JPS60500054A - デス−アスパラギン−３−カルシトニン - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 デス−アスパラギン−６−カルシトニン発明の分野 本発明は、生物学的活性を有するカルシトニン及び生物学的に活性なカルシトニ ンに転化可能なペプチド並びに斯かるペプチド及びカルシトニンを調製する方法 に関するＯ 発明の背景 全ての既知天然カルシトニンはブチｒは、３２個のアミノ酸の連鎖を含有する。

例えばサケカルシトニンは下記の式を有する。

Ｈ２ 米国特許第３．９２６．９３８号、同第４．０６２．８１５号。

同第３．９２９，７５８号、同第４．０３３．９４０号及び同第４．２１７，２ ６８号は、上記のサケカルシトニンを含むカルシトニン類の改善された合成法を 開示している。

天然カルシトニンにはサケカルシトニン、ウシ、ブタ。

ヒツジ及びウナギのカルシトニン並びにヒトカルシトニンがある。これらは全て 第３番位置にアスパラギンを有する。

発明の概略 木発明者等は、既知の同型のカルシトニンよりも生物学的活性が犬なる３１アミ ノ酸の合成カルシトニンＲプチドを発見した。著るしい構造の違いは、木発明者 等の新規ヘフチＰのアミノ酸連釦には、既知のカルシトニンアミノ酸連鎖の第６ 番位置にアスパラギン残基が含有されていないことである。ペプチド類の合成的 変性に関するＩＵＰＡＣ４ＵＢ命名法を用いて、この新規はプチドをデス−Ｘ（ ｄｅｓ−Ｘ）カルシトニン（但しＸはアスパラギン）と称する。［Ｂｉｏｃｈｅ ｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ａｃｔａ、　男１−５（１９６７））この新規ハフチドは 既知のカルシトニンと較べて良好な効力と品質を有する。

発明の詳細な説明 一般に、木発明者等は固相型の合成法を使用し、ベンズヒト９リルアミン樹脂（ ＢＨＡ樹脂）と称される樹脂から出発する。この樹脂は、スチレンとジビニルベ ンゼンとの共重合により製造される架橋ポリスチレンビーズ樹脂から誘導される 。この型の樹脂は既知であり、その製法はビニツタ等が詳細に示している。［Ｐ ｉｅｔｔａ　、　Ｐ−３，及びＭａｒｓｈａｌｌ、　Ｇ、Ｒ，、Ｃｈｅｍ−Ｃｏ ｍｍｕｎ、、　／）５０　（１９７０）　］この架橋ポリスチレンＢＨＡ樹脂は 化学品供給業者から入手可能である。このＢＨＡ樹脂を表わすのに以下の式式中 　■は樹脂のポリスチレン部分である。

本合成では、樹脂上に全啄プチド連鉛が形成されるまで、不溶性樹脂に１時期に １個のアミノ０を添加する。

アミノ酸官能基はブロッキング基で保護される。アミン酸のα−アミノ基は、３ 級ブチルオキシカルボニル基又はその均等物で保護される。このα−６級ブチル オキシカルボニルを基をＢＯＧと称する。セリンとトレオニンの水酸基はベンジ ル基又はベンジル誘導基例なば４−メトキシベンジル、４−メチルベンジル、３ ．４−ジメチルベンジル、４−クロルベンジル、２．６−０クロルベンジル。

４−ニトロベンジル、ベンズヒト９リル又はそれらの均等物により保護される。

ベンジル又はベンジル誘導基を表わすためにＢＺなる用語を用いる。

チロシンの水酸基は未保護のまへであるか、又は前器でＢＺ基と記したベンジル 若しくはベンジル誘導基で保護され、或いはインジルオキシカルボニル若しくは ベンジルオキシカルボニル誘導体１例えば２−クロルはンジルオキシカルボニル 若しくは２−ブロムベンジルオキシカルボニル基又はそれらの均等物にて保護さ れる。保護基なし、ＢＺ基、ベンジルオキシカルボニル基又はベンジルオキシカ ルボニル誘導基を表わすのに用語Ｗを用Ｘ、する。

システィンのチオール基は、前記のＢＺで表わされるベンジル又はベンジル保護 基、又はｎ−アルキルチオ基例えばメチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ 、ｎ−ブチルチオ若しくはそれらの均等物にて保護される。

ｎ−アルキルチオ基又はＢＺを表わすためにＷ号Ｒ２をＢＺである場合のｎ−ア ルキルチオを表わすためにＨｅ号Ｒを用いる。その他＋　Ｒ，は別のシスティン 基でありてもよく、この場合Ｒ２はＢＺである。アルギ；ンのグアニジン基は、 ニトロ基、トシル基又はそれらの均等物にて保護されろ。ニトロ基又はトシル基 を表わすために記号Ｔを使用する。リジンのε−アミノ基はベンジルオキシカル ボニル基又は２−クロルベンジルオキシカルボニル、３．４−ジメチルベンジル オキシカルボニル等インジルオキシカルボニル誘導体若しくはそれらの均等物に より保護される。ベンジルオキシカルボニル基、又はベンジルオキシカルボニル 誘導基を表わすため忙記号Ｖを用いろ。ヒスチジンのイミダゾール窒素上に用い られる保護基は、リジン用として前記しＶと命名したようなベンジルオキシカル ボニル基及びベンジルオキシカルボニル誘導体である。グルタミン酸のγ−カル ボン酸基は、セリン及びトレオニンの水酸基の保護用として説明したようなベン ジル又はベンジル誘導基により保護される。

これらの保護基は記号ＢＺで表わされる。。

既知のサケカルシトニンと同種の活性を有する太発明者等の新規デス−ＡＳｎ− サケカルシトニンの式は、以下の様に記載される。

５ 上記の式かられかるように、６１個のアミノ酸が関与しており１本式での位置は 一般に認められている方法に従って番号付けされている。すなわち、鎖の一端上 のＣＹＳの位置１で始まり、連鎖から失せたアスパラギンの位置３は省略１２． ＠の他端の位置３２　ＰＲＯで終っている。

