JPH10197531A - 被検物質の免疫化学的測定の改良のための免疫解離 - Google Patents
被検物質の免疫化学的測定の改良のための免疫解離Info
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- JPH10197531A JPH10197531A JP9348384A JP34838497A JPH10197531A JP H10197531 A JPH10197531 A JP H10197531A JP 9348384 A JP9348384 A JP 9348384A JP 34838497 A JP34838497 A JP 34838497A JP H10197531 A JPH10197531 A JP H10197531A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 被検物質の免疫化学的測定を改良し、被検物
質が従来法における固定化された特異的受容体と低親和
性を示す場合の感度の低下を生じない方法の提供。 【解決手段】 サンプル中の１種または２種以上の被検
物質を、被検物質と相互作用性の生物親和性を示す固定
化した特異的受容体Ｒ１および被検物質と同様に相互作
用性の生物親和性を示すに標識した特異的受容体Ｒ２を
用いて測定する方法において、被検物質に対する特異的
結合部位１個または２個以上を有する受容体Ｒ３を添加
し、既に形成した免疫複合体を完全にまたは部分的に解
離させたのち、再会合させついで検出する方法、または
受容体Ｒ３に加えて、Ｒ３に対して結合親和性を示す固
定化した特異的受容体Ｒ４を用い、既に形成した免疫複
合体を完全にまたは部分的に解離させたのち、再会合さ
せついで検出する方法。
質が従来法における固定化された特異的受容体と低親和
性を示す場合の感度の低下を生じない方法の提供。 【解決手段】 サンプル中の１種または２種以上の被検
物質を、被検物質と相互作用性の生物親和性を示す固定
化した特異的受容体Ｒ１および被検物質と同様に相互作
用性の生物親和性を示すに標識した特異的受容体Ｒ２を
用いて測定する方法において、被検物質に対する特異的
結合部位１個または２個以上を有する受容体Ｒ３を添加
し、既に形成した免疫複合体を完全にまたは部分的に解
離させたのち、再会合させついで検出する方法、または
受容体Ｒ３に加えて、Ｒ３に対して結合親和性を示す固
定化した特異的受容体Ｒ４を用い、既に形成した免疫複
合体を完全にまたは部分的に解離させたのち、再会合さ
せついで検出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル中の１種
または２種以上の被検物質（アナライト）の免疫化学的
測定方法に関し、被検物質と相互作用性の生物親和性を
示す固定化された特異的受容体Ｒ１、および同様に被検
物質と相互作用性の生物親和性を示し一般的に標識され
ている特異的受容体Ｒ２を使用する。本発明の新規な方
法においては、被検物質に対する１個または２個以上の
特異的結合部位を有する受容体Ｒ３が添加され、生成し
た免疫複合体を完全にまたは部分的に解離させたのち、
それらを再会合させ、ついで検出する。他の実施態様に
おいては、受容体Ｒ３に加えて受容体Ｒ４が使用され、
この受容体Ｒ４はＲ３に対して親和性を有し、固相に固
定化され、生成した免疫複合体を完全にまたは部分的に
解離させたのち、それらを再会合させ、ついで検出す
る。
または２種以上の被検物質（アナライト）の免疫化学的
測定方法に関し、被検物質と相互作用性の生物親和性を
示す固定化された特異的受容体Ｒ１、および同様に被検
物質と相互作用性の生物親和性を示し一般的に標識され
ている特異的受容体Ｒ２を使用する。本発明の新規な方
法においては、被検物質に対する１個または２個以上の
特異的結合部位を有する受容体Ｒ３が添加され、生成し
た免疫複合体を完全にまたは部分的に解離させたのち、
それらを再会合させ、ついで検出する。他の実施態様に
おいては、受容体Ｒ３に加えて受容体Ｒ４が使用され、
この受容体Ｒ４はＲ３に対して親和性を有し、固相に固
定化され、生成した免疫複合体を完全にまたは部分的に
解離させたのち、それらを再会合させ、ついで検出す
る。
【０００２】
【従来の技術】疾患の誘発因子、たとえばウイルス、細
菌、アレルゲン、自己抗原または特定の医薬に対する特
異的な抗体の形成を伴う疾患の診断に慣用される免疫学
的方法は、これらの抗体がその誘発因子の属する抗原性
構造と複合体を形成する能力に基づくものである。
菌、アレルゲン、自己抗原または特定の医薬に対する特
異的な抗体の形成を伴う疾患の診断に慣用される免疫学
的方法は、これらの抗体がその誘発因子の属する抗原性
構造と複合体を形成する能力に基づくものである。
【０００３】一般に不均一系イムノアッセイと呼ばれる
これらの方法の特定の実施態様においては、たとえば特
異的な抗体（被検抗体）の含量を検査すべきサンプル
を、適当な既知の支持材料に固定化された疾患誘発因子
の抗原性構造と接触させる。サンプル中に存在する被検
抗体は支持材料上に固定化された疾患誘発因子の抗原性
構造に免疫複合体として結合し、検出される。サンプル
の被検抗体と複合体を形成できる検出抗体または他の特
異的受容体（たとえばプロテインＡ）を検出に使用する
ことができる。
これらの方法の特定の実施態様においては、たとえば特
異的な抗体（被検抗体）の含量を検査すべきサンプル
を、適当な既知の支持材料に固定化された疾患誘発因子
の抗原性構造と接触させる。サンプル中に存在する被検
抗体は支持材料上に固定化された疾患誘発因子の抗原性
構造に免疫複合体として結合し、検出される。サンプル
の被検抗体と複合体を形成できる検出抗体または他の特
異的受容体（たとえばプロテインＡ）を検出に使用する
ことができる。
【０００４】一般に、検出試薬は、結合した抗体の量の
検出を原理的に可能にする標識を有する。通常用いられ
る標識は、放射性同位元素、酵素、蛍光、リン光もしく
は化学発光物質、安定な不対電子を有する物質、ラテッ
クス粒子、磁性粒子、金属ゾルおよび赤血球である。
検出を原理的に可能にする標識を有する。通常用いられ
る標識は、放射性同位元素、酵素、蛍光、リン光もしく
は化学発光物質、安定な不対電子を有する物質、ラテッ
クス粒子、磁性粒子、金属ゾルおよび赤血球である。
【０００５】これらの方法には、単一工程および多重工
程検出法の両者を包含することが知られている。各操作
工程は通常、分離過程（洗浄工程）によって終了する。
しかしながら、不均一系イムノアッセイにおいては、実
施が極めて簡単な技術である単一工程はすべての疾患マ
ーカーの検出には適当ではない。この技術的理由によ
り、二工程または多重工程法が頻繁に採用されなければ
ならない。
程検出法の両者を包含することが知られている。各操作
工程は通常、分離過程（洗浄工程）によって終了する。
しかしながら、不均一系イムノアッセイにおいては、実
施が極めて簡単な技術である単一工程はすべての疾患マ
ーカーの検出には適当ではない。この技術的理由によ
り、二工程または多重工程法が頻繁に採用されなければ
ならない。
【０００６】さらに免疫複合体トランスファー酵素イム
ノアッセイと呼ばれる多重工程方法（S. Hashidaら, Jo
urnal of Clinical Laboratory Analysis 8：86-95, 19
94）も知られている。これらの方法では、固相抗原、特
異的抗体および標識接合抗原から全免疫複合体が固相か
ら脱着される。ついで全免疫複合体はピペットで抗体結
合固相に移されたのち固定され検出される。
ノアッセイと呼ばれる多重工程方法（S. Hashidaら, Jo
urnal of Clinical Laboratory Analysis 8：86-95, 19
94）も知られている。これらの方法では、固相抗原、特
異的抗体および標識接合抗原から全免疫複合体が固相か
ら脱着される。ついで全免疫複合体はピペットで抗体結
合固相に移されたのち固定され検出される。
【０００７】これらの方法は極めて特異的ではあるが、
第一工程において固定化された特異的受容体との複合体
中に入った検出すべき疾患誘発因子またはそれらに向け
られた抗体は、本技術分野の熟練者には周知の逆反応に
より、次の反応工程中に再び複合体から脱着し、その結
