JPH01304895A - Ｎ‐末端プロリンで始まるタンパク質の製造法 - Google Patents
Ｎ‐末端プロリンで始まるタンパク質の製造法Info
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- JPH01304895A JPH01304895A JP1089576A JP8957689A JPH01304895A JP H01304895 A JPH01304895 A JP H01304895A JP 1089576 A JP1089576 A JP 1089576A JP 8957689 A JP8957689 A JP 8957689A JP H01304895 A JPH01304895 A JP H01304895A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
Ｎ−末端プロリンで始まるタンパク質の遺伝子工学的手
法による調製は、既に開示されている。これは、アスパ
ラギン酸、またはＣ−末端アスパラギン酸を含む短いア
ミノ酸配列物、がプロリンの前に位置している、より長
いタンパク質を先ず発現させるものであり、これが所望
のタンパク質の始まりに相当する。次いで、この中間体
はタンパク質分解によって切断されて、プロリン開始部
を有する所望のタンパク質を遊離する。このタイプの工
程は、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第０．２１９，７８１
号、第０．２２７，９３８号および第０．２２８，０１
８号明細書に記載されている。
法による調製は、既に開示されている。これは、アスパ
ラギン酸、またはＣ−末端アスパラギン酸を含む短いア
ミノ酸配列物、がプロリンの前に位置している、より長
いタンパク質を先ず発現させるものであり、これが所望
のタンパク質の始まりに相当する。次いで、この中間体
はタンパク質分解によって切断されて、プロリン開始部
を有する所望のタンパク質を遊離する。このタイプの工
程は、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第０．２１９，７８１
号、第０．２２７，９３８号および第０．２２８，０１
８号明細書に記載されている。
もちろん、この既知の工程は、遊離されるタンパク質が
充分に酸安定性である場合にのみ適用される。しかしな
がら、比較的に酸安定性であるタンパク質の場合でさえ
も、副反応が起きるおそれがあり、これは、一方では収
率の直接的な減少をもたらし、他方では望ましくない副
産物からの分離の難しさによる更なる収率の減少をもた
らす。
充分に酸安定性である場合にのみ適用される。しかしな
がら、比較的に酸安定性であるタンパク質の場合でさえ
も、副反応が起きるおそれがあり、これは、一方では収
率の直接的な減少をもたらし、他方では望ましくない副
産物からの分離の難しさによる更なる収率の減少をもた
らす。
上記のような限定がなく、さらに記述されたような欠点
を有しない工程がいま見出された。本発明によるＮ−末
端プロリンで始まるタンパク質は、短いＮ−末端伸長部
を有し、かつ遺伝子操作によって得ておいた前駆体を、
アミノペプチダーゼＰで酵素的に切断することによって
、調製される。
を有しない工程がいま見出された。本発明によるＮ−末
端プロリンで始まるタンパク質は、短いＮ−末端伸長部
を有し、かつ遺伝子操作によって得ておいた前駆体を、
アミノペプチダーゼＰで酵素的に切断することによって
、調製される。
前駆体の短いＮ−末端伸長部は、とくに、！Ｒ菌からの
タンパク質の通常の直接的発現において見られるように
、メチオニン残基を含んでなる。しかしながら、好まし
い出発材料は、また、タンパク質混合物であり、直接的
に発現された産生物の場合にみられるように、これらタ
ンパク質はその一部だけがＮ末端にメチオニン残基を有
するものである。今までに知られている工程を用いて、
そのようなタンパク質混合物はきわめて大きい困難性を
ともなってのみ分画することができる。
タンパク質の通常の直接的発現において見られるように
、メチオニン残基を含んでなる。しかしながら、好まし
い出発材料は、また、タンパク質混合物であり、直接的
に発現された産生物の場合にみられるように、これらタ
ンパク質はその一部だけがＮ末端にメチオニン残基を有
するものである。今までに知られている工程を用いて、
そのようなタンパク質混合物はきわめて大きい困難性を
