JPH0542427B2

JPH0542427B2 -

Info

Publication number: JPH0542427B2
Application number: JP59145510A
Authority: JP
Inventors: Satomi Takahashi; Kazuhiko Yamada; Yasuyoshi Ueda; Yoshio Shimada; Kyoshi Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1984-07-12
Filing date: 1984-07-12
Publication date: 1993-06-28
Also published as: JPS6125491A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、半合成β−ラクタム抗生物質などの
医薬の合成中間体として有用なＤ−ナフチルグリ
シンの前駆物質となる新規化合物Ｎ−カルバモイ
ル−Ｄ−ナフチルグリシンに関する。さらに詳し
くは本発明は、(1)一般式（）〔式中、α炭素はＲ配置を示す〕で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグ
リシン。式（）に属する化合物としては、

【式】で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−（１−ナフ
チル）グリシンと、

【式】で表わされるＮ −カルバモイル−Ｄ−（２−ナフチル）グリシン
が該当する。及び、(2)一般式で表わされる５−ナフチルヒダントインを、微生
物の菌体内酵素を利用して生化学的に加水分解す
ることによりＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグ
リシンを製造する方法に関する。（発明が解決しようとする問題点）本発明者らは、先に５−フエニルヒダントイン
または５−（置換フエニル）ヒダントイン類に微
生物酵素を作用させてＮ−カルバモイル−Ｄ−フ
エニルグリシンまたはその置換誘導体を製造する
方法を特願昭51−11575号、特願昭51−145748号
および特願昭52−48717号として出願し、天然ア
ミノ酸類またはそれらの置換誘導体に対応する５
−置換ヒダントイン類から同様にしてＮ−カルバ
モイル−Ｄ−α−アミノ酸類を製造する方法を特
願昭51−157713号として出願した。また５−チエ
ニルヒダントインに、微生物酵素を作用させてＮ
−カルバモイル−Ｄ−チエニルグリシンを製造す
る方法を特願昭53−30062号として出願した。本
発明は前記技術の発展の一つとして５−ナフチル
ヒダントインへの適用を確認したものである。本発明の目的化合物Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ナ
フチルグリシンは、医薬などの合成中間体として
有用なＤ−ナフチルグリシン合成の前駆物質であ
り、文献未記載の新規な化合物である。（問題点を解決するための手段及び作用効果）本発明の要点は次式で表わされる。上記のように、本発明は５−ナフチルヒダント
インに、ヒダントイン環を立体特異的に加水分解
してＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシンを
生成させる能力を有する微生物の培養物、菌体ま
たは菌体処理物をPH７〜10の水性媒体中で作用さ
せることを特徴とする新規化合物Ｎ−カルバモイ
ル−Ｄ−ナフチルグリシン及びその製造法に関す
るものである。この場合、基質の５−ナフチルヒダントインが
５−（１−ナフチル）ヒダントイン、５−（２−ナ
フチル）ヒダントインのいずれの場合にでも本発
明を適用することができ、それぞれＮ−カルバモ
