JPH01309682A - 動物細胞培養用基体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、動物細胞培養用基体に関する。−船釣に動物
細胞は付着依存性細胞であり大量培養する際、何等かの
基体に付着又は接着させる必要があるが、本発明は基体
への動物細胞接着性を改良した細胞培養用基体に関する
ものである。

［従来の技術］ 従来、動物の生産する生理活性物質など有用成分を得る
ために、動物細胞の大量培養によって生産する方法が検
討されてきた。しかしながら動物細胞の培養には特殊な
細胞を除いて基体に接着していないと増殖できない接着
依存性細胞が一般的である。これらあ細胞は、多糖類や
合性高分子をポリマー基体とする場合、通常基体に対す
る接着性が充分でなく細胞の進展・増殖が順調に行われ
ないのが実状である。このため動物細胞の接着性改良の
ため基体の表面に正の荷電を持たせる方法（Ｃｙｔｏｄ
ｅｘ　１　、ファルマシア製マイクロキャリアー）やコ
ラーゲンをコーティング処理する方法（Ｃｙｔ。

ｄｅｘ３．ファルマシア製マイクロキャリアー）が用い
られてぎた。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、従来用いられてきたこれらの動物細胞培
養用基体のうち表面に正の荷電を持たせた基体は、接着
性が充分でないのが実状であり、またコラーゲンをコー
ティング処理した基体は滅菌操作や大量培養操作におい
て、剥離や変性を受けることがしばしば見られる等の問
題があった。

また基体の表面処理材料が生体内から得られた成分やそ
の誘導体を用いていることや、上記の動物細胞培養基体
を使用する条件として培地中に牛胎児血清（以下ＦＣ５
と記載）を必要とすることから・大量培養を行った後、
培養液から有用成分だけを精製するのは非常に困難であ
フた。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記問題点に鑑みて動物細胞培養を行う
際、接着性付与良好で有用成分の精製が容易な動物細胞
培養用基体を見いだすべく鋭意検討した結果、本発明に
到達した。すなわち、本発明は動物細胞培養用のポリマ
ー基体に対してアルギニン−グリシン−アスパラギン酸
を必須構成単位として有する接着性ペプチドを共有結合
させてなる動物細胞の接着性を改良した動物細胞培養用
基体である。

本発明に用いられる接着性ペプチドとしては、以下の３
つのアミノ酸すなわちアルギニン（以下Ａｒｇと記載）
、グリシン（以下Ｇ１ｙと記載）、アスパラギン酸（以
下Ａｓｐと記載）を必須成分として結合した一般式 ％式％（ Ｘ、　、Ｘ２：Ｏまたは１〜３０個のアミノ酸残基のペ
プチド鎖。アミノ酸の種類及び結合 の順序は特に限定しない。

を構成成分とする分子量３　、０００以下のペプチドが
あげられる。好ましくは上記Ａｒ５−Ｇｌｙ−Ａｓｐに
セリン（以下Ｓｅｒと記載）の結合した一般式 ％式％（２） Ｙ、、’／２：Ｏまたは１〜３０個のアミノ酸残基のペ
プチド鎖。アミノ酸の種類及び結合 の順序は特に限定しない。

を構成成分とする分子量３　、０００以下のペプチドで
あり、特に好ましくは疎水性のアミノ酸であるプロリン
（以下Ｐｒｏと記載）を含む一般式％式％（３） Ｚ１＄Ｚ２：Ｐｒｏを１個以上含む１〜３０個のアミノ
酸残基のペプチド鎖。アミノ酸の種類及び 結合の順序は特に限定しない。

を構成成分とする分子−ｍ３，０００以下のペプチドで
ある。一般式（１）、（２）、（３）におけるＸ４、×
２、Ｙ４、Ｙ２．２、．２２のアミノ酸残基な構成する
アミノ酸としては特に限定されず、生化学データブック
　Ｉ　　Ｐ２９〜Ｐ５９（日本生化学金線・東京化学同
人発行）に記載されているアミノ酸が挙げられる。

本発明に係わる接着性ペプチドに用いられるアミノ酸は
、Ｌ体、０体どちらでもよいが、好ましくはＬ体である
。また構成アミノ酸であるＰｒｏは、接着性ペプチドに
疎水性の性質を与えることから、ポリマー基体に結合反
応させる際ＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド）等の有機
溶媒を反応溶媒として用いることが出来ることから、従
来の水溶液中の反応と比較して反応効率の向上が図れる
。

本発明に係わる接着性ペプチドの分子量は、通。

常３，０００以下である。３　、０００を越える場合、
抗原になる可能性があり、１０，０００以上では完全抗
原として作用することから本発明に使用するペプチドの
分子量を３，０００以下とした。

