JPH01312465A - 診断用具 - Google Patents
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- JPH01312465A JPH01312465A JP10435689A JP10435689A JPH01312465A JP H01312465 A JPH01312465 A JP H01312465A JP 10435689 A JP10435689 A JP 10435689A JP 10435689 A JP10435689 A JP 10435689A JP H01312465 A JPH01312465 A JP H01312465A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
種々のウィルス抗体の検出、とくにＨｒＶに対する抗体
の検出は、遺伝子技術によって製造されるウィルス抗原
で被覆されたビーズを用いて行われる。特定のウィルス
に対する抗原が存在すると、抗体はビーズ上に存在する
ウィルス抗原と反応する。免疫複合体の検出には、洗浄
後、適当な標識とくにペルオキシダーゼを付加された抗
−ヒト抗体が使用される。この抗−ヒト抗体が探索すべ
き抗体に結合する。
の検出は、遺伝子技術によって製造されるウィルス抗原
で被覆されたビーズを用いて行われる。特定のウィルス
に対する抗原が存在すると、抗体はビーズ上に存在する
ウィルス抗原と反応する。免疫複合体の検出には、洗浄
後、適当な標識とくにペルオキシダーゼを付加された抗
−ヒト抗体が使用される。この抗−ヒト抗体が探索すべ
き抗体に結合する。
従来、遺伝子技術によって製造されるウィルス抗原はビ
ーズに吸着によって結合され、これは結合の様式が予測
できず、したがってエピトープの露出は偶然にまかされ
ていることを意味する。
ーズに吸着によって結合され、これは結合の様式が予測
できず、したがってエピトープの露出は偶然にまかされ
ていることを意味する。
本発明は、診断用具、とくに、抗原と同時にそのエピト
ープも、明確に定められた様式で固相に結合している（
第１図参照）固相を有する診断用具に関する。これは、
抗原と同時にそのエピトープも全くランダムに結合して
部分的には重複している（第２図参照）固相とは対照的
である。固相上への一定の様式での抗原の配置は、遺伝
子技術によって製造され、ＮまたはＣ末端に隣接ヒスチ
ジン基を有する抗原を、金属イオンをもつニトリロ玉酢
酸誘導体を介して結合させることによって行われる。
ープも、明確に定められた様式で固相に結合している（
第１図参照）固相を有する診断用具に関する。これは、
抗原と同時にそのエピトープも全くランダムに結合して
部分的には重複している（第２図参照）固相とは対照的
である。固相上への一定の様式での抗原の配置は、遺伝
子技術によって製造され、ＮまたはＣ末端に隣接ヒスチ
ジン基を有する抗原を、金属イオンをもつニトリロ玉酢
酸誘導体を介して結合させることによって行われる。
上述のニトリロ三酢酸誘導体は、次式
％式％）
（式中、Ｘは２，３または４であり、Ｍｅｚ＋は金属イ
オンを示す）で表される構造を有する。
オンを示す）で表される構造を有する。
金属イオンとしては、Ｃｏ”、 Ｎｉ”、Ｃｕ２＋また
はｚｎ２＋が好ましい。
はｚｎ２＋が好ましい。
金属イオンをもつ上述のニトリロ三酢酸誘導体は、ジャ
ーナル・オブ・クロマトグラフィー、第４巻、第１１号
、第１７７〜１８４頁（１９８７年）に記載されている
。
ーナル・オブ・クロマトグラフィー、第４巻、第１１号
、第１７７〜１８４頁（１９８７年）に記載されている
。
スペーサー基は固体支持体とニトリロ三酢酸との間に挿
入することが望ましい。有用なスペーサーとしてはアフ
ィニティークロマトグラフィーに通常使用されるスペー
サー基があげられる。
入することが望ましい。有用なスペーサーとしてはアフ
ィニティークロマトグラフィーに通常使用されるスペー
サー基があげられる。
固相としては、アフィニティークロマトグラフィーおよ
びゲルクロマトグラフィーに用いられる材料、例えば架
橋デキストラン、アガロース（とくにセファロース■の
商標で知られている型）またはポリアクリルアミドが考
慮される。しかしながら、診断法において通常使用され
るガラスピーズがとくに適用であり、表面に予めエポキ
シド機能をもたせたものがとくに好ましい。
びゲルクロマトグラフィーに用いられる材料、例えば架
橋デキストラン、アガロース（とくにセファロース■の
商標で知られている型）またはポリアクリルアミドが考
慮される。しかしながら、診断法において通常使用され
るガラスピーズがとくに適用であり、表面に予めエポキ
シド機能をもたせたものがとくに好ましい。
本発明によるタンパク質抗原の配置により、生物学的体
液中の種々のウィルス抗体の定量は驚異的に改善される
。
液中の種々のウィルス抗体の定量は驚異的に改善される
。
本発明の診断用具は、主として、ＨＩＶＩ、ＨＩＶＩＩ
、ＨＩＶＩおよびＨＩＶＩＩ、Ｂ型肝炎ウィルス、狂犬
病ウィルス、ＨＴＬＶ ＩならびにＨＴＬＶＩＩに対す
る抗体の定量に適している。
、ＨＩＶＩおよびＨＩＶＩＩ、Ｂ型肝炎ウィルス、狂犬
病ウィルス、ＨＴＬＶ ＩならびにＨＴＬＶＩＩに対す
る抗体の定量に適している。
問題の抗原を、たとえば大腸菌内で、ＮまたはＣ末端に
隣接ヒスチジン基を有するように、どのようにして発現
させねばならないかは、遺伝子技術者には自明であろう