説明をわかりゃすくたるため１合成のサイクルに関してもこれと同じ番号付与体 系に従う。アミノ酸の組立は、プロリンのカップリングに関するサイクル３２か ら始まり、トレオニンのカップリングに関するサイクル６１に続き、以下同様で ある。

３２合成サイクルの各々に使用される好適アミノ酸反応物を以下の表１に記載す る。

３２　ＢＯＣ−Ｌ−プロリン ３１　ＢＯＧ−〇メンジルーＬ−）レオニン３０　ＢＯＧ−グリシン ２９　、ＢＯＣ−〇−ベンジルーＬ−セリン２８　、ＢＯＣ−グリシン ２７　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−トレオニン２６　ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン 　ｐ−ニトロフェニル　エステル２５　Ｂｏｏ−０−ベンジル−Ｌ−トレオニン ２４　ＢＯＣ−Ω−ニドＩ：Ｉ−Ｌ−７／Ｉ／ギニン０ｒＢＯＣ−〇−トシルー Ｌ−アルギニン ２３　ＢＯＧ−Ｌ−プロＩＪン ２２　ＢＯＣ−０−インジル−Ｌ−チロシンＬ　ＢＯＣ−Ｌ−シロシン、又はＢ ＯＣ−０−２臭化ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−チロシン２１　ＢＯ（、−０ −ベンジル−Ｌ−）レオニン２０　ＢＯＣ−Ｌ＋グルタミン　ｐ−二トロフェニ ル　エステル１９　ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン １８　ＢＯＣ−Ｅ−ＣＢＺ−Ｌ−１））ン５１ＪｔＢＯＣ−ε−２−塩化ペンジ ルオキシカルボニルーＬ−リジン１７　ＢＯＣ−Ｎ（ｉｍ）−ＧＢＺ−Ｌ−ヒｘ チジン１６　ＢＯＣ，Ｌ−ロイシン １５　ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸　γ−ベンジルエステル１４　ＢＯＣ−Ｌ−／ ｙ、Ｊ　ミン　ｐ−ニトロフェニル　エステル１３　ＢＯＣ−Ｌベンジル−Ｌ− セリン１２　ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン １１　ＢＯＣ−Ｅ−ＣＢＺ−Ｌ−ＩＪジン又ハＢＯＣ−ε−２−塩化ペンジルオ キシカルボニル−Ｌ−リジン１０　、ＢＯＧ−グリシン ９　ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン ８、ＢＯＣ−Ｌ−バリン ７　ＢＯＧ−３−エチルチオ−Ｌ−システィｙ、ＢＯＣ−８−メチルチオーム− システィ４　ＢＯＣｉ−３−ｎ−プロピルチオ−し−シスライン又は　ＢＯＧ− ３−ｎ−ブチルチオ−Ｌ−システィン６　Ｂｏｃ−ｏ−ベンジル−Ｌ　＝、　） レオニン５　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−セリン４　ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン ２　ＢＯＣ−〇−ベンジルーＬ−セリンＩ　Ｂｏｃ−ｓ−ｐ−メトキク〈ンジル ーＬ−システィン。

ＢＯＣ−６−ベンジル−Ｌ−システィン　又はＢＯＣ−３−３，４−ジメチルベ ンジル−し−システメン。

ビスーＢＯＣ−Ｌ−システィン 表Ｉに指摘した各アミノ酸誘導体は市販される。

サイクル３２ ＢＨＡ樹脂へのプロリンのカップリング樹脂ペプチド合成の全工程に用いられる 反応器は、頂部に原料添加用入口を備え、可溶性反応混合物及び洗浄溶剤を濾過 ・除去するための焼結ガラス板を底部に備えたガラス容器である。濾過は、真空 又は窒素圧使用のいずれかにより行なわれる。容器内容物は、容器全体の振と５ 又は機械的攪拌装置にて攪拌される。

サイクル６２では、ＢＨＡ樹脂を反応器内に配置し、塩化メチレン、クロロホル ム、ジメチルホルムアミド９゜はンゼン又はそれらの均等物等の溶剤中に、樹脂 ダラム当り溶剤約６乃至１２−の割合で溶剤中に懸濁させる。

これに、使用ＢＨＡ樹脂の遊離アミン当量当り約１乃至６当量のＢＯ（、Ｌ−プ ロリンを添加する。５乃至１０分間ｑｎ後−：）シクロヘキシルカルボジイミト 責ＤＣＣ）等のカップリング剤（ＣＱ又はその他のジイミドカップリング剤が使 用される、ジイミドカ゛ツブ１）ング剤の使用量は使用ＢＯＣ−Ｌ−プロリン当 量当り０．５乃至２．０当量である。

ＢＯＣ−Ｌ−プロリンは、その活性エステル誘導体、そのアジド誘導体、その対 称的無水物誘導体又は適当に選択された無水物誘導体を使用した場合には、カッ プ１１ンダ剤無しでもカップリングする。使用可能な活性エステル誘導体は、２ −二トロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、はンタフルオルフェ ニルエステル＋Ｎ−ヒドロキシこはく酔イミドエステル又はそれらの均等物であ る。活性エステルの使用量は、ＢＨＡ樹脂の遊離アミン等量当り１乃至１０当量 である。　・ＢＨＡ樹脂、浴剤、ＢＯＣ−Ｌ−プロリン及びカップリング剤又は ＢＯＧ−Ｌ−プロリン活性エステルからなる反応混合物を、試験試料のニンヒド リン試験〔イー・カイザー（Ｅ、Ｋａｉｓｅｒ）等＋　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、、　３４．５９５−８（１９７０）１が反応の完了を示すまで機械的に攪拌 又は振とうする。

