JPH0134240B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 発明の分野 本発明は、生物学的活性を有するカルシトニン
及び生物学的に活性なカルシトニンに転化可能な
ペプチド並びに斯かるペプチド及びカルシトニン
を調製する方法に関する。 発明の背景 全ての既知天然カルシトニンペプチドは、32個
のアミノ酸の連鎖を含有する。例えばサケカルシ
トニンは下記の式を有する。 米国特許第3926938号、同第4062815号、同第
3929758号、同第4033940号及び同第4217268号は、
上記のサケカルシトニンを含むカルシトニン類の
改善された合成法を開示している。 天然カルシトニンにはサケカルシトニン、ウ
シ、ブタ、ヒツジ及びウナギのカルシトニン並び
にヒトカルシトニンがある。これらは全て第３番
位置にアスパラギンを有する。 発明の概略 本発明者等は、既知の同型のカルシトニンより
も生物学的活性が大なる31アミノ酸の合成カルシ
トニンペプチドを発見した。著るしい構造の違い
は、本発明者等の新規ペプチドのアミノ酸連鎖に
は、既知のカルシトニンアミノ酸連鎖の第３番位
置にアスパラギン残基が含有されていないことで
ある。ペプチド類の合成的変性に関するIUPAC
―IUB命名法を用いて、この新規ペプチドをデス
―X³（des―X³）カルシトニン（但しＸはアスパ
ラギン）と称する。〔Biochem―Biophys.Acta，
133，１―５（1967）〕この新規ペプチドは既知の
カルシトニンと較べて良好な効力と品質を有す
る。 【発明の詳細な説明】 一般に、本発明者等は固相型の合成法を使用
し、ベンズヒドリルアミン樹脂（BHA樹脂）と
称される樹脂から出発する。この樹脂は、スチレ
ンとジビニルベンゼンとの共重合により製造され
る架橋ポリスチレンビーズ樹脂から誘導される。
この型の樹脂は既知であり、その製法はピエツタ
等が詳細に示している。〔Pietta，P.S.及び
Marshall，G.R.，Chem―Commun.，650
（1970）〕この架橋ポリスチレンBHA樹脂は化学
品供給業者から入手可能である。このBHA樹脂
を表わすのに以下の式を用いる。 式中は樹脂のポリスチレン部分である。 本合成では、樹脂上に全ペプチド連鎖が形成さ
れるまで、不溶性樹脂に１時期に１個のアミノ酸
を添加する。アミノ酸官能基はブロツキング基で
保護される。アミノ酸のα―アミノ基は、３級ブ
チルオキシカルボニル基又はその均等物で保護さ
れる。このα―３級ブチルオキシカルボニル基を
BOCと称する。セリンとトレオニンの水酸基は
ベンジル基又はベンジル誘導基例えば４―メトキ
シベンジル、４―メチルベンジル、３，４―ジメ
チルベンジル、４―クロルベンジル、２，６―ジ
クロルベンジル、４―ニトロベンジル、ベンズヒ
ドリル又はそれらの均等物により保護される。ベ
ンジル又はベンジル誘導基を表わすためにBZな
る用語を用いる。 チロシンの水酸基は未保護のまゝであるか、又
は前にBZ基と記したベンジル若しくはベンジル
誘導基で保護され、或いはベンジルオキシカルボ
ニル若しくはベンジルオキシカルボニル誘導体、
例えば２―クロルベンジルオキシカルボニル若し
くは２―ブロムベンジルオキシカルボニル基又は
それらの均等物にて保護される。保護基なし、
BZ基、ベンジルオキシカルボニル基又はベンジ
ルオキシカルボニル誘導基を表わすのに用語Ｗを
用いる。 システインのチオール基は、前記のBZで表わ
されるベンジル又はベンジル保護基、又はｎ―ア
ルキルチオ基例えばメチルチオ、エチルチオ、ｎ
―プロピルチオ、ｎ―ブチルチオ若しくはそれら
の均等物にて保護される。ｎ―アルキルチオ基又
はBZを表わすために記号R₂をR₂がｎ―アルキル
チオである場合のBZ及びR₂がBZである場合のｎ
―アルキルチオを表わすために記号R₁を用いる。
その他、R₁は別のシステイン基であつてもよく、
この場合R₂はBZである。アルギニンのグアニジ
ン基は、ニトロ基、トシル基又はそれらの均等物
にて保護される。ニトロ基又はトシル基を表わす
ために記号Ｔを使用する。リジンのε―アミノ基
はベンジルオキシカルボニル基又は２―クロルベ
ンジルオキシカルボニル、３，４―ジメチルベン
ジルオキシカルボニル等ベンジルオキシカルボニ
ル誘導体若しくはそれらの均等物により保護され
る。ベンジルオキシカルボニル基、又はベンジル
オキシカルボニル誘導基を表わすために記号Ｖを