イル−Ｄ−（１−ナフチル）グリシン、Ｎ−カル
バモイル−Ｄ−（２−ナフチル）グリシンを生成
する。本発明の方法を利用することにより、安価な微
生物酵素源を用いてDL−５−ナフチルヒダント
インの全量をほぼ定量的にＤ体のＮ−カルバモイ
ル−Ｄ−ナフチルグリシンに変換させることも可
能である。Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリ
シンは、例えば亜硝酸との反応によつて高収率で
Ｄ−ナフチルグリシンに変換されるので、本発明
はＤ−ナフチルグリシンの工業的製法として極め
て有利な手段を提供するものである。以下に本発
明を詳細に説明する。本発明で原料として用いられる５−ナフチルヒ
ダントインは、通常は、化学合成で得られるDL
体を使用するのが適当である。DL−５−ナフチ
ルヒダントインは、公知のヒダントイン合成法
（別名Bucherer−Berg法）を利用して、例えば
１、または２−ナフトアルデヒドに青酸ソーダと
重炭酸アンモニウムを反応させることによつてそ
れぞれ、５−（１−ナフチル）ヒダントインまた
は５−（２−ナフチル）ヒダントインを合成する
ことができる。本発明で使用される微生物は、５−ナフチルヒ
ダントインのヒダントイン環を立体特異的に加水
分解してＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシ
ンを生成させる能力を有するもので、自然界に存
在する野生株、公的な微生物保存機関に保存され
ている菌株、あるいはそれから人工的に変異誘導
した微生物などから、前記能力の有無を調べるこ
とによつて選択されるものである。この能力の検定方法としては、例えば次のよう
な方法が用いられる。先づ微生物の培養物２mlを
遠心分離して菌体を集め、それを２mlの0.9％食
塩水で洗浄後再び遠心分離して菌体を集菌する。
この分離した菌体（湿重量40〜200mg）を濃度0.5
％のDL−５−（２−ナフチル）ヒダントイン懸濁
液２mlに加えてPH７〜10、温度30〜40℃に保つて
10〜40時間反応させる。反応後、適宜希釈しｐ−
ジメチルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液を
加えて発色させ、その液を遠心分離して菌体等の
不溶物を除き、次いで上澄液の吸光度を430nｍ
で測定して反応液中のＮ−カルバモイル−（２−
ナフチル）グリシン生成量を求める。このようにして比較的高い変換率を示した菌株
については、実験規模を大きくして再度５−（２
−ナフチル）ヒダントインの加水分解反応を行な
い、生成したＮ−カルバモイル−（２−ナフチル）
グリシンを単離して、それがＤ体であると認めら
れた菌株を本発明に使用する微生物として採用す
る。このようにして得られた微生物は５−（１−
ナフチル）ヒダントインに対応しても同様に作用
しＮ−カルバモイル−（１−ナフチル）グリシン
を生成する。本発明で使用する微生物は、細菌、方線菌、か
び、酵母および不完全菌の中から上記の検定に合
格するものが選ばれるが、本発明者らの研究によ
れば分類学的にみても極めて広範囲の種属の中に
見出すことができる。それら菌株の具体的な例示
は、既に特開昭51−11575号、特願昭51−145748
号、特願昭51−157713号、特願昭52−48717号お
よび特願昭53−30062号の明細書中に記載されて
いるが、５−ナフチルヒダントインに対して特に
高活性を示す微生物で細菌に属するものとして
は、アエロバクター属、アグロバクテリウム属、
バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属、ミクロバクテリウム属、シユードモ
ナス属など；放線菌に属するものとしては、アク
チノミセス属、ミコバクテリウム属、ノカルデイ