カップリング反応完了後、塩化メチレン、クロロホルム、メチルアルコール、ベ ンゼン、ジメチルホルムアミＰ又は酢酸等の溶剤でＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂を 洗浄する。洗浄溶剤量は、最初に使用したＢＨＡ樹脂各グラム当り５乃至２０１ ＬＩＩの溶剤が適当である。完了前にカップリング反応を停止したい場合には洗 浄法が使用され、　ＢＯＧ−Ｌ−プロリン樹脂上の残存遊離アミノ基は、過剰の アセチ９ ル化剤にてアセチル化することにより更なる反応から保獲される。アセチル化剤 は、　ＢＯＣ−Ｌ−プロ１１ン樹脂をアセチル化剤溶液と共に０５乃至１２時間 の間攪拌することによりなされる。Ｎ−アセチルイミダゾール／塩化メチレン溶 液又は無水酢酸とトリエチルアミン／クロロホルム混合物等のアセチル化剤が使 用される。アセチル化剤の使用量は、出発ＢＨＡ樹脂の遊離アミンタイターの当 量当り０．５乃至５．０当量である。

ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂を製造するためのカップ１１ング反応は、次式にて記 述される。

ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂の保護基除去前記のように調製されたＢＯＣ−Ｌ−プ ロリン樹脂を、前記したような溶剤で洗浄し、それを塩化メチレン、クロロホル ム、ばンゼン又はそれらの均等物等の溶剤とトリフルオル酢酸（ＴＦＡ）の混合 物等の試薬と共和攪拌して保護基を除去する。溶剤中のＴＦＡ量は、混合物の１ ０％から１００％まで変化する。ＴＦＡ−溶剤混合物の量は最初に用いたＢＨＡ 樹脂ダラム当り、３乃至２０ｍ１の範囲で変化する。反応時間は約１０分乃至４ 時間である。

保護基除去前記は、ＴＦＡ−溶剤混合物を濾過・除去することにより停止される 。残留ＴＦＡは、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン又はそれらの均等物等 の溶剤にトリエチルアミンを５乃至６０％溶解させた溶液を、ＢＨＡ樹脂ダラム 当り、３乃至２０７ｄ用いて洗浄することによりＬ−プロ１１ン樹脂から除去さ れる。トリエチルアミンの代りにその他の３級又は２級有機アミン、例えばトリ メチルアミン、Ｎ−エチルビはリジン−ジイソプロピルアミン又はそれらの均等 物を使用することもできる。Ｌ−プロリン樹脂の遊離アミンのタイターは、ド− マｙ　（Ｄｏｒｍａｎ）滴定法（）″−マン、エル、シー。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、’　１９６９．２３１９−２１　 ）で測定される。保護基除去反応は、次式にて記述される。

サイクル３１ サイクル３２の結果として得られたプロ１）ルＢＨＡ樹脂をカップリング溶剤に 懸濁し、ＢＯＣ−０−ＢＺ−Ｌ　）レオニン誘導体を添加して混合物を同様に平 衡状態に至らしめる。カップリング剤のＤＣＣを添加し、ニンヒドす１ ン試験が反応完結を示したあと、反応混合物をＥ過によりＢＯＣ−０−ＢＺ）レ オニルプロリルＢＨＡ樹脂から分離、する。このはプチド樹脂を溶剤で洗浄する 。反応物と溶剤の量並びに反応時間は、サイクル６２に記載されたものと同様で ある。サイクル６２に記載した保護基除去法により、ＢＯＣ基をこのスプチド樹 脂から除去する。続いて得られた０−ＢＺ−トレオニルプロＩＩルＢＨＡ樹脂＋ −ｉサイクル６０用に供される、サイクル３１の諸反応は、次式にて示される。

便宜上、この生成樹脂はプチドを以下のような略記表示を用いて記す。

サイクル３０では、ＢＯＧ−０−ＢＺ−）リレオニンの代りにＢＯＣ−グリシン を用いる点を除き、サイクル３１と同様な方法でカップリング反応及び保護基除 去反応を行なう。カップリング反応及び保設基反応は以下のように記される。

サイクル２９では、アミノ酸誘導体をＢＯＧ−・０−ＢＺ−Ｌ−セリンに置き換 える以外は、カップリング及び保護基除去反応はサイクル３１と同様になされる 。これは以下のように記される。

１３ サイクル２８ サイクル２８で（・工、アミノ酸反応物をＢＯＣ−グリシンに置き換える以外は 、カップリング及び保護基反応はサイクル６１に記載のようになされろ。これら のカップリング及び保護基除去反応は以下のように記される。

サイクル２７ 本サイクルのカップリング及び保護基除去反応は、サイクル６１と同じアミノ酸 反応物を用いて行なわれ、下記化合物が得られる。

サイクル２６ サイクル２６でのカップリング反応は、ＢＯ（３−Ｌ−アスパラギンの活性エス テル誘導体を用いてなされる。活性エステル法は、ＤＯＣカップリング剤の代り にＢｏＣ−アスパラギン又はＢＯＣ−グルタミンと共に使用される。

反応は、ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギンの活性エステル誘導体を、ＢＨＡ樹脂の遊離 アミン当量当り２乃至１０当量使用し、ジメチルホルムアミド９．ジメチルホル ムアミド９とベンゼン、塩化メチレン又はクロロホルムの混合物又はそれらの均 等物との混合物中、最初ＩＣ使用したＢＨＡ樹脂ダラム当り２乃至２０ｍ１の溶 剤量にて行なわれる。

は、ニンヒドす、ン試験で反応完了が示されたあ左、ＢＯＣはプチド樹脂から濾 過・除去される。使用される活性エステル誘導体ｉ１２−二トロフェニルエステ ル、４−ニトロフェニルエステル、はンタフルオルフェニル又ハソれらの均等物 である。誘導体の活性エステル部をＡＥと記す。カップリング反応は以下のよう に起される。

