JPH01309687A - 安定化されたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ及びそれを含有するコントロール製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、安定化されたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニダーゼ及びそれを含有し、臨床検査分野で対照（
コントロール）として使用されるコントロール製剤に関
する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］Ｎ−ア
セチルーβ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下、ＮＡＧと
称する）は、野原細管上皮に多く含まれるリゾソーム中
の酵素の一種で、ムコ多糖類や糖蛋白の分解に関与する
。各種腎疾患や腎臓の術後においては尿中のＮＡＧが上
昇し、また糖尿病においては尿中のみならず血清中のＮ
ＡＧも上昇することが知られており、各種腎疾患の診断
に有用な指標となる酵素である。従って、ＮＡＧの測定
は、腎移植後の拒絶反応の早期診断、急性腎不全、糸球
体腎炎等の各種腎疾患の診断及び経過観察、薬物の腎毒
性試験等において有用な情報が得らｉ、臨床的意義が大
きいことがら、ＮＡＧの測定が重要視されている。

上記ＮＡＧの活性測定方法としては、例えば、ｐ−ニト
ロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド
［Ｂｉｏｃｈｅｍｌｃａｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ
。

Ｖｏｌ、１０．１１８　（１９６３）コ、４−メチルウ
ンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナ
イド［Ｃｌ１ｎｉｅａＣｈｆＩａｉｃａ　Ａｃｔａ、　
Ｖｏｌ、６９　（１）、　８５−９１　（１９７６）コ
等を用いる方法、特開昭５８−９９４号公報、特開昭８
１−１１２０９２号公報、特開昭８１−１７７９９９号
公報等に開示されるグルコサミン誘導体を使用する方法
等が知られているが、上記方法におけるＮＡＧの活性測
定に際しては、既知量のＮＡＧを含有するコントロール
の測定も併せて行い、測定精度を高め信頼性の向上を図
ることにより、精度管理を行っている。臨床検査におい
ては、一般に多数の検査対象項目を同時に測定すること
が行われ、それら各検査対象についてもコントロールの
測定がなされることから、通常、検査対象に対応する多
数の成分を含有した製剤がコントロールとして繁用され
る。このようなコントロール製剤は、不安定な酵素、蛋
白等を含有するので、保存時の変質を防止し、調製当初
の活性を長期に亘って維持するため、通常、凍結乾燥製
剤の形態で市販され、用時に精製水等で希釈して使用さ
れる。

しかしながら、酵素であるＮＡＧは保存安定性が悪く、
凍結乾燥しても著しく失活するので、長期に亘って保存
できるＮＡＧは知られておらず、未だ安定性に優れたＮ
ＡＧ含有コントロール製剤は提供されていない。そのた
め、従来のＮＡＧ含有コントロール製剤をコントロール
として用いた場合、時間経過に伴う酵素活性の低下によ
り、ＮＡＧの検出精度の信頼性に欠け、ひいては腎疾患
の有無等について誤認を生ずるおそれがある。また検査
のたびごとに、ＮＡＧを溶解してコントロールを調製す
る必要があり、作業が煩雑化するという問題がある。

本発明者らは、ＮＡＧの安定化について鋭意研究の結果
、ジアルデヒド化合物によるＮＡＧの架橋に際してアン
モニウム塩を存在させることによりＮＡＧが極めて安定
化することを見い出し、本発明を完成した。即ち、本発
明は、保存性に優れ且つ長期に亘り酵素活性を維持でき
る安定化されたＮＡＧ及びそれを含有する臨床検査用の
コントロール製剤を提供することを目的とする。

なお、酵素を安定化する方法として、グルタルアルデヒ
ド等の架橋剤により酵素を架橋することが知られている
。しかしながら、ＮＡＧをグルタルアルデヒド等の架橋
剤により架橋するとＮＡＧの酵素活性が著しく低下する
ため、上記の方法をＮＡＧに適用することは困難である
。

また、固定化酵素の分野においては、不溶性担体上に、
グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて酵素を固定化し
て安定化する方法が提案されている（特開昭５９−１３
０１８４号公報等参照）。しかし、コントロール製剤は
液状で使用されるので、不溶性担体を用いた固定化酵素
は適切でない。

［課題を解決するための手段］ 上記の課題を解決すべくなされた、本発明にかかるＮＡ
Ｇは、ＮＡＧをアンモニウム塩の溶液に溶解し、ジアル
デヒド化合物を添加して架橋させた後、過剰のアンモニ
ウム塩及びジアルデヒド化合物を除去し、凍結乾燥する
ことにより得られたことを特徴とする安定化されたＮＡ
Ｇである。