ア属、ストレプトミセス属などの中に見出されて
いる。本発明の方法は、微生物の菌体またはその処理
物の形態で菌体内酵素の作用を利用するものであ
るが、この酵素は天然栄養源を含有する通常の培
地で微生物を培養することによつて菌体内に生成
蓄積させることができる。培養は通常液体培地で
行なわれるが、固体表面培養によつても行なうこ
とができる。培地には通常、資化し得る炭素源、
窒素源および各微生物の生育に必要な無機塩なら
びに栄養素とを含有させるが、更に各種のピリミ
ジン系核酸塩基類またはそれらの誘導体、或いは
各種のヒダントイン類を0.05〜0.3％添加して所
望の酵素を適応的に増強させることが望ましい。
酵素誘導効果の高いピリミジン系核酸塩基類とし
ては、ウラシル、シトシンおよびチミンがあり、
それらの誘導体としてはジヒドロウラシル、ジヒ
ドロチミンなどがある。またヒダントイン類の中
ではヒダントイン、DL−５−メチルヒダントイ
ンなどが比較的好ましい。しかし多くの微生物に
共通して、実用的に最も好ましい酵素誘導基質は
ウラシルである。培養条件は、使用する微生物の
至適生育条件に応じて温度20〜65℃、PH４〜11の
範囲が用いられる。培養中には通気撹拌を行なつ
て微生物の生育を促進させることもできる。５−ナフチルヒダントインの加水分解反応に
は、前記のようにして培養した微生物を培養物、
菌体または菌体処理物の形態で使用する。通常微
生物の培養液をそのまま反応に使用することがで
きるが、培養液中の成分が障害になる場合や酵素
量を多く用いたい場合には、培養液から分離した
菌体を使用すればよい。菌体は生菌体のままで使
用目的を達するが、貯蔵あるいは取扱いの便宜か
ら凍結乾燥菌体として用いることもできる。また
菌体そのものでなく、菌体破砕物や菌体抽出物の
ような菌体処理物の状態で使用することも可能で
ある。更に上記の菌体または菌体処理物を公知の
方法で固定化したものも使用することができる。５−ナフチルヒダントインに微生物の培養物、
菌体または菌体処理物を作用させるには、通常水
性媒体中で両者を混合する方法が用いられる。５
−ナフチルヒダントインの反応液中での濃度につ
いては特に制限はないが、１〜30％程度の高濃度
では基質は完全には溶解しない。しかし反応の進
行に伴つて５−ナフチルヒダントインが逐次溶解
していくので何ら支障にはならない。本発明において用いられる微生物酵素の真の基
質はＤ体であり、Ｄ体の５−ナフチルヒダントイ
ンのみが選択的に加水分解されて、カルバモイル
体に変換される。一般に、５−置換ヒダントイン
は、容易にラセミ化しやすい性質を有することが
知られているが、本酵素反応条件のような穏和な
条件においても、基質である５−ナフチルヒダン
トインは、実際、酵素反応中常にラセミ化状態に
あり、酵素反応の進行に伴つてＤ体が消費されて
も、加水分解されないＬ体の迅速なラセミ化によ
り反応系には常にＤ体が補給される。このように
ラセミ化反応が酵素反応と併行して進むというこ
とから、Ｌ体も間接的な基質とみなすことができ
る。従つて原料の５−ナフチルヒダントインは、
DL体、Ｄ体、Ｌ体のいずれであつても、実際的
な効果には殆んど差がないことになる。一方、生
成物であるＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリ
シンは全くラセミ化されることはない。これらの
結果として、酵素反応の基質として、DL体、Ｄ
体またはＬ体のいずれを用いても生成物として
は、常にＤ体のＮ−カルバモイル−ナフチルグリ
シンを、対掌体基質を残すことなく、ほぼ定量的
な収率で得ることも可能である。水性媒体中で５−ナフチルヒダントインの立体
特異的加水分解反応を行なう際に、実用上好まし
いPHの範囲は７〜10であり、特に好ましいのは８
〜９である。活性の高い微生物を使用して、この