ＢＯＣ基を除去するための保護基除去反応は、サイクル６２と同様妃なされる。

サイクル２５−２１ サイクル２５乃至２１の各サイクルでは、方法及び反応物の割合はサイクル３１ と同様にし、サイクル２５ではＢＯＣ−ＢＺ−Ｌ−）レオニンを、サイクル２４ ではＢＯＣ−ω−Ｔ−Ｌ−アルギニンを、サイクル２３ではＢＯＧ−Ｌ−プロリ ンを、サイクル２２ではＢＯＣ−Ｗ−Ｌ−チロシンを、サイクル２１ではＢＯＣ −０−ＢＺ−Ｌ−）レオニンを用いて行なわれる。サイクル光子後に得られる化 合物は以下のように記される。

５ サイクル２０ サイクル２０では、アミノ酸誘導体としてＢＯＯ−Ｌ−グルタミン活性エステル 誘導体を用い、サイク〃２６と同様の方法及び反応物割合を用いてカップリング 及び保護基除去反応を行なう。生成化合物は下記の通りである。

サイクル１９では、アミノ酸誘導体としてＢＯ（３−Ｌ−ロイシンを使用し、サ イクル３１と同様に反応を行なった。サイクル１９の生成化合物は以下の通りで ある。

サイクル１８ サイクル１８では、ＢＯＣ−ε−Ｖ−Ｉ、−リジンなるアミノ酸誘導体を使用す る。その他の点ではサイクル１８の方法はサイクル６１と同様になされ、下記の 生成物が得られる。

サイクル１７−１５ サイクル１７乃至１５は、サイクル１７ではＢＯＣ−Ｎ（ｉｍ）　−Ｖ−Ｌ−ヒ スチジンを、サイクル１６では反応物としてＢＯＣ−Ｌ−ロイシンを、サイクル １５では反応物としてＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸ＢＺエステル（ＢＺはセリン及 びトレオニンに対し表わしたものと同じ基を表わす）を使用する以外は、サイク ル３１と同様和なされ、サイクル１５から下記化合物を得る。

サイクル１４−８ サイクル１４は、アミノ酸誘導体としてＢＯＣ−Ｌ−グルタミン−ＡＥを用℃゛ ・、サイクル２０と同様になされる。

サイクル１６乃至８は、　’ｒイク＃１３　テハＢＯ（３−０−ＢＺ−Ｌ−セリ ンを、サイクル１２ではＢＯＣ−Ｌ−ロイシンな。

サイクル１１ではＢＯＣ−ε−Ｖ−Ｌ−リシンを、サイクル１０ではＢＯＣ−グ リシンを、サイクル９ではＢＯＣ−Ｌ−ロイシンを、サイクル８ではＢＯＣ−Ｌ −バリンを用いる１７ ことを除きサイクル６１と同様になされ、下記の化合物が得られる。

サイクル７は、アミノ酸誘導体としてＢＯＣ−８−Ｌ−システィンを用いる点を 除き、サイクル６１と同様になされる。サイクル７の結果書られる化合物は次式 により記式中Ｒ２はアルキルチオ又はＢＺ基である。

サイクル６−４及び２ サイクル６乃至４は、アミノ誘導体としてサイクル６ではＢＯＣ−０−ＢＺ−Ｌ −トレオニンを、サイクル５ではＢＯＣ−ＢＺ−Ｌ−セリンを、サイクル４では ＢＯＣ−Ｌ−ロイシンを、サイクル２ではＢＯＣ−ＢＬ−Ｌセリンを使用したこ とを除きサイクル６１と同様になされる。サイクル２から得られる化合物は次式 の通りである。

このサイクルは、ＢＯＣ−８−Ｒ−Ｌ−システィン誘導体を用いてサイクル７と 同様になされる。システィン忙対して選択されるＲグループは、サイクル７で用 いられるものと同−又は相異なるものである。例えば、サイクル７に対して選択 される誘導体がＢＯＧ−Ｓ−エチルチオ−Ｌ−システィンであるならば、サイク ル１の誘導体はＢＯＣ−８−４−メトキシベンジル−４−システィンであり、サ イクル７としてＢＯＣ−８−４−メトキシベンジル−Ｌ−メトキシベンジル−Ｌ −システィンが選択されたならば、この誘導体はサイクル１にも使用される。サ イクル１から得られる化合物は次式により示される。

９ 但し式中Ｒ□は５−ｎ−アルキル−ＣＹＳ又はＢＺであり、Ｒ２は５−ｎ−アル キル又はＢＺであり、Ｒ□はＲ２がＢＺならば５−ｎ−アルキルであり、Ｒ２は Ｒ′ＩＪ″−５−ｎ−アルキル又はＣＹＳｔｃらばＢＺである。

サイクル１は柳脂はプチドの完了を表わし、樹脂ペプチドは反応器から除去され 、真空で乾燥される。樹脂Ｒブチ１の重量は、合成に最初使用されたＢＨＡ樹脂 重量の２．０乃至４．０倍であると期待される。

樹脂Ｒブチｒ開裂 はプチドは、サイクル１から得られる樹脂はプチドがら液状ソツ化水素（ＨＦ） 　で処理して開裂される。ＨＦ開裂は、樹脂ヘフチドとアニソール（樹脂ペプチ ド各グラム当り０．５乃至５　ｍｌ’　）の混合物を液体ＨＦ（樹脂はプチト９ 各グラム当り２乃至２０−）にて−２０℃乃至＋１５℃で０．５乃至２０時間処 理してなされる。反応後過剰のＨＦを蒸発して除去し、残りのペプチドと樹脂ビ ーズの混合物を酢酸エチル、：）エチルエーテル、ベンゼン又は類似物等の有機 溶剤で抽出してアニソールとＨＦ残分を除去する。ペプチドは、酢、酸水溶液中 に抽出することにより、樹脂ビーズから分離される。この段階のベプチ１は環状 でなく１分子中の第１位置と第７位置のシスティン間に環状ジスルフィド結合を 有さぬ非環状生成物である。