ともなってのみ分画することができる。
所望のタンパク質からアミノペプチダーゼＰを分離する
ことは、その酵素の大きざの故に困難ではない。ざらに
、切断に用いた酵素を既知の方法、例よば、欧州特許（
ＥＰ−Ｂ）第０．１４１，２２３号および第０．１４１
，２２４号明細書およびそれらに記載の文献に記載され
た方法によって固定化することが可能である。
ことは、その酵素の大きざの故に困難ではない。ざらに
、切断に用いた酵素を既知の方法、例よば、欧州特許（
ＥＰ−Ｂ）第０．１４１，２２３号および第０．１４１
，２２４号明細書およびそれらに記載の文献に記載され
た方法によって固定化することが可能である。
アミノペプチダーゼＰは、Ａ、 Ｙａｒｏｎらによって
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ
’３：２．６５８−６６３．１９６８に開示されてお
り、これには、末端プロリンに至るまでのペプチドに対
するＮ−末端攻撃についても記述されている。しかしな
がら、記述されている遊離されるアミノ酸は、中性アミ
ノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン
およびプロリン（後者にもうひとつのプロリンが続く）
および塩基性アミノ酸アルギニンのみである。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ
’３：２．６５８−６６３．１９６８に開示されてお
り、これには、末端プロリンに至るまでのペプチドに対
するＮ−末端攻撃についても記述されている。しかしな
がら、記述されている遊離されるアミノ酸は、中性アミ
ノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン
およびプロリン（後者にもうひとつのプロリンが続く）
および塩基性アミノ酸アルギニンのみである。
アミノペプチダーゼＰは、Ｙａｒｏｎらによって記述さ
れた方法によって容易に単離される。その分子量の約２
Ｘ１０５は、固定化をしなくても所望のタンパク質から
分離することが可能な大きさである。
れた方法によって容易に単離される。その分子量の約２
Ｘ１０５は、固定化をしなくても所望のタンパク質から
分離することが可能な大きさである。
このように、この酵素は、メチオニンを迅速にまた定量
的に切除することから、Ｎ−末端プロリンで始まるタン
パク質を遺伝子操作によって得られる前駆体から、とく
に細菌からの直接的な発現の産生物から得るために、と
りわけ適している。
的に切除することから、Ｎ−末端プロリンで始まるタン
パク質を遺伝子操作によって得られる前駆体から、とく
に細菌からの直接的な発現の産生物から得るために、と
りわけ適している。
本発明は、以下の諸例において詳細に説明される通りで
ある。パーセント表示は重量パーセントを表す。
ある。パーセント表示は重量パーセントを表す。
例」−
アミノペプチダーゼＰを、前出のＹａｒｏｎらの方法に
次のような改変を行った方法によって単離精製する。
次のような改変を行った方法によって単離精製する。
大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） Ｂｔａｌ胞を５０ｍＭ燐酸
ナトリウム緩衝液中で破砕してから遠心分離して、粗細
胞抽出物を５０℃で１５分間インキュベートする。
ナトリウム緩衝液中で破砕してから遠心分離して、粗細
胞抽出物を５０℃で１５分間インキュベートする。
混合物を再び遠心分離して、４５％飽和にて硫酸アンモ
ニウム沈澱を行う。遠心分離の後、酵素は上清液中に見
出される。その後の精製を既知の方法にて行う。
ニウム沈澱を行う。遠心分離の後、酵素は上清液中に見
出される。その後の精製を既知の方法にて行う。
肘２
プラスミド構築に用いる出発材料は、ＥＰ−Ａ第０．２
２８，０１８号明細書からのプラスミドｐｓ２０３およ
びｐＰＨ１６０である。
２８，０１８号明細書からのプラスミドｐｓ２０３およ
びｐＰＨ１６０である。
プラスミドｐｓ２０３は、ＥＰ−Ａ第
０．２２８，０１８号明細書の第１０ａ図において（７
８）として見出されるものである。これは、ヒト顆粒球
マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）の
合成遺伝子を含む。この遺伝子は、複数の制限酵素切断
部位を含んでおり、それらはＥＰ−Ａ第０．２２８，０
１８号明細書の９〜１１ページの諸表に示されている。