用いる。ヒスチジンのイミダゾール窒素上に用い
られる保護基は、リジン用として前記しＶと命名
したようなベンジルオキシカルボニル基及びベン
ジルオキシカルボニル誘導体である。グルタミン
酸のγ―カルボン酸基は、セリン及びトレオニン
の水酸基の保護用として説明したようなベンジル
又はベンジル誘導基により保護される。これらの
保護基は記号BZで表わされる。 既知のサケカルシトニンと同種の活性を有する
本発明者等の新規デス―Asn³―サケカルシトニ
ンの式は、以下の様に記載される。 上記の式からわかるように、31個のアミノ酸が
関与しており、本式での位置は一般に認められて
いる方法に従つて番号付けされている。すなわ
ち、鎖の一端上のCYSの位置１で始まり、連鎖
から失せたアスパラギンの位置３は省略し、鎖の
他端の位位置32PROで終つている。説明をわか
りやすくたるため、合成のサイクルに関してもこ
れと同じ番号付与体系に従う。アミノ酸の組立
は、プロリンのカツプリングに関するサイクル32
から始まり、トレオニンのカツプリングに関する
サイクル31に続き、以下同様である。 31合成サイクルの各々に使用される好適アミノ
酸反応物を以下の表に記載する。 【表】 【表】 表に指摘した各アミノ酸誘導体は市販され
る。 サイクル 32 BHA樹脂へのプロリンのカツプリング 樹脂ペプチド合成の全工程に用いられる反応器
は、頂部に原料添加用入口を備え、可溶性反応混
合物及び洗浄溶剤を過・除去するための焼結ガ
ラス板を底部に備えたガラス容器である。過
は、真空又は窒素圧使用のいずれかにより行なわ
れる。容器内容物は、容器全体の振とう又は機械
的撹拌装置にて撹拌される。 サイクル32では、BHA樹脂を反応器内に配置
し、塩化メチレン、クロロホルム、ジメチルホル
ムアミド、ベンゼン又はそれらの均等物等の溶剤
中に、樹脂グラム当り溶剤約３乃至12mlの割合で
溶剤中に懸濁させる。これに、使用BHA樹脂の
遊離アミン当量当り約１乃至６当量のBOC―Ｌ
―プロリンを添加する。５乃至10分間撹拌後、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（DCC）等のカ
ツプリング剤（CA）又はその他のジイミドカツ
プリング剤が使用される。ジイミドカツプリング
剤の使用量は使用BOC―Ｌ―プロリン当量当り
0.5乃至2.0当量である。 BOC―Ｌ―プロリンは、その活性エステル誘
導体、そのアジド誘導体、その対称的無水物誘導
体又は適当に選択された無水物誘導体を使用した
場合には、カツプリング剤無しでもカツプリング
する。使用可能な活性エステル誘導体は、２―ニ
トロフエニルエステル、４―ニトロフエニルエス
テル、ペンタフルオルフエニルエステル、Ｎ―ヒ
ドロキシこはく酸イミドエステル又はそれらの均
等物である。活性エステルの使用量は、BHA樹
脂の遊離アミン等量当り１乃至10当量である。 BHA樹脂、溶剤、BOC―Ｌ―プロリン及びカ
ツプリング剤又はBOC―Ｌ―プロリン活性エス
テルからなる反応混合物を、試験試料のニンヒド
リン試験〔イー・カイザー（E.Kaiser）等、
Anal.Biochem.，34，595―８（1970）〕が反応の
完了を示すまで機械的に撹拌又は振とうする。カ
ツプリング反応完了後、塩化メチレン、クロロホ
ルム、メチルアルコール、ベンゼン、ジメチルホ
ルムアミド又は酢酸等の溶剤でBOC―Ｌ―プロ
リン樹脂を洗浄する。洗浄溶剤量は、最初に使用
したBHA樹脂各グラム当り５乃至20mlの溶剤が
適当である。完了前にカツプリング反応を停止し
たい場合には洗浄法が使用され、BOC―Ｌ―プ
ロリン樹脂上の残存遊離アミノ基は、過剰のアセ
チル化剤にてアセチル化することにより更なる反
応から保護される。アセチル化は、BOC―Ｌ―
プロリン樹脂をアセチル化剤溶液と共に0.5乃至
12時間の間撹拌することによりなされる。Ｎ―ア
セチルイミダゾール／塩化メチレン溶液又は無水
酢酸とトリエチルアミン／クロロホルム混合物等
のアセチル化剤が使用される。アセチル化剤の使
用量は、出発BHA樹脂の遊離アミンタイターの
当量当り0.5乃至5.0当量である。 BOC―Ｌ―プロリン樹脂を製造するためのカ
ツプリング反応は、次式にて記述される。 BOC―Ｌ―プロリン樹脂の保護基除去 前記のように調製されたBOC―Ｌ―プロリン
樹脂を、前記したような溶剤で洗浄し、それを塩
化メチレン、クロロホルム、ベンゼン又はそれら
