JPH01308955A

JPH01308955A - 参照電極及び参照電極を用いた計測装置

Info

Publication number: JPH01308955A
Application number: JP63140833A
Authority: JP
Inventors: Akio Karigome; 刈米　昭夫; Ryuzo Hayashi; 隆造林; Yoshio Hashizume; 義雄橋爪
Original assignee: Kanzaki Paper Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Kanzaki Paper Manufacturing Co Ltd
Priority date: 1988-06-07
Filing date: 1988-06-07
Publication date: 1989-12-13
Anticipated expiration: 2011-03-21
Also published as: JPH0827250B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、固定化酵素電極を組み込んだフロー型計測装
置に用いられる参照電極に関し、特に銀イオン流出によ
る酵素活性の阻害を防止した銀・塩化銀参照電極に関す
る。

（従来の技術）酵素電極を用いた各種化学物質の計測は、酵素反応が有
する高い基質特異性と、電気化学分析が有する測定の高
速性や感度の高さという特徴を合わせ持ち、近年臨床化
学・食品化学等の分野で広く利用されるようになってき
た。酵素電極による計測法は１）ポテンシオメトリック法（電位差検出法）２）アン
ペロメトリック法（定電位における電解電流を検出する
方法）に分類される。ボテンシオメトリック法の場合、作用電
極の電位を、基準電位を発生する参照電極に対して正確
に計測する必要があり、又アンペロメトリック法の場合
、作用電極の電位を正確に保持することが必要である。

このように正確に測定するためには、基準となる参照電
極の電位が安定して得られなければならず、参照電極は
、次に挙げる性質を具備する必要がある。

（１）参照電極表面での電極反応が可逆であって、電解
質液中の特定の化学種とＮｅｒｎｓ　ｔの平衡電位式に
従って応答すること。

（ＩＦ）その可逆電極電位が長時間安定で、かつ再現性
がよいこと。

（■）２電極系でのアンペロメトリンク法などの場合、
計測の際に流れる電流によって電位は無視しうる程度し
か変化せず（非分極性）、また、微小電流が電極に流れ
電位が変化した場合でも、すぐにもとの電位にもどるこ
と。

（ＩＶ）温度変化に対する電位のヒステリシスがないこ
と等。

このような条件を満たすものとして銀・塩化銀参照電極
が知られている。銀・塩化銀参照電極は塩化銀で被覆し
た電極と塩素イオンを含んだ内部液で半電池を構成し電
極内部液と被検液を含む電解質液とを適当な液絡部を介
して接液させて用いられており、液絡部は次の様な条件
を満たすものでなければならない。

（１）電極内部〜液による被検液の汚染をできるだけ少
なくするために流出液の量は多すぎてはならないが、流
出速度が余りに遅いと異常な液間電位差を生じることが
あるため、適度な流出が必要である。

（ＩＩ）安定で再現性の良い液間電位差を得るためには
流出速度は一定でなければならない。

すなわち、安定な参照電極としては電極内部液が一定の
速度で液絡部より流出することが必要である。

このため参照電極と測定系の電解質液をつなぐ液絡部と
して、従来より細孔、塩橋、フリットグラス等が用いら
れている。

参照電極を小型化すると作用電極と参照電極の距離を近
づけることにより溶液の抵抗による電圧降下を小さくす
ることが可能で、作用電極の電位を、より安定に保持す
ることが出来、結果的に極めて正確な計測が可能になる
。このため銀・塩化銀参照電極を小型化する試みがなさ
れたが以下に記す問題があった。

即ち、酵素電極の小型化に伴い銀・塩化銀参照電極を小
型化すると内部液の全量に対する液絡部より流出する内
部液の量の割合が太き（なるために参照電極の電位安定
性に問題が生じる。