８）として見出されるものである。これは、ヒト顆粒球
マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）の
合成遺伝子を含む。この遺伝子は、複数の制限酵素切断
部位を含んでおり、それらはＥＰ−Ａ第０．２２８，０
１８号明細書の９〜１１ページの諸表に示されている。
次の構築に非常に重要なｐＳ２０３の切断部位は、本明
細書の第１図に示される通りである。
細書の第１図に示される通りである。
プラスミドｐＳ２０３をＳｍａｌおよび部分的に５ａｌ
ｌで消化して、大きさが約３８０ ｂｐであって、アミ
ノ酸９／１０からのＧＭ−〇ＳＦのための合成遺伝子を
含むフラグメントを酢離する。
ｌで消化して、大きさが約３８０ ｂｐであって、アミ
ノ酸９／１０からのＧＭ−〇ＳＦのための合成遺伝子を
含むフラグメントを酢離する。
このフラグメントを、５ａｉｌおよびＳｍａＩで開裂し
ておいた市販のベクターｐＵｃ１８に挿入する。コンピ
テントにした大腸菌７９１０２細胞をライゲーション混
合物とインキュベートして、形質転換混合物を２０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＩＰＴＣ；−Ｘｇａ ｌプ
レートに画線する。−晩インキユベートした後に、白色
コロニーを単離して、プラスミドＤＮＡを得る。プラス
ミドＤＮＡを制限酵素分析によって特徴づけする。期待
された制限酵素パターンを有するプラスミドをｐＳ４９
９と称する。
ておいた市販のベクターｐＵｃ１８に挿入する。コンピ
テントにした大腸菌７９１０２細胞をライゲーション混
合物とインキュベートして、形質転換混合物を２０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＩＰＴＣ；−Ｘｇａ ｌプ
レートに画線する。−晩インキユベートした後に、白色
コロニーを単離して、プラスミドＤＮＡを得る。プラス
ミドＤＮＡを制限酵素分析によって特徴づけする。期待
された制限酵素パターンを有するプラスミドをｐＳ４９
９と称する。
プラスミドｐＳ４９９をＥｃｏＲＩおよび部分的に５ａ
ｌＩで消化して、合成ＣＭ−ＣＳＦ遺伝子を含むフラグ
メントを単離する。このフラグメントをここで発現プラ
スミドｐＰＨ１６０に挿入する。この目的のためζこ、
オリゴヌクレオチドＭｅｔ Ｐｒｏ ＡＬａ Ｐ
ｒｏ ＡＬａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ｐｒ。
ｌＩで消化して、合成ＣＭ−ＣＳＦ遺伝子を含むフラグ
メントを単離する。このフラグメントをここで発現プラ
スミドｐＰＨ１６０に挿入する。この目的のためζこ、
オリゴヌクレオチドＭｅｔ Ｐｒｏ ＡＬａ Ｐ
ｒｏ ＡＬａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ｐｒ。
５’ −ＣＡＴＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＣＣＧ
ＧＣＣＣＧＡ ＴＣＧ ＣＣＧ ＴＣＴ Ｃ
ＣＧ −３’ＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧ
ＧＣＴ ＡＧＣＧＧ（ＡＧＡ ＧＧＣＡＧＣＴ（
ＳａＬＩ） を合成して、単離したフラグメントおよび酵素ＮｃｏＩ
およびＥｃｏＲＩで開裂しておいたプラスミドｐＰＨ１
６０と連結させる。これによってＮｃｏ１部位は破壊さ
れる（第２図中のＮｃｏｌ ）。ライゲーション混合
物を用いて、コンピテントにした大腸菌ＭＭ２９４細胞
を形質転換させて、プラスミドを制限酵素およびＤＮＡ
配列分析によって同定する。期待された制限酵素パター
ンを有するプラスミドをｐｓ５００と称する（第２図）
。このプラスミドは、Ｎ−末端Ｍｅｔ−Ｐｒｏ伸長部を
有するＧＭ−Ｃ３Ｆ誘導体をコードする。
ＧＣＣＣＧＡ ＴＣＧ ＣＣＧ ＴＣＴ Ｃ
ＣＧ −３’ＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧ
ＧＣＴ ＡＧＣＧＧ（ＡＧＡ ＧＧＣＡＧＣＴ（
ＳａＬＩ） を合成して、単離したフラグメントおよび酵素ＮｃｏＩ
およびＥｃｏＲＩで開裂しておいたプラスミドｐＰＨ１
６０と連結させる。これによってＮｃｏ１部位は破壊さ
れる（第２図中のＮｃｏｌ ）。ライゲーション混合
物を用いて、コンピテントにした大腸菌ＭＭ２９４細胞
を形質転換させて、プラスミドを制限酵素およびＤＮＡ
