JPH01321362A - レーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫測定方法に関す
るものである。更に詳述するならば、本発明は極めて微
ｍの検体から特定の抗体または抗原を定量的に検出可能
なレーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方
法に関する乙のである。

「従来の技術」 後天性免疫不全症候群、成人Ｔ細胞白血病等のような新
型ウィルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法とし
て、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現在
、阻界的規模で推進されている。

従来から知られる微量免疫測定法としては、ラジオイム
ノアッセイ（以下、ＲＩＡ法と記す）、酵素イムノアッ
セイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（Ｆ’ｌＡ）法等
が既に実用化されている。これらの方法は、それぞれア
イソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加した抗原
または抗体を用い、これと特異的に反応する抗体または
抗原の有無を検出する方法である。

ＲＩＡは、標識化されたアイソトープの放射線量を測定
することにより抗原抗体反応に寄与した検体量を定量す
るものであり、ピコグラム程度の超微量測定が可能な現
在唯一の方法である。しかしながら、この方法は放射性
物質を利用するので、特殊設備を必要とし、また、半減
期等による標識効果の減衰等を考慮しなければらないの
で、実施には大きな制約がある。更に、放射性廃棄物処
理が社会問題となっている現状を考慮すると、その実施
は自ずと制限される。

一方、酵素、蛍光体を標識として用いる方法は、抗原抗
体反応に寄与した検体ｍを、発色や発光を観測すること
により検出する方法であり、ＲＩＡ法の如き実施上の制
約はない。しかしながら、検出限界はナノグラム程度で
ある。

上述のように、従来の免疫測定法においては、高い検出
感度を有するＲＩＡ法は、放射性物質を使用するために
、その実施については多くの制約があり、一方、実施の
容易な酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）法、蛍光イムノア
ッセイ（Ｆ’ｌＡ）法等は感度が低いため、主として抗
体検査に適用されていた。抗体検査は人体の免疫反応に
よってつくられた抗体を検出する方法であるから、感染
直後の血中のウィルスの直接検出は原理的に不可能であ
る。

また、レーザ光を利用して抗原抗体反応の有無を検出す
る方法として、例えば、主に肝臓癌の検出を目的として
開発されたＡＰＰ（アルファ・フェトプロティン）を利
用した方法がある。従来のレーザ光散乱法の根本的欠点
は、検体が分散された溶液の１部分のみをレーザ照射し
て検出するために、これ以上に検出感度を高めることは
原理的に望外のものである。また、このような本質的欠
点があるため、多量の検体を必要としていた。

これに対し、本発明者らは、従来の方法とは原理を異に
する免疫測定法の研究を行ない、先に特願昭６１−２２
４５６７号、特願昭６１−２５２４２７号、特願昭６１
−２５４１６４号、特願昭６２−２２０６２号、特願昭
６２−２２０６３号、特願昭６２−１５２７９１号、特
願昭６１−１５２７９２号、特願昭６２−１８４９０２
号、特願昭６２−２６４３１９号、特願昭６２−２６７
４８１号としてレーザ磁気免疫測定法及び測定装置につ
いての発明を特許出願している。これらの新しい免疫測
定法は標識材料として磁性微粒子を用いる点に特徴があ
り、アイソトープを用いないでピコグラムの超微量検出
が可能である。本発明者らは上述の特許に基づき、磁性
微粒子を抗原あるいは抗体に標識し、初めて、ウィルス
の検出等を行なった。この新しいレーザ磁気免疫測定法
は従来量も検出感度が高いとされているＲＩＡ法よりら
、検出感度が高いことが確認されつつある。例えば、本
発明者らが日本ウィルス学会第３５回総会（昭和６２年
１１月　講演番号４０１１ｒ新しく開発した免疫測定装
置を用いたウィルスの検出実験」）で発表したように、
不活性化したインフルエンザウィルスＡ％Ｂ型をウィル
スのモデルとして用いて、ウィルス検出実験を行なった
ところ、１ｍＱ中に１個程度のウィルスが存在する場合
でも検出できた。レーザ光をａ縮された検体に照射して
検体からの出射光を検出する方法は、このように検出感
度が非常に高い方法である。

「発明が解決しようとする課題」 ところで、上述のＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＩＡ法等の標
識法においては、それぞれアイソトープ、酵素、蛍光色
素の各標識試薬を検体に過剰に加えて、検体との間で抗
原抗体反応させた後、未反応の標識試薬を洗浄により除
去する方法が取られている。検体の量が少なくなるほど
標識試薬が検体よりら大過剰となるため、洗浄で除去で
きずに残留する標識試薬の非特異反応が重要な問題とな
っていた。このような問題は、先に出願したレーザ磁気
免疫測定法においてら、同様に問題となっている。