銀・塩化銀参照電極の液絡部を小型化し電極内部液の流
出速度を遅（すると、液絡部において異常な液間電位差
を生じてしまう。

また、塩橋を使用する場合は構造上塩橋を含んだ銀・塩
化銀参照電極全体の小型化が困難であり、さらに電極内
部液と被検液の塩素、イオン濃度に差があると電極内部
液の塩素イオン濃度は変化するので電位安定性に問題が
ある。

このように、内部液と液絡部を有する従来の銀・塩化銀
参照電極は、構造上小型化するのが困難であるため、本
発明者等は、銀線上に塩化銀含有層を設けた参照電極を
直接測定系の電解質液中に挿入することを検討したが、
このような構成では酵素の種類によっては固定化酵素が
失活することが明らかになった。

塩化銀は僅かに水に溶解（１，９Ｂ／ｌ）するが、銀イ
オンは蛋白質と非常に良く結合する。一方、酵素の中に
は銀イオンの存在により阻害を受けたり、失活してしま
うものがあり、このような酵素としては、Ｌ−３ｏｒｂ
ｏｓｅ　　ｏｘｉｄａｓｅ（Ｅ、Ｃ，１，１，３，１１
）　、Ｉ　ｎ　ｕ　ｌ　ｉ　ｎ　ａ　ｓ　ｅ　　（Ｅ、
Ｃ，３゜２．１．７）　、α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓ　１ｄ
ａｓｅ　　（Ｅ、Ｃ。

３．２．１．２０）　、β−Ｄ−ＱｌｕｃｏｓｉｄａＳ
ｅ　　（Ｅ。

Ｃ，３，２，１，２１）　、β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓ
ｉｄａｓｅ　　（Ｅ、Ｃ，３，２，１，２３）　、β−
Ｄ−Ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａ　ｎ　ｏ　ｓ　ｉ　ｄ　ａ　
ｓ　ｅ　　（Ｅ、Ｃ，３，２，１，２６）等多数のもの
が知られている。

このように銀・塩化銀参照電極を小型化する方法に関し
て従来有効な対策は提示されていないのが現状である。

（本発明が解決しようとする課題）本発明は上記の問題を解決し、酵素を失活させず、しか
も小型化できる銀・塩化銀参照電極を提供することを目
的とする。

（課題を解決するための手段）本発明は、塩化銀含有層（１）上に親水性ゲル層（２）
を設け、塩化銀含有層（１）が該親水性ゲル層（２）を
介して電解質液と接するように構成した銀・塩化銀参照
電極（３）であり、又本発明は、フローセル（４）に固
定化酵素作用電極（５）と上記銀・塩化銀参照電極（３
）を装着したことを特徴とするフロー型計測装置である
。

（作用）第１図に従って本発明の参照電極を説明する。

本発明では、銀・塩化銀参照電極（３）の塩化銀含有層
（１）に親水性ゲル層（２）を設けることにより、電極
内部液と液絡構造を不要にし小型化することが出来る。

また塩化銀含有層（１）が親水性ゲル層（２）を介して
電解質液に接するため、銀イオンの溶出を防ぐことが出
来、結果的に固定化酵素作用電極（５）の酵素を失活さ
せることがない。従って、長期間にわたり安定した測定
をすることが出来る。

以下に電気メツキ法で塩化銀含有層を生成させる場合を
例にして本発明の参照電極について詳述する。

まず銀線（６）を良く研磨し、酸化層を除去し、その端
面が、接液部（７）より作用電極から遠ざかる様に後退
させ電極の支持体（８）に装着する。

次に塩素イオンを含んだ電解液、例えば塩化物水溶液、
もしくは塩化物を溶解した緩衝液に銀線を浸漬する。緩
衝液としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等各種用い
ることができる。電解液としては、塩酸水溶液や、塩化
ナトリウム、塩化カリウム等アルカリ金属の塩化物水溶
液を用いることができる。塩化物の濃度は０．０１〜Ｉ
Ｍ程度である。