ペプチドの合成方法としては特に限定しないが、液相法
、固相法および固相法を応用した自動合成装置による合
成方法などが挙げられる。これらの合成方法の詳細につ
いては、゛生化学実験講座・タンパク質の化学ＩＶ　Ｐ
２Ｏ７〜Ｐ４９５　（日本生化学金線・東京化学同人発
行）、続生化学実験講座・タンパク質の化学（下）　Ｐ
６４１−Ｐ６９４　（日本生化学金線・東京化学同人発
行）等に記載されている。

動物培養用基体を作成するためのポリマー基体としては
、従来用いられているセルロース、デキストラン、キチ
ン等の多糖類：ナイロン、ガラス繊維、ポリビニルアル
コール、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリカーボネ
ート、ウレタン樹脂、フッ素樹脂、シリコーン樹脂等の
合成高分子が挙げられる。これらポリマー基体は、ビー
ズ状、フオーム状、エラストマー状、フィルム状、多孔
膜、中空管、中空糸、繊維等成形品に加工された物が用
いられる。これらの中で好ましいものは、大量培養の効
率の面からビーズ状のポリマー基体である。

本発明に用いる接着性ペプチドを動物培養用基体に用い
るには、本ペプチドを基体に共有結合させる必要がある
。結合させる方法としては特に限定しないが、基体表面
の水酸基、アミノ基、カルボン酸基等と接着性ペプチド
とを架橋剤を利用して結合させる合成法、基体表面に反
応性官能基がない場合反応性官能基を導入Ｌノで結合さ
せる合成法等が挙げられる。例えば、臭化シアン、酸ア
ジド、水溶性カルボジイミド等を利用したペプチド結合
合成法；基体に導入した芳香族アミノ基と亜硝酸ナトリ
ウムとを反応させて得たジアゾニウム化合物を利用する
ジアゾ合成法；ハロゲン化アセチル誘導体、トリアジニ
ル誘導体を利用するアルギル化法；グルタルアルデヒド
等のアルデヒド基と基体のアミノ基との反応を利用する
シップ塩基□形成合成法；カルボシル基、アミ７ノ基、
アルデヒド基及びイソニトリル基を共存させて縮合を行
うＵｇｉ反応合成法；トレシルエステルを利用するトレ
シルクロリド合成法；スペリン酸ジ−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル、酒石酸シート１−・ヒドロキシ
スクシンイミドエステ等ルの活性エステル基を用いる合
成法；ジメチルスベロイミデートニ塩基酸、メチル−４
−メルカプトブチルイミデート塩酸塩、メチル−４−ア
ジドベンゾイミデート塩酸塩等のイミドエステル基を用
いる合成法；ｐ−フェニレンビスマレイミド等のマレイ
ミド基を用いる合成法；基体の水酸基をＮ、Ｎ’−カル
ボニルジイミダゾールで活性化する合成法が挙げられる
。上記合成法は、水溶液中やＤＭＦやピリジンのような
極性有機溶媒中で行うことができる。好ましい溶媒は極
性有機溶媒である。

架橋剤をポリマー基体に架橋剤を利用して結合させる方
法としては、架橋剤をポリマー基体に直接結合させる方
法、ポリマー基体にポリエチレングリコールやポリプロ
ピレングリコール等をグラフトさせその末端に上記架橋
剤を結合させる方法が挙げられる。

動物細胞の培養における細胞培養基体の使用方法につい
ては、通常の方法で行われ特に限定されない。例えば、
接着性ペプチドを共有結合処理１ノたビーズを培養液中
に浮遊させて低速度で撹拌を行うことで動物細胞をビー
ズ表面に接着させ培養する方法；接着性ペプチドを共有
結合処理したシャーレ、ルーびん、ローラーびん等の上
で動物細胞を培養する方法；接着性ペプチドを共有結合
処理した中空糸に培養液を還流させ動物細胞を中空糸内
面に接着させ培養する方法；接着性ペプチドを共有結合
処理したビーズを充填したカラムを用いる方法；接着性
ペプチドを共有結合処理したマルチディスク、マルチト
レーを用いる方法等が挙げられる。

本発明に係わる動物細胞としては特に限定されないが、
生理活性物質など有用成分を産出する細胞が挙げられる
。例えば、インターフェロンを生産する羊膜または腎臓
に由来する上皮細胞など；ウロキナーゼを生産する腎細
胞；インシュリンを生産する膵臓起源の細胞等、動物の
各組織の細胞が挙げられる。また、ワクチン等の製造の
ため上記培養細胞を宿主として水痘ウィルスや肝炎ウィ
ルスを接種し培養することも可能である。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。