果、検出反応から逃避して、たとえば感度の低下を生じ
るという欠点がある。
第一工程において固定化された特異的受容体との複合体
中に入った検出すべき疾患誘発因子またはそれらに向け
られた抗体は、本技術分野の熟練者には周知の逆反応に
より、次の反応工程中に再び複合体から脱着し、その結
果、検出反応から逃避して、たとえば感度の低下を生じ
るという欠点がある。
【０００８】固定化された受容体と検出すべき物質の間
の逆反応の速度が高い場合、このような多重工程の診断
効率の低下の程度はとくに著しい。このような高い速度
は、たとえば、疾患誘発因子または医薬に対する抗体が
低親和性である場合に認められる。これらの効果が、頻
繁に突然変異する疾患誘発因子または疾患マーカーを検
出する方法で、それらが突然変異後には、固定化された
特異的受容体とわずかな相互作用しか示さない場合にと
くに起こることは、本技術分野の熟練者に知られている
通りである。
の逆反応の速度が高い場合、このような多重工程の診断
効率の低下の程度はとくに著しい。このような高い速度
は、たとえば、疾患誘発因子または医薬に対する抗体が
低親和性である場合に認められる。これらの効果が、頻
繁に突然変異する疾患誘発因子または疾患マーカーを検
出する方法で、それらが突然変異後には、固定化された
特異的受容体とわずかな相互作用しか示さない場合にと
くに起こることは、本技術分野の熟練者に知られている
通りである。
【０００９】EP 0 572 845 号には、検出すべき物質の
構造的特徴に対する更なる受容体を添加することによっ
て逆反応が実質的に低下することが開示されている。こ
の受容体は検出すべき物質に対する２個以上の結合部位
をもたねばならず、その物質の免疫化学的検出を妨害す
るものであってはならない。しかしながら、逆反応の顕
著な低下にもかかわらず、この方法を、このような疾患
誘発因子または医薬に対する特異的低親和性抗体の信頼
に足る高感度での検出に使用することはやはりできな
い。
構造的特徴に対する更なる受容体を添加することによっ
て逆反応が実質的に低下することが開示されている。こ
の受容体は検出すべき物質に対する２個以上の結合部位
をもたねばならず、その物質の免疫化学的検出を妨害す
るものであってはならない。しかしながら、逆反応の顕
著な低下にもかかわらず、この方法を、このような疾患
誘発因子または医薬に対する特異的低親和性抗体の信頼
に足る高感度での検出に使用することはやはりできな
い。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、したがっ
て、上述のような低親和性の抗体による欠点をもたない
試薬の発見をその基盤とするものである。
て、上述のような低親和性の抗体による欠点をもたない
試薬の発見をその基盤とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】固定化された特異的受容
体Ｒ１、受容体Ｒ１と相互作用性の生物親和性を示す被
検物質Ａ、およびこの被検物質に向けられ一般に標識さ
れている特異的受容体Ｒ２から構成される既に形成され
た免疫複合体に免疫解離工程および再会合工程を行い、
さらに受容体Ｒ３を付加的に添加した場合、結果として
シグナルの増大が認められるという驚くべき事実が観察
されたのである。すなわち、この後者の受容体が、被検
物質Ａと受容体Ｒ１または被検物質Ａと受容体Ｒ２の間
の免疫反応を抑制することなく、２個以上の被検物質を
結合できるという事実により、固相に結合しない被検物
質の比率を低下させる。
体Ｒ１、受容体Ｒ１と相互作用性の生物親和性を示す被
検物質Ａ、およびこの被検物質に向けられ一般に標識さ
れている特異的受容体Ｒ２から構成される既に形成され
た免疫複合体に免疫解離工程および再会合工程を行い、
さらに受容体Ｒ３を付加的に添加した場合、結果として
シグナルの増大が認められるという驚くべき事実が観察
されたのである。すなわち、この後者の受容体が、被検
物質Ａと受容体Ｒ１または被検物質Ａと受容体Ｒ２の間
の免疫反応を抑制することなく、２個以上の被検物質を
結合できるという事実により、固相に結合しない被検物
質の比率を低下させる。
【００１２】他の実施態様においては、Ｒ３に加えて、
さらに固定化された受容体Ｒ４を添加する。この受容体
Ｒ４はＲ３に対して相互作用性の結合親和性を示すこと
ができる。Ｒ４は、被検物質Ａと受容体Ｒ３からなる免
疫複合体を固相に結合させることにより、非固定化免疫
複合体の比率を低下させる。しかしながらこの場合、特
異的受容体Ｒ３は、上述の実施態様の場合のように、被
検物質Ａに対する２個以上の特異的結合部位をもたねば
ならない。被検物質Ａのこの付加的結合、および結果と
して一般に標識を有する受容体Ｒ２の付加的結合は、シ
グナルの発生を著しく増大させ、最終的に被検物質Ａの
アッセイの感度を上昇させる。
さらに固定化された受容体Ｒ４を添加する。この受容体
Ｒ４はＲ３に対して相互作用性の結合親和性を示すこと
ができる。Ｒ４は、被検物質Ａと受容体Ｒ３からなる免
疫複合体を固相に結合させることにより、非固定化免疫
複合体の比率を低下させる。しかしながらこの場合、特
異的受容体Ｒ３は、上述の実施態様の場合のように、被
検物質Ａに対する２個以上の特異的結合部位をもたねば
ならない。被検物質Ａのこの付加的結合、および結果と
して一般に標識を有する受容体Ｒ２の付加的結合は、シ
グナルの発生を著しく増大させ、最終的に被検物質Ａの
アッセイの感度を上昇させる。
【００１３】他の実施態様においては、受容体Ｒ４が第
二の固相に固定化され、解離した免疫複合体たとえばＲ
３−Ａ−Ｒ２は、第一の固相から第二の固相に移動し
て、ここで再会合が起こり、またＲ２の検出も行われ
る。
二の固相に固定化され、解離した免疫複合体たとえばＲ
３−Ａ−Ｒ２は、第一の固相から第二の固相に移動し
て、ここで再会合が起こり、またＲ２の検出も行われ
る。
【００１４】本発明の目的の範囲内において、検出され
る被検物質Ａは、たとえば疾患誘発因子によって誘導さ
れる抗体、また疾患誘発因子自体のような抗原のいずれ
であってもよい。
る被検物質Ａは、たとえば疾患誘発因子によって誘導さ
れる抗体、また疾患誘発因子自体のような抗原のいずれ
であってもよい。
【００１５】本発明は、したがって、１種または２種以
上の被検物質の免疫学的測定方法において、支持体上に
固定化された特異的受容体Ｒ１を用い、特異的受容体Ｒ
１に対する被検物質の結合の程度は、直接または間接的
に標識を有する別の特異的受容体のＲ２によって測定さ
れ、解離工程を包含する過程では、検出すべき物質Ａに
対する１個または２個以上の結合部位を有し、固定化さ
れた特異的受容体Ｒ１とは親和性を示さず、標識されて
いない受容体Ｒ３を添加し、直接または間接的に標識を
有する特異的受容体Ｒ２に対する被検物質Ａの結合の程
度を再会合後に測定する方法に関する。
上の被検物質の免疫学的測定方法において、支持体上に
固定化された特異的受容体Ｒ１を用い、特異的受容体Ｒ
１に対する被検物質の結合の程度は、直接または間接的
に標識を有する別の特異的受容体のＲ２によって測定さ
れ、解離工程を包含する過程では、検出すべき物質Ａに
対する１個または２個以上の結合部位を有し、固定化さ
れた特異的受容体Ｒ１とは親和性を示さず、標識されて
いない受容体Ｒ３を添加し、直接または間接的に標識を
有する特異的受容体Ｒ２に対する被検物質Ａの結合の程
度を再会合後に測定する方法に関する。
【００１６】本発明はまた１種または２種以上の被検物
質の免疫学的測定方法において、支持体上に固定化され
た特異的受容体Ｒ１を用い、特異的受容体Ｒ１に対する
被検物質Ａの結合の程度は、直接または間接的に標識を
有する別の特異的受容体Ｒ２によって測定され、解離工
程を包含する過程では、検出すべき物質Ａに対してこの
場合は単一の結合部位しかもってはならない結合因子Ｒ
３に加えて、さらに固定化されたまたは固定化可能な特
異的受容体Ｒ４を添加し、この受容体Ｒ４はＲ３に対し
て親和性を示し、直接的または間接的な標識を有する特
異的受容体Ｒ２に対する被検物質Ａの結合の程度を再会
合後に測定する方法に関する。
質の免疫学的測定方法において、支持体上に固定化され
た特異的受容体Ｒ１を用い、特異的受容体Ｒ１に対する
被検物質Ａの結合の程度は、直接または間接的に標識を
