JPH0133448B2 - - Google Patents
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- JPH0133448B2 JPH0133448B2 JP51061030A JP6103076A JPH0133448B2 JP H0133448 B2 JPH0133448 B2 JP H0133448B2 JP 51061030 A JP51061030 A JP 51061030A JP 6103076 A JP6103076 A JP 6103076A JP H0133448 B2 JPH0133448 B2 JP H0133448B2
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- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Description
ダウノマイシン（８−アセチル−10−〔（３−ア
ミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキ
ソ−ヘキソピラノシル）オキシ〕−７，８，９，
10−テトラヒドロ−６，８，11−トリヒドロキシ
−１−メトキシ−５，12−ナフタセンジオン）は
強力な抗腫瘍物質で、新生物細胞を死滅さすのに
有効な薬剤となりうる。しかし、正常組織に対す
る毒性のゆえに使用が制限されている。腫瘍細胞
に対する毒性の選択性は、腫瘍細胞サイトへ薬剤
が濃縮するように体の中の分布を改める方法で強
化されうる。この目的への接近方法として、薬剤
の担体として選択的な抗腫瘍性抗血清を用いる方
法がある。 ある種の抗腫瘍性薬剤が、活性を消失すること
なく巨大分子に共有的に結合しうることを示す報
告が最近現われている。また、薬剤と抗腫瘍性抗
体との共有結合によらない複合物または混合物が
ある条件では、薬剤単独によるよりも癌を治療す
るのにより効率的であることも示されている。本
発明者等は、以前の研究で、ダウノマイシンおよ
びアドリアマイシン（adriamycin）が免疫グロ
ブリンに共有結合により結合することを示した。
この薬剤−抗体複合物は、腫瘍および正常細胞に
対してインビトローで試験してみて遊離の薬剤と
類似の細胞毒性を示しそして著量の抗体活性が保
留される。ダウノマイシンと２種の淋巴腫瘍のい
ずれかを対象とする免疫グロブリンとの複合物の
毒性を種種の標的腫瘍細胞に対し試験した結果、
抗体が認識しうる標的細胞に薬剤が選択的に影響
を与えることが分つた。 本発明はFab′2量体をダウノマイシンのような
抗腫瘍剤の共有結合担体として使用に関する。こ
のものは抗腫瘍性抗体を含有する免疫グロブリン
よりペプシン消化によりみちびかれるものであ
る。 本発明により、標的細胞に可及的に特異的に到
達するようにデザインされた薬剤−抗体複合物を
供給しうることが発見されたのである。本発明に
よれば、細胞抗原に結合しなかつたものはいずれ
もできるだけすみやかに循環系から除かれること
がもつとも望ましい。本発明の目的では、“抗原
と結合性の２量体分画”つまり（Fab′）2と称す
る、抗体に由来する分画が、“結晶化しうる分画”
つまりFc分画と称する分画を有する生のままの抗
体分子より有利である。その理由は、血流中の
（Fab′）2の半減期は、生のままの免疫グロブリン
のそれよりもずつと短かいからである。治療の目
的で薬剤を局所的に供給するために抗体を使用す
ることは、免疫原性であるゆえに好ましくない反
応をおこすかも知れない異質の抗体を含むことが
ある。Fcは免疫グロブリンのもつとも免疫原的に
強い部分で、これを除去すると、Fab′上の抗原
決定基と反応しうる抗体をなお誘発するとして
も、免疫原性がより少ない分子、Fab′二量体が
得られる。Fab′二量体は完全免疫グロブリンIgG
に比較して免疫原性がずつと小さく、しかも半減
期が極めて短い利点を有し、従つて、薬物を所望
の部位に供給する役目を果たすと、有害な免疫原
性をほとんど発揮することなく、体内から迅速に
除去される格別に望ましい効果が得られる。 本発明によればダウノマイシンと、抗リンフオ
ーマ抗血清より分離された免疫グロブリンに由来
するFab′2量体との共有結合による複合物が調製
される。この複合物のインビトローでの細胞毒性
を調べてみた。 本発明の記載 化合物および試剤。ダウノマイシン塩酸塩は