ＨＦ処理は、第１位置又は第７位置のシスティン残基のチオール基上のＳ−アル キルチオブロッキング基を除いて、全てのブロッキング基をズプチドから除去す る。

５−ｎ−アルキルチオ−Ｌ−システィン残基はＨＦ開裂操作に対し安定であり、 開裂及び抽出操作中ずつとそのま〜である。５−ＢＺ−Ｌ−システィンはＨＦで 開裂され、遊離チオール基を有するシスティン残基を与える。木発明者等の合成 では、第１位置及び厚７位置に両タイプのブロッキング基を互いに組合せて使用 した。

に対し選択されるブロッキング基に応じ、６タイプの一つである。

樹脂ペプチド合成サイクル１でＢＯＣ−３−ＢＺ−Ｌ−システィン誘導体が使用 され、サイクル７でＢＯＣ−８−ｎ−アルキルチオ−Ｌ−システィンが使用さ＾ たならハ、ＨＦ開裂後に得られるペプチドはタイプｌとなり、第１位置に遊離チ オール基を有し、且つ第７位置のシスティン残基上に５−ｎ−アルキルチオ基を 有するであろう。本発明者等はこれをタイプＩ　ｏブチ１と称し１次式のように 表■ Ｈ−ＣＹＳ−３ＥＲ−ＬＥＵ−３ＥＲ−ＴＨＲ−ＣＹＳ−ｖＡＬ−ＬＥＵ−ＧＬ Ｕ−ＬＹＳ−２１ ＬＥＵ−８ＥＲ−ＧＬＮ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＨＩＳ、−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ ＋ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＴＨＲ−ＡＳＮ−ＴＨＦｉ−ＧＬＹ　−Ｓ ＥＲ，−ＧＬＹ　−ＴＨＲ−ＰＲＯ−ＮＨ２逆に、サイクル１でＢＯＧ−３−ｎ −アルキルチオ−Ｌ−システィン誘導体を使用し、第７位置でＢＯＣ−８−ＢＺ −Ｌ−システィンを使用したならば、開裂から得られるペプチＦはタイプ■とな り１次式にて表わされるであろう。

ＬＥＵ−３ＥＲ−（、ＬＮ　−ＧＬＵ−ＬＥＵ−Ｈｌ５−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬ Ｎ−ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＴＨＲ−ＡＳＮ−ＴＨＲ−ＧＬｙ−５Ｅ Ｒ−ＧＬＹ−ＴＨＲ＝　ＰＲＯ−ＮＨ２第１位置の保護基５−ｎ−アルキルの代 りに、木発明者等はシスティン基を使用するが（このシスティン基はこの位置で システィンと共にシスチン基を形成する）、この場合第７位置のシスティンを保 護するためにＢＺ基を用いる。サイクル１の反応物としてビスーＢＯＧ−Ｌ−シ スティンを使用し、サイクル７／）反応物としてＢＯＯ−８−ＢＺ−Ｌ−システ ィンを使用したならば、開裂から得られるペプチドはタイプ■となり１次式にて 表わされる。

−ＧＹＳ ＬＥＵ−８ＥＲ−ＧＬＮＬ−ＧＬＵ−Ｌ；ＥＵ−ＨＩＳ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−（、 ＬＮ　−ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＰＲＯ−ｐｘ、−ＴＨＲ−ＡＳＮ−ＴＨＲ−ＧＬＹ− ＳＥＲ−ＧＬＹ−Ｔｍ−ＰＲＯ−ＮＨ２第１位置、第７位置共にＢＯＣ−ＢＺ− Ｌ−システィンを反応物として使用したならば、開裂から得られるペプチドはタ イプ■となり、次式にて表わされる。

Ｈ−ＣＹＳ−８ＥＲ−ＬＥＵ−８ＩｉＲ−Ｔ）（Ｒ−ＣＹＳ−ＶＡＬ−ＬＥＵ− ＧＬＹ−ＬＹＳ、−ＬＥＵ−８原ｔ−ＧＬＮ−ＧＬｕ−ｂＥｕ−Ｈ工ｓ−ｒ、ｙ ｓ−ｊＥｕ−Ｇｔ、Ｎ−ＴＨＲ−ＴｙＲ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＴＨＲ，ＡＳＮ−Ｔ ＨＲ−ＧＬＹ−５ＥＲ−ＧＬＹ−ＴＨＲ−ＰＲＯ−ＮＨ２タイプＩ、Ｉｆ及びｍ ＜プチドの環状ジスルフイドイプチドへの転化は、ＨＦ開裂からの粗ペプチドの 酢酸水溶液を蒸留水で、最終容積が開裂される樹脂被プチドダラム当り５０乃至 ２００ゴとなるまで稀釈することによりなされる。この溶液のｐＨは水酸化アン モニウム溶液の添加により５乃至１０に調整され、混合物は窒素等の不活性ガス 流下、密封容器内で約２乃至４８時間攪拌される。反応は、オフガス流がｎ−ア ルキルメルカプタンを含有しなくなる時点で停止可能である。氷酢酸を添加して 反応混合物のｐＨを約６．５乃至５．５に低下させる。

タイプＩＶ　ｓプチドの環状ジスルフイｈ−Ｊ　ペプチド９への転化は、ペプチ ドを酸化して環内に第１位置と第７位置のシスティンを含むような環構造にする 既知の古典的方法によりなされる。

中間体啄プチドがタイプ１．Ｉｌ、ｍ又は■のいずれかであると、第３位置のア スパラギンが省略されている点を除き、任意の既知カルシトニンに対応するアミ ノ酸鎖のベプチｒを合成でき、このようにして合成されたペプチドを精製すると 、この既知のカルシトニンと同タイプの生物学的活性を有することが判明した。