また、本発明にかかるコントロール製剤は、上記のＮＡ
Ｇを少なくとも含有することを特徴とするものである。

なお、上記コントロール製剤は、必要に応じて他の検査
対象に対応する成分、例えば、グルコース、ビリルビン
、アルブミン、ウロビリノーゲン、尿素、尿酸、クレア
チニン、へ′モグロビン、アミラーゼ、亜硝酸塩等を適
宜量含有していてもよい。上記のような多数の成分を含
有するコントロール製剤は、多数の検査対象のコントロ
ールとして使用できる利点を有する。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の安定化されたＮＡＧは、アンモニウム塩の存在
下、ＮＡＧがジアルデヒド化合物により架橋されており
凍結乾燥品の形態を呈する。

上記アンモニウム塩としては、例えば、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、酢酸アンモニウム等の種々のアンモニウム塩
が例示される。上記アンモニウム塩のうち、ＮＡＧの失
活を防止する上で、硫酸アンモニウムが特に好ましい。

またジアルデヒド化合物としては、固定化酵素の分野に
おいて、酵素の架橋剤として用いられているジアルデヒ
ド化合物の何れも使用でき、例えば、グルタルアルデヒ
ド、スクシンジアルデヒド、アジピンアルデヒド等が例
示される。上記ジアルデヒド化合物のうち、ＮＡＧの失
活度の少ないことからグルタルアルデヒドが特に好まし
い。

上記本発明のＮＡＧは、ＮＡＧを前記アンモニウム塩の
溶液に溶解し、ジアルデヒド化合物を添加して架橋させ
、次いで過剰のアンモニウム塩及びジアルデヒド化合物
を除去し、さらに凍結乾燥することにより得られる。

ＮＡＧを溶解するアンモニウム塩溶液中の塩濃度は、ア
ンモニウム塩の種類等に応じて適宜選択することができ
、２Ｍ以上、特に２．５〜３．５Ｍの水溶液が好ましい
。アンモニウム塩の濃度が２Ｍ未満であると、ＮＡＧが
失活するおそれがある。またＮＡＧは前記アンモニウム
塩の溶液に適宜の濃度、例えば１〜１０単位／１！程度
溶解させることができる。

ＮＡＧを前記アンモニウム塩の溶液に溶解した後、ジア
ルデヒド化合物を添加して架橋させる。

この工程において、ジアルデヒド化合物は適宜の濃度で
使用できるが、反応液中のジアルデヒド化合物の濃度が
１〜１０　（Ｗ／Ｖ）％、好ましくは２〜６　（Ｗ／Ｖ
）％程度となるように調製するのがよい。

ジアルデヒド化合物が１　（Ｗ／Ｖ）５未満であるとＮ
ＡＧを安定化させることが困難であり、また１０（Ｗ／
Ｖ）％を越えるとＮＡＧの活性が低下したり、不溶化す
る場合があるので好ましくない。

また上記架橋工程は、ジアルデヒド化合物の種類等に応
じて適宜の温度で行なうことができ、反応時間は、反応
温度及び使用されるジアルデヒド化合物の反応性等によ
り適宜選択することができるが、ＮＡＧの酵素活性の低
下を抑制するため、低温、例えば２〜８℃で行なうのが
好ましく、通常５〜６０時間、好ましくは１２〜４８時
間程度反応させることにより行なわれる。この架橋工程
において、ジアルデヒド化合物は温和な架橋剤であり、
ＮＡＧと架橋的に結合してシッフ塩基を形成し、ＮＡＧ
の高次構造の変化を抑制し、ＮＡＧを安定化させる。

上記架橋処理の後、過剰のアンモニウム塩及びジアルデ
ヒド化合物を除去する。この除去工程は、従来慣用の方
法、例えば、透析法、クロマトグラフィー法等の手段に
より行なうことができるが、架橋されたＮＡＧを高純度
かつ効率的に精製するため、限外濾過法によるのが好ま
しい。その際、完全かつ迅速に濾過するため、限外濾過
と電気透析とを同時に行なえる電気限外濾過法を採用す
ることもできる。

上記除去工程の後、ＮＡＧ含有溶液を慣用の方法に阜じ
て凍結乾燥することにより、本発明の安定化されたＮＡ
Ｇが得られる。この凍結乾燥は低温で行なうことができ
るので、ＮＡＧの失活を防止できるとともに、得られた
凍結乾燥品は液状ＮＡＧよりも安定性が高い。