有する別の特異的受容体Ｒ２によって測定され、解離工
程を包含する過程では、検出すべき物質Ａに対してこの
場合は単一の結合部位しかもってはならない結合因子Ｒ
３に加えて、さらに固定化されたまたは固定化可能な特
異的受容体Ｒ４を添加し、この受容体Ｒ４はＲ３に対し
て親和性を示し、直接的または間接的な標識を有する特
異的受容体Ｒ２に対する被検物質Ａの結合の程度を再会
合後に測定する方法に関する。
【００１７】本発明はさらに１種または２種以上の被検
物質の免疫学的測定方法において、支持体上に固定化さ
れた特異的受容体Ｒ１を用い、特異的受容体Ｒ１に対す
る被検物質Ａの結合の程度は、直接または間接的に標識
を有する別の特異的受容体Ｒ２によって測定され、解離
工程を包含する過程では、検出すべき物質に対してこの
場合は単一の結合部位しかもってはならない結合因子Ｒ
３に加えて、さらに固定化されたまたは固定化可能な特
異的受容体Ｒ４からなる第二の固相に、解離した免疫複
合体たとえばＲ３−Ａ−２が移動し、直接または間接的
に標識を有する特異的受容体Ｒ２に対する被検物質Ａの
結合の程度を再会合後に測定する方法に関する。
物質の免疫学的測定方法において、支持体上に固定化さ
れた特異的受容体Ｒ１を用い、特異的受容体Ｒ１に対す
る被検物質Ａの結合の程度は、直接または間接的に標識
を有する別の特異的受容体Ｒ２によって測定され、解離
工程を包含する過程では、検出すべき物質に対してこの
場合は単一の結合部位しかもってはならない結合因子Ｒ
３に加えて、さらに固定化されたまたは固定化可能な特
異的受容体Ｒ４からなる第二の固相に、解離した免疫複
合体たとえばＲ３−Ａ−２が移動し、直接または間接的
に標識を有する特異的受容体Ｒ２に対する被検物質Ａの
結合の程度を再会合後に測定する方法に関する。
【００１８】本発明の目的の範囲内においては、非標識
とは、Ｒ３が標識をもたないか、少なくとも特異的受容
体に対する被検物質の結合の程度を測定するために用い
られる標識をもたないことを意味する。
とは、Ｒ３が標識をもたないか、少なくとも特異的受容
体に対する被検物質の結合の程度を測定するために用い
られる標識をもたないことを意味する。
【００１９】固定化された特異的受容体Ｒ４を使用でき
る方法は、それらのすべての実施態様において、本技術
分野の熟練者には周知である。重要な因子は新規な方法
が、好ましくは固定化された特異的受容体に対する免疫
化学的またはそれに匹敵する被検物質の結合が第一工程
で行われ第二の工程で直接または間接的検出が行われる
が、必ずしも順序だった別個の工程として行われること
が必須ではないすべての免疫学的方法において適当な形
態で採用できることである。
る方法は、それらのすべての実施態様において、本技術
分野の熟練者には周知である。重要な因子は新規な方法
が、好ましくは固定化された特異的受容体に対する免疫
化学的またはそれに匹敵する被検物質の結合が第一工程
で行われ第二の工程で直接または間接的検出が行われる
が、必ずしも順序だった別個の工程として行われること
が必須ではないすべての免疫学的方法において適当な形
態で採用できることである。
【００２０】これらの方法は、好ましくは色素原もしく
は蛍光原基質を有する酵素または好ましくは標識システ
ムとして用いられる発光標識を用いる本技術分野の熟練
者にはサンドイッチＥＬＩＳＡとして知られる方法にお
いて好んで採用されている。
は蛍光原基質を有する酵素または好ましくは標識システ
ムとして用いられる発光標識を用いる本技術分野の熟練
者にはサンドイッチＥＬＩＳＡとして知られる方法にお
いて好んで採用されている。
【００２１】好ましくはマイクロタイトレーションプレ
ート、磁性粒子、ラテックス粒子、または、たとえば線
維もしくは膜からなる試験モジュールのような化学マト
リックスが固相として使用される。
ート、磁性粒子、ラテックス粒子、または、たとえば線
維もしくは膜からなる試験モジュールのような化学マト
リックスが固相として使用される。
【００２２】上述のような免疫学的方法が異なる被検物
質の同時測定に、たとえばＨＩＶ１（ＨＩＶ＝ヒト免疫
不全ウイルス）およびＨＩＶ２の個別的もしくは両者の
組合せでの測定、またはＨＩＶ１および／またはＨＩＶ
２のＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス
抗原）との組合せの測定に採用できる。上述の意味での
被検物質は、ウイルス抗原でもまたそれらに対する抗体
であってもよい。このような実施態様は本発明に包含さ
れる。
質の同時測定に、たとえばＨＩＶ１（ＨＩＶ＝ヒト免疫
不全ウイルス）およびＨＩＶ２の個別的もしくは両者の
組合せでの測定、またはＨＩＶ１および／またはＨＩＶ
２のＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス
抗原）との組合せの測定に採用できる。上述の意味での
被検物質は、ウイルス抗原でもまたそれらに対する抗体
であってもよい。このような実施態様は本発明に包含さ
れる。
【００２３】本発明の目的の範囲内において、解離と
は、生物親和性相互作用の可逆的破壊または減弱を可能
にするすべての化学的および物理的方法を包含する。本
技術分野の熟練者にはチオシアナート、尿素またはグア
ニジンのような化学物質がよく知られていて、これらは
タンパク質および抗体の免疫化学的精製に使用される。
解離はまた、適当な免疫学的活性物質との競合のような
免疫学的方法を用いることによってももたらされる。解
離はさらに、酸性またはアルカリ性溶液を使用すること
によって達成できる。本技術分野の熟練者は同様に、解
離の物理的方法、たとえば温度差、マイクロ波または超
音波についても精通している。
は、生物親和性相互作用の可逆的破壊または減弱を可能
にするすべての化学的および物理的方法を包含する。本
技術分野の熟練者にはチオシアナート、尿素またはグア
ニジンのような化学物質がよく知られていて、これらは
タンパク質および抗体の免疫化学的精製に使用される。
解離はまた、適当な免疫学的活性物質との競合のような
免疫学的方法を用いることによってももたらされる。解
離はさらに、酸性またはアルカリ性溶液を使用すること
によって達成できる。本技術分野の熟練者は同様に、解
離の物理的方法、たとえば温度差、マイクロ波または超
音波についても精通している。
【００２４】本発明の目的の範囲内においては、再会合
とは、とくに、非解離条件をもたらすこと、たとえば中
和もしくは希釈たとえば単に以前に支配的であった解離
条件を逆転させること、たとえば上述の温度差を除去す
ることまたはマイクロ波発生装置もしくは超音波発生装
置のスイッチを切ることを意味する。
とは、とくに、非解離条件をもたらすこと、たとえば中
和もしくは希釈たとえば単に以前に支配的であった解離
条件を逆転させること、たとえば上述の温度差を除去す
ることまたはマイクロ波発生装置もしくは超音波発生装
置のスイッチを切ることを意味する。
【００２５】本発明の目的の範囲内においては、受容体
Ｒ３は被検物質Ａに対する生物親和性結合部位１個また
は２個以上有する特異的結合パートナーである。さらに
それらは受容体Ｒ４と相互作用することができる。この
受容体Ｒ３の結合パートナーまたはその成分は抗体と接
合できるかまたは抗体自体である。これらの抗体もしく
は抗体フラグメントまたはそれらの接合体は、Ａに向け
られるかあるいはＡおよびＲ４に向けられる。受容体Ｒ
３はまた、受容体Ｒ４が向けられる構造エレメントにカ
ップリングする抗体または抗体フラグメントから構成さ
れてもよい。
Ｒ３は被検物質Ａに対する生物親和性結合部位１個また
は２個以上有する特異的結合パートナーである。さらに
それらは受容体Ｒ４と相互作用することができる。この
受容体Ｒ３の結合パートナーまたはその成分は抗体と接
合できるかまたは抗体自体である。これらの抗体もしく
は抗体フラグメントまたはそれらの接合体は、Ａに向け
られるかあるいはＡおよびＲ４に向けられる。受容体Ｒ
３はまた、受容体Ｒ４が向けられる構造エレメントにカ
ップリングする抗体または抗体フラグメントから構成さ
れてもよい。
【００２６】本発明の目的の範囲内においては、受容体
Ｒ４はＲ３に対する生物親和性結合部位１個または２個
以上有する特異的結合パートナーである。この受容体の
受容体またはその成分は、抗体／抗体フラグメントの接