配列分析によって同定する。期待された制限酵素パター
ンを有するプラスミドをｐｓ５００と称する（第２図）
。このプラスミドは、Ｎ−末端Ｍｅｔ−Ｐｒｏ伸長部を
有するＧＭ−Ｃ３Ｆ誘導体をコードする。
涯ユ
ＥＰ−Ａ第０．２２８，０１８号明細書に開示されたＣ
Ｍ−Ｃ９Ｆ誘導体を直接的に発現させる類似プラスミド
構築を以下に記述する。
Ｍ−Ｃ９Ｆ誘導体を直接的に発現させる類似プラスミド
構築を以下に記述する。
これらの構築には、プラスミドｐｓ２０３またはｐＳ４
９９のＨｐａＩ切断部位を用いる。
９９のＨｐａＩ切断部位を用いる。
例２と同様にして、ｐＳ４９９をＥｃｏＲＩおよびＨＩ
） ａ Ｉで消化して、合成ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有す
るフラグメントな単離する。しかしながら、オリゴヌク
レオチド（１）の代わりにオリゴヌクレオチド（２） Ｍｅｔ Ｐｒｏ ＡＬａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＧＬｎ５’ −ＣＡＴ
Ｇ ＣＣＧ ＧＣＣＣＧＡ ＴＣＧ ＣＣＧ ＴＣＴ
ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＣＣＣＡＧ −ＧＧＣＣＧＧ Ｇ
ＣＴ ＡＧＣＧＧＣＡＧＡ ＧＧＣＡＧＣＴＧＧ
ＧＴＣＰｒｏ Ｔｒｐ ＧＬｕ Ｈｉｓ ＶａＬ
（２）ＣＣＣ丁ＧＧ ＧＡＡ ＣＡＣＧ
ＴＴ −３’ＧＧＧ ＡＣＣＣＴＴ ＧＴＧ
ＣＡＡ（Ｈｐａｌ） を挿入する。このようにしてプラスミドｐｓ５０２を得
る。
） ａ Ｉで消化して、合成ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有す
るフラグメントな単離する。しかしながら、オリゴヌク
レオチド（１）の代わりにオリゴヌクレオチド（２） Ｍｅｔ Ｐｒｏ ＡＬａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＧＬｎ５’ −ＣＡＴ
Ｇ ＣＣＧ ＧＣＣＣＧＡ ＴＣＧ ＣＣＧ ＴＣＴ
ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＣＣＣＡＧ −ＧＧＣＣＧＧ Ｇ
ＣＴ ＡＧＣＧＧＣＡＧＡ ＧＧＣＡＧＣＴＧＧ
ＧＴＣＰｒｏ Ｔｒｐ ＧＬｕ Ｈｉｓ ＶａＬ
（２）ＣＣＣ丁ＧＧ ＧＡＡ ＣＡＣＧ
ＴＴ −３’ＧＧＧ ＡＣＣＣＴＴ ＧＴＧ
ＣＡＡ（Ｈｐａｌ） を挿入する。このようにしてプラスミドｐｓ５０２を得
る。
オリゴヌクレオチド（２）をオリゴヌクレオチド （
３） Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐ、ｒｏ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ ＧＬｎ ’Ｐｒｏ 工ｒｐ ＧＬｕ
Ｈａｓ ＶａＬ５’ −ＣＡＴＧ ＣＣＧ
ＴＣ了 ＣＣＣＴＣＧ ＡＣＣＣＡＧ ＣＣＣＴ
ＧＧ ＧＡＡ ＣＡＣＣＴＴ −３１ＧＧＣＡＧＡ
ＧＧＧ ＡＧＣＴＧＧ （ＩＴｃ ＧＧＧ ＡＣＣ
ＣＴＴ ＧＴＧ （ＡＡ（ＨｐａＬ） で置換して、プラスミドｐｓ５０３を得る。
３） Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐ、ｒｏ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ ＧＬｎ ’Ｐｒｏ 工ｒｐ ＧＬｕ
Ｈａｓ ＶａＬ５’ −ＣＡＴＧ ＣＣＧ
ＴＣ了 ＣＣＣＴＣＧ ＡＣＣＣＡＧ ＣＣＣＴ
ＧＧ ＧＡＡ ＣＡＣＣＴＴ −３１ＧＧＣＡＧＡ
ＧＧＧ ＡＧＣＴＧＧ （ＩＴｃ ＧＧＧ ＡＣＣ
ＣＴＴ ＧＴＧ （ＡＡ（ＨｐａＬ） で置換して、プラスミドｐｓ５０３を得る。
同様にして、オリゴヌクレオチド（４）Ｍｅｔ Ｐｒ
ｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＧＬｎ Ｐｒｏ 丁ｒ
ｐ ＧＬｕ Ｈｉｓ ＶａＬ５’ −ＣＡＴＧ
Ｃ（Ｇ ＴＣＧ Ａ（Ｃ（ＡＧ ＣＣＣ丁Ｇ
Ｇ ＧＡＡ （ＡＣＧＴＴ −３’ （４）
ＧＧ（ＡＧＣＴＧＧ ＧＴＣＧＧＧ Ａｃｅ （
ＴＴ ＧＴＧ ＣＡＡ（Ｈｐａｌ） の挿入によって、ｐｓ５０４を得る。
ｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＧＬｎ Ｐｒｏ 丁ｒ
ｐ ＧＬｕ Ｈｉｓ ＶａＬ５’ −ＣＡＴＧ