の均等物等の溶剤とトリフルオル酢酸（TFA）
の混合物等の試薬と共に撹拌して保護基を除去す
る。溶剤中のTFA量は、混合物の10％から100％
まで変化する。TFA―溶剤混合物の量は最初に
用いたBHA樹脂グラム当り、３乃至20mlの範囲
で変化する。反応時間は約10分乃至４時間であ
る。保護基除去工程は、TFA―溶剤混合物を
過・除去することにより停止される。残留TFA
は、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン又は
それらの均等物等の溶剤にトリエチルアミンを５
乃至30％溶解させた溶液を、BHA樹脂グラム当
り、３乃至20ml用いて洗浄することによりＬ―プ
ロリン樹脂から除去される。トリエチルアミンの
代りにその他の３級又は２級有機アミン、例えば
トリメチルアミン、Ｎ―エチルピペリジン、ジイ
ソプロピルアミン又はそれらの均等物を使用する
こともできる。Ｌ―プロリン樹脂の遊離アミンの
タイターは、ドーマン（Dorman）滴定法（ドー
マン、エル、シー、Tetrahedron Letters，
1969，2319―21）で測定される。保護基除去反応
は、次式にて記述される。 サイクル 31 サイクル32の結果として得られたプロリル
BHA樹脂をカツプリング溶剤に懸濁し、BOC―
Ｏ―BZ―Ｌトレオニン誘導体を添加して混合物
を同様に平衡状態に至らしめる。カツプリング剤
のDCCを添加し、ニンヒドリン試験が反応完結
を示したあと、反応混合物を過によりBOC―
Ｏ―BZトレオニルプロリルBHA樹脂から分離す
る。このペプチド樹脂を溶剤で洗浄する。反応物
と溶剤の量並びに反応時間は、サイクル32に記載
されたものと同様である。サイクル32に記載した
保護基除去法により、BOC基をこのペプチド樹
脂から除去する。続いて得られたＯ―BZ―トレ
オニルプロリルBHA樹脂はサイクル30用に供さ
れる。サイクル31の諸反応は、次式にて示され
る。 便宜上、この生成樹脂ペプチドを以下のような
略記表示を用いて記す。 サイクル 30 サイクル30では、BOC―Ｏ―BZ―トレオニン
の代りにBOC―グリシンを用いる点を除き、サ
イクル31と同様な方法でカツプリング反応及び保
護基除去反応を行なう。カツプリング反応及び保
護基反応は以下のように記される。 サイクル 29 サイクル29では、アミノ酸誘導体をBOC―Ｏ
―BZ―Ｌ―セリンに置き換える以外は、カツプ
リング及び保護基除去反応はサイクル31と同様に
なされる。これは以下のように記される。 サイクル 28 サイクル28では、アミノ酸反応物をBOC―グ
リシンに置き換える以外は、カツプリング及び保
護基反応はサイクル31に記載のようになされる。
これらのカツプリング及び保護基除去反応は以下
のように記される。 サイクル 27 本サイクルのカツプリング及び保護基除去反応
は、サイクル31と同じアミノ酸反応物を用いて行
なわれ、下記化合物が得られる。 サイクル 26 サイクル26でのカツプリング反応は、BOC―
Ｌ―アスパラギンの活性エステル誘導体を用いて
なされる。活性エステル法は、DCCカツプリン
グ剤の代りにBOC―アスパラギン又はBOC―グ
ルタミンと共に使用される。反応は、BOC―Ｌ
―アスパラギンの活性エステル誘導体を、BHA
樹脂の遊離アミン当量当り２乃至10当量使用し、
ジメチルホルムアミド、ジメチルホルムアミドと
ベンゼン、塩化メチレン又はクロロホルムの混合
物又はそれらの均等物との混合物中、最初に使用
したBHA樹脂グラム当り２乃至20mlの溶剤量に
て行なわれる。 反応時間は１乃至72時間の範囲である。反応混
合物は、ニンヒドリン試験で反応完了が示された
あと、BOCペプチド樹脂から過・除去される。
使用される活性エステル誘導体は、２―ニトロフ
エニルエステル、４―ニトロフエニルエステル、
ペンタフルオルフエニル又はそれらの均等物であ
る。誘導体の活性エステル部をAEと記す。カツ
プリング反応は以下のように記される。 BOC基を除去するための保護基除去反応は、
サイクル32と同様になされる。 サイクル 25−21 サイクル25乃至21の各サイクルでは、方法及び
反応物の割合はサイクル31と同様にし、サイクル
25ではBOC―BZ―Ｌ―トレオニンを、サイクル
24ではBOC―ω―Ｔ―Ｌ―アルギニンを、サイ
クル23ではBOC―Ｌ―プロリンを、サイクル22
ではBOC―Ｗ―Ｌ―チロシンを、サイクル21で