次に、白金を対極として、飽和カロメル電極（以下ＳＣ
Ｅと略す）に対して、銀線（６）を正極として電解を行
う。

電解を行う電位は対ＳＣＥ＋０．０５Ｖ以上であり、対
ＳＣＥ＋０．２０Ｖまで上げると充分な量の塩化銀を生
成させることができる。電解に要する時間は通常１〜４
８０分間、好ましくは５〜６０分間である。この際ウシ
血清アルブミン等の蛋白質を電解液に混合しておき塩化
銀と蛋白質の混合層を形成させると、親水性ゲル層（２
）として蛋白質ゲルを用いる場合に眉間の結合強度を増
す利点がある。

次にこうして銀線（６）上に得られた塩化銀含有層（１
）と接液部（７）との空間に親水性ゲルを充填する。

ゲルの充填は別途作成したゲルを充填しても良いし、ま
た塩化銀含有層（１）と接液部（７）との空間に例えば
蛋白質と架橋剤の溶液を充填しゲル化をおこなってもよ
い。

充填する親水性ゲルとしては、アガロース、アガロペク
チン、に−カラゲナン等の多１！類のゲル、ポリアクリ
ルアミドゲル、ポリビニールアルコールゲル、更にアル
ブミン、グロブリン、ゼラチン等の蛋白質のゲル等を用
いることができる。

アガロースゲルの場合、ジイソシアネート、ホウ酸等の
架橋剤を含んだ濃度１〜ｌＯ％程度のアガロース熱水溶
液を室温まで冷却して調製する。

ポリアクリルアミドゲルを調製する場合は、アクリルア
ミド溶液にＮ、Ｎ’　　−メチレンビスアクリルアミド
等の架橋剤、ベルオキソニ硫酸アンモニウム、Ｎ、Ｎ、
Ｎ’　、Ｎ’　　−テトラメチルエチレンジアミン等の
重合促進剤を添加してゲル化を行った後、水または緩衝
液中に保存し脱塩する。

ポリビニールアルコールゲルを調製する場合はポリビニ
ールアルコールに架橋剤としてグルタルアルデヒド等の
アルデヒド類、Ｎ−メチロールメラミン等のメチロール
化合物、ジビニルスルホン等の活性化ビニル化合物、エ
ピクロルヒドリン等のエポキシ化合物、ジカルボン酸、
ジイソシアネート、または銅塩等の無機架橋剤等を添加
してゲル化を行うか、あるいは熱水または水の存在下で
放射線や紫外線照射による架橋反応を行いゲル化させる
。

蛋白質を架橋剤と反応させてゲルとする場合には架橋剤
としては公知の各種蛋白質の架橋剤が用いられるが、中
でもホルマリン、グルタルアルデヒド、グリオキザール
等のアルデヒド類が水溶性が高く、またゲル強度の点で
も好ましい。

蛋白質を架橋剤でゲル化する場合は、蛋白質濃度は０．
１〜１０重量％程度、架橋剤濃度は０．１〜１０重量％
程度が好ましい。ゲル化は室温で放置して行ってもよい
し、加温あるいは冷却を行いながらでもよい。またアル
デヒド類で架橋を行う場合密封容器中でアルデヒドＭ溶
液の飽和蒸気雰囲気下で行うと均一な架橋が得られ好ま
しい。

親水性ゲルのなかでも蛋白質のゲルは、蛋白質中のメル
カプト基が銀イオンを取り込みメルカプチドを生成する
ので銀イオンの溶出を効果的に防げるため好ましく用い
られる。特に、アルブミン等メルカプト基を多く含む蛋
白質はより好ましく用いられる。