合体または抗体／抗体フラグメント自体であることがで
きる。これらの抗体／抗体フラグメントまたはそれらの
接合体はＲ３に向けられているか、あるいは受容体Ｒ３
に属する結合部位によって認識される抗原構造を有す
る。Ｒ４はまた、Ｒ３が向けられる構造エレメントにカ
ップリングするタンパク質から構成されてもよい。
Ｒ４はＲ３に対する生物親和性結合部位１個または２個
以上有する特異的結合パートナーである。この受容体の
受容体またはその成分は、抗体／抗体フラグメントの接
合体または抗体／抗体フラグメント自体であることがで
きる。これらの抗体／抗体フラグメントまたはそれらの
接合体はＲ３に向けられているか、あるいは受容体Ｒ３
に属する結合部位によって認識される抗原構造を有す
る。Ｒ４はまた、Ｒ３が向けられる構造エレメントにカ
ップリングするタンパク質から構成されてもよい。
【００２７】本発明はまた、上述の方法において使用さ
れる試剤に関する。特異的抗原（被検物質）を検出する
ための受容体の好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質に向けられた抗体、 Ｒ２：標識を有し、被検物質に向けられた抗体、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられた抗体、 である。
れる試剤に関する。特異的抗原（被検物質）を検出する
ための受容体の好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質に向けられた抗体、 Ｒ２：標識を有し、被検物質に向けられた抗体、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられた抗体、 である。
【００２８】抗原（被検物質）を特異的に検出するため
の受容体の好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質Ａに向けられた抗体、 Ｒ２：標識を有し、被検物質Ａに向けられた抗体、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられた抗体、 Ｒ４：抗体Ｒ３に向けられた抗体、 である。
の受容体の好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質Ａに向けられた抗体、 Ｒ２：標識を有し、被検物質Ａに向けられた抗体、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられた抗体、 Ｒ４：抗体Ｒ３に向けられた抗体、 である。
【００２９】抗原を検出する場合には、固相抗体Ｒ１が
認識しまたは抗体Ｒ２が接合するのと同じエピトープを
認識しない抗体または抗体フラグメントをＲ３として使
用することが好ましい。
認識しまたは抗体Ｒ２が接合するのと同じエピトープを
認識しない抗体または抗体フラグメントをＲ３として使
用することが好ましい。
【００３０】特異的抗体（被検物質）を検出するための
受容体の好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ２：標識を有し、被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられた抗体、 である。
受容体の好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ２：標識を有し、被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられた抗体、 である。
【００３１】特異的抗体（被検物質）を検出するための
受容体の好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ２：標識を有し、被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられた抗体、 Ｒ４：抗体Ｒ３に向けられた抗体、 である。
受容体の好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ２：標識を有し、被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられた抗体、 Ｒ４：抗体Ｒ３に向けられた抗体、 である。
【００３２】特異的抗体（被検物質）を検出するための
受容体のとくに好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ２：標識を有し、被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられ、抗体固有性ではない付加
的エピトープを有する抗体、 Ｒ４：抗体固有性ではないエピトープである抗体Ｒ３の
付加的エピトープに向けられた抗体、 である。
受容体のとくに好ましい組合せは、 Ｒ１：被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ２：標識を有し、被検物質Ａが向けられた抗原、 Ｒ３：被検物質Ａに向けられ、抗体固有性ではない付加
的エピトープを有する抗体、 Ｒ４：抗体固有性ではないエピトープである抗体Ｒ３の
付加的エピトープに向けられた抗体、 である。
【００３３】抗体固有性ではない抗体および付加的抗原
（たとえば、ビオチンまたはジゴキシゲニン）からそれ
ぞれなる接合体の製造方法は本技術分野の熟練者には周
知の通りである。出発材料の生物親和性機能を維持し
て、このような接合体は、たとえば化学的試薬の補助で
の連結または生物親和性相互作用によって調製すること
ができる。ハイブリッド分子はまた、化学合成、ハイブ
リドーマ技術または組換えＤＮＡ法によって産生させる
こともできる。
（たとえば、ビオチンまたはジゴキシゲニン）からそれ
ぞれなる接合体の製造方法は本技術分野の熟練者には周
知の通りである。出発材料の生物親和性機能を維持し
て、このような接合体は、たとえば化学的試薬の補助で
の連結または生物親和性相互作用によって調製すること
ができる。ハイブリッド分子はまた、化学合成、ハイブ
リドーマ技術または組換えＤＮＡ法によって産生させる
こともできる。
【００３４】新規な試剤は多数のヒトおよび動物用の診
断方法に使用することができる。実例としては、様々な
免疫原クラスの抗体、ウイルス（たとえばＡ、Ｂおよび
Ｃ型肝炎ウイルス、ならびに様々なＨＩＶ型）、細菌お
よび寄生体病原体、さらにはアレルギー疾患の特徴的構
造に対する抗体の検出のための二工程または多重工程試
験を挙げることができる。他の例には、疾患誘発因子た
とえばウイルス（たとえばＢ型肝炎ウイルス）、細菌、
寄生体、およびアレルゲン、さらには疾患マーカー（た
とえば腫瘍マーカー）の多重検出方法における検出があ
る。
断方法に使用することができる。実例としては、様々な
免疫原クラスの抗体、ウイルス（たとえばＡ、Ｂおよび
Ｃ型肝炎ウイルス、ならびに様々なＨＩＶ型）、細菌お
よび寄生体病原体、さらにはアレルギー疾患の特徴的構
造に対する抗体の検出のための二工程または多重工程試
験を挙げることができる。他の例には、疾患誘発因子た
とえばウイルス（たとえばＢ型肝炎ウイルス）、細菌、
寄生体、およびアレルゲン、さらには疾患マーカー（た
とえば腫瘍マーカー）の多重検出方法における検出があ
る。
【００３５】
【発明の実施の形態】本発明を次に以下の実施例によっ
てさらに明確にする。しかしながら、これらの実施例
は、さらに一般的な請求の範囲による教示の何らかの限
定を意味する意図ではない。
てさらに明確にする。しかしながら、これらの実施例
は、さらに一般的な請求の範囲による教示の何らかの限
定を意味する意図ではない。
【００３６】
実施例１ １ａ) 固相の調製 Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Nunk, Roskil
de, Denmark）を各ウエルあたり１００mlのコーティン
グ溶液〔50mMの炭酸ナトリウム緩衝液，pH9.5中600μg
／ｌの組換えｇｐ４１(Behringwerke AG, Marburg, FR
G）ならびに10mg／mlのビオチンに対するモノクローナ