はBOC―Ｏ―BZ―Ｌ―トレオニンを用いて行な
われる。サイクル完了後に得られる化合物は以下
のように記される。 サイクル 20 サイクル20では、アミノ酸誘導体としてBOC
―Ｌ―グルタミン活性エステル誘導体を用い、サ
イクル26と同様の方法及び反応物割合を用いてカ
ツプリング及び保護基除去反応を行なう。生成化
合物は下記の通りである。 サイクル 19 サイクル19では、アミノ酸誘導体としてBOC
―Ｌ―ロイシンを使用し、サイクル31と同様に反
応を行なつた。サイクル19の生成化合物は以下の
通りである。 サイクル 18 サイクル18では、BOC―ε―Ｖ―Ｌ―リジン
なるアミノ酸誘導体を使用する、その他の点では
サイクル18の方法はサイクル31と同様になされ、
下記の生成物が得られる。 サイクル 17―15 サイクル17乃至15は、サイクル17ではBOC―
Ｎ（im）―Ｖ―Ｌ―ヒスチジンを、サイクル16で
は反応物としてBOC―Ｌ―ロイシンを、サイク
ル15では反応物としてBOC―Ｌ―グルタミン酸
BZエステル（BZはセリン及びトレオニンに対し
表わしたものと同じ基を表わす）を使用する以外
は、サイクル31と同様になされ、サイクル15から
下記化合物を得る。 サイクル 14―８ サイクル14は、アミノ酸誘導体としてBOC―
Ｌ―グルタミン―AEを用い、サイクル20と同様
になされる。サイクル13乃至８は、サイクル13で
はBOC―Ｏ―BZ―Ｌ―セリンを、サイクル12で
はBOC―Ｌ―ロイシンを、サイクル11ではBOC
―ε―Ｖ―Ｌ―リジンを、サイクル10ではBOC
―グリシンを、サイクル９ではBOC―Ｌ―ロイ
シンを、サイクル８ではBOC―Ｌ―バリンを用
いることを除きサイクル31と同様になされ、下記
の化合物が得られる。 サイクル ７ サイクル７は、BOC―Ｓ―Ｌ―システイン又
はアミノ酸誘導体均等物を用いる点を除き、サイ
クル31と同様になされる。サイクル７の結果得ら
れる化合物に次式により記される。 式中R₂はアルキルチオ又はBZ基である。 サイクル６―４及び２ サイクル６乃至４は、アミノ誘導体としてサイ
クル６ではBOC―Ｏ―BZ―Ｌ―トレオニンを、
サイクル５ではBOC―BZ―Ｌ―セリンを、サイ
クル４ではBOC―Ｌ―ロイシンを、サイクル２
ではBOC―BL―Ｌセリンを使用したことを除き
サイクル31と同様になされる。サイクル２から得
られる化合物は次式の通りである。 サイクル １ このサイクルは、BOC―Ｓ―Ｒ―Ｌ―システ
イン誘導体を用いてサイクル７と同様になされ
る。システインに対して選択されるＲグループ
は、サイクル７で用いられるものと同一又は相異
なるものである。例えば、サイクル７に対して選
択される誘導体がBOC―Ｓ―エチルチオ―Ｌ―
システインであるならば、サイクル１の誘導体は
BOC―Ｓ―４―メトキシベンジル―４―システ
インであり、サイクル７としてBOC―Ｓ―４―
メトキシベンジル―Ｌ―メトキシベンジル―Ｌ―
システインが選択されたならば、この誘導体はサ
イクル１にも使用される。サイクル１から得られ
る化合物は次式により示される。 但し式中R₁はＳ―ｎ―アルキル、CYS又はBZ
であり、R₂はＳ―ｎ―アルキル又はBZであり、
R₁はR₂がBZならばＳ―ｎ―アルキルであり、R₂
はＲがＳ―ｎ―アルキル又はCYSならばBZであ
る。 サイクル１は樹脂ペプチドの完了を表わし、樹
脂ペプチドは反応器から除去され、真空で乾燥さ
れる。樹脂ペプチドの重量は、合成に最初使用さ
れたBHA樹脂重量の2.0乃至4.0倍であると期待さ
れる。 樹脂ペプチド開裂 ペプチドは、サイクル１から得られる樹脂ペプ
チドから液状フツ化水素（HF）で処理して開裂
される。HF開裂は、樹脂ペプチドとアニソール
（樹脂ペプチド各グラム当り0.5乃至５ml）の混合
物を液体HF（樹脂ペプチド各グラム当り２乃至
20ml）にて−20℃乃至＋15℃で0.5乃至20時間処
理してなされる。反応後過剰のHFを蒸発して除
去し、残りのペプチドと樹脂ビーズの混合物を酢
酸エチル、ジエチルエーテル、ベンゼン又は類似
物等の有機溶剤で抽出してアニソールとHF残分
を除去する。ペプチドは、酢酸水溶液中に抽出す
ることにより、樹脂ビーズから分離される。この
段階のペプチドは環状でなく、分子中の第１位置
と第７位置のシステイン間に環状ジスルフイド結
合を有さぬ非環状生成物である。 HF処理は、第１位置又は第７位置のシステイ
