JPH0132234B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0132234B2 JPH0132234B2 JP60234924A JP23492485A JPH0132234B2 JP H0132234 B2 JPH0132234 B2 JP H0132234B2 JP 60234924 A JP60234924 A JP 60234924A JP 23492485 A JP23492485 A JP 23492485A JP H0132234 B2 JPH0132234 B2 JP H0132234B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mrna
- acid
- porous glass
- glyceryl
- oligothymidylic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はmRNAの精製方法に関する。
mRNAは生体内に存在しタンパク質生合成に
関与することが知られている。生体内のホルモン
や酵素等の蛋白質情報を含む比活性の高い
mRNAを高度に精製する方法を開発することは、
これらのmRNAに対応するDNAを得るのに重要
であり、このDNAを得れば遺伝子工学的手法で
医療分野に重要なホルモンや酵素等を大量に産生
する基礎となる。
関与することが知られている。生体内のホルモン
や酵素等の蛋白質情報を含む比活性の高い
mRNAを高度に精製する方法を開発することは、
これらのmRNAに対応するDNAを得るのに重要
であり、このDNAを得れば遺伝子工学的手法で
医療分野に重要なホルモンや酵素等を大量に産生
する基礎となる。
（従来の技術）
従来、mRNAの精製法としてはProc.Natl.
Acad.Sci.USA69巻1408頁（1972年）に示されて
いるように、mRNA含有液をオリゴチミジル酸
―セルロースを充填したカラムに通過させて
mRNAを吸着させ、吸着しないrRNAを溶出さ
せたのち、ついでmRNAのみを溶出させる方法
がある。
Acad.Sci.USA69巻1408頁（1972年）に示されて
いるように、mRNA含有液をオリゴチミジル酸
―セルロースを充填したカラムに通過させて
mRNAを吸着させ、吸着しないrRNAを溶出さ
せたのち、ついでmRNAのみを溶出させる方法
がある。
（発明が解決しようとする問題点）
しかし、この方法では一部mRNA以外のRNA
も吸着するため精製度が必ずしも充分でないこと
からmRNA含量の低いRNA溶液の場合には活性
の高いmRNAを得るのに困難があつた。また粗
製RNA溶液が混濁している場合にはセルロース
が目詰まりを起し高流速を得られない欠点があつ
た。
も吸着するため精製度が必ずしも充分でないこと
からmRNA含量の低いRNA溶液の場合には活性
の高いmRNAを得るのに困難があつた。また粗
製RNA溶液が混濁している場合にはセルロース
が目詰まりを起し高流速を得られない欠点があつ
た。
（問題点を解決するための手段）
本発明者はこれらの欠点を克服するために鋭意
検討を重ねた結果、mRNAを含むポリソーム
RNA液をオリゴチミジル酸を結合したグリセリ
ル多孔質ガラスを充填したカラムに通過させて
mRNAを吸着させ、ついでmRNAを溶出するこ
とによつて、比活性の高いmRNAを得るととも
に、カラムの目詰りを起すことなくmRNAを精
製できることを見出し、本発明に到達した。
検討を重ねた結果、mRNAを含むポリソーム
RNA液をオリゴチミジル酸を結合したグリセリ
ル多孔質ガラスを充填したカラムに通過させて
mRNAを吸着させ、ついでmRNAを溶出するこ
とによつて、比活性の高いmRNAを得るととも
に、カラムの目詰りを起すことなくmRNAを精
製できることを見出し、本発明に到達した。
オリゴチミジル酸―グリセリル多孔質ガラスの
調製法としては、GilhamのJ.Am.Chem.Soc.，86
巻4982頁（1964年）の方法によつて調製したオリ
ゴチミジル酸と無水ピリジン中シクロヘキシルカ
ルボジイシド存在下、グリセリル多孔質ガラスと
５日間反応させることによつて調製することがで
きる。
調製法としては、GilhamのJ.Am.Chem.Soc.，86
巻4982頁（1964年）の方法によつて調製したオリ
ゴチミジル酸と無水ピリジン中シクロヘキシルカ
ルボジイシド存在下、グリセリル多孔質ガラスと
５日間反応させることによつて調製することがで
きる。
なお、上記の方法で調製されたオリゴチミジル
酸―グリセリル多孔質ガラス１mlへのpolyAの結
合量は80μｇであつた。グリセリル多孔質ガラス
の孔径は350Åを用いたが、本発明はオリゴチミ
ジル残―グリセリル多孔質ガラスの平均孔径に特
に制限されることはないが、mRNAの大きさか
ら孔径は小より大がよい。オリゴチミジル酸―グ
リセリル多孔質ガラスの粒子径にも特に制限はな
いが、カラムに充填して使用するため10〜200μm
が適当である。
