例８の方法と実質上同様にして所望の組立てを個々
に行い１選択し５回収した。Ｓ、フラディ工は古くから
存在し、良く仰られている菌株であって、アメリカン・
タイプ・カルチャー、コレクション、１２３０１パーク
ローン・ドライブ（ＰａｒｋＪａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ　
）、　ｏツクに：し、　メ７１７−５　ｙド２０８５２
に寄託され、その一部となっている菌株から、寄託番号
ＡＴＣＣ：１９６０９の下、誰でも入手することができ
る。なお、Ｓ、フラディエのプロトプラスト化および増
殖のために用いるＴＳＢ培地は改良されたものであり、
グリンン含有量は、２％にすぎない。エンドジーニアス
（内因性）の制限酵素系に起因してＳ、フラディエの形
質転換の頻度は極めて低く、従って、ｐＨＪＬ２０１、
ｐ）ｌＪＬ２１０およびｐＨＪＬ２１１　で形質転換さ
れたＳ、フラディエ宿主の形質転換体のＤＮＡ１μｇ当
りの数は、Ｓ、グリセオフスカスまたはＳ、リビダンス
宿主の場合の数よりも、実質的に少い。しかしながら、
Ｓ、フラデイエから単層されたプラスミドＤＮＡをＳ、
フラディエに再導入（リドランスフオーム）した場合に
は％高頻度で形質転換が起こる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＪＬ１９２の制限サイト地図、第
２図はプラスミドＰＨＪＬ２２００　　およびｐＨＪＬ
２２０１　の制限サイトおよび機能地図、第３図はプラ
スミドｐＨＪ　Ｌ２２０２およびｐＨＪＬ２２０３の制
限サイトおよび機能地図、第４図はプラスミドｐＨＪＬ
２０１　の制限サイトおよび機能地図、第５図はプラス
ミドＰＨＪＬ２００、ｐＨＪＬ２０２、ｐＩ−ＩＪ　Ｌ
２０３．　ｐ）ＩＪ　Ｌ２０４およびｐＨＪＬ２０５の
制限サイトおよび機能地図、第６図はプラスミドｐＨＪ
　Ｌ２１０　およびｐＨＪＬ２１１の制限サイトおよび
機能地図を示す模式図である。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー 代　理　人　弁理士　青白　葆（外１名）ＦＩＧ、Ｉ ｓｉ　Ｉ ＪＬ１９２ ＦＩＧ、２ ｐＨＪＬ２２００ ｐＨＪＬ２２０１ ＦＩＧ、３ ｐＨＪＬ２２０３ ＦＩＧ、４ ｓｔ　Ｉ ｐＨＪＬ２０１ ＦＩ　Ｇ、　５ ＦＩＧ、６ ｐＨＪＬｌｌｌｏ ｐＨＪＩＪ１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）プラスミドｐＪＬ１９２の〜２．５ｋｂＫｐｎ
   Ｉ複製起源含有制限フラグメントと、ｂ）感受性を有す
   る非制限宿主細胞に導入した時、少くとも１個の抗生物
   質に対する耐性を付与し得る１またはそれ以上のＤＮＡ
   セグメントとを含む、適度に高いコピー数を有する組換
   えＤＮＡクローニングベクター。 ２、プラスミドｐＨＪＬ２２００、ｐＨＪＬ２２０１、
   ｐＨＪＬ２２０２またはｐＨＪＬ２２０３である第１項
   記載のベクター。 ３、更に、ｃ）大腸菌の複製起源を含有する制限フラグ
   メントをも含む、第１項記載のベクター。 ４、プラスミドｐＨＪＬ２００、ｐＨＪＬ２０１、、ｐ
   ＨＪＬ２０２、ｐＨＪＬ２０３、ｐＨＪＬ２０４、ｐＨ
   ＪＬ２０５、ＰＨＪＬ２１０またはｐＨＪＬ２１１であ
   る第３項記載のベクター。 ５、プラスミドｐＨＪＬ２０１、ｐＨＪＬ２１０または
   ｐＨＪＬ２１１である第４項記載のベクター。 ６、第１項〜第５項のいずれかに記載の組換えＤＮＡク
   ローニングベクターを含有する、形質転換された非制限
   宿主細胞。 ７、ストレプトマイセス属の菌株である第６項記載の形
   質転換された宿主細胞。 ８、グリセオフスカス、リビダンスまたはフラデイエ種
   のストレプトマイセス菌株である第７項記載の宿主細胞
   。 ９、プラスミドｐＨＪＬ２０１、ｐＨＪＬ２１０または
   ｐＨＪＬ２１１で形質転換されたストレプトマイセス・
   フラデイエである第８項記載の宿主細胞。 １０、第３、４または５項のいずれかに記載のベクター
   で形質転換された大腸菌である第６項記載の宿主細胞。 １１、大腸菌Ｃ６００Ｒ＿ｋ−Ｍ＿ｋ−である第１０項
   記載の宿主細胞。