製造例１ 接着性ポリペプチドの合成 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ方式によるペプチド自動合成１４
ｉを用いて合成を行った。αアミノ基の保護にはＢｏａ
基を用い、セファデックスゲル、側−セルロースイオン
交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー
によって精製を行い、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラ
フィー）上単一ピークを示す接着性合成ペプチド表−１
を得た。

表−１接着性合成ペプチド 実施例１ 架橋デキストランビーズにＤＭＦ溶媒中ジイソシアン酸
へキサメチレンを反応させた後、側鎖のイソシアネート
基を加水分解してアミノ化を行った。

次いでスペリン酸ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
（ＤＳＳ）でアミノ基を活性化し緩衝溶液中にて上記の
接着性合成ペプチド−１と反応させて動物細胞培養用基
体を得た。

実施例２．３ 架橋デキストランビーズに接着性合成ペプチド−２，３
を実施例１に従って反応させ動物細胞培養用基体を得た
。

実施例４ 架橋デキストランビーズの表面水酸基をＮ、Ｎ’−力ル
ボニルジイミダゾールで活性化しＤＭＦ溶媒中にて上記
の接着性合成ペプチド−３と反応させて動物細胞培養用
基体を得た。

実施例５ 架橋デキストランビーズに接着性合成ペプチド−４を実
施例４に従って反応させ動物細胞培養用基体を得た。

比較例１ 架橋デキストランビーズの表面をＮ、Ｎ−）＋７メーｆ
）Ｌ−２−ヒト”ロ１シー１ミノフ０ロヒ０ル荷電基で
置換したＣｙｔｏｄｅｘ　　２　　（７アルマシア製）
を動物細胞培養用基体とした。

比較例２ 架橋デキストランビーズの表面をブタ表皮より得た変性
コラーゲン（ＭＷ　６０，０００〜２００，０００）で
処理したＣｙｔｏｄｅｘ　３　（ファルマシア製）を動
物細胞培養用基体とした。

試験例１ （１）接着性合成ペプチドの固定化密度接着性合成ペプ
チド−３を固定化した実施例３．４の固定化密度を測定
し、反応条件による差を調べた。ポリマー基体表面にお
ける炭素原子、窒素原子の割合を測定したところ、ＤＭ
Ｆの溶媒で反応させた実施例４の方が固定化密度で７０
％増加していた。

（２）動物細胞の接着性、増殖性の評価実施例１〜５及
び比較例１．２にて作成した動物細胞培養用基体を用い
細胞培養を行った。細胞は血管内皮細胞を用い、培養液
はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌ
ｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（以下ＤＭＥＭと記載する）、
及びＤＭＥＭにＦｅ２をｌＯχ加えた培養液を用いた。

培養後、位相差顕微鏡及び走査型電子顕微鏡にて接着性
及び増殖性の観察を行い、結果を表−２に示した。

表−２動物細胞の接着性、増殖性 ○：良好、　△：やや不良、　×：不良比較に用いたＣ
ｙｔｏｄｅｘ−２，３は、Ｆｅ２を含まぬＤＭＥＭ培地
に於て細胞接着性及び増殖性は、実施例の基体に比べて
劣っていた。Ｆｅ２の添加によって改善されるものの、
培地中よりＦＣ５成分を除くのはゲルろ過繰り返す必要
があり完全に除くのは困難であった。

［発明の効果コ 本発明の動物細胞培養用基体は、ポリマー基体に対して
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐｅ必須構成単位として有する接
着性ペプチドを共有結合させていることから、次のよう
な効果を奏する。■フィブロネクチン等細胞接着性ペプ
チドを含む牛胎児血清（以下ＦＣ５と記載）を加えなく
ても、ポリマー基体に対する生細胞の接着性は良好とな
る。■上記ＦＣＳを加えなくても細胞接着に伴う培養が
良好に行われることから、本発明の動物細胞培養用基体
による細胞大量培養によって生理活性を有する薬理成分
を得る場合、ＦＣ５中に含まれる抗原となりうる成分の
混入がなくなり患者にとって安全性が高まる。また本発
明で用いられる接着性ペプチドは低分子量であることか
ら、これ自体が抗原となる可能性が低減され、安全性は
さらに高まる。■本発明の接着性ペプチドは、共有結合
で基体に結合されていることから基体からの脱落もなく
、滅菌操作も安全に行うことが可能となる。■接着性ペ
プチド中にＰｒｏを含有した物は、有機溶媒中にて反応
することが可能となり反応効率は格段に向上する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ポリマー基体に対してアルギニン−グリシン−アス
   パラギン酸を必須構成単位として有する接着性ペプチド
   を共有結合させてなる動物細胞の接着性を改良した動物
   細胞培養用基体。