。
隣接ヒスチジン基を有するように、どのようにして発現
させねばならないかは、遺伝子技術者には自明であろう
。
さらに、本発明は、種々のウィルス抗原、とくニＨＩＶ
Ｉ 、ＨＩＶ ＩＩ、ＨＩＶ Ｉ オ、ｌ：ヒＨＩＶ
ＩＩ、Ｂ型肝炎ウィルス、狂犬病ウィルス、ＨＴＬＶ
ＩならびにＨＴＬＶ ＩＩに対する抗体の検出のため
の診断用具の使用に関する。
Ｉ 、ＨＩＶ ＩＩ、ＨＩＶ Ｉ オ、ｌ：ヒＨＩＶ
ＩＩ、Ｂ型肝炎ウィルス、狂犬病ウィルス、ＨＴＬＶ
ＩならびにＨＴＬＶ ＩＩに対する抗体の検出のため
の診断用具の使用に関する。
以下の例は本発明を例示するものである。
倒」
ビーズの製造
表面に既にエポキシド機能を有する市販のビーズを本発
明のビーズの製造に使用した。
明のビーズの製造に使用した。
水２５ｍｅに溶解したＮ−［５−アミノ−１−カルボキ
シペンチル］イミノニ酢酸、 Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４０
Ｈ（ＣＯＯＨ） −Ｎ −（ＣＨ２ＣＯＯＨ）２１．２
ｇ、 Ｎａ２Ｃｏ３１．３ ｇおよびオイベルギット
（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ ） ＣＢ ６２００ビーズ（Ｒ５
ｈｍ Ｐｈａｒｍ、 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ） １００
個を丸底フラスコに加えた。反応混合物を水浴中５５°
Ｃで１５時間インキュベートした。次に、ビーズをクロ
マトグラフィーカラムに充填し、水で中性になるまで洗
浄した。ついでビーズを、最初１０ｍ（のＣｕ ８０４
・６Ｈ２０（２重量％）で次に２５０ｍ６の水で洗浄し
た。
シペンチル］イミノニ酢酸、 Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４０
Ｈ（ＣＯＯＨ） −Ｎ −（ＣＨ２ＣＯＯＨ）２１．２
ｇ、 Ｎａ２Ｃｏ３１．３ ｇおよびオイベルギット
（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ ） ＣＢ ６２００ビーズ（Ｒ５
ｈｍ Ｐｈａｒｍ、 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ） １００
個を丸底フラスコに加えた。反応混合物を水浴中５５°
Ｃで１５時間インキュベートした。次に、ビーズをクロ
マトグラフィーカラムに充填し、水で中性になるまで洗
浄した。ついでビーズを、最初１０ｍ（のＣｕ ８０４
・６Ｈ２０（２重量％）で次に２５０ｍ６の水で洗浄し
た。
生成した式
オイベルギットＣＢ−ＣＨ（ＯＨ） −ＣＨ２−ＮＨ−
（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＯＯＨ） −Ｎ−（ＣＨ３ＣＯＯ
−）２Ｃｕ”で表されるビーズの銅イオン濃度は約３．
５ナノモルｌビニズであった。
（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＯＯＨ） −Ｎ−（ＣＨ３ＣＯＯ
−）２Ｃｕ”で表されるビーズの銅イオン濃度は約３．
５ナノモルｌビニズであった。
このビーズに、次側に記載するようにして、ＨＩＶ抗原
を負荷した。
を負荷した。
例２
ビーズのＡＩＤＳ抗原による被覆
１００個のビーズを各１５ｍ（の６Ｍグアニジン塩酸塩
ｐＨ８＋ ０．１ Ｍリン酸ナトリウムで３回洗浄する
。
ｐＨ８＋ ０．１ Ｍリン酸ナトリウムで３回洗浄する
。
ついで、以下の抗原を同じ緩衝液１５ｍ！：に溶解する
。
。
ａ） ０．２６ｍｇ（ＥＮＶ−８０）（ＧＡＧ−Ｖｌ
ｌ）（ヘキサヒス）（アミノ酸配列は第３図参照） ｂ） ０．２６ｍｇ（ＥＮＶ−８０）（ＧＡＧ−Ｖｌ
ｌ）（ヘキサヒス） ＋ ０．５５ ｍｇ （ヘキサヒ
ス） （ｍＤＨＦＲ） （ＥＮＶ ６０ ）（アミノ酸
配列は第４図参照） 回転振盪機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ）上、２２
°Ｃで１８時間、穏やかな振盪を行う。次に過剰の抗原
を吸引枦去し、各回１５ｍ６の上記緩衝液で２回、０．
１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７で３回洗浄して完全に除去
する。ビーズはこの緩衝液中に（湿潤）、または真空中
で乾燥後（乾燥）、保存することができる。
ｌ）（ヘキサヒス）（アミノ酸配列は第３図参照） ｂ） ０．２６ｍｇ（ＥＮＶ−８０）（ＧＡＧ−Ｖｌ
ｌ）（ヘキサヒス） ＋ ０．５５ ｍｇ （ヘキサヒ
ス） （ｍＤＨＦＲ） （ＥＮＶ ６０ ）（アミノ酸
配列は第４図参照） 回転振盪機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ）上、２２
°Ｃで１８時間、穏やかな振盪を行う。次に過剰の抗原
を吸引枦去し、各回１５ｍ６の上記緩衝液で２回、０．
１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７で３回洗浄して完全に除去
する。ビーズはこの緩衝液中に（湿潤）、または真空中
で乾燥後（乾燥）、保存することができる。
例Ｊ
ヒト血清中のＡＩＤＳ抗 の検出
ヒト血清中のＡＩＤＳ抗体の試験には、市販のＲｏｃｈ
ｅ ＡＩＤＳ診断キットの操作および全試薬溶液が使用