Ｃ（Ｇ ＴＣＧ Ａ（Ｃ（ＡＧ ＣＣＣ丁Ｇ
Ｇ ＧＡＡ （ＡＣＧＴＴ −３’ （４）
ＧＧ（ＡＧＣＴＧＧ ＧＴＣＧＧＧ Ａｃｅ （
ＴＴ ＧＴＧ ＣＡＡ（Ｈｐａｌ） の挿入によって、ｐｓ５０４を得る。
同様に、オリゴヌクレオチド（５）
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｔｒｐ ＧＬｕ旧ｓ ＶａＬ５１ −
ＣＡＴＧ ＣＣＧ ＴＧＧ ＧＡＡ （Ａ
ＣＧＴＴ −３’ （５）Ｇ
ＧＣＡＣＣＣＴＴ ＧＴＧ ＣＡＡ（Ｈｐａｌｌ の挿入によって、プラスミドｐｓ５０５を得る。
ＣＡＴＧ ＣＣＧ ＴＧＧ ＧＡＡ （Ａ
ＣＧＴＴ −３’ （５）Ｇ
ＧＣＡＣＣＣＴＴ ＧＴＧ ＣＡＡ（Ｈｐａｌｌ の挿入によって、プラスミドｐｓ５０５を得る。
明確にするために、ＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸番号をオリ
ゴヌクレオチドに付した。
ゴヌクレオチドに付した。
すべてのＧＭ−Ｃ５Ｆ誘導体の発現を、ＥＰ−Ａ第０．
２２８，０１８号明細書の例１のようにして行う。
２２８，０１８号明細書の例１のようにして行う。
培養条件によって、ＧＭ−ＣＳＦ誘導体は細胞中で溶解
した状態でまたは不溶性の封入体（１ｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙ）として存在する。
した状態でまたは不溶性の封入体（１ｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙ）として存在する。
後者の場合には、細胞破砕の後に、遠心分離によってタ
ンパク質を沈澱物中に濃厚富化することができる。沈澱
物を水で洗浄し、次いでデオキシコレート溶液に再懸濁
させる。懸濁液を遠心分離して沈澱物を再び水で洗浄し
て、６Ｍ尿素を含む５０ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）に溶
解させる（水４ｍｌ当りタンパク質５０ｍｇ）。
ンパク質を沈澱物中に濃厚富化することができる。沈澱
物を水で洗浄し、次いでデオキシコレート溶液に再懸濁
させる。懸濁液を遠心分離して沈澱物を再び水で洗浄し
て、６Ｍ尿素を含む５０ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）に溶
解させる（水４ｍｌ当りタンパク質５０ｍｇ）。
タンパク質のスルフォン化物（ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を
形成するために、約１５ｍ８の亜硫酸ナトリウムを上清
液または溶液に加えて、混合物を室温にて約１２０分間
放置する。１０＋ｎｌに希釈の後、ｐ）Ｉを４．７に調
整して、混合物を一晩放置する。沈澱物を遠心分離して
、沈澱物を水で洗浄してから緩衝ｆｆ （５Ｍ尿素、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ）リス）に再溶解させる。
形成するために、約１５ｍ８の亜硫酸ナトリウムを上清
液または溶液に加えて、混合物を室温にて約１２０分間
放置する。１０＋ｎｌに希釈の後、ｐ）Ｉを４．７に調
整して、混合物を一晩放置する。沈澱物を遠心分離して
、沈澱物を水で洗浄してから緩衝ｆｆ （５Ｍ尿素、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ）リス）に再溶解させる。
この溶液をＲＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＤＥＡＥＴＳＫ物質
（４５〜９０μｍ、メルク社製）を充填してから６Ｍ尿
素、５０ｍＭ）リス、５０ｍＭＮａＣ１゜０．１％（ｗ
／ｖ）界面活性剤（ＲＴＷＥＥＮ）、２ｍＭエチレンジ
アミン（ｐＨ８，７）で平衡にしておいた陰イオン交換
カラムにかける。ＧＭ−Ｃ５Ｆ Ｓ−スルフォン化物
は、１４０〜２１０ｍＭ Ｎ ａＣｌの範囲に溶出され
る。
（４５〜９０μｍ、メルク社製）を充填してから６Ｍ尿
素、５０ｍＭ）リス、５０ｍＭＮａＣ１゜０．１％（ｗ
／ｖ）界面活性剤（ＲＴＷＥＥＮ）、２ｍＭエチレンジ
アミン（ｐＨ８，７）で平衡にしておいた陰イオン交換
カラムにかける。ＧＭ−Ｃ５Ｆ Ｓ−スルフォン化物
は、１４０〜２１０ｍＭ Ｎ ａＣｌの範囲に溶出され
る。
ＣＭ−Ｃ５Ｆ Ｓ−スルフォン化物を含む分画を合わ
せてからタンパク質濃度を１０−５Ｍに調整して、次い