ル抗体（Behringwerke AG, Marburg，FRG)〕を加え４℃
で２４時間インキュベートする。ついで、マイクロタイ
トレーションプレートを３回、各回３００μlの洗浄溶
液（50mM Tris，0.1％Tween20，pH7.2）で洗浄する。シ
リカゲル上で乾燥したマイクロタイトレーションプレー
トは無気的条件下に約１年間安定である。
de, Denmark）を各ウエルあたり１００mlのコーティン
グ溶液〔50mMの炭酸ナトリウム緩衝液，pH9.5中600μg
／ｌの組換えｇｐ４１(Behringwerke AG, Marburg, FR
G）ならびに10mg／mlのビオチンに対するモノクローナ
ル抗体（Behringwerke AG, Marburg，FRG)〕を加え４℃
で２４時間インキュベートする。ついで、マイクロタイ
トレーションプレートを３回、各回３００μlの洗浄溶
液（50mM Tris，0.1％Tween20，pH7.2）で洗浄する。シ
リカゲル上で乾燥したマイクロタイトレーションプレー
トは無気的条件下に約１年間安定である。
【００３７】１ｂ) 接合体の調製 １０mgのＨＩＶ１ｇｐ４１ペプチド（IAF Biochem, Lav
al, Canada）を１mlの氷酢酸／水（50：50，v／v）に溶
解する。５Ｎ水酸化ナトリウムで中和したのち１０倍モ
ル過剰のＮ−γ−マレイミドブチリルスクシンイミドを
加え、この混合物を室温で１時間インキュベートする。
反応しなかったヘテロ二官能性試薬をゲルろ過（Sephad
ex G-25）によって１００mMリン酸ナトリウム、５mMニ
トリロ三酢酸、pH６.０を用いて分離する。１０mgの西
洋ワサビペルオキシダーゼ（Behringwerke AG, Marbur
g, FRG）を室温で１時間、１０mlの１０mMリン酸ナトリ
ウム、１００mM食塩、pH８.０中１００倍モル過剰の２
−イミノチオランとインキュベートする。遊離の修飾試
薬をゲルろ過（Sephadex G-25）により１００mMリン酸
ナトリウム、５mMニトリロ三酢酸、pH６.０を用いて分
離する。２種の溶出物（SH−活性化ペルオキシダーゼお
よびマレイミド修飾HIV１ペプチド）を合わせて室温で
一夜インキュベートする。１／１０容の１００mM Ｎ−
エチルマレイミドで反応を停止させたのち、接合体を未
反応ＨＩＶ１ペプチドからゲルろ過（Sephadex G-25）
により分離する。濃縮したのち（２mg／ml)、接合体は
−２０℃で保存する。
al, Canada）を１mlの氷酢酸／水（50：50，v／v）に溶
解する。５Ｎ水酸化ナトリウムで中和したのち１０倍モ
ル過剰のＮ−γ−マレイミドブチリルスクシンイミドを
加え、この混合物を室温で１時間インキュベートする。
反応しなかったヘテロ二官能性試薬をゲルろ過（Sephad
ex G-25）によって１００mMリン酸ナトリウム、５mMニ
トリロ三酢酸、pH６.０を用いて分離する。１０mgの西
洋ワサビペルオキシダーゼ（Behringwerke AG, Marbur
g, FRG）を室温で１時間、１０mlの１０mMリン酸ナトリ
ウム、１００mM食塩、pH８.０中１００倍モル過剰の２
−イミノチオランとインキュベートする。遊離の修飾試
薬をゲルろ過（Sephadex G-25）により１００mMリン酸
ナトリウム、５mMニトリロ三酢酸、pH６.０を用いて分
離する。２種の溶出物（SH−活性化ペルオキシダーゼお
よびマレイミド修飾HIV１ペプチド）を合わせて室温で
一夜インキュベートする。１／１０容の１００mM Ｎ−
エチルマレイミドで反応を停止させたのち、接合体を未
反応ＨＩＶ１ペプチドからゲルろ過（Sephadex G-25）
により分離する。濃縮したのち（２mg／ml)、接合体は
−２０℃で保存する。
【００３８】１ｃ) ビオチン化抗体の調製 ヒト免疫グロブリンＧに対するモノクローナル抗体１０
mg（Behringwerke AG,Marburg, FRG）を、１０mMリン酸
ナトリウム、１００mM食塩、pH８.０中に溶解し、１０m
Mリン酸ナトリウム、１００mM食塩、pH８.０に溶解し１
０倍モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミド−Ｘ−ビ
オチンと室温で１時間インキュベートする。遊離修飾試
薬を、ついでゲルろ過（Sephadex G-25）によって１０
０mM Tris、５mMニトリロ三酢酸、pH７.０を用いて分離
する。
mg（Behringwerke AG,Marburg, FRG）を、１０mMリン酸
ナトリウム、１００mM食塩、pH８.０中に溶解し、１０m
Mリン酸ナトリウム、１００mM食塩、pH８.０に溶解し１
０倍モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミド−Ｘ−ビ
オチンと室温で１時間インキュベートする。遊離修飾試
薬を、ついでゲルろ過（Sephadex G-25）によって１０
０mM Tris、５mMニトリロ三酢酸、pH７.０を用いて分離
する。
【００３９】実施例２：新規試剤の使用 ２ａ) ＨＩＶ１抗体を検出する酵素イムノアッセイ（参
考システムI） 抗−ＨＩＶ１を検出する酵素イムノアッセイは以下のよ
うに実施する。２５μlのサンプル緩衝液（0.3Ｍ Tris
／HCl，１％アルブミン、２％Tween 20，pH7.2）を実施
例１ａに記載のようにして調製したマイクロタイトレー
ションプレートの各ウエル内で、１００μlのヒト血清
とともに３７℃で３０分間インキュベートする。プレー
トを４回、５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween 20で洗浄した
のち、実施例１ｂの記載のように調製した接合体１２５
μl（0.1Ｍ Tris／HCl，１mMグリシン，0.2％アルブミ
ン，0.4％ Pluronic F 64，１mg／mlのヒト免疫グロブ
リンＧに対するモノクローナル抗体，pH8.1中１：1000
に希釈）を各ウエルにピペットで加える。３０分のイン
キュベーション（＋37℃）をさらに４回の洗浄工程で終
結させる。結合した抗−ＨＩＶ１抗体の数に正比例する
結合ペルオキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベ
ンジジンを添加して測定する。室温に３０分置いたの
ち、基質の変換を０.５Ｍ硫酸を添加して停止させる。
吸光度は４５０nmで測定する。
考システムI） 抗−ＨＩＶ１を検出する酵素イムノアッセイは以下のよ
うに実施する。２５μlのサンプル緩衝液（0.3Ｍ Tris
／HCl，１％アルブミン、２％Tween 20，pH7.2）を実施
例１ａに記載のようにして調製したマイクロタイトレー
ションプレートの各ウエル内で、１００μlのヒト血清
とともに３７℃で３０分間インキュベートする。プレー
トを４回、５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween 20で洗浄した
のち、実施例１ｂの記載のように調製した接合体１２５
μl（0.1Ｍ Tris／HCl，１mMグリシン，0.2％アルブミ
ン，0.4％ Pluronic F 64，１mg／mlのヒト免疫グロブ
リンＧに対するモノクローナル抗体，pH8.1中１：1000
に希釈）を各ウエルにピペットで加える。３０分のイン
キュベーション（＋37℃）をさらに４回の洗浄工程で終
結させる。結合した抗−ＨＩＶ１抗体の数に正比例する
結合ペルオキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベ
ンジジンを添加して測定する。室温に３０分置いたの
ち、基質の変換を０.５Ｍ硫酸を添加して停止させる。
吸光度は４５０nmで測定する。
【００４０】２ｂ) ＨＩＶ１抗体を検出する酵素イムノ
アッセイ（新規システムI） 抗−ＨＩＶ１を検出する酵素イムノアッセイは以下のよ
うに実施する。２５μlのサンプル緩衝液（0.3Ｍ Tris
／HCl，１％アルブミン，２％Tween 20，pH7.2）を実施
例１ａに記載のようにして調製したマイクロタイトレー
ションプレートの各ウエル内で、１００μlのヒト血清
とともに３７℃で３０分間インキュベートする。プレー
トを４回、５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween 20で洗浄した