Specia（Paris、France）よりセルビジン
（Cerubidine）として得られる。５−〔 3H〕ウリ
ジン（比活性25c／ｍＭ）および 125Iは
Radiochemical Center（Amerskam.England）
より販売されている。過ヨー素酸ナトリウムおよ
び水素化ホウ素ナトリウムはBDH（Poole、
England）より販売されている。Biogel Ｐ−60
はBio−Rad（Los Angeles、Calif.）より得られ
る。Porapak Ｑ、50−80メツシユはwaters
Associates（Boston、Mass.）より販売されてい
る。Sephadex Ｇ−200はPharmacia（Uppsala
Sweden）より得られる。 腫瘍細胞。本発明で用いる腫瘍細胞は
Moloneyウイルスで誘発されたマウスYacリンパ
腫細胞でＡ／Ｊマウスで植えつがれている
（Nat.Canc.３、547（1964））。 抗血清。完全フロインドアジユバンド中にエマ
ルジヨンとした２mgの牛血清アルブミン（BSA）
を１週間おいて２度うさぎの皮下に注射し牛血清
アルブミン（BSA）に対する抗血清を生成させ
る。兎（Fab）2に対する抗血清は同様に山羊にも
生成させる。Yac細胞に対する抗血清は、５日間
隔で５回108個の細胞を兎に静脈注射して調製す
る。これら抗血清の免疫グロブリン分画を調製す
るには、33％飽和硫安で沈殿させる。インビボー
で使用の抗腫瘍性IgGまたは（Fab′）2は、ひ臓、
胸腺、肝臓および赤血球の正常細胞に吸着させ
る。37度Ｃで30分かけて段階的に吸着を反復し、
正常のひ臓に対するインビトロー活性が残存しな
い状態に至らす。 ダウノマイシン活性。細胞RNA合成の阻害に
よりダウノマイシンの薬剤活性を測定する。 （Fab′）2の調製。37度Ｃで16時間、PH4.5の0.1
モル酢酸ナトリウム緩衝液中で、酸素と蛋白質と
の比率を１／50（重量／重量）として、20mg／ml
の濃度の免疫グロブリンをペプシンで消化する。
PH7.4として消化を中止させ、反応混合物をリン
酸緩衝塩溶液に対して十分に透析する。最後にセ
フアデツクスG200で分画して未消化の免疫グロ
ブリンを除き、（Fab′）2を得る。 やぎの抗−うさぎ（Fab′）2IgGのヨー素化。う
さぎ（Fab′）2に対する山羊の抗血清よりの免疫グ
ロブリン分画を、Int.Arc.Allergy、29、185
（1966）に記載のMc Conahey等の方法でヨー素
化する。調製物の比活性は１×108cpm／mg蛋白
となる。 （Fab′）2調製品に対するダウノマイシンの結
合。40mg／mlPBS（リン酸塩緩衝塩溶液）のダウ
ノマイシンを僅かにモル過剰の100ｍMNaIO4と
混合し、暗黒下に室温で１時間放置する。次い
で、グリセロール（1M）を最終濃度0.05Mまで
加え過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。得られた酸
化ダウノマイシン溶液を10mg／mlの濃度で0.15M
炭酸カリウム中PH9.5で室温において１時間１ml
の（Fab′）2と混合する。生成物にNaBH4を最終
濃度0.3mg／mlとなるよう加えて、37℃で１時間
還元し、次いで、バイオーゲルＰ−60（カラムサ
イズ48×１cm）で分画して（Fab′）2に結合したダ
ウノマイシンを得る。得られたダウノマイシン−
（Fab′）2複合体は共有結合化合物である。これは
次の事実から証明される。すなわち、水素化ホウ
素ナトリウム（NaBH4）による還元前の生成物
をPH５またはそれ以下の酸性溶液に対して透析す
ると、少なくともその60％が分解され、遊離のダ
ウノマイシンと（Fab′）2とに分かれてしまう。こ
のことからこの生成物はシツフ塩基結合であるこ
とがわかる。またNaBH4による還元後の生成物
は酸で分解を受けず、この結合が安定化されたこ
と、つまり、共有結合が形成されていることを示
す。 抗体活性の測定。抗−BSAよりの（Fab′）2の
抗体活性は、Biochem.Biophy.Acta、207、115
（1970）に記載のようにBSA−T4バクテリオフア
ージ系で測定する。抗Yac（Fab′）2は、それの
Yac腫瘍細胞への結合により測定する。コンプリ
メントを除去した胎盤牛血清（FCS）10％を含有
するミニマルエツセンシヤル培地（Mem）0.2c.c.