で、クエン酸マンガン反応緩衝液（ｐＨ８，６、Ｍ ｎ
２＋濃度３ Ｘ １０−５Ｍ）に対して透析する。次
いで、ＧＭ−Ｃ５Ｆ Ｓ−スルフォン化物を１０−５
Ｍの濃度に調製して、０．５〜ｌμｇ／ｍｌのアミノペ
プチダーゼＰと３７〜４０℃で１時間反応させる。次い
で、ゲルクロマトグラフィー（Ｒ５ＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ
７５ カラム、ファルマシア社製）によって反応生成
物をそれぞれに分離する。次いで、ＧＭ−Ｃ５Ｆを、５
０ｍＭグリシン緩衝液中で酸素の存在下で希釈によって
復元（ｒｅｎａｔｕｒｅ）させる。
せてからタンパク質濃度を１０−５Ｍに調整して、次い
で、クエン酸マンガン反応緩衝液（ｐＨ８，６、Ｍ ｎ
２＋濃度３ Ｘ １０−５Ｍ）に対して透析する。次
いで、ＧＭ−Ｃ５Ｆ Ｓ−スルフォン化物を１０−５
Ｍの濃度に調製して、０．５〜ｌμｇ／ｍｌのアミノペ
プチダーゼＰと３７〜４０℃で１時間反応させる。次い
で、ゲルクロマトグラフィー（Ｒ５ＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ
７５ カラム、ファルマシア社製）によって反応生成
物をそれぞれに分離する。次いで、ＧＭ−Ｃ５Ｆを、５
０ｍＭグリシン緩衝液中で酸素の存在下で希釈によって
復元（ｒｅｎａｔｕｒｅ）させる。
復元させた産物を濃縮して、タンパク質配列分析のため
にＨＰＬＣによって精製する（カラム：Ｗａｔｅｒｓ
Ｃ、、，２５０Ｘ４．６ｍｍ、緩衝液Ａ：０．１％トリ
フルオロ酢酸、緩衝液Ｂ：８０％アセトニトリル、０．
１％トリフルオロ酢酸）。３５％Ｂから７５％Ｂまでの
勾配を３０分間で流速１．５ｍｌ／分になるように設定
する。ＣＭ−Ｃ５Ｆを含む画分を自動タンパク質配列分
析に供する。メチオニンが実際に定量的に切除されてい
たことが明らかになる。これに対して、アミノペプチダ
ーゼＰで処理しなかった産生物は、〉５０％のメチオニ
ンをＮ−末端アミノ酸として含んでいた。
にＨＰＬＣによって精製する（カラム：Ｗａｔｅｒｓ
Ｃ、、，２５０Ｘ４．６ｍｍ、緩衝液Ａ：０．１％トリ
フルオロ酢酸、緩衝液Ｂ：８０％アセトニトリル、０．
１％トリフルオロ酢酸）。３５％Ｂから７５％Ｂまでの
勾配を３０分間で流速１．５ｍｌ／分になるように設定
する。ＣＭ−Ｃ５Ｆを含む画分を自動タンパク質配列分
析に供する。メチオニンが実際に定量的に切除されてい
たことが明らかになる。これに対して、アミノペプチダ
ーゼＰで処理しなかった産生物は、〉５０％のメチオニ
ンをＮ−末端アミノ酸として含んでいた。
前記の公開された欧州特許出願は、次の公開されたオー
ストラリア特許出願に対応する。
ストラリア特許出願に対応する。
ＥＰ−Ａ ＡＵ−Ａ
Ｏ，２１９，７８１６３９７９／８６
０．２２７．９３８ ６５６９３／８６０．２２
８．０１８ ６６７５６／８６欧州特許第０
．１４１，２２３号は、オーストラリア特許第５６５
、７０３号に対応する。
８．０１８ ６６７５６／８６欧州特許第０
．１４１，２２３号は、オーストラリア特許第５６５
、７０３号に対応する。
第１図は、本発明に非常に重要なｐｓ２０３の切断部位
を示す、説明図である。 第２図は、本発明に係るプラスミドｐｓ５００の、説明
図である。
を示す、説明図である。 第２図は、本発明に係るプラスミドｐｓ５００の、説明
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、短いＮ−末端伸長部（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）を有し
、かつ遺伝子操作によって得ておいた前駆体を、アミノ
ペプチダーゼＰによる酵素的切断に供することからなる
、Ｎ−末端プロリンで始まるタンパク質の製造法。 ２、短いＮ−末端伸長部がメチオニン残基を含んでなる
、請求項１に記載の製造法。 ３、用いられる出発材料が、タンパク質の混合物であっ
て、それらの一部のみがＮ−末端にメチオニン残基を有
するタンパク質の混合物である、請求項１に記載の製造
法。 ４、用いられる出発材料が、タンパク質の混合物であっ
て、それらの一部のみがＮ−末端にメチオニン残基を有
するタンパク質の混合物である、請求項２に記載の製造
法。 ５、プロリンで始まり、かつＮ−末端伸長部を有するヒ
ト顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子誘導体を用
いることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。 ６、プロリンで始まり、かつＮ−末端伸長部を有するヒ
ト顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子誘導体を用
いることを特徴とする、請求項２に記載の製造法。 ７、プロリンで始まり、かつＮ−末端伸長部を有するヒ
ト顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子誘導体を用
いることを特徴とする、請求項３に記載の製造法。 ８、プロリンで始まり、かつＮ−末端伸長部を有するヒ
ト顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子誘導体を用
いることを特徴とする、請求項４に記載の製造法。 ９、プロリンで始まり、かつＮ−末端伸長部を有するヒ
ト顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子誘導体を用
いることを特徴とする、請求項５に記載の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3811921A DE3811921A1 (de) | 1988-04-09 | 1988-04-09 | Verfahren zur herstellung von proteinen, die n-terminal mit prolin beginnen |
| DE3811921.8 | 1988-04-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01304895A true JPH01304895A (ja) | 1989-12-08 |
Family
ID=6351689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1089576A Pending JPH01304895A (ja) | 1988-04-09 | 1989-04-07 | Ｎ‐末端プロリンで始まるタンパク質の製造法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0337264A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01304895A (ja) |
| KR (1) | KR890016171A (ja) |
| AU (1) | AU3253689A (ja) |
| DE (1) | DE3811921A1 (ja) |
| DK (1) | DK169889A (ja) |
| FI (1) | FI891652L (ja) |
| HU (1) | HUT51676A (ja) |
| IL (1) | IL89877A0 (ja) |
| NO (1) | NO891451L (ja) |
| PT (1) | PT90225A (ja) |
| ZA (1) | ZA892551B (ja) |
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| DE3822045A1 (de) * | 1988-06-30 | 1990-01-11 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen |
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| WO2006027179A1 (de) | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Clariant Produkte (Deutschland) Gmbh | Bleichmittel-mischungen |
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| ATE30246T1 (de) * | 1982-12-10 | 1987-10-15 | Nordisk Gentofte | Verfahren zur herstellung reifer proteine aus schmelzproteinen hergestellt in pro- oder eukaryotischen zellen. |