本発明のコントロール製剤は上記のようにして調製され
たＮＡＧを少なくとも含有するものであり、該製剤は他
の検査対象に対応する成分を併有する製剤であってもよ
い。他の検査対象に対応する成分を併有する製剤は、前
記凍結乾燥品と他の検査対象に対応する成分を混合する
方法、また前記アンモニウム塩及びジアルデヒド化合物
の除去工程を経て得られたＮＡＧ溶液に、他の検査対象
に対応した成分を添加混合し、凍結乾燥する方法等によ
り調製される。また、該製剤は、ＮＡＧの安定性を維持
するため、バイアル等の容器内に密閉した形態で保存す
るのが好ましく、用時に精製水等で希釈して使用される
。

［発明の作用及び効果］ 本発明のＮ　Ａ　Ｇは、単に凍結乾燥されたり架橋剤で
処理された従前のＮＡＧと異なり、アンモニウム塩の存
在下、ジアルデヒド化合物により処理されている。ジア
ルデヒド化合物はＮＡＧ分子中のアミノ基とシッフ塩基
を生成し、架橋構造を形成することにより、ＮＡＧの高
次構造の変形、変性を防止し、ＮＡＧの安定性を向上さ
せる。この際、アンモニウム塩は、ＮＡＧの高次構造の
維持に関与して安定性の向上に寄与しているものと推察
される。また凍結乾燥されているので、ＮＡＧの安定性
はさらに向上する。従って、本発明のＮＡＧは、長期に
亘って保存でき且つ活性を維持することができるという
効果を奏し、特に、可溶性であることから臨床検査のコ
ントロールとして好適に使用できる。

また、本発明のコントロール製剤は、尿中ＮＡＧの測定
等の臨床検査のコントロールとして有用であり、上記安
定化されたＮＡＧを含有し、調製当初の活性を長期に亘
り維持することができるので、測定結果の信頼性を高め
、精度管理に貢献できるとともにコントロールの調製が
容易となり作業性の向上が図れるという効果を奏する。

［実施例］ 以下、実施例及び試験例に基づき、本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

実施例１ ３．２Ｍの硫酸アンモニウム水溶液にＮＡＧを３単位／
１１！となるように溶解した後、５０％のグルタルアル
デヒド溶液を４１１１ｄｌ加えた。２〜８℃に冷却し１
５時間撹拌して反応させた。次いで、反応液を展開液（
水酸化リチウムを含有する０、１５ＭＨＥＰＥＳ緩衝液
、ｐＨ８，０）に混和した後、限外濾過に付し、過剰の
硫酸アンモニウム及びグルグルアルデヒドを除去する操
作を２度行なった。残渣液は展開液に混合し、バイアル
に小分けした後、凍結乾燥することにより、ＮＡＧ製剤
を調製した。

実施例２ 上記実施例１の方法において、限外濾過して得られたＮ
ＡＧ含有溶液に、グルコース、ビリルビン、アルブミン
、ウロビリノーゲン、尿素、尿酸、クレアチン、ヘモグ
ロビン、アミラーゼを添加した後、凍結乾燥することに
より、上記検査対象項目成分を併有する尿検査用コント
ロール製剤を調製した。

比較例 アンモニウム塩及びグルタルアルデヒドを用いることな
く、ＮＡＧ水溶液を、前記実施例１と同様にして凍結乾
燥することによりＮＡＧ製剤を調製した。

試験例 前記実施例１及び２で調製した各製剤を、３７℃の温度
で２０日間保存し、調製当初と保存後のＮＡＧの活性を
調べることにより、安定性を調べたところ、残存酵素活
性が９９％であり、殆ど酵素活性が低下していないこと
が判明した。また２〜８℃の条件で６ケ月間保存したと
ころ、ＮＡＧの活性低下は全く認められなかった。

これに対して、比較例のＮＡＧ製剤を３７℃の温度で１
週間保存したところ、残存酵素活性は僅か３％にすぎな
いことが判明した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを、ア
   ンモニウム塩を含有する溶液に溶解し、ジアルデヒド化
   合物を添加して架橋した後、過剰のアンモニウム塩及び
   ジアルデヒド化合物を除去し、凍結乾燥して得られるこ
   とを特徴とする安定化されたＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
   ルコサミニダーゼ。 ２、アンモニウム塩が、硫酸アンモニウムである請求項
   １記載の安定化されたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
   ミニダーゼ。 ３、ジアルデヒド化合物が、グルタルアルデヒドである
   請求項１記載の安定化されたＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
   ルコサミニダーゼ。 ４、請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
   ニダーゼを少なくとも含有する臨床検査用のコントロー
   ル製剤。 ５、他の検査対象に対応する成分を含有する請求項４記
   載の臨床検査用のコントロール製剤。