ン残基のチオール基上のＳ―アルキルチオブロツ
キング基を除いて、全てのブロツキング基をペプ
チドから除去する。Ｓ―ｎ―アルキルチオ―Ｌ―
システイン残基はHF開裂操作に対し安定であ
り、開裂及び抽出操作中ずつとそのまゝである。
Ｓ―BZ―Ｌ―システインはHFで開裂され、遊離
チオール基を有するシステイン残基を与える。本
発明者等の合成では、第１位置及び第７位置に両
タイプのブロツキング基を互いに組合せて使用し
た。 斯くて、HF開裂後に得られるペプチドは、樹
脂ペプチド合成時に使用されたシステイン誘導体
のチオール基に対し選択されるブロツキング基に
応じ、３タイプの一つである。 樹脂ペプチド合成サイクル１でBOC―Ｓ―BZ
―Ｌ―システイン誘導体が使用され、サイクル７
でBOC―Ｓ―ｎ―アルキルチオ―Ｌ―システイ
ンが使用されたならば、HF開裂後に得られるペ
プチドはタイプとなり、第１位置に遊離チオー
ル基を有し、且つ第７位置のシステイン残基上に
Ｓ―ｎ―アルキルチオ基を有するであろう。本発
明者等はこれをタイプペプチドを称し、次式の
ように表わされる。 逆に、サイクル１でBOC―Ｓ―ｎ―アルキル
チオ―Ｌ―システイン誘導体を使用し、第７位置
でBOC―Ｓ―BZ―Ｌ―システインを使用したな
らば、開裂から得られるペプチドはタイプとな
り、次式にて表わされるであろう。 第１位置の保護基Ｓ―ｎ―アルキルの代りに、
本発明者等はシステイン基を使用するが（このシ
ステイン基はこの位置でシステインと共にシスチ
ン基を形成する）、この場合第７位置のシステイ
ンを保護するためにBZ基を用いる。サイクル１
の反応物としてビス―BOC―Ｌ―システインを
使用し、サイクル７の反応物としてBOC―Ｓ―
BZ―Ｌ―システインを使用したならば、開裂か
ら得られるペプチドはタイプとなり、次式にて
表わされる。 第１位置、第７位置共にBOC―BZ―Ｌ―シス
テインを反応物として使用したならば、開裂から
得られるペプチドはタイプとなり、次式にて表
わされる。 Ｈ―CYS―SER―LEU―SER―THR―CYS―
VAL―LEU―GLY―LYS―LEU―SER―GLN
―GLU―LEU―HIS―LYS―LEU―GLN―
THR―TYR―PRO―ARG―THR―ASN―
THR―GLY―SER―GLY―THR―PRO―NH₂ タイプ，及びペプチドの環状ジスルフイ
ドペプチドへの転化は、HF開裂からの粗ペプチ
ドの酢酸水溶液を蒸留水で、最終容積が開裂され
る樹脂ペプチドグラム当り50乃至200mlとなるま
で稀釈することによりなされる。この溶液のPHは
水酸化アンモニウム溶液の添加により５乃至10に
調整され、混合物は窒素等の不活性ガス流下、密
封容器内で約２乃至48時間撹拌される。反応は、
オフガス流がｎ―アルキルメルカプタンを含有し
なくなる時点で停止可能である。氷酢酸を添加し
て反応混合物のPHを約3.5乃至5.5に低下させる。 タイプペプチドの環状ジスルフイドペプチド
への転化は、ペプチドを酸化して環内に第１位置
と第７位置のシステインを含むような環構造にす
る既知の古典的方法によりなされる。 中間体ペプチドがタイプ，，又はのい
ずれかであると、第３位置のアスパラギンが省略
されている点を除き、任意の既知カルシトニンに
対応するアミノ酸鎖のペプチドを合成でき、この
ようにして合成されたペプチドを精製すると、こ
の既知のカルシトニンと同タイプの生物学的活性
を有することが判明した。斯く合成されるカルシ
トニンをデス―Asn³―カルシトニンと命名する。
これはIUPAC―IUB命名法に従うものである。 粗デスAsn³―SCTの精製 前述の合成によるPH5.0の粗ペプチド溶液を、
イオン交換樹脂法を用いて濃縮する。この濃縮物
を、ゲル―過法とイオン交換クロマトグラフ法
を組合せた方法で精製する。最終精製物は、溶液
から凍結乾燥法によりふわふわの白色固体として
得られる。この生成物のアミノ酸分析結果は、所
望ペプチドに正確に一致する。 以下は、ペプチド調製の特定例である。 実施例 １ 樹脂の活性化 アミンタイター0.61ミリ当量／ｇのBHA樹脂
（５ｇ）を、シユバルツ・マン社（Shwarz―
Man，Inc.ニユヨーク州オレンジバーグ）製のペ
プチド合成装置の反応容器内に配置した。この樹
脂を以下の溶剤25mlで処理し、各処理後に過し
た。 クロロホルム２分間処理を２回、 10％トリエチルアミン／クロロホルム５分間処