本発明の課題は、先に本発明者らが発明したレーザ磁気
免疫測定法において、非特異反応を低減するための検体
調整方法を提供することにある。

「課屈を解決するための手段」 本発明に係るレーザ磁気免疫測定方法を実施するための
検体調整方法は、磁性体微粒子に抗体を結合してなる磁
性体標識抗体と検体とを遠心沈殿させた後、抗原抗体反
応させることを特徴とするしのである。

また、本発明の実施態様として、前記磁性体微粒子を超
常磁性体超微粒子として用いることが挙げられる。これ
により未反応の磁性体標識抗体が混在したままでも検体
を定量することが可能となる。

また、本発明の他の実施態様として、前記検体が前記遠
心工程以前に前記磁性体標識抗体よりも質量または体積
が充分に大きな非磁性体微小球に捕捉しておくことか挙
げられる。これによって、該遠心工程か簡単になり、か
つ未反応の磁性体標識抗体を検体と反応した磁性体標識
検体複合体から分離することが容易になる。分離の手段
としては、遠心分離あるいはフィルターなどが適用でき
る。

「作用」 本発明に係るレーザ磁気免疫測定方法を実施するための
検体調整方法は、感染初期の微量なウィルスの検出に特
に有効である。ウィルスが極僅かしか存在しない場合、
ウィルスに標識するためには大過剰の標識試薬を加えて
ウィルスとの遭遇の機会を増やす必要がある。しかし、
大過剰の標識試薬を加えるとウィルスと結合しない標識
試薬が測定時にも多量に残留するため、非特異反応によ
るバックグランドの上昇を来たす。本発明は遠心操作に
よって、磁性体標識抗体と検体を沈殿させることによっ
て濃縮し、反応の確率を高める処理を行なうことを特徴
としている。従って、検体が微量でも磁性体標識抗体は
少量で済み、未反応の該磁性体標識抗体に基づく非特異
反応の低減に効果的である。このように、従来大過剰に
加えていた標識試薬の量を著しく低減することが可能に
なった。

本発明による検体調整の後、沈澱物を緩衝液中に分散し
て、検体と反応した磁性体標識抗体を検査容器に回収す
ることが出来る。このような検体調整方法によって回収
した磁性体標識抗体は検体と未反応のものも含まれてい
る。未反応の磁性体標識抗体を分離するいわゆるＩ３／
Ｆ分離を行なう場合は、本発明者らが特許出願中の、検
体をマイクロビーズで捕捉する処理工程を導入すること
によって、遠心分離で容易に分離できる。

即ち、該磁性体微粒子に抗体を結合して得られる磁性体
標識抗体よりも充分に大きな質量を有する非磁性体粒子
の表面上で検体を捕捉した後、該磁性体標識抗体と検体
とを抗原抗体反応させる。

検体を捕捉するための前記非磁性体粒子は磁性体であっ
てはならない。何故ならば、検体を捕捉後磁性体標識抗
体で標識する意味が無くなるからである。前記非磁性体
微粒子としては、平均粒径０゜１〜１０μｍ程度の微粒
子が好ましい。該非磁性体粒子は、例えばアクリルポリ
マー樹脂やポリスチレン樹脂等のプラスチック微小球、
あるいはンリカやアルミナ等の無機コロイド粒子などが
好ましい。

非磁性体粒子の表面に検体を捕捉する方法の一つとして
、該非磁性体粒子の表面を活性化して検体を非特異的に
吸着させる方法をとることができる。この方法は、スク
リーニング検査や、患者のうがい液からインフルエンザ
ウィルスを検出するような場合に有効である。うがい液
にはウィルスは多くても数百側程度しか存在しないし、
また、Ａ型、Ｂ型等の複数の変異株があるから、まずウ
ィルスを特定せずに確実に前記非磁性体粒子に捕捉する
目的に適している。もう一つの方法として、非磁性体粒
子の表面上に予め既知の抗体あるいは抗原を固定してお
き検体を抗原抗体反応によって特異的に結合させる方法
がある。この方法は、非特異反応をできる限り排除して
特定のウィルスのみを確実に検出する精密検査に適して
いる。

本発明の検体調整方法によって回収された検体は、遠心
によるＢ／Ｆ分離が望ましいが、フィルタによって分離
することも可能である。遠心分離の一例としては、例え
ば、１μｍのアクリルポリマー樹脂を非磁性体粒子とし
て用いた場合、該非磁性体粒子に捕捉された抗原抗体複
合体は＋５０Ｏｒｐｍ、５分間の低速遠心で沈殿する。

