JPH0768274B2 - プラスミノゲンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は人血漿由来のプラスミンを含まないプラスミノ
ゲンの製造方法に関する。

〔従来技術とその問題点〕

プラスミノゲンは、ウロキナーゼ，ストロプトキナーゼ
等によって活性化されてプラスミンとなり、これがフイ
ブリンを分解して線溶現象を生起するので、ウロキナー
ゼやストレプトキナーゼとともに血栓症の治療のほか広
く臨床応用が可能な医薬品として注目されている。

しかしながら、プラスミンを含有するプラスミノゲンは
上記分解により早期に失活するので、保存性の劣るもの
であった。

プラスミノゲンのリジン・アガロースを用いての精製法
はすでに確立された方法（Science,第170巻，第1095項,
1970年参照）であるが、コーンの分画IIIを原料として
用いた場合に得られるプラスミノゲン中には約５〜10％
のプラスミンが混在しており、長期保存により活性を低
下させるものであった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、プラスミノゲンを含有する水溶液
からプラスミンを完全に除去する方法を種々検討し、吸
着・除去剤としてアプロチニン・アガロースを選択する
ことにより本発明を完成した。

本発明は、アプロチニン・アガロースを用いて粗製プラ
スミノゲン中に含有するプラスミンを選択的に吸着除去
し、長期保存によっても失活のないプラスミノゲンを製
造する方法からなる。

本発明のプラスミノゲンは夾雑物としてプラスミンを５
〜10％程度含むものであれば特に限定されない。このよ
うなプラスミノゲンとしては血漿由来のものが挙げら
れ、具体的にはコーンの第II＋IIIあるいは第III画分な
どが例示される。

プラスミノゲンの濃度としては、100〜1000単位/ml程度
が例示される。

また、アプロチニン・アガロースはアプロチニンをアガ
ロースに固定化したものである。アガロースとしてはセ
ファロース4B（商品名）などが用いられる。また、アプ
ロチニンとしては、比活性1000〜10000KIE/mg程度のも
のが用いられる。固定化方法自体は公知であり、特に限
定されるものではない。

本発明の処理方法はバッチ法、カラム法のいずれを用い
てもよい。平衡溶媒および吸着溶媒としては、pH6〜８
（好ましくはpH7〜7.5）の緩衡液（例えばリン酸緩衡液
など）が用いられる。また、塩化ナトリウムなどを添加
しておくことも可能である。上記条件下、プラスミンは
ゲルに吸着し、プラスミノゲンは吸着せず、故にプラス
ミノゲンのみを回収することができる。

アプロチニン・アガロースとの接触処理を行ったプラス
ミノゲンの水溶液はその後常法の手段により無菌バルク
あるいは凍結乾燥品として提供される。

〔作 用〕

アプロチニン・アガロースはプラスミノゲン溶液中に混
在するプラスミンを選択的に吸着除去し、このことによ
ってプラスミンをほとんど含まないプラスミノゲンを製
造することが可能になる。

実施例（１） アプロチニン・セファローズのプラスミン結合能の一例
を示せば第１表の通りとなる。

この表は10％のプラスミンを含有するプラスミノゲン溶
液をアプロチニン・セファローズゲルを用いたアフィニ
ティクロマトグラフィー処理した結果を示す。

この表からも解るように添加したプラスミノゲン溶液に
は10％のプラスミンが混在しているが、その含有率がア
プロチニン・セファローズによる特異吸着により減少し
ている。そしてこの時の上清のプラスミンの活性はほど
んど減少していなかった。

このようにアプロチニン・セファローズはプラスミノゲ
ン溶液からプラスミノゲンの活性を低下させることなく
プラスミンを吸着除去できる。このプラスミンの吸着除
去効果は第１表に示すようにプラスミノゲン溶液に対す
るアプロチニン・セファローズゲルの量が増えるほど増
加するが、作業性と経済性の面から、上清中のプラスミ
ンの含有率が0.55％（第１表No.4）になる条件が望まし
い。また、プラスミノゲン溶液をアプロチニン・セファ
ローズに接触させる方式は、バッチ式又はカラムクロマ
トグラフィ処理を行う連続式の両者が可能であるが、第
１表から容易に推定されるように連続式を採用すること
により例えばアプロチニン・セファローズゲル200gを用
いて10％のプラスミンが混在するプラスミノゲン溶液の
500,000CU分を一度に処理することが可能となるので一
段と生産性が向上する。