中でYac細胞（２×106）を、抗Yac血清に由来
する全IgGまたは（Fab′）2の種種の濃度とあわせ
て、シエーカー上で０度Ｃで１時間インキユベー
トする。このインキユベーシヨンの期間を経過し
たら細胞を遠心（1000×ｇ）しミニマルエツセン
シヤル培地で３度洗う。洗つたあと、細胞は、10
％FCSを補給した0.1c.c.の培地中に分散させ、そ
れぞれの試験管に山羊に生成させた抗−うさぎ
（Fab′）2の 125I−IgGを５mg／溶液c.c.の割合に添
加する。混合物は上記と同じ条件でインキユベー
トし、遠心し３回洗う。洗つたあと0.5c.c.のMem
中に細胞を分散させる。結合放射活性をオートガ
ンマーカウンター（Packard）中でカウントす
る。 抗−BSAおよび抗−Yac免疫グロブリンより
（Fab′）2の調製 抗−BSAおよび抗−Yac免疫グロブリンより
（Fab′）2の製造はつぎのようにする。抗−BASお
よび抗−Yacの硫安沈殿IgGを、上記のようにペ
プシン消化する。各消化物の試料を、Sephadex
Ｇ−200のカラム（27×２cm）に通す。全（未消
化）IgGを同じカラムに通して比較する。結果は
第１図のようである。（Fab′）2調製物の還元、つ
いでアルキル化でFab′単量体のみを与えること
は、同じフアデツクスＧ−200カラムで知りうる。
このことからペプシン消化は完全である。第１図
で、抗−Yac（Fab′）2は白丸（〇）で、抗−BSA
（Fab′）2は黒（●）で示してある。図はまた、全
IgG（Ｘ）に関する（Fab′）2のセフアデクツスＧ
−200（23×２cm）のゲル過を示す。 蛋白質に結合した薬剤の薬剤としての活性。ダ
ウノマイシン単独ならびにダウノマイシンの２種
の（Fab′）2との複合物、すなわちダウノマイシン
−抗BSA（Fab′）2およびダウノマイシン−抗Yac
（Fab′）2の薬理作用をYac細胞を用いて〔 3H〕
ウリジンの取込み阻害率を指標として測定した。
Yac細胞104／0.1ml／ウエルを上記３種の薬剤と
２時間インキユベートした。次いで、〔 3H〕ウ
リジン1μCiも加え、さらに２時間インキユベー
シヨンを続けた。洗浄によりインキベーシヨンを
終了し、サンプルを取り生し、細胞に取込まれた
放射能を測定した。結果を表１に記載する。表１
から明らかなごとく、ダウノマイシンが
（Fab′）2に共有結合してもダウノマイシンの活性
は何ら失われていないことがわかる。 ダウノマイシン−置換（Fab′）2の抗体活性。ダ
ウノマイシン置換（Fab′）2の抗体活性を第２図に
示す、第２図は、Haimovick等が、Biochim.