一方、未反応の磁性体標識抗体は沈殿せず、上清として
留まる。沈澱物を採取して、例えば、ＨＥ　Ｐ　ＥＳの
ような緩衝液中に抗原抗体複合体を分散させる。

以上、説明したＢ／Ｆ分離を行なう方法の他に、該磁性
体微粒子として、本発明者らが先に発明し、特許出願し
た超常磁性体超微粒子を用いる方法を適用すれば、未反
応の磁性体標識抗体が混在したままでも検体を定量する
ことが可能であるから、本発明のレーザ磁気免疫方法を
実施するための検体調整を行なった検体を直接レーザ磁
気免疫測定装置で定量することが出来る。

以上のようにして、本発明の検体は実施される。

本発明の検体調整方法を適用した後、萌述したレーザ磁
気免疫測定法及び測定装置について技術開示している方
法で極微量の抗原あるいは抗体の検出を行うことができ
る。この新しいレーザ磁気免疫測定法はウィルスが１側
枕度でも検出できる感度かある。

「実施例」 及鳳夕工 本実施例は、実験上安全性の高い不活化したインフルエ
ンザウィルスを用いて本発明の検体調整法の検出限界を
調べる目的で実施したものである。

′＝Ｖ均粒径１μｍのアクリルポリマーからなる非磁性
体粒子の表面には、ウサギを免疫として得られたインフ
ルエンザウィルスに対する高度免疫血清が抗体として同
相化されている。凍結乾燥保存されている前記非磁性体
粒子は反応容器に入れられＰＢＳ緩衝液中に分散される
。モデル検体として既知の濃度のインフルエンザウィル
ス（Ａ／石川用８３　Ｎ　２　））を前記工程で得られ
た非磁性体粒子分散液に加えて、該インフルエンザウィ
ルスを該非磁性体粒子の表面に捕捉した。本実施例では
ウィルスの検出限界を調べるために濃度１〜１千万個／
ｍＱの範囲でｌθ倍段階希釈した各濃度のウィルス溶液
を用いた。

磁性体標識抗体はデキストランで被覆した平均粒径４０
ｒ＋Ｉ！＋のマグネタイトからなる磁性体微粒子にフェ
レットを免疫して得られる抗血清から単離したＩｇＧ抗
体を共有結合したものである。

前記非磁性体粒子に捕捉した検体と前記磁性体標識抗体
Ｉ　Ｘ　ｌ　Ｏ−”ｍｇとを遠心管に入れ、３０００ｒ
ｐｍ、１５分の遠心の後、３５℃、２．５時間のインキ
ュベートを行なった。この操作によって、検体は磁性標
識された。

つぎに、前記工程で得られた抗原抗体複合体と未反応の
磁性体標識抗体とを分離するため、沈澱物を緩衝液中に
分散し、１５００ｒｐｍ、　５分間の遠心によって、前
記抗原抗体複合体は沈殿し、未反応の磁性体標識抗体は
上清として得られた。この工程で得られた沈澱物を採取
して、ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液１ｍｆ２に該沈澱物を加
え、本発明者らが先に発明した干渉法（特開昭６２−１
８４９０２号）でウィルスの検出を行なった。その結果
、ウィルス１側枕度を検出することが出来た。

本発明の場合、表面積の大きな非磁性体粒子の表面で３
次元的に検体を捕捉し、磁性体標識抗体−と抗原抗体反
応するから、従来の２次元的に反応させる方法よりも反
応時間を短縮することができる。また、この特徴のため
、極微量の検体の捕捉にも有利である。捕捉・反応過程
で攪拌処理を併用すれば更に捕捉・反応処理時間の短縮
ができる。

本発明の実施例を適用した場合、磁性体標識抗体の量は
、適用しない場合に比べ１桁以上低減することが出来た
。

また、本実施例のように遠心力によってＢ／Ｆ分離すれ
ば、洗浄よりも確実な分離が行なわれる。

遠心条件は使用する非磁性体粒子と磁性体標識抗体との
比重差に応じて最適な条件が決められる。

この際、アルブミン、パーコールを加えた密度勾配遠心
すれば、さらに非磁性体粒子と磁性体標識抗体の分離が
確実に行える。

実施例２ 本実施例は徂者のうがい液からインフルエンザウィルス
を検出する実験例である。患者のうがい液を３０ｍ１２
採取し、まず、前処理として３０００ｒｐｍ、　　Ｉ　
０分間の遠心にかけて異物等を沈殿させて除去し、この
上清を検体とした。

磁性体標識抗体は、平均粒径５ｎｍのマグネタイト超常
磁性超微粒子であって、その表面はデキストランで被覆
され、フエレットを免疫して得られた抗血清から単離さ
れたＩｇＧ抗体が該デキストランに共有結合されている
。