斯く合成されるカルシトニンをデス−Ａｓｎ−カルシトニンと命名する。

これはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従うものである。

３ 粗デスＡｓｎ　ＳＯＴの精製 前述め合成によるｐＨ５，０の相イゾチド溶液を、イオン交換樹脂法を用いて濃 縮する。この濃縮物を、ゲル−濾過法とイオン交換クロマトグラフ法を組合せた 方法で精製する。最終精製物は、溶液から凍結乾燥法によりふわふわの白色固体 として得られる。この生成物のアミノ酸分析結果は、所望ペプチドに正確に一致 する。

以下は、ペプチド調製の特定例である。

実施例１ 樹脂の活性化 アミンタイター０．６１ミリ当量／ｇのＢＨＡ樹脂〔５ｇ）を、シュパルツ・マ ン社（Ｓｈｗａｒｚ−Ｍａｎ　、　Ｉｎｃ、＝　：ｘ−ヨーク州オレンジパーグ ）製のペプチド合成装置の反応容器内に配置した。この樹脂を以下の溶剤２５ゴ で処理し、各処理後に濾過した。

クロロホルム２分間処理を２回。

１０％トリエチルアミン／クロロホルム５分間処理を２回クロロホルム２分間処 理 塩化メチレン２分間処理を６回 サイクル３２ カップリング：該ＢＨＡ樹脂、塩化メチレン２５ゴ及びＢｏｃ−ｒ、−プロリン ２．５’８．９　（０，０１２モル）を１０分間攪拌した。ジシクロヘキシンカ ルボジイミドの塩化メチレン溶液１２．０ｄ（溶液１ｒｒＬｌ当゛すＤＣＣ１１ ミリ当量）を反応器に添加し、混合物を６時間攪拌した。反応混合物を濾過して 反応器から除去し、ＢＯＧ−プロリルＢＨＡ樹脂を以下の溶剤で継続的に洗浄し く２５ｍ／−２分間）洗液を各回濾過・除去した。

塩化メチレン　２回 メチルアルコール　２回 塩化メチレン　３回 アセチル化二次に該樹脂をトリエチルアミン（ＴＥＡ）１．５７ＬＡ、無水酢酸 １ｍ７！及びクロロホルム２５−の混合物と共に２時間攪拌した。反応混合物ｋ ｆ濾過・除去し、該樹脂を以下の洗浄（２分間−２５ｍ１）に付した。

クロロホルム　２回 メチルアルコール　２回 塩化メチレン　６回 保護基除去：ＢＯＣ保護樹脂ヲートリフルオル酢酸（ＴＦＡ）　１５ｄと塩化メ チレン１５ｍ１の混合物と共に５分間攪拌した。この混合物を濾過・除去し、樹 脂を。

ＴＦＡ１５ｍ７と塩化メチレン１５ゴの第２の混合物と共に６０分間攪拌した。

反応混合物を濾過・除去し、樹脂を以下の洗浄（２５ｄ、）に付した。

塩化メチレン２回、各２分間 メチルアルコール２回、各２分間 クロロホルム２回、各２分間 １０％ＴＥＡ／クロロホルム２回、各１０分間クロロホルム２回、各２分間 塩化メチレン２回、各２分間 Ｔ、Ｊ　−７’ロリンＢＨＡｉ脂を滴定してアミン又はプロリンのタメターを測 定した。この値は、樹脂ダラム当りアミン又はプロリン０．５５ミリ当量であっ た。

２５ゴ及びＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−）レオニン６．４９（０，０１１モル） を１０分間攪拌した。次にジシクロへキシルカルボジイミド９の塩化メチレン溶 液（溶液１ｄ当りＤＣＣＩ　１ミリ当量）１１．０ｍ１（ＤＧＧＩ全０．０１１ ｒ−ル）を反応器に添加し、混合物を２時間攪拌した。反応混合物を反応器から 除去し、樹脂を下記溶剤２５ゴで２分間継続的に洗浄し、各回毎に洗液を濾過・ 除去した。

塩化メチレン　２回 メチルアルコール　２回 塩化メチレン　３回 ニンヒドリン試験は陰性であった。

保護基除去：このサイクルに対しても、サイクル５２に記載の保護基除去方法ケ 繰返した。

サイクル３０乃至２７ これらのサイクルで用いたカップリング及び保護基除去法は、トレオニン誘導体 の代りに下記アミノ酸誘導体を使用した点ビ除き、サイクル３１と同様であった 。

サイクル３０・・・ＢＯＣグリシン１．９２．９　（０，０１１モル）サイクル ２９・・・ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−セリン３．２５ｇ（０，０１１モル）サ イクル２８・・・サイクル６０と同じ反応物を使用サイクル２７・・・サイクル ３１と同じ反応物を使用サイクル２６ カツプリング：サイクル２７から得られたペプチド樹脂なジメチルホルムアミド ’（ＤＭＦ）各２５７７１４で２回洗浄した。次に該樹脂をＤＭＦ３５−中ＢＯ Ｃ−Ｌ−アスパラギンｐ−ニトロフェニルエステル５．８２．９　（０，０１６ ５モル）の溶液と共に２４時間攪拌した。反応混合物をＦＡし。

樹脂にプチドを下記溶剤各２５ｍＡ’で継続的に２回、２分間洗浄した。ＤＭＦ 、塩化メチレン・メタノール、塩化メチレン。各溶剤は濾過・除去され、ニンヒ ドリン試験は陰性であった。

保護基除去：サイクル３２で用いた保護基除去法を繰返した。

サイクル２５ カップリング及び保護基除去は、サイクル３１と同じ反応物を同量用いて同様な 方法で行なわれた。

サイクル２４ カップリング：サイクル２５から得られた樹脂ペプチドをＤＭＦ各２５１Ｌｔで ２回継続して洗浄した。次にこの樹脂ハフチト４をＢｏｃ−Ｎ−ｙ−）シルーＬ −アルギニン７．０６■（０，０１６５モル）とＤＭＦ２５ゴの混合物と共に１ ０分間攪拌した。続いて塩化メチレンに溶かしたＤＣＣＩ１６．５ｒｄ　（ＤＣ ＣＩ　０．０１６５モルに相当）ケ添加し、混合物を６時間攪拌した。反応混合 物を濾過・除去した。この樹脂はプチビな下記溶剤各２５−にて２回継続して２ 分間洗浄した。ＤＭＦ、塩化メチレン、メチル７　／ｌ／　＝ｒ　−ル、　塩化 メチレン。ニンヒトｅ　＋ｌン試験は陰性であった。