のち、１００μlの解離緩衝液（５mMグリシン塩酸塩，p
H7.5）を室温で３０分間加える。実施例１ｂに記載のよ
うにして調製された接合体２５μl（0.5Ｍ Tris／HCl，
１％アルブミン，２％ Pluronic F 64，５mg／mlのヒト
免疫グロブリンＧに対するモノクローナル抗体，pH8.1
中１：200に希釈）を各ウエルに洗浄工程を行わずにピ
ペットで加える。３０分のインキュベーション（＋37
℃）をさらに４回の洗浄工程で終結させる。結合した抗
−ＨＩＶ１抗体の数に正比例する結合ペルオキシダーゼ
活性をＨ2Ｏ2／テトラメチルベンジジンを加えて測定す
る。室温に３０分置いたのち、基質の変換を０.５Ｍ硫
酸を添加して停止させる。吸光度は４５０nmで測定す
る。
アッセイ（新規システムI） 抗−ＨＩＶ１を検出する酵素イムノアッセイは以下のよ
うに実施する。２５μlのサンプル緩衝液（0.3Ｍ Tris
／HCl，１％アルブミン，２％Tween 20，pH7.2）を実施
例１ａに記載のようにして調製したマイクロタイトレー
ションプレートの各ウエル内で、１００μlのヒト血清
とともに３７℃で３０分間インキュベートする。プレー
トを４回、５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween 20で洗浄した
のち、１００μlの解離緩衝液（５mMグリシン塩酸塩，p
H7.5）を室温で３０分間加える。実施例１ｂに記載のよ
うにして調製された接合体２５μl（0.5Ｍ Tris／HCl，
１％アルブミン，２％ Pluronic F 64，５mg／mlのヒト
免疫グロブリンＧに対するモノクローナル抗体，pH8.1
中１：200に希釈）を各ウエルに洗浄工程を行わずにピ
ペットで加える。３０分のインキュベーション（＋37
℃）をさらに４回の洗浄工程で終結させる。結合した抗
−ＨＩＶ１抗体の数に正比例する結合ペルオキシダーゼ
活性をＨ2Ｏ2／テトラメチルベンジジンを加えて測定す
る。室温に３０分置いたのち、基質の変換を０.５Ｍ硫
酸を添加して停止させる。吸光度は４５０nmで測定す
る。
【００４１】抗−ＨＩＶ１陽性サンプルおよび異常な低
反応性を有する抗−ＨＩＶ１陽性サンプル、ならびに抗
−ＨＩＶ１陰性血清について参考システムおよび新規な
酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光
度単位）を表１に示した。
反応性を有する抗−ＨＩＶ１陽性サンプル、ならびに抗
−ＨＩＶ１陰性血清について参考システムおよび新規な
酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光
度単位）を表１に示した。
【００４２】
【表１】
【００４３】２つの試験システムにおいて産生するシグ
ナルには、とくに低親和性サンプルの場合（たとえば、
9111／46）に、著しい差が認められる。これらのサンプ
ルに関する感度は参考システムIに比較してほぼ２倍で
ある。コーティングされた抗原に対して高い親和性を有
し、参考システムIにおいて既に高希釈度で認識された
サンプルでは、新規システムIにおけるシグナルの上昇
は認められない。抗−ＨＩＶ陰性血清は２つの試験シス
テムにおいて匹敵する様式で反応する。
ナルには、とくに低親和性サンプルの場合（たとえば、
9111／46）に、著しい差が認められる。これらのサンプ
ルに関する感度は参考システムIに比較してほぼ２倍で
ある。コーティングされた抗原に対して高い親和性を有
し、参考システムIにおいて既に高希釈度で認識された
サンプルでは、新規システムIにおけるシグナルの上昇
は認められない。抗−ＨＩＶ陰性血清は２つの試験シス
テムにおいて匹敵する様式で反応する。
【００４４】実施例３：新規試剤の使用 ３ａ) ＨＩＶ１抗体を検出する酵素イムノアッセイ（参
考システムII） 抗−ＨＩＶ１を検出する酵素イムノアッセイは以下のよ
うに実施する。２５μlのサンプル緩衝液（0.3Ｍ Tris
／HCl，１％アルブミン，２％Tween 20，pH7.2）を実施
例１ａに記載のようにして調製したマイクロタイトレー
ションプレートのウエル内で、１００μlのヒト血清と
ともに３７℃で３０分間インキュベートする。プレート
を４回、５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween 20で洗浄したの
ち実施例１ｂの記載のように調製した接合体１２５μl
（0.1Ｍ Tris／HCl，１mMグリシン，0.2％アルブミン，
0.4％ Pluronic F 64，１mg／mlの実施例１ｃに記載の
ように予めビオチン化した、ヒト免疫グロブリンＧに対
するモノクローナル抗体，pH8.1中１：1000に希釈）を
各ウエルにピペットで加える。３０分のインキュベーシ
ョン（＋37℃）をさらに４回の洗浄工程によって終結さ
せる。結合した抗−ＨＩＶ１抗体の数に正比例する結合
ペルオキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベンジ
ジンを加えて測定する。室温に３０分置いたのち、基質
の変換を０.５Ｍ硫酸を添加して停止させる。吸光度は
４５０nmで測定する。
考システムII） 抗−ＨＩＶ１を検出する酵素イムノアッセイは以下のよ
うに実施する。２５μlのサンプル緩衝液（0.3Ｍ Tris
／HCl，１％アルブミン，２％Tween 20，pH7.2）を実施
例１ａに記載のようにして調製したマイクロタイトレー
ションプレートのウエル内で、１００μlのヒト血清と
ともに３７℃で３０分間インキュベートする。プレート
を４回、５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween 20で洗浄したの
ち実施例１ｂの記載のように調製した接合体１２５μl
（0.1Ｍ Tris／HCl，１mMグリシン，0.2％アルブミン，
0.4％ Pluronic F 64，１mg／mlの実施例１ｃに記載の
ように予めビオチン化した、ヒト免疫グロブリンＧに対
するモノクローナル抗体，pH8.1中１：1000に希釈）を
各ウエルにピペットで加える。３０分のインキュベーシ
ョン（＋37℃）をさらに４回の洗浄工程によって終結さ
せる。結合した抗−ＨＩＶ１抗体の数に正比例する結合
ペルオキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベンジ
ジンを加えて測定する。室温に３０分置いたのち、基質
の変換を０.５Ｍ硫酸を添加して停止させる。吸光度は
４５０nmで測定する。
【００４５】３ｂ) ＨＩＶ１抗体を検出する酵素イムノ
アッセイ（新規システムII） 抗−ＨＩＶ１を検出する酵素イムノアッセイは以下のよ
うに実施する。２５μlのサンプル緩衝液（0.3Ｍ Tris
／HCl，１％アルブミン，２％Tween 20，pH7.2）を実施
例１ａに記載のようにして調製したマイクロタイトレー
ションプレートのウエル内で、１００μlのヒト血清と
ともに３７℃で３０分間インキュベートする。プレート
を４回、５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween 20 で洗浄した
のち１００μlの解離緩衝液（５mMグリシン塩酸塩，pH
2.5）を室温で３０分間加える。実施例１ｂに記載のよ
うにして調製した接合体２５μl（0.5Ｍ Tris／HCl，１
％アルブミン，２％ Pluronic F 64，５mg／mlの実施例
１ｃに記載のように予めビオチン化したヒト免疫グロブ
リンＧに対するモノクローナル抗体，pH8.1中１：200に
希釈）を各ウエルに洗浄工程を行わずにピペットで加え
る。３０分のインキュベーション（＋37℃）をさらに４
回の洗浄工程で終結させる。結合した抗−ＨＩＶ１抗体
の数に正比例する結合ペルオキシダーゼ活性をＨ2Ｏ2／
テトラメチルベンジジンを加えて測定する。室温に３０
分置いたのち、基質の変換を０.５Ｍ硫酸を添加して停
止させる。吸光度は４５０nmで測定する。
アッセイ（新規システムII） 抗−ＨＩＶ１を検出する酵素イムノアッセイは以下のよ
うに実施する。２５μlのサンプル緩衝液（0.3Ｍ Tris