ような条件で反応を行なえば非常に高収率で目的
物を得ることができる。PH７未満では反応速度は
極めて小さく、PH10を超えると好ましくない副反
応を生じるので、いずれも実用性には乏しい。PH
７〜10が好ましい理由としては、本発明で利用さ
れる微生物酵素の至適PHが８〜９付近にあるこ
と、PHが増すにつれて基質の溶解度が増すこと、
ならびにヒダントイン環のラセミ化反応がアルカ
リ性において効果的に促進されることなどによつ
て結果的に５−ナフチルヒダントインからＮ−カ
ルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシンへの変換速度
が増大することにある。反応の進行に伴つて媒体
のPHが低下するので、反応中、継続的に中和剤を
添加して至適PHに保持することが望ましい。中和
剤としては、アンモニア、苛性ソーダ、苛性カ
リ、炭酸ソーダなどが適当である。その他、目的
に応じて水性媒体に有機溶媒や界面活性剤を添加
して反応を行なわせることもできる。反応温度
は、使用する微生物の酵素に適した温度が採用さ
れるが、通常20〜70℃の範囲内にある。加水分解によつて生成したＮ−カルバモイル−
Ｄ−ナフチルグリシンは、沈殿法あるいは陰イオ
ン交換樹脂を利用するなど、通常の方法により単
離することができるが、単離をしないでそのまま
鉱酸酸性下、亜硝酸と反応させることにより容易
にＤ−ナフチルグリシンに変換される。Ｄ−ナフチルグリシンは半合成β−ラクタム抗
生物質等、医薬の製造中間体として重要な化合物
であるが、本発明による新規な方法により得られ
る新規な化合物Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ナフチル
グリシンを用いることにより、その製造を工業的
に有利に行なうことができるのである。（実施例）以下実施例によつて本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例のみに限定されるもので
はない。実施例１下記組成からなる栄養液体培地を調製し、綿栓
をした大型試験管に10mlずつ分注して120℃で15
分間蒸気殺菌を行なつた。培地組成：肉エキス 0.5％（重量％）酵母エキス 0.5％ポリペプトン 1.0％ NaCl 0.15％ウラシル 0.1％ PH 7.0 予め、ブイヨン寒天スラントで30℃、24時間培
養した表−１に示す微生物を上記栄養液体培地に
一白金耳接種して33℃で24時間振とう下に培養を
行なつた。これらの培養液の４mlを用い、遠心分
離して得た生菌体を更に同量の0.9％食塩水で洗
浄したのち、再び遠心分離して集菌し、下記の反
応液成分として使用した。反応液組成： (1) DL−５−（２−ナフチル）ヒダントインを
0.05M NaHCO₃−Na₂CO₃緩衝液に加え、PH
8.7に調製した濃度8.85ｍＭ〔0.2％（ｗ／ｖ）〕
の基質懸濁液……4.0ml (2) 前記、40ml培養液より遠心分離、洗浄した生
菌体。上記(1)と(2)を混合し、よく菌体を懸濁した反応
液を夫々共栓付小型試験管に入れ、緩く振とうし
ながら37℃で48時間反応させた。尚、対照として
基質懸濁液(1)に生菌体を加えないものを同様に反
応条件下においた。反応後、反応液をそれぞれ純
水で５倍に希釈した後、希釈液4.0mlに対し20％
トリクロル酢酸2.0ml、10％ｐ−ジメチルアミノ
ベンズアルデヒドの12N塩酸溶液1.0mlを加えて
混合した。この黄色に発色した液を遠心分離して
不溶物を除き430nｍの吸光度を測定してＮ−カ
ルバモイル−（２−ナフチル）グリシンを比色定
量した。その結果、反応液中に生成したＮ−カル
バモイル−（２−ナフチル）グリシンの量とDL−
５−（２−ナフチル）ヒダントインからの変換率
は、各微生物について夫々表−１に示す通りであ
つた。