保ｔφ基除去：サイクルろ２で用いた保護基除去を繰返した。

サイクル２６ カツプリング：サイクル２４から得られたペプチド樹脂を、ＢＯＣ−Ｌ−プロリ ン３．５４　ｇ（０，［）１６５モル）及び塩化メチレン２５７１ＬＩ！！と共 に１０分間攪拌し、塩化メチレ：／中１７）　ＤＣＣＩ　１６．５　ｍｌ　（Ｄ ＣＣＩ　０．０１６５モルに相当）を添加して混合物ケ６時間攪拌した。反応混 合物を濾過・除去し、樹脂はプチト“を下記溶剤各２５ゴで２回継続して洗浄し た。塩化メチレン、メチルアルコール、塩化メチレン。各洗液は濾過・除去され た。ニンヒドリン試験は陰性であった。

保護基除去：サイクル６２で用いた保護基除去法を繰返した。

サイクル２２及び２１ これらのサイクルで用いたカップリング及び保護基除去法は、カップリング反応 でＢＯＣ−Ｌ−プロ１）ンの代りに以下のアミノ酸誘導体を使用した点７除き、 サイクル２３と同様であった。

サイクル２２・・・ＢＯ（３−Ｗ−Ｌ−チロシン８．１．５ｇ（０，０１７５５ モル）サイクル２１・・・ＢＯＣ−○−ベンジルーＬ−トレオニン（０，［１１ ６５モル） ８ サイクル２０ この方法は、アスパラギン誘導体の代りにＢＯＣ−Ｌ−グルタミンｐ−ニトロフ ェニルエステルを６．５０９（０，０１６５モル）使用した点を除き、サイクル ２６と同様であった〇 サイクル１９乃至１５ トレオニン誘導の代りに下記アミノ酸誘導体を使用した点！除き、サイクル６１ と同様な方法を用いた。

サイクル１９・・・ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン２．５４　ｇ（０，０１１モル）サイ クル１８・・・ＢＯＧ−ε−２−クロルカルボベンジルオキシ−Ｌ−リジン４５ ５．！ｉ’（０，０１１モル）サイクル１７・・・Ｂ’ＯＣ−Ｎ（ｉｍ　）−カ ルボ−ベンジルオキシ−Ｌ−ヒスチジン サイクル１６・・・サイクル１９参照のことサイクル１５・・・ＢＯＣ−Ｌ−グ ルタミン酸−γ−ベンジルエステル６．７０（０，０１１モル） サイクル１４ サイクル２０と同様 サイクル１６ カップリング反応に、プロリン誘導体の代りにＢＯＣ−Ｏ−ばンジルーＬ−セ１ １ン４．８６　ｇ（０，０１６５モル）を使用した点を除き、す子クル２６と同 様な方法を用いた。

サイクル１２乃至９ カップリング反応に、トレオニン誘導体の代りに下記アミノ酸を使用した点を除 き−サイクル６１と同様な方２９ 法を用いた。

サイクル１２・・・サイクル１９で使用したものと同じ反応物。

サイクル１１・・・反応物はサイクル１８と同じであった。

サイクル１０・・・サイクル６０で使用したものと同じ反応物。

サイクル　９・・・サイクル１９で使用したものと同じ反応物。

サイクル８ カップリング：サイクル９からの樹脂イプチドヲ。

ＢＯＣ−Ｌ−バリン３．８５　ｇ（０，Ｑ１６５モル）及び塩化メチレン２５ゴ と共に１０分間攪拌した。次に塩化メチレン中のＤＯＣｄ　１６．５ｍｌ！（Ｄ ＣＣＩ　０．０１６５モルに相当）を添加し、混合物を１６時間攪拌した。反応 混合物を濾過・除去した。樹脂ペプチドを、下記溶剤各２５−にて継続して２回 ２分間洗浄に付した。塩化メチレン、メチルアルコール、塩化メチレン。洗液は 各回毎に濾過・除去した。

保護基除去：サイクル３１を参照のことサイクル７ カップリング反応に、トレオニン誘導体の代りにＢＯＣ−８−エチルチオ−Ｌ− システィン３．０９　Ｉｌ（０，０１１モル）を使用した点を除き、サイクル６ １と同様の方法を用いた。

サイクール６ 用いた反応物及び方法は、サイクル３１と同様であった。

サイクル５ 用いた反応物及び方法は、サイクル２９と同様であった。

用いた反応物及び方法は、サイクル１９と同様であった。

サイクル２ 用いた反応物及び方法は、サイクル２９と同様であった。

サイクル１ 用いた反応物及び方法は、トレオニン誘導体の代りにＢＯＣ−８−１）−メトキ シベンジル−Ｌ−システィン３．７５ｇ（０，０１１モル）を使用した点を除き 、サイクル６１と同様であった。

サイクル１完了後、該樹脂ペプチドを各２５１Ｌ１１のｎ−ヘキサンで２回継続 して洗浄した。ｋブチｒ物質を反応器から取り出し、電気式真空乾燥器内４０℃ 、０．１ｍ）切にて２４時間乾燥した。

フッ化水素による開裂 乾燥した樹脂イプチｌ−″（２ｇ）とアニソール２Ｎｌをテフロン製反応容器内 に配置した。テフロン被覆マグネットスターラーを備えた該容器を１ライアイス −アセトン浴内に配置し、フッ化水素ガス１０−を該容器内に凝縮させた。この 混合物を水浴にて０℃で１時間攪拌した。