酸―グリセリル多孔質ガラス１mlへのpolyAの結
合量は80μｇであつた。グリセリル多孔質ガラス
の孔径は350Åを用いたが、本発明はオリゴチミ
ジル残―グリセリル多孔質ガラスの平均孔径に特
に制限されることはないが、mRNAの大きさか
ら孔径は小より大がよい。オリゴチミジル酸―グ
リセリル多孔質ガラスの粒子径にも特に制限はな
いが、カラムに充填して使用するため10〜200μm
が適当である。
本発明を実施するに際して、mRNAを含むポ
リソームRNA液とは高等動物を含む真核細胞か
ら調製されるもので、組織磨砕物または遠心分離
法でえたポリソーム画分をフエノール―SDS法あ
るいはグアニジン―チオシアン酸塩法で処理抽出
した後、アルコールで沈殿させる方法などの一般
的方法で調製される。
リソームRNA液とは高等動物を含む真核細胞か
ら調製されるもので、組織磨砕物または遠心分離
法でえたポリソーム画分をフエノール―SDS法あ
るいはグアニジン―チオシアン酸塩法で処理抽出
した後、アルコールで沈殿させる方法などの一般
的方法で調製される。
一方、精製操作としては、オリゴチミジル酸―
グリセリル多孔質ガラスを円筒カラムに充填し
て、０〜30℃の範囲内で選択される一定の温度に
おいて、0.5Mの食塩またはKCl等の塩を含む液
で平衡化した後、前記ポリソームRNA液をカラ
ムを通してmRNAを吸着させ、カラムに吸着さ
れないrRNA等の不純物は前記緩衝液でカラムを
洗浄して完全に除去する。しかるのちカラムに吸
着されたmRNAの溶出はPH中性の10mM緩衝液
で行うことができる。
グリセリル多孔質ガラスを円筒カラムに充填し
て、０〜30℃の範囲内で選択される一定の温度に
おいて、0.5Mの食塩またはKCl等の塩を含む液
で平衡化した後、前記ポリソームRNA液をカラ
ムを通してmRNAを吸着させ、カラムに吸着さ
れないrRNA等の不純物は前記緩衝液でカラムを
洗浄して完全に除去する。しかるのちカラムに吸
着されたmRNAの溶出はPH中性の10mM緩衝液
で行うことができる。
以下実施例を挙げて本発明を説明するが本発明
はこれらに限定されるものではない。
はこれらに限定されるものではない。
実施例 １
ウサギ網状赤血球溶解液の150000×ｇ沈殿を
4Mチオシアン酸グアニジンに溶解し、これに半
量のアルコールを加えて沈殿させる。沈殿を6M
塩酸グアニジンに溶解し、等量のエタノールを加
えて沈殿させ、遠心によつて集めついで、0.24M
の酢酸ナトリウムに溶解し、2.5倍量のエタノー
ルを加えて沈殿させる。この沈殿を塩心して集
め、0.5M食塩―10mMTris―塩酸PH7.2にとかし、
遠心してこの上清をmRNAを含むポリソーム
RNA液とした。
4Mチオシアン酸グアニジンに溶解し、これに半
量のアルコールを加えて沈殿させる。沈殿を6M
塩酸グアニジンに溶解し、等量のエタノールを加
えて沈殿させ、遠心によつて集めついで、0.24M
の酢酸ナトリウムに溶解し、2.5倍量のエタノー
ルを加えて沈殿させる。この沈殿を塩心して集
め、0.5M食塩―10mMTris―塩酸PH7.2にとかし、
遠心してこの上清をmRNAを含むポリソーム
RNA液とした。
一方、オリゴチミジル酸―多孔質ガラスは次の
ように調製した。平均孔径350Åのグリセリル多
孔質ガラス50mlと0.7mmolのチミジル酸から調製
したオリゴチミジル酸を1.5ｇのジシクロヘキシ
ルカルボジイミドと無水ピリジン50ml中５日間反
応を行つた。ついでオリゴチミジル酸多孔質ガラ
スをピリジン、50％ピリジン、温エタノール、
2M食塩、10mMTris―塩酸でよく洗つた。
ように調製した。平均孔径350Åのグリセリル多
孔質ガラス50mlと0.7mmolのチミジル酸から調製
したオリゴチミジル酸を1.5ｇのジシクロヘキシ
ルカルボジイミドと無水ピリジン50ml中５日間反
応を行つた。ついでオリゴチミジル酸多孔質ガラ
スをピリジン、50％ピリジン、温エタノール、
2M食塩、10mMTris―塩酸でよく洗つた。
このようにして調製したオリゴチミジル酸―グ
リセリル多孔質ガラスを内径0.6cm高さ15cmのカ
ラム（４ml）に充填し、0.5M食塩―10mMTris
―塩酸でよく緩衝化した後、前記ポリソーム
RNA液１ml（50A260ユニツト）を通した。カラ
ムに吸着されないrRNA等の不純物を前記緩衝液
で洗浄除去した後、10mMTris―塩酸でmRNA
を溶出した。その結果を第１図Ａに示す。
リセリル多孔質ガラスを内径0.6cm高さ15cmのカ
ラム（４ml）に充填し、0.5M食塩―10mMTris
―塩酸でよく緩衝化した後、前記ポリソーム
RNA液１ml（50A260ユニツト）を通した。カラ
ムに吸着されないrRNA等の不純物を前記緩衝液
で洗浄除去した後、10mMTris―塩酸でmRNA
を溶出した。その結果を第１図Ａに示す。
該図の最初のピークは不純物のrRNAで２番目
のピークはmRNAである。その収率は2.9％であ
つた。mRNAの活性は2350cpm／0.02A260ユニ
ツトであつた。
のピークはmRNAである。その収率は2.9％であ