親水性ゲルの厚みは０．１１ＩＩＩＩＩ〜２０ＩＩＩＩ
ｍ、好ましくは０．５　ｖｗ〜１０　ｎ＋＋ｙ＋程度で
ある。

このようにして作成した銀・塩化銀参照電極（３）は電
極内部液がなく、液絡部構造を持たないため小型化が可
能で、しかも親水性ゲル層（２）の物理的強度が優れる
ので、緩衝液の剪断力が掛かるフロー型計測装！（第２
図）において、例えば固定化酵素作用電極（５）（酵素
を表面に固定した白金電極等）と対向する位置に配置し
て、直接緩衝液の流れに接液させて用いても、電極内部
液の流出による電位の変化等の問題がなく長期間安定し
た測定を行うことができる。

第２図は本発明のフロー型計測装置を例示したもので、
定量ポンプ（９）により送られる緩衝液に、注入口αｅ
よりサンプルが注入され、サンプルは配管ジヨイントＱ
ｌ）を経てフローセル（４）まで導かれ、測定される。

フローセル（４）には銀・塩化銀参照電極（３）と固定
化酵素作用電極（５）が装着され、さらに補助電極（対
極）（ロ）が装着されている。そして出力電流値はポテ
ンシオスタットα国により測定される。

第３図は、測定部を拡大したもので、参照電極（３）と
作用電極（５）の配置は、第３ａ図、第３ｂ図、第３ｃ
図の様な構成が例示出来る。ただし第３ａ図のように画
電極を近傍に配置する方が精度上好ましい。

この場合フロー型計測装置に用いる緩衝液に０゜Ｏ１〜
０．５Ｍの範囲で塩化カリウム等を添加し、塩素イオン
を含有させると、参照電極（３）の電位が更に安定化し
、極めて高精度の測定を行うことができる。

本発明の参照電極では、銀イオンの流出が防止されるた
めに例えばβ−〇−フルクトフラノシダーゼ等の銀イオ
ンにより阻害を受ける酵素を固定化した固定化酵素作用
電極の近傍に配置しても固定化酵素が失活してしまうこ
とがない。従って、近傍に配置することにより極めて高
精度の測定が可能となる。

（実施例）以下に実施例を示し本発明をより具体的に説明するが、
勿論本発明はこれのみに限定されるものではない。尚、
％は重量％を表す。

実施例１第１図に従って説明する。直径’１ｍｍ、長さ５ｍｍの
銀線（６）の末端を１６００メツシユのエメリー紙で平
面に仕上げ、その片端に直径０．１　ｍ　ｍ、長さ２Ｑ
ｍｍの銀リード線Ｑ４１を熱硬化型導電性接着剤αりで
接着し、電気炉中にて１２０℃・１時間加熱し硬化処理
を行った。この銀線のもう一方の断面を、外径２ｍｍ、
内径１ｍｍ、長さ５ｍｍのアクリルパイプαｅの片端と
一直線になる様に密着させ側面全体を熱収縮テフロン０
ηで被覆した。

この先端部を、０．０５Ｍの塩化カリウムを含むｐＨ７
，０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に浸漬し、これ
を作用電極とし、１ｃｆｌＩ角白金電極を対極、ＳＣＥ
を参照電極とし、室温で３０分間、＋０．２Ｖで電解を
行い塩化銀層を形成した。

電解終了後、銀線を軽く水洗し、アクリルパイプαｅ内
の空間に５．０％グルタルアルデヒドを含む５．０％ウ
シ血清アルブミン水溶液をマイクロシリンジで充填した
後室温にて３０分間放置しゲル化を行い、親水性ゲルＪ
ｉ（２）を形成した。

この銀線（６）を電極の支持体（８）に固定し、銀リー
ド線をハンダ付けしたプラグ型接続具Ｑ８１を取り付け
て、銀・塩化銀参照電極とした。

次に第４図に従って作用電極（５）を説明する。直径２
ｍｍ、長さ１０ｍｍの白金線ＯｃＪの末端を１６００メ
ソシユのエメリー紙で平面に仕上げ、その片端に直径０
．１ｍｍ、長さ２０ｍｍの銀リード線ｆ２ｍを熱硬化型
導電性接着剤（２１）で接着し、電気炉中にて１２０℃
で１時間加熱し硬化処理を行った。