できる［これに関しては、Ａｎｔｉ−ＨＩＶ （ＨＴＬ
ＶＩＩＩ ／ ＬＡＶ ） ＥＩＡ ＜ Ｒｏｃｈｅ
＞ Ｔｅ５ｔ説明書、１９８７年４月刊、参照］。例２
によるａ）型ビーズのみでなく ｂ）型ビーズもＡＩＤ
Ｓ陽性血清とＡＩＤＳ 陰性血清を明瞭に識別する。
ｅ ＡＩＤＳ診断キットの操作および全試薬溶液が使用
できる［これに関しては、Ａｎｔｉ−ＨＩＶ （ＨＴＬ
ＶＩＩＩ ／ ＬＡＶ ） ＥＩＡ ＜ Ｒｏｃｈｅ
＞ Ｔｅ５ｔ説明書、１９８７年４月刊、参照］。例２
によるａ）型ビーズのみでなく ｂ）型ビーズもＡＩＤ
Ｓ陽性血清とＡＩＤＳ 陰性血清を明瞭に識別する。
例４
ａ）型 ｂ）型
ＮＹ２．非希釈 １．６９８ １．５３０
第１図は、本発明の診断用具のビーズ表面における抗原
とエピトープの配置状態を模式的に示した図であり、第
２図は従来の吸着によった場合のビーズ表面における抗
原とエピトープの配置状態を模式的に示す図である。第
３図は（ＥＮＶ −８０） （ＧＡＧ−Ｖｌｌ）（ヘキ
サヒス）のアミノ酸配列を示す構造図であり、第４図は
（ヘキサヒス） （ｍ ＤＨＦＲ）（ＥＮＶ−６０）の
アミノ酸配列を示す構造図である。
とエピトープの配置状態を模式的に示した図であり、第
２図は従来の吸着によった場合のビーズ表面における抗
原とエピトープの配置状態を模式的に示す図である。第
３図は（ＥＮＶ −８０） （ＧＡＧ−Ｖｌｌ）（ヘキ
サヒス）のアミノ酸配列を示す構造図であり、第４図は
（ヘキサヒス） （ｍ ＤＨＦＲ）（ＥＮＶ−６０）の
アミノ酸配列を示す構造図である。
Claims (26)
- （１）遺伝子技術によつて製造され、隣接ヒスチジン基
を有する抗原が、金属イオンをもつニトリロ三酢酸誘導
体を介し、所望によりさらにスペーサー基を介して固相
に結合されていることを特徴とする診断用具 - （２）金属イオンをもつニトリロ三酢酸誘導体は、式 ＮＨ＿２−（ＣＨ＿２）＿ｘ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（
ＣＨ＿２ＣＯＯ＾−）＿２ＭＥ＾２＾＋（ I ） （式中、ｘは２、３または４であり、Ｍｅ＾２＾＋は金
属イオンを示す）で表される構造を有する特許請求の範
囲第１項の診断用具 - （３）Ｍｅ＾２＾＋はＣｏ＾２＾＋、Ｎｉ＾２＾＋、Ｃ
ｕ＾２＾＋またはＺｎ＾２＾＋である特許請求の範囲第
１項または第２項のいずれか一つの診断用具 - （４）固相は、診断法において慣用されるビーズである
特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか一つの
診断用具 - （５）ビーズはその表面にエポキシド機能を含有する特
許請求の範囲第４項の診断用具 - （６）遺伝子技術によつて製造される抗原はＨＩＶ I
抗原である特許請求の範囲第１項から第５項までのいず
れかの診断用具 - （７）遺伝子技術によつて製造される抗原はＨＩＶIIで
ある特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか一
つの診断用具 - （８）遺伝子技術によつて製造される抗原はＨＩＶ I
およびＨＩＶIIである特許請求の範囲第１項から第５項
までのいずれか一つの診断用具 - （９）遺伝子技術によつて製造される抗原は狂犬病ウィ
ルスである特許請求の範囲第１項から第５項までのいず
れか一つの診断用具 - （１０）遺伝子技術によつて製造される抗原はＨＴＬＶ
I である特許請求の範囲第１項から第５項までのいず
れか一つの診断用具 - （１１）遺伝子技術によつて製造される抗原はＨＴＬＶ
IIである特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つの診断用具 - （１２）ウィルス抗原に対する抗体を検出するための特
許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか一つの診
断用具 - （１３）ＨＩＶ I に対する抗体を検出するための特許
請求の範囲第１項から第５項までのいずれか一つの診断
用具の使用 - （１４）ＨＩＶIIに対する抗体を検出するための特許請
求の範囲第１項から第５項までのいずれか一つの診断用
具の使用 - （１５）ＨＩＶ I およびＨＩＶIIに対する抗体を検出
するための特許請求の範囲第１項から第５項までのいず
れか一つの診断用具の使用 - （１６）Ｂ型肝炎ウィルスに対する抗体を検出するため
の特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか一つ
の診断用具の使用 - （１７）狂犬病ウィルスに対する抗体を検出するための
特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか一つの
診断用具の使用 - （１８）ＨＴＬＶ I に対する抗体を検出するための特
許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか一つの診
断用具の使用 - （１９）ＨＴＬＶIIに対する抗体を検出するための特許
請求の範囲第１項から第５項までのいずれか一つの診断
用具の使用 - （２０）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つの診断用具を使用するＨＩＶ I に対する抗体の