Biophys.Acta、207巻、115から124頁、1970に記
載した方法に従い、BSA−T4バクテリオフアー
ジの不活化パーセントとして測定した、（Fab′）2
抗−BSAの抗体活性を示す。第２図から分かる
ように、未置換（Fab′）2に比して、複合物の抗体
活性はほとんど減少しない。抗体活性は、置換度
の低いもの（4M／Ｍ）にも、高いもの（14M／
Ｍ）にも保留される。第２図において、抗−
BSA（Fab′）2は（●）で、ダウノマイシン−抗−
BSA（Fab′）215M／Ｍは（△）で、ダウノマイシ
ン−抗−BSA（Fab′）24M／Ｍは（〇）で示され
る。 標的細胞への結合活性により測定される、抗−
Yacよりの（Fab′）2の活性を第３図に示す。山羊
のヨー素化された抗−うさぎ（Fab′）2への結合に
より測定した、ダウノマイシン−（Fab′）2の抗体
活性は、全IgGまたは非置換（Fab′）2に比して23
から27％減少する。しかし、著量（70％以上）結
合力は保持される。全IgGに比しての、細飽に対
する（Fab′）2結合性の減少がこのように観察され
たのは、調製操作に由来するのであろう。第３図
で、Yacに対しての、抗−Yac IgGの結合は
（〇）で、（Fab′）2のそれは（×）で、ダウノマイ
シン（Fab′）2のそれは（△）で示す。測定は、山
羊の 125Iラベル抗−うさぎ（Fab′）2を用いる２重
結合法で実施したものである。 ダウノマイシン−抗−Yac（Fab′）2複合物の特
異的細胞毒性。関係のない抗体つまり抗−BSA
（Fab′）2にダウノマイシンを結合さすよりも特異
的抗−Yac（Fab′）2に結合さす方が有利なことを、
薬剤結合（Fab′）2分画または遊離薬剤に対し腫瘍
細胞を５分間だけさらす方法によりインビトロー
で試験してみた。つぎに細胞を洗つて、細胞に結
合していない反応剤を除き、細胞と接触した状態
に留まつているダウノマイシンの毒性を〔 3H〕
ウリジン取込みの阻害により評価する。結果（第
２表）から分るように、ダウノマイシン−抗−
Yacは、抗−BSAの関係のない（Fab′）2または
薬剤のみの２倍の活性を示すことが分る。
ミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキ
ソ−ヘキソピラノシル）オキシ〕−７，８，９，
10−テトラヒドロ−６，８，11−トリヒドロキシ
−１−メトキシ−５，12−ナフタセンジオン）は
強力な抗腫瘍物質で、新生物細胞を死滅さすのに
有効な薬剤となりうる。しかし、正常組織に対す
る毒性のゆえに使用が制限されている。腫瘍細胞
に対する毒性の選択性は、腫瘍細胞サイトへ薬剤
が濃縮するように体の中の分布を改める方法で強
化されうる。この目的への接近方法として、薬剤
の担体として選択的な抗腫瘍性抗血清を用いる方
法がある。 ある種の抗腫瘍性薬剤が、活性を消失すること
なく巨大分子に共有的に結合しうることを示す報
告が最近現われている。また、薬剤と抗腫瘍性抗
体との共有結合によらない複合物または混合物が
ある条件では、薬剤単独によるよりも癌を治療す
るのにより効率的であることも示されている。本
発明者等は、以前の研究で、ダウノマイシンおよ
びアドリアマイシン（adriamycin）が免疫グロ
ブリンに共有結合により結合することを示した。
この薬剤−抗体複合物は、腫瘍および正常細胞に
対してインビトローで試験してみて遊離の薬剤と
類似の細胞毒性を示しそして著量の抗体活性が保
留される。ダウノマイシンと２種の淋巴腫瘍のい
ずれかを対象とする免疫グロブリンとの複合物の
毒性を種種の標的腫瘍細胞に対し試験した結果、
抗体が認識しうる標的細胞に薬剤が選択的に影響
を与えることが分つた。 本発明はFab′2量体をダウノマイシンのような
抗腫瘍剤の共有結合担体として使用に関する。こ
のものは抗腫瘍性抗体を含有する免疫グロブリン
よりペプシン消化によりみちびかれるものであ
る。 本発明により、標的細胞に可及的に特異的に到
達するようにデザインされた薬剤−抗体複合物を
供給しうることが発見されたのである。本発明に
よれば、細胞抗原に結合しなかつたものはいずれ
もできるだけすみやかに循環系から除かれること
がもつとも望ましい。本発明の目的では、“抗原
と結合性の２量体分画”つまり（Fab′）2と称す
る、抗体に由来する分画が、“結晶化しうる分画”
つまりFc分画と称する分画を有する生のままの抗
体分子より有利である。その理由は、血流中の
（Fab′）2の半減期は、生のままの免疫グロブリン
のそれよりもずつと短かいからである。治療の目
的で薬剤を局所的に供給するために抗体を使用す
ることは、免疫原性であるゆえに好ましくない反
応をおこすかも知れない異質の抗体を含むことが
ある。Fcは免疫グロブリンのもつとも免疫原的に
強い部分で、これを除去すると、Fab′上の抗原
決定基と反応しうる抗体をなお誘発するとして
も、免疫原性がより少ない分子、Fab′二量体が
得られる。Fab′二量体は完全免疫グロブリンIgG