つた。mRNAの活性は2350cpm／0.02A260ユニ
ツトであつた。
比較例 １
オリゴチミジル酸―グリセリル多孔質ガラスを
オリゴチミジル酸―セルロースにかえた以外は、
実施例１と同様の操作を行なつた。その結果を第
１図Ｂに示す。該図のmRNA相当のRNAの収率
は7.5％であつたが、mRNA活性は1030cpm／
0.02A260ユニツトであり、mRNAの精製度は実
施例１の約半分と悪い。
オリゴチミジル酸―セルロースにかえた以外は、
実施例１と同様の操作を行なつた。その結果を第
１図Ｂに示す。該図のmRNA相当のRNAの収率
は7.5％であつたが、mRNA活性は1030cpm／
0.02A260ユニツトであり、mRNAの精製度は実
施例１の約半分と悪い。
実施例 ２
オリゴチミジル酸―セルロースによつて得た
mRNA（0.8A260ユニツト）を実施例１と同様の
操作を行つた。その結果を第１図Ｃに示した。該
図からわかるようにオリゴチミジル酸―セルロー
スで得たmRNA画分は二つのピークに分離され、
初めのピークにはmRNA活性はなく、２番目の
mRNAのピークに活性が見出された。
mRNA（0.8A260ユニツト）を実施例１と同様の
操作を行つた。その結果を第１図Ｃに示した。該
図からわかるようにオリゴチミジル酸―セルロー
スで得たmRNA画分は二つのピークに分離され、
初めのピークにはmRNA活性はなく、２番目の
mRNAのピークに活性が見出された。
（発明の効果）
以上、本発明によれば従来のオリゴチミジル酸
―セルロースより比活性の高いmRNAが得られ
ると共に、試料液が混濁していても目詰りを起す
ことなく所定の流速を得ることが出来る。
―セルロースより比活性の高いmRNAが得られ
ると共に、試料液が混濁していても目詰りを起す
ことなく所定の流速を得ることが出来る。
また、本発明で使用されるオリゴチミジル酸―
グリセリル多孔質ガラスはカラムへの充填のしや
すさにおいてもオリゴチミジル酸―セルロースに
比し容易で、短時間で行うことができ、さらにオ
リゴチミジル酸―グリセリル多孔質ガラスは無機
質材料であることから、セルロース等の有機質材
料に比べ微生物に侵される恐れも少なくその耐久
性は大である。
グリセリル多孔質ガラスはカラムへの充填のしや
すさにおいてもオリゴチミジル酸―セルロースに
比し容易で、短時間で行うことができ、さらにオ
リゴチミジル酸―グリセリル多孔質ガラスは無機
質材料であることから、セルロース等の有機質材
料に比べ微生物に侵される恐れも少なくその耐久
性は大である。
第１図Ａ，Ｂ，Ｃはそれぞれ本発明の実施例
１、比較例１および実施例２の溶出パターンを示
す。
１、比較例１および実施例２の溶出パターンを示
す。
Claims (1)
- １ ポリソーム画分より得たRNAをオリゴチミ
ジル酸を有するグリセリル多孔質ガラスに接触せ
しめてmRNAを吸着させ、rRNAを溶出せしめ、
ついでmRNAを溶出することを特徴とする
mRNAの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60234924A JPS6293299A (ja) | 1985-10-21 | 1985-10-21 | ｍＲＮＡの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60234924A JPS6293299A (ja) | 1985-10-21 | 1985-10-21 | ｍＲＮＡの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6293299A JPS6293299A (ja) | 1987-04-28 |
| JPH0132234B2 true JPH0132234B2 (ja) | 1989-06-29 |
Family
ID=16978414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60234924A Granted JPS6293299A (ja) | 1985-10-21 | 1985-10-21 | ｍＲＮＡの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6293299A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3639949A1 (de) * | 1986-11-22 | 1988-06-09 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren |
-
1985
- 1985-10-21 JP JP60234924A patent/JPS6293299A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6293299A (ja) | 1987-04-28 |
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