検出方法 - （２１）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つの診断用具を使用するＨＩＶIIに対する抗体の検
出方法 - （２２）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つの診断用具を使用するＨＩＶ I およびＨＩＶII
に対する抗体の検出方法 - （２３）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つの診断用具を使用するＢ型肝炎ウィルスに対する
抗体の検出方法 - （２４）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つの診断用具を使用する狂犬病ウィルスに対する抗
体の検出方法 - （２５）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つの診断用具を使用するＨＴＬＶ I に対する抗体
の検出方法 - （２６）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つの診断用具を使用するＨＴＬＶIIに対する抗体の
検出方法
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH153788 | 1988-04-25 | ||
| CH163588 | 1988-05-02 | ||
| CH1635/88-0 | 1988-05-02 | ||
| CH1537/88-0 | 1988-05-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01312465A true JPH01312465A (ja) | 1989-12-18 |
| JPH0758294B2 JPH0758294B2 (ja) | 1995-06-21 |
Family
ID=25687939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10435689A Expired - Lifetime JPH0758294B2 (ja) | 1988-04-25 | 1989-04-24 | 診断用具 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0339389B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0758294B2 (ja) |
| DE (1) | DE58905660D1 (ja) |
| DK (1) | DK174991B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010156647A (ja) * | 2009-01-05 | 2010-07-15 | Fujifilm Corp | 担体およびその製造方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3879881D1 (de) * | 1987-11-16 | 1993-05-06 | Hoffmann La Roche | Rekombinante hiv-2 polypeptide. |
| US5780038A (en) * | 1987-11-16 | 1998-07-14 | Roche Diagnostic Systems, Inc. | HIV-2 envelope polypeptides |
| CA2047235A1 (en) * | 1990-01-19 | 1991-07-20 | Rainer Rudolph | Process for the enzymatic treatment of substrates |
| DE4405810A1 (de) | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
| DE4433980C2 (de) * | 1994-09-23 | 1996-08-22 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren und Biosensorhit zur Untersuchung der Wechselwirkung von Biomolekülen mittels Oberflächen-Plasma-Resonanz |
| DE19745001A1 (de) * | 1997-10-11 | 1999-05-06 | Evotec Biosystems Ag | Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1989
- 1989-04-14 DE DE89106688T patent/DE58905660D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-14 EP EP89106688A patent/EP0339389B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-24 DK DK197589A patent/DK174991B1/da not_active IP Right Cessation
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