に比較して免疫原性がずつと小さく、しかも半減
期が極めて短い利点を有し、従つて、薬物を所望
の部位に供給する役目を果たすと、有害な免疫原
性をほとんど発揮することなく、体内から迅速に
除去される格別に望ましい効果が得られる。 本発明によればダウノマイシンと、抗リンフオ
ーマ抗血清より分離された免疫グロブリンに由来
するFab′2量体との共有結合による複合物が調製
される。この複合物のインビトローでの細胞毒性
を調べてみた。 本発明の記載 化合物および試剤。ダウノマイシン塩酸塩は
Specia（Paris、France）よりセルビジン
（Cerubidine）として得られる。５−〔 3H〕ウリ
ジン（比活性25c／ｍＭ）および 125Iは
Radiochemical Center（Amerskam.England）
より販売されている。過ヨー素酸ナトリウムおよ
び水素化ホウ素ナトリウムはBDH（Poole、
England）より販売されている。Biogel Ｐ−60
はBio−Rad（Los Angeles、Calif.）より得られ
る。Porapak Ｑ、50−80メツシユはwaters
Associates（Boston、Mass.）より販売されてい
る。Sephadex Ｇ−200はPharmacia（Uppsala
Sweden）より得られる。 腫瘍細胞。本発明で用いる腫瘍細胞は
Moloneyウイルスで誘発されたマウスYacリンパ
腫細胞でＡ／Ｊマウスで植えつがれている
（Nat.Canc.３、547（1964））。 抗血清。完全フロインドアジユバンド中にエマ
ルジヨンとした２mgの牛血清アルブミン（BSA）
を１週間おいて２度うさぎの皮下に注射し牛血清
アルブミン（BSA）に対する抗血清を生成させ
る。兎（Fab）2に対する抗血清は同様に山羊にも
生成させる。Yac細胞に対する抗血清は、５日間
隔で５回108個の細胞を兎に静脈注射して調製す
る。これら抗血清の免疫グロブリン分画を調製す
るには、33％飽和硫安で沈殿させる。インビボー
で使用の抗腫瘍性IgGまたは（Fab′）2は、ひ臓、
胸腺、肝臓および赤血球の正常細胞に吸着させ
る。37度Ｃで30分かけて段階的に吸着を反復し、
正常のひ臓に対するインビトロー活性が残存しな
い状態に至らす。 ダウノマイシン活性。細胞RNA合成の阻害に
よりダウノマイシンの薬剤活性を測定する。 （Fab′）2の調製。37度Ｃで16時間、PH4.5の0.1
モル酢酸ナトリウム緩衝液中で、酸素と蛋白質と
の比率を１／50（重量／重量）として、20mg／ml
の濃度の免疫グロブリンをペプシンで消化する。
PH7.4として消化を中止させ、反応混合物をリン
酸緩衝塩溶液に対して十分に透析する。最後にセ
フアデツクスG200で分画して未消化の免疫グロ
ブリンを除き、（Fab′）2を得る。 やぎの抗−うさぎ（Fab′）2IgGのヨー素化。う
さぎ（Fab′）2に対する山羊の抗血清よりの免疫グ
ロブリン分画を、Int.Arc.Allergy、29、185
（1966）に記載のMc Conahey等の方法でヨー素
化する。調製物の比活性は１×108cpm／mg蛋白
となる。 （Fab′）2調製品に対するダウノマイシンの結
合。40mg／mlPBS（リン酸塩緩衝塩溶液）のダウ
ノマイシンを僅かにモル過剰の100ｍMNaIO4と
混合し、暗黒下に室温で１時間放置する。次い
で、グリセロール（1M）を最終濃度0.05Mまで
加え過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。得られた酸
化ダウノマイシン溶液を10mg／mlの濃度で0.15M
炭酸カリウム中PH9.5で室温において１時間１ml
の（Fab′）2と混合する。生成物にNaBH4を最終
濃度0.3mg／mlとなるよう加えて、37℃で１時間
還元し、次いで、バイオーゲルＰ−60（カラムサ
イズ48×１cm）で分画して（Fab′）2に結合したダ
ウノマイシンを得る。得られたダウノマイシン−
（Fab′）2複合体は共有結合化合物である。これは
次の事実から証明される。すなわち、水素化ホウ
素ナトリウム（NaBH4）による還元前の生成物
をPH５またはそれ以下の酸性溶液に対して透析す
ると、少なくともその60％が分解され、遊離のダ
ウノマイシンと（Fab′）2とに分かれてしまう。こ
のことからこの生成物はシツフ塩基結合であるこ
とがわかる。またNaBH4による還元後の生成物
は酸で分解を受けず、この結合が安定化されたこ
と、つまり、共有結合が形成されていることを示
す。 抗体活性の測定。抗−BSAよりの（Fab′）2の
抗体活性は、Biochem.Biophy.Acta、207、115
（1970）に記載のようにBSA−T4バクテリオフア
ージ系で測定する。抗Yac（Fab′）2は、それの
Yac腫瘍細胞への結合により測定する。コンプリ
メントを除去した胎盤牛血清（FCS）10％を含有
するミニマルエツセンシヤル培地（Mem）0.2c.c.