理を２回 クロロホルム２分間処理 塩化メチレン２分間処理を３回 サイクル 32 カツプリング：該BHA樹脂、塩化メチレン25
ml及びBOC―Ｌ―プロリン2.58ｇ（0.012モル）
を10分間撹拌した。ジシクロヘキシンカルボジイ
ミドの塩化メチレン溶液12.0ml（溶液１ml当り
DCCI1ミリ当量）を反応器に添加し、混合物を６
時間撹拌した。反応混合物を過して反応器から
除去し、BOC―プロリルBHA樹脂を以下の溶剤
で継続的に洗浄し（25ml、２分間）洗液を各回
過・除去した。 塩化メチレン ２回 メチルアルコール ２回 塩化メチレン ３回 アセチル化：次に該樹脂をトリエチルアミン
（TEA）1.5ml、無水酢酸１ml及びクロロホルム
25mlの混合物と共に２時間撹拌した。反応混合物
を過・除去し、該樹脂を以下の洗浄（２分間、
25ml）に付した。 クロロホルム ２回 メチルアルコール ２回 塩化メチレン ３回 保護基除去：BOC保護樹脂を、トリフルオル
酢酸（TFA）15mlと塩化メチレン15mlの混合物
と共に５分間撹拌した。この混合物を過・除去
し、樹脂を、TFA15mlと塩化メチレン15mlの第
２の混合物と共に30分間撹拌した。反応混合物を
過・除去し、樹脂を以下の洗浄（25ml）に付し
た。 塩化メチレン２回、各２分間 メチルアルコール２回、各２分間 クロロホルム２回、各２分間 10％TEA／クロロホルム２回、各10分間 クロロホルム２回、各２分間 塩化メチレン２回、各２分間 Ｌ―プロリンBHA樹脂を滴定してアミン又は
プロリンのタイターを測定した。この値は、樹脂
グラム当りアミン又はプロリン0.55ミリ当量であ
つた。 サイクル 31： カツプリング：該Ｌ―プロリル樹脂、塩化メチ
レン25ml及びBOC―Ｏ―ベンジル―Ｌ―トレオ
ニン3.4ｇ（0.011モル）を10分間撹拌した。次に
ジシクロヘキシルカルボジイミドの塩化メチレン
溶液（溶液１ml当りDCCI1ミリ当量）11.0ml
（DCCI全0.011モル）を反応器に添加し、混合物
を２時間撹拌した。反応混合物を反応器から除去
し、樹脂を下記溶剤25mlで２分間継続的に洗浄
し、各回毎に洗液を過・除去した。 塩化メチレン ２回 メチルアルコール ２回 塩化メチレン ３回 ニンヒドリン試験は陰性であつた。 保護基除去：このサイクルに対しても、サイク
ル32に記載の保護基除去方法を繰返した。 サイクル 30乃至27 これらのサイクルで用いたカツプリング及び保
護基除去法は、トレオニン誘導体の代りに下記ア
ミノ酸誘導体を使用した点を除き、サイクル31と
同様であつた。 サイクル30…BOCグリシン1.92ｇ（0.011モル） サイクル29…BOC―Ｏ―ベンジル―Ｌ―セリ
ン3.25ｇ（0.011モル） サイクル28…サイクル30と同じ反応物を使用 サイクル27…サイクル31と同じ反応物を使用 サイクル 26 カツプリング：サイクル27から得られたペプチ
ド樹脂をジメチルホルムアミド（DMF）各25ml
で２回洗浄した。次に該樹脂をDMF35ml中BOC
―Ｌ―アスパラギンｐ―ニトロフエニルエステル
5.82ｇ（0.0165モル）の溶液と共に24時間撹拌し
た。反応混合物を過し、樹脂ペプチドを下記溶
剤各25mlで継続的に２回、２分間洗浄した。
DMF、塩化メチレン・メタノール、塩化メチレ
ン。各溶剤は過・除去され、ニンヒドリン試験
は陰性であつた。 保護基除去：サイクル32で用いた保護基除去法
を繰返した。 サイクル 25 カツプリング及び保護基除去は、サイクル31と
同じ反応物を同量用いて同様な方法で行なわれ
た。 サイクル 24 カツプリング：サイクル25から得られた樹脂ペ
プチドをDMF各25mlで２回継続して洗浄した。
次にこの樹脂ペプチドをBOC―Ｎ―ｙ―トシル
―Ｌ―アルギニン7.06mg（0.0165モル）とDMF25
mlの混合物と共に10分間撹拌した。続いて塩化メ
チレンに溶かしたDCCI16.5ml（DCCI0.0165モル
に相当）を添加し、混合物を６時間撹拌した。反
応混合物を過・除去した。この樹脂ペプチドを
下記溶剤各25mlにて２回継続して２分間洗浄し
た。DMF、塩化メチレン、メチルアルコール、
塩化メチレン。ニンヒドリン試験は陰性であつ
た。 保護基除去：サイクル32で用いた保護基除去を
繰返した。 サイクル 23 カツプリング：サイクル24から得られたペプチ
ド樹脂を、BOC―Ｌ―プロリン3.54ｇ（0.0165モ
ル）及び塩化メチレン25mlと共に10分間撹拌し