実施例（２） アプロチニン・セファローズゲルの調製； アプロチニン1g（福田勘産業（株）製アプロチニン“オ
ークラ”（6,500KIE/mg）使用）を24mlのバッファーＡ
（0.1M NaHCO,0.55M NaCl,pH8.3）に溶解し、バッフ
ァーＡを外液として一晩透析した。１のセファローズ
（ファルマシア社製セファローズ4B使用）をグラスフィ
ルター上で、３の蒸留水と２のバッファーＡとで順
次洗浄後、セファローズゲルを2lのバッファーＡに懸濁
し8N−水酸化ナトリウム溶液でpHを11〜11.5に調節し
た。その後この懸濁液をスターラーで静かに撹拌しなが
ら室温下で50gのCNBrを一度に加え、15分間8N−水酸化
ナトリウム溶液でpHを11〜11.5に維持した。次いで、懸
濁液を素早く大型グラスフィルターに移し２のバッフ
ァーＡで洗浄した後、活性化セファローズゲルを１の
バッファーＡ中に再度懸濁しそのうちの200mlに透析後
のアプロチニン溶液を加えて４℃で一晩静かに撹拌して
アプロチニン・セファローズゲルを得た。

このアプロチニン・セファローズゲルはその後バッファ
ーＡで洗浄後0.1Mトリス−塩酸溶液,pH7.2,0.1％三窒化
ナトリウム溶液中に懸濁されて使用時まで４℃で保存し
た。

実施例（３） 融解した凍結保存プラスミノゲン3,500ml（98CU/ml、計
343,00OCU）に適宜の安定剤を添加するとともに、6N−
塩酸溶液でpH7.2±0.1に調節した溶解液3,500mlを調製
した。このものを常法通り濃縮濾過して濃縮濾過後液72
0mlを得た。上記濃縮にはアミコン社製ホローファイバ
ー（Type HIP10−８）を用いた。その後この濃縮濾過
後液を上記したアプロチニン・セファローズゲルを充填
したカラムと接触，展開させ、プラスミンを吸着除去
し、通過してくるプラスミノゲンを含有する水溶液850m
lを回収した。このときのカラムクロマトグラフィーの
条件は、溶出バッファー:50Mリン酸、0.45％食塩、pH7.
2、カラム洗浄バッファー:500mMグリシン−塩酸、600mM
食塩、pH3.5、溶出量:50ml/9min/フラクション、ゲル
量：約200mlで行った。

このものはその後除菌濾過して無菌バルク840mlを得
た。

このときの各工程におけるプラスミノゲンの活性とプラ
スミン含量との関係を第２表に示した。

この第２表から明らかなように、プラスミノゲン溶解液
中にはプラスミンが2.4％含まれていたが、アプロチニ
ン・セファローズカラムを通過した溶出液にはプラスミ
ンの含有は認められなかった。このことによってアプロ
チニン・セファローズカラム使用によってプラスミンの
混在しないプラスミノゲン製剤の製造が可能であること
が理解できる。

この実施例（３）によって得た無菌バルクを３年間凍結
保存したが、その活性低下は３％弱と小さく保存安定性
が良好であった。

実施例（４） 融解した凍結保存プラスミン9,000ml（79CU/ml、計709,
000CU）に適宜の安定剤を添加するとともに、6N−塩酸
溶液でpH7.2±0.1に調節した溶解液9,000mlを調製し
た。このものを実施例（３）と同様の方法で濃縮濾過し
て濃縮濾過後液950mlを得た。その後この濃縮濾過後液
を実施例（３）と同一条件で上記したアプロチニン・セ
ファローズゲルと接触、展開させ、プラスミンを吸着除
去し、通過してくるプラスミノゲンを含有する水溶液1,
220mlを回収した。

次いで、このものは清澄濾過した後、凍結乾燥して凍結
乾燥品を得た。

このときの各工程におけるプラスミノゲンの活性とプラ
スミン含量との関係を第３表に示した。

この第３表から明らかなように、プラスミノゲン溶解液
中にはプラスミンが2.7％含まれていたが、アプロチニ
ン・セファローズカラムを通過した溶出液にはプラスミ
ンの含有が認められなかった。以後の工程においてもプ
ラスミンの含有は認められず、最終の凍結乾燥品の保存
安定性は良好であった。

〔発明の効果〕

以上述べたように、本発明の方法は少ないゲル量で大量
のプラスミノゲン溶液を処理することができるので産業
上効率が良く、さらにプラスミンをほとんど含有しない
プラスミノゲンを確実に提供し得るものである。而し
て、保存安定性にも優れた高品質の試薬，医薬品の生産
の達成が可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プラスミンを含有するプラスミノゲン水溶
   液をアプロチニン・アガロースに接触させて、含有する
   プラスミンをほぼ完全に吸着除去し、プラスミンをほと
   んど含まないプラスミノゲンを製造する方法。