中でYac細胞（２×106）を、抗Yac血清に由来
する全IgGまたは（Fab′）2の種種の濃度とあわせ
て、シエーカー上で０度Ｃで１時間インキユベー
トする。このインキユベーシヨンの期間を経過し
たら細胞を遠心（1000×ｇ）しミニマルエツセン
シヤル培地で３度洗う。洗つたあと、細胞は、10
％FCSを補給した0.1c.c.の培地中に分散させ、そ
れぞれの試験管に山羊に生成させた抗−うさぎ
（Fab′）2の 125I−IgGを５mg／溶液c.c.の割合に添
加する。混合物は上記と同じ条件でインキユベー
トし、遠心し３回洗う。洗つたあと0.5c.c.のMem
中に細胞を分散させる。結合放射活性をオートガ
ンマーカウンター（Packard）中でカウントす
る。 抗−BSAおよび抗−Yac免疫グロブリンより
（Fab′）2の調製 抗−BSAおよび抗−Yac免疫グロブリンより
（Fab′）2の製造はつぎのようにする。抗−BASお
よび抗−Yacの硫安沈殿IgGを、上記のようにペ
プシン消化する。各消化物の試料を、Sephadex
Ｇ−200のカラム（27×２cm）に通す。全（未消
化）IgGを同じカラムに通して比較する。結果は
第１図のようである。（Fab′）2調製物の還元、つ
いでアルキル化でFab′単量体のみを与えること
は、同じフアデツクスＧ−200カラムで知りうる。
このことからペプシン消化は完全である。第１図
で、抗−Yac（Fab′）2は白丸（〇）で、抗−BSA
（Fab′）2は黒（●）で示してある。図はまた、全
IgG（Ｘ）に関する（Fab′）2のセフアデクツスＧ
−200（23×２cm）のゲル過を示す。 蛋白質に結合した薬剤の薬剤としての活性。ダ
ウノマイシン単独ならびにダウノマイシンの２種
の（Fab′）2との複合物、すなわちダウノマイシン
−抗BSA（Fab′）2およびダウノマイシン−抗Yac
（Fab′）2の薬理作用をYac細胞を用いて〔 3H〕
ウリジンの取込み阻害率を指標として測定した。
Yac細胞104／0.1ml／ウエルを上記３種の薬剤と
２時間インキユベートした。次いで、〔 3H〕ウ
リジン1μCiも加え、さらに２時間インキユベー
シヨンを続けた。洗浄によりインキベーシヨンを
終了し、サンプルを取り生し、細胞に取込まれた
放射能を測定した。結果を表１に記載する。表１
から明らかなごとく、ダウノマイシンが
（Fab′）2に共有結合してもダウノマイシンの活性
は何ら失われていないことがわかる。 ダウノマイシン−置換（Fab′）2の抗体活性。ダ
ウノマイシン置換（Fab′）2の抗体活性を第２図に
示す、第２図は、Haimovick等が、Biochim.