この白金線の側面を熱収縮テフロン（２２）で被覆し電
極の支持体（２３）に固定し、銀リード線をハンダ付け
したプラグ型接続具（２４）を取り付けて、白金線の断
面に、グルコースオキシダーゼとβ−Ｄ−フルクトフラ
ノシダーゼとムタロターゼをウシ血清アルブミンと共に
グルタルアルデヒドで固定した固定化酵素膜（２５）を
設は作用電極とした。

この銀・塩化銀参照電極（３）と作用電極（５）を第３
ａ図に示すフローセル（４）に装着し、このフローセル
（４）に接続した配管系の途中に導電性をもつ配管接続
具を下流側に配し補助電極（対極）０２とした。

この３電極系セルを配管と接続し、第２図に示すフロー
型測定装置に組み込みポテンシオスタットａ３で一定電
圧を印加し記録計で出力値を記録して測定を行った。

ポンプ（９）で０．０５Ｍ塩化カリウムを含む、Ｉ）　
Ｈ７，０の０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を１．０
ｍｌ／　ｍ　ｉ　ｎの流速で流した。尚以下の計測は恒
温槽（３７，０±０．２℃）中で行った。

先ず印加電圧を変化させて、注入口（ＩＩよりマイクロ
シリンジで１ｍＭ過酸化水素水溶液を５μｌ注入した場
合に、明瞭な限界電流が得られることを確認した（第５
図において０．３５　Ｖ〜０．６■の間では、はぼ一定
の電流値が得られる）。

次にグルコースまたはスクロースを含む試料を注入口よ
りマイクロシリンジで５μｌ注入し、３電極ポルタンメ
トリーの形式で、作用電極に対眼・塩化銀参照電極＋〇
、６０Ｖの電圧を印加し、過酸化水素電極として測定を
行った。この状態で３０日間グルコースまたはスクロー
スを含む試料の計測を続け、のべ１０００検体を分析し
た（図中○印は使用開始時の値を表し、Ｘ印は１０００
検体測定後の値を表す）。

３０日間の計測の後においても１ｍＭ過酸化水素水溶液
を用いて限界電流を再現性良く検知できることを確認し
た（第５図）。

即ちグルコースまたはスクロースを含む試料１０００検
体測定後においても測定開始時と同様に、対参照電極約
０．３５〜０．６　Ｖの電圧を掛けると、一定の電流値
が得られることを示している。このため安定した測定が
可能である。

また３０日間の測定の間、酵素電極はグルコース、スク
ロース両方に対して各々一定の応答を示した。第６図は
測定開始時の応答電流値を１００とした相対応答値を表
したものである。

比較例１直径２ｍｍ・長さ１０ｍｍの銀線の末端を１６００メソ
シユのエメリー紙で平面に仕上げ、その片端に直径Ｑ、
１ｍｍ・長さ２０ｍｍの銀リード線を熱硬化型導電性接
着剤で接着し、電気炉中にて１２０℃・１時間加熱し硬
化処理を行った。

この銀線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、先端部を、
０．０５Ｍの塩化カリウムを含むｐ　Ｈ７，０の０．１
　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に漫清し、これを作用電極
とし、１ｃｆｆＩ角白金電極を対極、ＳＣＥを参照電極
とし、室温で３０分間、＋　０．２　Ｖで電解を行った
。

電解終了後、銀線を軽く水洗し、電極の支持体に固定し
、銀リード線をハンダ付けしたプラグ型接続具を取り付
けて、銀・塩化銀参照電極とした。

次に実施例１と同様の方法で固定化酵素膜を設けた作用
電極を作製した。

この銀・塩化銀参照電極と作用電極を実施例１で用いた
フローセルに装着した。このフローセルに接続した配管
系の途中に導電性をもつ配管接続具を下流側に配し補助
電極とした。