た。塩化メチレン中のDCCI16.5ml（DCCI0.0165
モルに相当）を添加して混合物を６時間撹拌し
た。反応混合物を過・除去し、樹脂ペプチドを
下記溶剤各25mlで２回継続して洗浄した。塩化メ
チレン、メチルアルコール、塩化メチレン。各洗
液は過・除去された。ニンヒドリン試験は陰性
であつた。 保護基除去：サイクル32で用いた保護基除去法
を繰返した。 サイクル22及び21 これらのサイクルで用いたカツプリング及び保
護基除去法は、カツプリング反応でBOC―Ｌ―
プロリンの代りに以下のアミノ酸誘導体を使用し
た点を除き、サイクル23と同様であつた。 サイクル22…BOC―Ｗ―Ｌ―チロシン8.15ｇ
（0.0165モル） サイクル21…BOC―Ｏ―ベンジル―Ｌ―トレ
オニン（0.0165モル） サイクル 20 この方法は、アスパラギン誘導体の代りに
BOC―Ｌ―グルタミンｐ―ニトロフエニルエス
テルを6.50ｇ（0.0165モル）使用した点を除き、
サイクル26と同様であつた。 サイクル 19乃至15 トレオニン誘導の代りに下記アミノ酸誘導体を
使用した点を除き、サイクル31と同様な方法を用
いた。 サイクル19…BOC―Ｌ―ロイシン2.54ｇ
（0.011モル） サイクル18…BOC―ε―２―クロルカルボベ
ンジルオキシ―Ｌ―リジン4.55ｇ（0.011
モル） サイクル17…BOC―Ｎ（im）―カルボ―ベンジ
ルオキシ―Ｌ―ヒスチジン サイクル16…サイクル19参照のこと サイクル15…BOC―Ｌ―グルタミン酸―γ―
ベンジルエステル3.70（0.011モル） サイクル 14 サイクル20と同様 サイクル 13 カツプリング反応に、プロリン誘導体の代りに
BOC―Ｏ―ベンジル―Ｌ―セリン4.86ｇ（0.0165
モル）を使用した点を除き、サイクル23と同様な
方法を用いた。 サイクル 12乃至９ カツプリング反応に、トレオニン誘導体の代り
に下記アミノ酸を使用した点を除き、サイクル31
と同様な方法を用いた。 サイクル12…サイクル19で使用したものと同じ
反応物。 サイクル11…反応物はサイクル18と同じであつ
た。 サイクル10…サイクル30で使用したものと同じ
反応物。 サイクル９…サイクル19で使用したものと同じ
反応物。 サイクル ８ カツプリング：サイクル９からの樹脂ペプチド
を、BOC―Ｌ―バリン3.85ｇ（0.0165モル）及び
塩化メチレン25mlと共に10分間撹拌した。次に塩
化メチレン中のDCCI16.5ml（DCCI0.0165モルに
相当）を添加し、混合物を16時間撹拌した。反応
混合物を過・除去した。樹脂ペプチドを、下記
溶剤各25mlにて継続して２回２分間洗浄に付し
た。塩化メチレン、メチルアルコール、塩化メチ
レン。洗液は各回毎に過・除去した。 保護基除去：サイクル31を参照のこと サイクル ７ カツプリング反応に、トレオニン誘導体の代り
にBOC―Ｓ―エチルチオ―Ｌ―システイン3.09ｇ
（0.011モル）を使用した点を除き、サイクル31と
同様の方法を用いた。 サイクル ６ 用いた反応物及び方法は、サイクル31と同様で
あつた。 サイクル ５ 用いた反応物及び方法は、サイクル29と同様で
あつた。 サイクル ４ 用いた反応物及び方法は、サイクル19と同様で
あつた。 サイクル ２ 用いた反応物及び方法は、サイクル29と同様で
あつた。 サイクル １ 用いた反応物及び方法は、トレオニン誘導体の
代りにBOC―Ｓ―ｐ―メトキシベンジル―Ｌ―
システイン3.75ｇ（0.011モル）を使用した点を
除き、サイクル31と同様であつた。 サイクル１完了後、該樹脂ペプチドを各25mlの
ｎ―ヘキサンで２回継続して洗浄した。ペプチド
物質を反応器から取り出し、電気式真空乾燥器内
40℃、0.1mmHgにて24時間乾燥した。 フツ化水素による開裂 乾燥した樹脂ペプチド（２ｇ）とアニソール２
mlをテフロン製反応容器内に配置した。テフロン
被覆マグネツトスターラーを備えた該容器をドラ
イアイス―アセトン浴内に配置し、フツ化水素ガ
ス10mlを該容器内に凝縮させた。この混合物を氷
浴にて０℃で１時間撹拌した。フツ化水素を減圧
下蒸発により除去した。残渣を各10mlの酢酸エチ
ルと共に６回砕いた。樹脂ビーズから0.1モル濃
度の酢酸水溶液120mlでペプチドを抽出した。 ペプチドの環化 フツ化水素開裂から得られた酢酸水溶液抽出物
に蒸留水80mlを添加して0.2リツトルに稀釈した。