Biophys.Acta、207巻、115から124頁、1970に記
載した方法に従い、BSA−T4バクテリオフアー
ジの不活化パーセントとして測定した、（Fab′）2
抗−BSAの抗体活性を示す。第２図から分かる
ように、未置換（Fab′）2に比して、複合物の抗体
活性はほとんど減少しない。抗体活性は、置換度
の低いもの（4M／Ｍ）にも、高いもの（14M／
Ｍ）にも保留される。第２図において、抗−
BSA（Fab′）2は（●）で、ダウノマイシン−抗−
BSA（Fab′）215M／Ｍは（△）で、ダウノマイシ
ン−抗−BSA（Fab′）24M／Ｍは（〇）で示され
る。 標的細胞への結合活性により測定される、抗−
Yacよりの（Fab′）2の活性を第３図に示す。山羊
のヨー素化された抗−うさぎ（Fab′）2への結合に
より測定した、ダウノマイシン−（Fab′）2の抗体
活性は、全IgGまたは非置換（Fab′）2に比して23
から27％減少する。しかし、著量（70％以上）結
合力は保持される。全IgGに比しての、細飽に対
する（Fab′）2結合性の減少がこのように観察され
たのは、調製操作に由来するのであろう。第３図
で、Yacに対しての、抗−Yac IgGの結合は
（〇）で、（Fab′）2のそれは（×）で、ダウノマイ
シン（Fab′）2のそれは（△）で示す。測定は、山
羊の 125Iラベル抗−うさぎ（Fab′）2を用いる２重
結合法で実施したものである。 ダウノマイシン−抗−Yac（Fab′）2複合物の特
異的細胞毒性。関係のない抗体つまり抗−BSA
（Fab′）2にダウノマイシンを結合さすよりも特異
的抗−Yac（Fab′）2に結合さす方が有利なことを、
薬剤結合（Fab′）2分画または遊離薬剤に対し腫瘍
細胞を５分間だけさらす方法によりインビトロー
で試験してみた。つぎに細胞を洗つて、細胞に結
合していない反応剤を除き、細胞と接触した状態
に留まつているダウノマイシンの毒性を〔 3H〕
ウリジン取込みの阻害により評価する。結果（第
２表）から分るように、ダウノマイシン−抗−
Yacは、抗−BSAの関係のない（Fab′）2または
薬剤のみの２倍の活性を示すことが分る。
【表】
【表】
本発明に準じFab′2量体に共有的に結合させた
他の型の薬剤でも類似の結果が得られる。 明らかに抗−腫瘍薬剤に結合したFab′2量体
は、ある型の腫瘍に対して強化されそして改良さ
れた活性を示し、腫瘍部位に濃縮される。それ
で、本発明の新規組成物は、種種の型の腫瘍の治
療に有用である。
他の型の薬剤でも類似の結果が得られる。 明らかに抗−腫瘍薬剤に結合したFab′2量体
は、ある型の腫瘍に対して強化されそして改良さ
れた活性を示し、腫瘍部位に濃縮される。それ
で、本発明の新規組成物は、種種の型の腫瘍の治
療に有用である。
第１図は、抗−Yac（Fab′）2（〇）および抗−
BSA（Fab′）（〇）を、全IgG（×）に比して、セ
フアデツクスＧ−200（23×２cm）でゲル過した
時の（Fab′）2分画である。第２図は、抗−BSA
（Fab′）（〇）、ダウノマイシン−抗−BSA
（Fab′）214M／Ｍ（△）、ダウノマイシン−抗−
BSA（Fab′）24M／Ｍ（〇）について、BSA−バク
テリフアージT4不活化で測定した、抗−BSA
（Fab′）2抗体活性に対する薬剤結合の効果を示す。
第３図は、抗−Yac IgG（〇）、（Fab′）2（×）お
よびダウノマイシン−抗−（Fab′）2（△）のYac細
胞への結合を、山羊の 125I抗−うさぎ（Fab′）2を
用いるダブル結合技術により測定した、抗−腫瘍
（Fab′）2抗体活性におよぼす薬剤結合の影響を示
す。
BSA（Fab′）（〇）を、全IgG（×）に比して、セ
フアデツクスＧ−200（23×２cm）でゲル過した
時の（Fab′）2分画である。第２図は、抗−BSA
（Fab′）（〇）、ダウノマイシン−抗−BSA
（Fab′）214M／Ｍ（△）、ダウノマイシン−抗−
BSA（Fab′）24M／Ｍ（〇）について、BSA−バク
テリフアージT4不活化で測定した、抗−BSA
（Fab′）2抗体活性に対する薬剤結合の効果を示す。
第３図は、抗−Yac IgG（〇）、（Fab′）2（×）お
よびダウノマイシン−抗−（Fab′）2（△）のYac細
胞への結合を、山羊の 125I抗−うさぎ（Fab′）2を
用いるダブル結合技術により測定した、抗−腫瘍
（Fab′）2抗体活性におよぼす薬剤結合の影響を示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 腫瘍細胞に対する抗血清の免疫グロブリン分
画をペプシンで消化し、PH7.4に中和してこの消
化を停止せしめ、リン酸塩で緩衝した塩溶液で透
析して（Fab′）2を得、この（Fab′）2に過ヨウ素酸
ナトリウムで酸化した、ダウノマイシンを加えて
（Fab′）2の遊離アミノ基と反応せしめ、シツフ塩
基を形成させ、さらに水素化ホウ素ナトリウムで
還元してこの結合を安定させ、次いでゲル濾過ク
ロマトグラフイーで分離することにより得られる
ダウノマイシンが共有結合した抗腫瘍免疫グロブ
リンの（Fab′）2である新規複合体。 ２ （Fab′）2が抗Yac抗体に由来する特許請求の
範囲第１項に記載の複合体。 ３ （Fab′）2が抗リンパ腫抗血清に由来する特許
請求の範囲第１項に記載の複合体。 ４ 腫瘍細胞に対する抗血清の免疫グロブリン分