実施例１と同様の方法で３０日間グルコースまたはスク
ロースを含む試料の計測を続け、のべ１０００検体を分
析したところグルコースまたはスクロースに対する応答
は第８図の様になった。

また第７図に示す様に、過酸化水素に対する応答は明ら
かに、１０００検体を測定したため限界電流検出位置が
不明瞭となった。１０００検体測定後において、測定開
始時と異なり電流値は電位の変化と共に変化し、安定し
た測定ができないことを示している（図中○印は使用開
始時の値を表し、Ｘ印は１０００検体測定後の値を表す
）。

参照電極の流れの上流側ケ所に塩化銀層の剥離が認めら
れたので、新たに作成した親水性ゲル層を有さない恨・
塩化銀参照電極を同様に装着し酵素電極の応答を調べた
ところ、グルコースに対しては初めの応答値と同じ応答
が得られたが、スクロースに対しては初めの応答値の約
４割の応答しか示さなかった。これはβ−Ｄ−フルクト
フラノシダーゼが銀イオンにより失活したためである。

（効果）本発明は、容易に小型化ができ物理的強度に優れ、長寿
命かつ安定性が高い銀・塩化銀参照電極であり、また限
イオンに影響を受は易い酵素等の生理活性物質に対して
の悪影響のない優れた銀・塩化銀参照電極であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の銀・塩化銀参照電極を例示した断面図
である。第２図は本発明のフロー型計測装置を例示したものであ
る。第３ａ図〜第３ｃ図は種々の形式のフローセルを例示し
たものである。第４図は固定化酵素作用電極の構造を例示した断面図で
ある。第５図は実施例１における、１ｍＭ過酸化水素に対する
電流−電圧曲線を示したものである（図中Ｏ印は測定開
始時の値を表し、Ｘ印は１０００検体測定後の値を表す
）。第６図は実施例１におけるグルコースとスクロースに対
する応答の経時変化を示したものである（図中Ｏ印はグ
ルコースに対する応答を、Ｘ印はスクロースに対する応
答を表す）。第７図は比較例１における、１ｍＭ過酸化水素に対する
電流−電圧曲線を示したものである（図中○印は測定開
始時の値を表し、×印は１０００検体測定後の値を表す
）。第８図は比較例１におけるグルコースとスクロースに対
する応答の経時変化を示したものである（図中○印はグ
ルコースに対する応答を、×印はスクロースに対する応
答を表す）。（１）・・・塩化銀含有層　　　（２）・・・親水性ゲ
ル層（３）・・・銀・塩化銀参照電極（４）・・・フローセル（５）・・・固定化酵素作用電極（６）・・・銀線　　　　　　　（７）・・・接液部（
８）・・・支持体　　　　　　（９）・・・ポンプ（１
０）・・・注入口　　　　　　（１１）・・・配管ジヨ
イント（１２）・・・補助電極（対極）（１３）・・・ポテンシオスタット

Claims

【特許請求の範囲】

（１）塩化銀含有層（１）上に親水性ゲル層（２）を設
け、塩化銀含有層（１）が該親水性ゲル層（２）を介し
て電解質液と接するように構成した銀・塩化銀参照電極
（３）。
（２）塩化銀含有層（１）が０．１ｍｍ〜２０ｍｍの厚
みを有する親水性ゲル層（２）を介して電解質液と接す
るように構成した請求項（１）記載の銀・塩化銀参照電
極（３）。
（３）親水性ゲル層（２）が、少なくとも蛋白質と架橋
剤より構成される請求項（１）記載の銀・塩化銀参照電
極（３）。
（４）フローセル（４）に固定化酵素作用電極（５）と
請求項（１）記載の銀・塩化銀参照電極（３）を装着し
たことを特徴とするフロー型計測装置。