前記検体と前記超常磁性体超微粒子からなる磁性体標識
抗体とを遠心管に入れ、３５℃で２００００　ｒｐｍ、
６０分間超遠心機にかけ、両者を沈殿させ、抗原抗体反
応させた。こうして得られた沈澱物Ｉｎ（を採取して、
以下に述べるレーザ磁気免疫測定装置で測定した。

本実施例の測定工程においては、本発明者らは現在出願
中のレーザ磁気免疫測定方法に記載した超常磁性超微粒
子を標識に用いた。この方法は、電磁石と該電磁石に対
向して設置された磁極片からなる傾斜磁界発生装置の中
に前記検査容器を挿入し、該検査容器の該磁極片直下の
水面に濃縮された検体からの散乱光等の出射光を検出す
るものであって、いわゆる１３／Ｆ分離が不要な方法で
ある。即ち、検体と抗原抗体反応した磁性体標識抗体は
未反応の磁性体標識抗体よりも体積が増大するため、ブ
ラウン運動が不活発となるから前記傾斜磁界発生装置で
濃縮する際に未反応のものよりも濃縮されやすいことを
利用する方法である。例えば、散乱光の経時変化パター
ンから、反応したしのと未反応のものとを識別すること
が出来る。

以上説明した検体調整方法を、うがい液中のインフルエ
ンザウィルスの検出を想定したモデル実験に適用したと
ころ、１００１１２の水溶液中に存在する数百側程度存
在するウィルスを検体調整から測定までの所要時間が３
時間程度で検出することが出来た。なお、うがい液中の
インフルエンザウィルスを鶏卵で培養し、血球凝集反応
を肉眼で観察する従来の方法では、数週間かかっていた
。

「発明の効果」 以上詳述のように、本発明に従うレーザ磁気免疫測定方
法を実施するための検体調整方法は、磁性体標識抗体の
使用量の低減が可能であるため、未反応の該磁性体標識
抗体による非特異反応を低減に極めて有効である。この
結果、測定のＳ／Ｎ比が改善されるので、検出感度の改
善に極めて効果的である。また、高価なモノクローナル
抗体を有効に使用することが出来るから、経済化が図れ
る。さらに、検体を連続的に反応させることか出来るか
ら、うがい液等の多量の検体中に僅かしか存在しないウ
ィルスの検出にも有利である。

このように、ＲＩＡ法以上の検出感度を有しているから
、従来不可能であった感染直後の抗原検査が実施できる
。更に、非磁性体粒子、標識体として用いる磁性体超微
粒子は、放射線あるいは毒性の点では問題なく、検体に
対して安定なものを容易に人手できる。

本発明は、実施例に上げたウィルスの検出に限らず、癌
の早期診断、アレルギー、細菌等の検査や従来ＲＩＡ法
が適用されていたペプチドホルモン等の種々のホルモン
あるいは種々の酵素、ビタミン、薬剤などの測定にも応
用することが可能である。従って、従来は限定された施
設でＲＩＡ法によらなければ実施できなかった精密な測
定を一般的な環境で広〈実施することが可能となる。集
団検診等のような一般的な状況で、各種のウィルス、癌
等のスクリーニング検査等の精密な測定が広〈実施でき
れば、癌あるいはウィルス性疾患等の早期診断が可能と
なり、有効な早期治療を的確に実施することか可能とな
る。このように、本発明が医学・医療の分野で果たす効
果は計り知れない。

出願人　　日本電信電話株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）所定の抗原あるいは抗体に磁性体微粒子を標識と
   して付加した磁性体標識体と検体たる抗体あるいは抗原
   とを抗原抗体反応させる第１工程と、前記第１工程後の
   磁性体標識体と検体との複合体である磁性体標識検体複
   合体を含む溶液に磁界を作用させてレーザ光照射領域に
   前記磁性体標識検体複合体を誘導・濃縮させる第２工程
   と、を少なくとも含むレーザ磁気免疫測定方法を実施す
   るための検体調整方法であって、 前記磁性体微粒子に抗体を結合してなる磁性体標識抗体
   と検体を遠心沈殿させた後、抗原抗体反応させることを
   特徴とするレーザ磁気免疫測定方法を実施するための検
   体調整方法。
2. （２）前記磁性体微粒子が超常磁性体超微粒子であるこ
   とを特徴とする請求項１記載のレーザ磁気免疫測定方法
   を実施するための検体調整方法。
3. （３）前記検体が前記遠心工程以前に前記磁性体標識抗
   体よりも質量または体積が充分に大きな非磁性体微小球
   に捕捉されていることを特徴とする請求項１または２記
   載のレーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整
   方法。