／HCl，１％アルブミン，２％Tween 20，pH7.2）を実施
例１ａに記載のようにして調製したマイクロタイトレー
ションプレートのウエル内で、１００μlのヒト血清と
ともに３７℃で３０分間インキュベートする。プレート
を４回、５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween 20 で洗浄した
のち１００μlの解離緩衝液（５mMグリシン塩酸塩，pH
2.5）を室温で３０分間加える。実施例１ｂに記載のよ
うにして調製した接合体２５μl（0.5Ｍ Tris／HCl，１
％アルブミン，２％ Pluronic F 64，５mg／mlの実施例
１ｃに記載のように予めビオチン化したヒト免疫グロブ
リンＧに対するモノクローナル抗体，pH8.1中１：200に
希釈）を各ウエルに洗浄工程を行わずにピペットで加え
る。３０分のインキュベーション（＋37℃）をさらに４
回の洗浄工程で終結させる。結合した抗−ＨＩＶ１抗体
の数に正比例する結合ペルオキシダーゼ活性をＨ2Ｏ2／
テトラメチルベンジジンを加えて測定する。室温に３０
分置いたのち、基質の変換を０.５Ｍ硫酸を添加して停
止させる。吸光度は４５０nmで測定する。
【００４６】抗−ＨＩＶ１陽性サンプルおよび異常な低
反応性を有する抗−ＨＩＶ１陽性サンプル、ならびに抗
−ＨＩＶ１陰性血清について参考システムおよび新規な
酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光
度単位）を表２に示した。
反応性を有する抗−ＨＩＶ１陽性サンプル、ならびに抗
−ＨＩＶ１陰性血清について参考システムおよび新規な
酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光
度単位）を表２に示した。
【００４７】
【表２】
【００４８】２つの試験システムにおいて産生するシグ
ナルには、とくに低親和性サンプルの場合（たとえば、
9111／39）に、著しい差が認められる。これらのサンプ
ルに関する感度は参考システムIIに比較してほぼ２倍で
ある。コーティングされた抗原に対して高い親和性を有
し参考システムIIにおいて既に高希釈度で認識されたサ
ンプルでは、新規システムIIにおいてシグナルの更なる
上昇は認められない。抗−ＨＩＶ陰性血清は２つの試験
システムにおいて匹敵する様式で反応する。
ナルには、とくに低親和性サンプルの場合（たとえば、
9111／39）に、著しい差が認められる。これらのサンプ
ルに関する感度は参考システムIIに比較してほぼ２倍で
ある。コーティングされた抗原に対して高い親和性を有
し参考システムIIにおいて既に高希釈度で認識されたサ
ンプルでは、新規システムIIにおいてシグナルの更なる
上昇は認められない。抗−ＨＩＶ陰性血清は２つの試験
システムにおいて匹敵する様式で反応する。
Claims (11)
- 【請求項１】 被検物質の測定方法において、 （１）測定すべき被検物質を含有する可能性があるサン
プルを、固相に固定化され被検物質Ａに対して結合親和
性を有する受容体Ｒ１と接触させて免疫複合体Ｒ１−Ａ
を生成させ、 （２）１回または２回以上の洗浄工程を実施し、 （３）被検物質Ａに対して結合親和性を示す少なくとも
１個の結合部位を有する標識受容体Ｒ２、および被検物
質Ａに対して結合親和性を示す２個以上の結合部位を有
する非標識受容体Ｒ３を添加し、この場合受容体Ｒ２と
Ｒ３の添加は、任意の順序とすることが可能で、最初は
免疫複合体の開裂を招く解離条件ついで再会合または免
疫複合体の新規形成を可能にする非解離条件で行い、
Ａ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３を含有する固定化免疫複合体
を生成させ、 （４）固相に固定化された被検物質の量の指標になる固
相に固定化された標識の量を適当な方法で検出する方
法。 - 【請求項２】 （１）受容体Ｒ３に対する結合親和性を
示す少なくとも１個の結合部位を有する受容体Ｒ４をさ
らに固相に固定化し、この場合（２）受容体Ｒ３は被検
物質Ａに対して結合親和性を示す少なくとも１個の結合
部位を有し、（３）一方ではＡ、Ｒ２およびＲ３を含有
する免疫複合体、他方ではＲ１および／またはＲ４を含
有する免疫複合体を生成させる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 被検物質の測定方法において、 （１）測定すべき被検物質を含有する可能性があるサン
プルを、固相に固定化され被検物質Ａに対して結合親和
性を有する受容体Ｒ１と接触させて免疫複合体Ｒ１−Ａ
を生成させ、 （２）１回または２回以上の洗浄工程を実施し、 （３）免疫複合体Ｒ１−Ａの開裂を招く解離工程を実施
し、 （４）被検物質Ａに対して結合親和性を示す少なくとも
１個の結合部位を有する標識受容体Ｒ２、および被検物
質Ａに対して結合親和性を示す少なくとも１個の結合部
位を有する非標識受容体Ｒ３を添加し、この場合、受容
体Ｒ２とＲ３の添加は、任意の順序とすることが可能
で、免疫複合体の新規形成を引き起こすことが可能な非
解離条件で、被検物質Ａならびに受容体Ｒ２およびＲ３
を、受容体Ｒ３に対して結合親和性を示す少なくとも１
個の結合部位を有する受容体Ｒ４が固定化された第二の
固相と接触させるように行われ、Ａ、Ｒ２、Ｒ３および
Ｒ４を含有する固定化免疫複合体を生成させ、 （５）固相に固定化された被検物質の量の指標になる固
相に固定化された標識の量を適当な方法で検出する方
法。 - 【請求項４】 Ｒ１およびＲ３はそれぞれ被検物質に向
けられた抗体または抗体フラグメントであり、Ｒ２は被
検物質に向けられた標識抗体または被検物質に向けられ
た標識抗体フラグメントである請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 Ｒ１およびＲ３はそれぞれ被検物質に向
けられた抗体または抗体フラグメントであり、Ｒ２は被
検物質に向けられた標識抗体または被検物質に向けられ
た標識抗体フラグメントであり、Ｒ４はＲ３に向けられ
た抗体またはＲ３に向けられた抗体フラグメントである
請求項２または３記載の方法。 - 【請求項６】 Ｒ３はＲ１またはＲ２によって認識され
るのとは異なるエピトープを認識する請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 被検物質は抗体であり、Ｒ１は被検物質
が向けられた抗原であり、Ｒ２は被検物質が向けられた
標識抗原であり、Ｒ３は被検物質に向けられた抗体また
は被検物質に向けられた抗体フラグメントである請求項
１記載の方法。 - 【請求項８】 被検物質は抗体であり、Ｒ１は被検物質
が向けられた抗原であり、Ｒ２は被検物質が向けられた
標識抗原であり、Ｒ３は被検物質に向けられた抗体また
は被検物質に向けられた抗体フラグメントであり、Ｒ４
は、Ｒ３に向けられた抗体またはＲ３に向けられた抗体
フラグメントである請求項２または３記載の方法。 - 【請求項９】 Ｒ３は抗体固有性ではない付加的エピト
ープを有し、Ｒ４は抗体固有性ではないＲ３の付加的エ
ピトープに向けられている請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 ＨＩＶに対する抗体を測定するための
請求項１〜９の１または２以上に記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０の１または２以上に記
載の方法を実施するための診断用キット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19653074 | 1996-12-19 | ||
| DE19700134:3 | 1997-01-03 | ||
| DE19653074:1 | 1997-01-03 | ||
| DE19700134A DE19700134A1 (de) | 1996-12-19 | 1997-01-03 | Immundissoziation zur Verbesserung der immunchemischen Bestimmung eines Analyten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10197531A true JPH10197531A (ja) | 1998-07-31 |