フッ化水素を減圧下蒸発忙より除去した。残漬を各１０１の酢酸エチルと共に６ 口枠いた。樹脂ビーズから０．１１ モル濃度の酢酸水溶液１２０ｄでペプチドを抽出した。

ペプチドの環化 フッ化水素開裂から得られた酢酸水溶液抽出物に蒸留水ｓｏｍｔ’ｅ添加して０ ．２リツトルに稀釈した。濃水酸化アンモニウムケ添加して、溶液のｐＨを１５ に調整した。

この溶液を窒素流下に密封容器内で２４時間攪拌した。

この時点では、出Ｏ窒素流にはエチルメルカゾタンは検出できなかった。窒素流 のエチルメルカプタン含量番言−該流をニルマン試薬溶ｉ（エルマン、０−、エ ル（Ｅｌｌｍａｎ　。

Ｇ、Ｌ、）　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＊　８２．７Ｏ−７ （１９６９）］に通すことにより測定された。氷酢酸の添加により、反応混合物 のｐＨを５．０に調整した。

粗デス−Ａｓｎ　−３ＣＴの精製 前記合成にて得られたｐＨ５，０の溶液０．２リツトルをｓｐ−セフ７デツクス （Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　０−２５イオン−交換カラムを用いて濃縮した。０．７ モル濃度の塩化ナト１）ラム溶液と共にカラムから取り出された濃縮物２５−を ８免塩し、セファデックスＧ−２５（細粒）ゲル・濾過カラムに通して０．０６ ６モル濃の酢酸水溶液で溶出させることにより精製した。このカラムからのデス ーＡＳＮ３−８ＣＴ留分のｐＨＹｓ水酸化アンモニウム浴液の添加により６．０ に調整した。この溶液を、ホワットマン（Ｗｈｉｔｍａｎ）０Ｍ５２カラムケ用 いるイオン交換クロマトグラフィーにて酢酸アンモニウム緩衝液で溶出させ更に 精製した。このカラムからのデスーＡＳＮ３−８ＯＴ留分のｐＨｙ＜、米酢２ 酬の添加により５．０に調整した。この溶液をＳＰ−セファデックスＣ−２５イ オン−交換カラムを用いて濃縮した。

０．７モル濃度の塩化ナトリウム溶液と共にカラムから取り出された濃縮物３０ ｍ／をセファデックスＧ−２５（細粒）ゲルー濾過カラムで脱塩した。精製はプ チド留分な捕集し凍結乾燥した。生成物はふわふ→っした白色の固体として得ら れた。生成物のアミノ酸分析による比は以下の通りであり、カッコ内に理論値を 記す。

Ａｓｐｌ、０　（１）−Ｔｈｒ４．９　（５）、　５ｅｒ３．８　（４）、　Ｇ ｌｎ３．１　（３）−Ｐｒｏ２．１（２）、Ｇｌｙ３．０（３）、　Ｌｅｕ４． ９（５１ＨｉｓＯ，９（１）。

Ｔｙｒｏ、８５（１１Ｃｙｓｌ、９（２）、　Ｌｙｓｌ、９（２）、Ａｒｇｏ、 ９（１）この生成物のアッセイはダ当り４３００ＭＲＣ単位であった。

未発明の幾つかの実施態様についてのみ詳細に説明したが、当業者には１発明の 精神及び特許請求の範囲内でその他多数の特定実施態様の実施が可能なること及 び多数の変化が可能なることは明らかであろう。

太発明者等の新規デス−Ａｑｎ−ウナギカルシトニンの式は以下のように記され る。

Ｃｙｓ　−８ｅｒ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ −Ｌｙｓ−ＬｅｕＳｅ　ｒ　−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ　５−Ｌｙｓ−Ｌ ｅ　ｕ−Ｇｌｎ　−Ｔｈ　ｒ　−Ｔｙｒ　−Ｐｒ　。

Ａｒｇ−Ｔｎｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ− ＮＨ２本発明はウシ、ブタ及びヒツジのカルシトニンのデス−Ａｓｎ　同族体を も包含するものである。

手続補正書 特許庁長官　若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和　年特許願第　号 ＰＣＴ／ＵＳ８ろ１０［］２２０ ２、発明の名称 デス−アスパラギン−６−カルシトニン６、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ６、補正の内容 明細書を次の通り補正します。

ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＹＳ− ＴＨＲ−ＣＹＳ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−Ｈ−ＣＹＳ−８ＥＲ−ＬＥＵ−８Ｅ Ｒ−ＴＨＲ−ＣＹＳ−ＶＡＬ′−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−以　上 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）Ｘがアスパラギンであるデス−Ｘ３−カルシトニン。 ２）カルシトニンがサケ、ウシ、ブタ−ヒツジ又はウナギのそれである′＝青求 の範囲第１項に記載のカルシトニン。 ３） なる構造を有するペプチド。 なる構造を有するペプチド９゜ なる構造を有するペプチド。 但しＲ□は５−ｎ−アルキル、、ｃｙｓ又はＥであり且つＲ２は５−ｎ−アルキ ル又はＨであり、Ｒ２がＨの場合はＲｏは５−ｎ−アルキル、Ｃｙｓ又はＨであ り、且つＲ１がＨである場合Ｒ２は５−ｎ−アルキル又はＨであり、Ｒｏが５− ｎ−アルキル又はｑｓの場合にはＲ２はＨであり、５−ｎ−アルキル基はメチル チオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ及びそれらの均等物から なる群から選択される。 なる構造を有するはプチド。 但しＲ工は５−ｎ−アルキル−Ｃｙｓ又はＨであり且つＲ２は５−ｎ−アルキル 又はＨであり、Ｒ２がＨの場合はＲ□は５−ｎ−アルキル−Ｇｙｓ又はＨであり 且つＲ，カＨである場合Ｒ２は５−ｎ−アルキル又はＨであり−Ｒ，が５−ｎ− アルキル又はＣｙＳの場合にはＲはＨであり、５−ｎ−アルキル基はメチルチオ 、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ及びそれらの均等物からなる 群から選、択される。 １