画をペプシンで消化し、PH7.4に中和してこの消
化を停止せしめ、リン酸塩で緩衝した塩溶液で透
析して（Fab′）2を得、この（Fab′）2に過ヨウ素酸
ナトリウムで酸化した、ダウノマイシンを加えて
（Fab′）2の遊離アミノ基と反応せしめ、シツフ塩
基を形成させ、さらに水素化ホウ素ナトリウムで
還元してこの結合を安定させ、次いでゲル濾過ク
ロマトグラフイーで分離することにより得られる
ダウノマイシンが共有結合した抗腫瘍免疫グロブ
リンの（Fab′）2である新規複合体を活性成分とし
て含有する抗癌組成物。 ５ 腫瘍細胞に対する抗血清の免疫グロブリン分
画をペプシンで消化し、PH7.4に中和してこの消
化を停止せしめ、リン酸塩で緩衝した塩溶液で透
析して（Fab′）2を得、この（Fab′）2に過ヨウ素酸
ナトリウムで酸化した、ダウノマイシンを加えて
（Fab′）2の遊離アミノ基と反応せしめ、シツフ塩
基を形成させ、さらに水素化ホウ素ナトリウムで
還元してこの結合を安定させ、次いでゲル濾過ク
ロマトグラフイーで分離することを特徴とするダ
ウノマイシンが共有結合した抗腫瘍免疫グロブリ
ンの（Fab′）2である新規複合体の製造方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL47372A IL47372A (en) | 1975-05-27 | 1975-05-27 | Fab'dimers bound to daunomycin or adriamycin,their preparation and pharmaceutical compositions containing same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS51144723A JPS51144723A (en) | 1976-12-13 |
| JPH0133448B2 true JPH0133448B2 (ja) | 1989-07-13 |
Family
ID=11048252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51061030A Granted JPS51144723A (en) | 1975-05-27 | 1976-05-26 | Antiitumor agent |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPS51144723A (ja) |
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| CA (1) | CA1064826A (ja) |
| CH (1) | CH619614A5 (ja) |
| DE (1) | DE2623736A1 (ja) |
| FR (1) | FR2312259A1 (ja) |
| GB (1) | GB1523980A (ja) |
| IL (1) | IL47372A (ja) |
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| ZA (1) | ZA762966B (ja) |
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| JPS5665829A (en) * | 1979-11-02 | 1981-06-03 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Antitumor agent |
| US4315851A (en) * | 1978-12-29 | 1982-02-16 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition having antitumor activity |
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| JPS57106625A (en) * | 1980-12-22 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | Cytotoxic protein complex and its preparation |
| JPS57106626A (en) * | 1980-12-22 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | Cytotoxic protein complex and its preparation |
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| FR2591895B1 (fr) * | 1985-12-20 | 1988-08-26 | Sanofi Sa | Immunotoxines a longue duree d'action in vivo comportant la chaine a de ricine modifiee sur ses motifs polysaccharidiques |
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