【表】実施例２下記の組成からなる液体栄養培地を調製し、綿
栓付大型試験管に10mlずつ分注して120℃で20分
間蒸気殺菌を行なつた。培地組成：グルコース 2.0％（重量％）ソイビーン・ミール 1.0％酵母エキス 0.25％（NH₄）₂SO₄ 0.10％ CaCO₃ 0.5％ K₂HPO₄ 0.4％５−（２−メチルチオエチル）−ヒダントイン
0.1％ PH 7.0 予め、ベネツト寒天スラントで28℃、72時間培
養した表−２に示す微生物を上記栄養液体培地に
接種して28℃で44時間振とう下に培養を行なつ
た。この培養液40mlから菌体を遠心分離し、以下
実施例１と同様の処理を行なつて洗浄生菌体を得
た。そして、この生菌体を用いて実施例１と同様
の反応液組成で、37℃で48時間緩やかな振とう下
に反応を行なつた。反応後も実施例１と同様に分
析を行ない、反応液中に生成したＮ−カルバモイ
ル−（２−ナフチル）グリシン量を定量した。そ
の結果と、DL−５−（２−ナフチル）ヒダントイ
ンからの変換率は、各微生物について夫々表−２
に示す通りであつた。

【表】実施例３下記組成からなる栄養液体培地を調製し2000ml
容肩付振とうフラスコに250mlずつ分注し、120℃
で20分間蒸気殺菌を行なつた。培地組成：肉エキス 0.5％（重量％）ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.5％ NaCl 0.3％ウラシル 0.1％ MnCl₂・4H₂O 20ppm PH 7.0 これに同一組成寒天培地で33℃にて24時間培養
した表−３に示す微生物を上記栄養液体培地に接
種して33℃にて24時間振とう下に培養を行なつ
た。この培養液から菌体を遠心分離し、以下実施
例１と同様に処理を行なつて洗浄生菌体を得た。
この生菌体をDL−５−（２−ナフチル）ヒダント
イン１ｇ／dlを含む0.05M NaHCO₃−Na₂CO₃
緩衝液（PH8.7）50mlに全量添加し、33℃に20時
間緩やかな振とう下に保持、反応させた。反応
後、反応液を遠心分離し、その上清を得て、生成
したＮ−カルバモイル−（２−ナフチル）グリシ
ン量を高速液体クロマトグラフイーにより分離定
量した（カラム；日本分光Finepak SIL C₁₈、
4.6×250mm、36ｍＭ KH₂PO₄を含む0.02M−
H₃PO₄（PH2.5）：MeOH＝７：３、検出210nｍ）。更に、この上清のPHを濃塩酸で1.5〜２に調製
するとＮ−カルバモイル２−（２−ナフチル）グ
リシンが沈殿して析出した。この沈殿を取し、
更にエタノールで再結晶して得られたＮ−カルバ
モイル−（２−ナフチル）グリシンの比旋光度を
測定した。以上の結果を各使用微生物ごとに表−
３に示す。比旋光度の測定結果からＮ−カルバモ
イル−（２−ナフチル）グリシンはすべてＤ体で
あることが確認された。