Family
ID=26032473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9348384A Pending JPH10197531A (ja) | 1996-12-19 | 1997-12-18 | 被検物質の免疫化学的測定の改良のための免疫解離 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5989806A (ja) |
| EP (1) | EP0849596B1 (ja) |
| JP (1) | JPH10197531A (ja) |
| AT (1) | ATE317979T1 (ja) |
| CA (1) | CA2225078A1 (ja) |
| DE (1) | DE59712575D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019020297A (ja) * | 2017-07-19 | 2019-02-07 | シスメックス株式会社 | 被検物質を検出する方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| AU2001242928A1 (en) | 2000-03-16 | 2001-09-24 | Biacore Ab | Method for capturing analytes eluted from surface-bound ligands |
| WO2002090961A2 (en) * | 2001-05-03 | 2002-11-14 | Immunetics, Inc. | Systems and methods for detection of analytes in biological fluids |
| US7262019B2 (en) * | 2001-05-03 | 2007-08-28 | Immunetics, Inc. | System and methods for detection of Bacillus anthracis related analytes in biological fluids |
| DE10232203A1 (de) * | 2002-07-16 | 2004-02-19 | Institut Virion/Serion Gmbh | Verfahren und Diagnostikum zum qualitativen oder quantitativen Nachweis von Antikörpern und zur Bestimmung von deren Avidität |
| GB2426050A (en) * | 2005-05-09 | 2006-11-15 | Orion Diagnostica Oy | Method of measuring binding rate using sonication |
| WO2009079192A1 (en) * | 2007-12-17 | 2009-06-25 | Ribo Guo | Universal tandem solid-phases based immunoassay |
| US8021850B2 (en) * | 2008-07-14 | 2011-09-20 | Ribo Guo | Universal tandem solid-phases based immunoassay |
| CN102081018A (zh) * | 2009-11-30 | 2011-06-01 | 希森美康株式会社 | 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法 |
| WO2011119920A2 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| ES2667425T3 (es) | 2011-06-10 | 2018-05-10 | Oregon Health & Science University | Glucoproteínas y vectores recombinantes de CMV |
| AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| EP2586461A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-01 | Christopher L. Parks | Viral particles derived from an enveloped virus |
| US9494606B2 (en) | 2012-05-09 | 2016-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Quantification of lipoproteins |
| EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
| US20150065381A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-05 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel hiv-1 immunogens |
| EP2873423B1 (en) | 2013-10-07 | 2017-05-31 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
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| US5384240A (en) * | 1992-11-25 | 1995-01-24 | Akzo Nobel, N.V. | Base dissociation assay |
-
1997
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- 1997-11-20 DE DE59712575T patent/DE59712575D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-20 EP EP97120361A patent/EP0849596B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-17 CA CA002225078A patent/CA2225078A1/en not_active Abandoned
- 1997-12-17 US US08/992,007 patent/US5989806A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-18 JP JP9348384A patent/JPH10197531A/ja active Pending
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| JP2019020297A (ja) * | 2017-07-19 | 2019-02-07 | シスメックス株式会社 | 被検物質を検出する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59712575D1 (de) | 2006-04-20 |
| US5989806A (en) | 1999-11-23 |
| EP0849596B1 (de) | 2006-02-15 |
| EP0849596A2 (de) | 1998-06-24 |
| EP0849596A3 (de) | 1999-04-14 |
| ATE317979T1 (de) | 2006-03-15 |
| CA2225078A1 (en) | 1998-06-19 |
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Legal Events
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