| DE122004000009I1 (de) * | 1984-08-16 | 2004-11-18 | Savient Pharmaceuticals Inc | Methode zur Herstellung von menschlichen Wachstumshormonen. |
| WO1986007380A1 (fr) * | 1985-06-04 | 1986-12-18 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Procede de preparation de polypeptides |
| US4865974A (en) * | 1985-09-20 | 1989-09-12 | Cetus Corporation | Bacterial methionine N-terminal peptidase |
| DE3822045A1 (de) * | 1988-06-30 | 1990-01-11 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen |
-
1988
- 1988-04-09 DE DE3811921A patent/DE3811921A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-04-05 EP EP89105927A patent/EP0337264A3/de not_active Withdrawn
- 1989-04-06 FI FI891652A patent/FI891652L/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-04-06 HU HU891661A patent/HUT51676A/hu unknown
- 1989-04-07 IL IL89877A patent/IL89877A0/xx unknown
- 1989-04-07 ZA ZA892551A patent/ZA892551B/xx unknown
- 1989-04-07 JP JP1089576A patent/JPH01304895A/ja active Pending
- 1989-04-07 DK DK169889A patent/DK169889A/da not_active IP Right Cessation
- 1989-04-07 PT PT90225A patent/PT90225A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-04-07 AU AU32536/89A patent/AU3253689A/en not_active Abandoned
- 1989-04-07 NO NO89891451A patent/NO891451L/no unknown
- 1989-04-08 KR KR1019890004645A patent/KR890016171A/ko not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| FI891652A7 (fi) | 1989-10-10 |
| HUT51676A (en) | 1990-05-28 |
| NO891451D0 (no) | 1989-04-07 |
| PT90225A (pt) | 1989-11-10 |
| KR890016171A (ko) | 1989-11-28 |
| FI891652A0 (fi) | 1989-04-06 |
| EP0337264A2 (de) | 1989-10-18 |
| ZA892551B (en) | 1989-12-27 |
| FI891652L (fi) | 1989-10-10 |
| AU3253689A (en) | 1989-10-12 |
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| IL89877A0 (en) | 1989-12-15 |
| DE3811921A1 (de) | 1989-10-19 |
| DK169889D0 (da) | 1989-04-07 |
| NO891451L (no) | 1989-10-10 |
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