【表】

【表】実施例４実施例３と同様の組成からなる栄養液体培地を
調製し、500ml容肩付振とうフラスコに100mlずつ
分注し120℃にて20分間蒸気殺菌を行なつた。こ
れに綿栓をした大型試験管にて、同一組成培地10
mlで33℃で24時間培養したバシルス・スピーシー
ズ（Bacillus species）KNK108（FERM Ｐ−
6056）を2.0ml接種し、33℃で24時間振とう培養
を行なつた。この培養液100mlを200ml容四ツ口丸
底フラスコに入れ、窒素通気下、撹拌しながら
DL−５−（２−ナフチル）ヒダントイン1.0ｇを
加え、37℃で20時間反応させた。反応中1.0N−
NaOH溶液を用いて反応系のPHを8.7に継続的に
調節した。反応後、液のPHを7.0に調整して遠心
分離を行ない、未反応基質や菌体等の不溶物を除
去した。こうして得られた上澄液の一部をとり実
施例３と同様に高速液体クロマトグラフイーで分
析した結果、生成Ｎ−カルバモイル−Ｄ−（２−
ナフチル）グリシン量は0.95ｇであり、変換率は
88.0％であつた。更に上澄液のPHを濃塩酸で1.5〜２に調整する
とＮ−カルバモイル−Ｄ−（２−ナフチル）グリ
シンが沈殿をして析出した。この沈殿を取し、
更にエタノールで再結晶して無色針状結晶0.69ｇ
を得た。以上のようにして得たＮ−カルバモイル
−Ｄ−（２−ナフチル）グリシンの比旋光度、融
点、IR、NMRの結果を以下に示す。〔α〕²⁵ _D＝−146.2（Ｃ＝１、0.1N NH₄OH） mp 205〜207℃（decomp.） IR（cm^-1）；3460、3300、1905、1685、1635、
1560、1310、1280、1180、1007、809、755、
478（KBr） NMR_DMSO-d6（δppm）；5.20（1H、ｄ、CH）、5.66
（2H、ｓ、NH₂）、6.83（1H、ｄ、NH）、7.4〜
7.9（7H、ｍ、ナフタレン環）実施例５実施例４と同様に培養したバシルス・スピーシ
ーズKNK−108（FERM Ｐ−6056）の培養液100
mlを200ml容四ツ口丸底フラスコに入れ窒素通気
下、撹拌しながらDL−５−（１−ナフチル）ヒダ
ントイン1.0ｇを加え、37℃20時間反応させた。
反応中1.0N−NaOH溶液を用いて反応系のPHを
8.7に継続的に調節した。反応後、液のPHを7.0に
調整して遠心分離を行ない、未反応基質や菌体等
の不溶物を除去した。こうして得られた上澄液の
一部をとり実施例３、４と同様に高速液体クロマ
トグラフイーで分析した結果、生成Ｎ−カルバモ
イル−Ｄ−（１−ナフチル）グリシン量は0.87ｇ
であり、変換率は80.6モル％であつた。更に上澄液のPHを濃塩酸で1.5〜２に調製する
とＮ−カルバモイル−Ｄ−（１−ナフチル）グリ
シンが沈殿をして析出した。この沈殿を取し、
更にエタノールで再結して白色粉末結晶0.61ｇを
得た。以上のようにして得たＮ−カルバモイル−Ｄ−
（１−ナフチル）グリシンの比旋光度、融点、
IR、NMRの結果を以下に示す。〔α〕²⁵ _D＝−161.7（Ｃ＝１、0.1N NH₄OH） mp
214〜217℃（decomp.） IR（cm^-1）；3460、3300、1920、1680、1630、
1560、1403、1310、1279、1180、1150、1008、
800、775（KBr） NMR_DMSO-d6（δppm）；5.67（2H、ｓ、NH₂）、
5.98（1H、ｄ、CH）、6.88（1H、ｄ、NH）、7.4
〜8.2（7H、ｍ、ナフタレン環）

Claims

【特許請求の範囲】１式（）で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグ
リシン。２式（）の化合物が、式で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−（１−ナフ
チル）グリシンである特許請求の範囲第１項記載
の化合物。３式（）の化合物が、式で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−（２−ナフ
チル）グリシンである特許請求の範囲第１項記載
の化合物。４５−ナフチルヒダントインに、ヒダントイン
環を立体特異的に加水分解してＮ−カルバモイル
−Ｄ−ナフチルグリシンを生成させる能力を有す
るアエロバクター属、アグロバクテリウム属、バ
チルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテ
リウム属、ミクロバクテリウム属、シユードモナ
ス属、アクチノミセス属、ミコバクテリウム属、
ノカルデイア属またはストレプトミセス属に属す
る微生物の培養物、菌体または菌体処理物をPH７
〜10の水性媒体中で作用させることを特徴とする
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシンの製造
法。５微生物の菌体として、生菌体または乾燥菌体
を使用する特許請求の範囲第４項記載の製造法。６微生物の菌体処理物として、菌体破砕物また
は菌体抽出物を使用する特許請求の範囲第４項記
載の製造法。７微生物の菌体または菌体処理物として、菌体
または、菌体処理物の固定化物を用いる特許請求
の範囲第４項、第５項または第６項記載の製造
法。８培地にピリミジン系核酸塩基類または、それ
らの誘導体を添加して培養し、ヒダントイン環を
立体特異的に加水分解する能力を増強させた微生
物を使用する特許請求の範囲第４項、第５項、第
６項または第７項記載の製造法。９５−ナフチルヒダントインがDL体である特
許請求の範囲第４項記載の製造法。