濃水酸化アンモニウムを添加して、溶液のPHを
7.5に調整した。この溶液を窒素流下に密封容器
内で24時間撹拌した。この時点では、出口窒素流
にはエチルメルカプタンは検出できなかつた。窒
素流のエチルメルカプタン含量は、該流をエルマ
ン試薬溶液〔エルマン、ジー、エル（Ellman，
G.L.）Arch.Biochem.Biophys.，82，70―７
（1969）〕に通すことにより測定された。氷酢酸の
添加により、反応混合物のPHを5.0に調整した。 粗デス―Asn³―SCTの精製 前記合成にて得られたPH5.0の溶液0.2リツトル
をSP―セフアデツクス（Sephadex）Ｃ―25イオ
ン―交換カラムを用いて濃縮した。0.7モル濃度
の塩化ナトリウム溶液と共にカラムから取り出さ
れた濃縮物25mlを脱塩し、セフアデツクスＧ―25
（細粒）ゲル・過カラムに通して0.03モル濃度
の酢酸水溶液で溶出させることにより精製した。
このカラムからのデス―ASN³―SCT留分のPH
を、水酸化アンモニウム溶液の添加により6.0に
調整した。この溶液を、ホワツトマン
（Whitman）CM52カラムを用いるイオン交換ク
ロマトグラフイーにて酢酸アンモニウム緩衝液で
溶出させ更に精製した。このカラムからのデス―
ASN³―SCT留分のPHを、氷酢酸の添加により
5.0に調整した。この溶液をSP―セフアデツクス
Ｃ―25イオン―交換カラムを用いて濃縮した。
0.7モル濃度の塩化ナトリウム溶液と共にカラム
から取り出された濃縮物30mlをセフアデツクスＧ
―25（細粒）ゲル―過カラムで脱塩した。精製
ペプチド留分を捕集し凍結乾繰した。生成物はふ
わふわした白色の固体として得られた。得られた
生成物を6N塩酸中で、110℃で24時間加水分解
し、スパツクマン（Spackman）氏等の方法によ
りアミノ酸分析を行つた〔スパツクマン氏等著、
アナル・ケム（Anal.chem.）、第30巻、第1190頁
（1958年）及びスパツクマン著、メソツズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）第11巻、第３〜15頁（1967年）参
照〕。アミノ酸自動分析計はベツクマン121
（Beckman121：商標）アミノ酸分析計を使用し
た。 アミノ酸分析計により得られた比は以下の通り
であり、カツコ内に理論値を記す。 Asp1.0(1)，Thr4.9(5)，Ser3.8(4)，Glu3.1(3)，
Pro2.1(2)，Gly3.0(3)，Leu4.9(5)，His0.9(1)，
Tyr0.85(1)，Cys1.9(2)，Lys1.9(2)，Arg0.9(1)この
生成物のアツセイはmg当り4300MRC単位であつ
た。 実施例 ２ デス―Asn³―SCTの生物活性を、実施例１の
如くして得たデス―Asn³―SCT及び合成サケカ
ルシトニン標準品（合成法については米国特許第
3926938号明細書参照）の、段階的用量を投与し
た後の、血清カルシウム濃度の減少を比較するこ
とによつて決定した。ラツトを５匹ずつ４群に分
け、各群を無作為に割り当て、一定用量の標準品
又は試験溶液を投与した。低用量及び高用量を、
用量―反応曲線の直線部分から選択した。サケカ
ルシトニン標準品に対しては、各々0.7及び2.1mg
ペプチド／100ｇ体重であつた。これらの各々の
用量はほぼ３及び9mu／100ｇ体重に相当する。
ペプチドを皮下注射（0.2ml／100ｇ体重）により
投与し、１時間後、血清カルシウム測定のために
血液を採取した。採取した血液を処理し、その血
清を採取後２時間以内に分析した。結果を２×２
平行線分析（２×2pallalel lineassay）によつて
分析した。サケカルシトニン標準品は、約
4000IU／mgのものを使用した。デス―Asn³―
SCTの力価は、4200IU／mgであつた。この力価
は、有意に優れていた。 上記の結果は、試験したデス―Asn³―SCTが
血液中のカルシウム濃度を下げることを示してお
り、これは明らかに生理活性カルシトニンの特有
的活性であることを示している。従つてデス―
Asn³―SCTがサケカルシトニンと比較して良好
な効力と品質を有することが判明した。 本発明の幾つかの実施態様についてのみ詳細に
説明したが、当業者には、発明の精神及び特許請
求の範囲内でその他多数の特定実施態様の実施が
可能なること及び多数の変化が可能なることは明
らかであろう。