【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はヒト脾臓フイブリン分解酵素（以下
SFPと略す。）と特異的に反応する新規な合成基
質に関するものである。
本発明者らはSFP、白血球中のエラスターゼ様
酵素を特異的に且つ感度よく測定できる新規合成
基質サクシニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−
Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリドについて先に特
許出願（特願昭55−131709号）を行なつている
が、本発明者らはさらに研究を重さねた結果SFP
に対しすぐれた特異性を有する新規合成基質を見
い出し、本発明を完成した。
SFPは特異的にフイブリンおよびフイブリノー
ゲンを分解する中性プロテイナーゼであり、分子
量約30000の塩基性蛋白質である。SFPは無菌動
物には存在しない。細菌性内毒素投与により惹起
した血管内凝固症候群においては血液凝固機能亢
進の発現と共に増加し、その消退と共に回復す
る。この酵素は網内系（以下RESと略す。）細胞
における微細血栓除去機構と密接な関連を有する
ものと考えられる。
本酵素は元来不溶性細胞顆粒内酵素であるが、
活性増加時には溶性酵素として血中にも出現す
る。従つて本基質を使用しての血中酵素測定によ
りプラスミン作用とは分離してSFPが測定でき、
RESの活性亢進を推察することができる。本発
明に係る新規なポリペプチド誘導体は次の一般式
で示される。
（式中Ａは第三ブチルオキシカルボニル基又はサ
クシニル基を示す。）
本基質によるSFPの測定原理を化学式で示せば
下記の通りである。
（式中Ａは前記と同様である。）
即ち本基質をPH７の緩衝液中被検血清と混合
し、SFPの濃度に比例して生成するＰ−ニトロア
ニリンの吸光度を測定する。なお、Ｐ−ニトロア
ニリンの代りに他の発色性物質あるいは螢光性物
質を使用し、可視部の吸光度の変化、螢光スペク
トルの変化により直接測定したり、あるいは芳香
族アミノ化合物の定量で通常行なわれるジアゾ発
色反応、インドフエノール発色反応等を応用し、
発色度を高めて測定することも可能である。以上
の如く測定系は臨床検査の分野で行なわれている
公知方法を応用して種々の組合せにより実施する
ことができるが、本発明の範囲がそれにより限定
されるものではない。なお、該ポリペプチド誘導
体は次の如くして得ることができる。
例えば保護されたアミノ基をもつＬ−アラニン
（以下Ｌ−Alaと略す。）とＬ−チロシル−Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド（以下
Ｌ−Tyr−Ｌ−Leu−Ｌ−Val−PNAと略す。）
をＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド法、
Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドと添
加剤による方法、アチド法あるいは混合酸無水物
法等常法により縮合させ、Ｎ−保護ポリペプチド
誘導体即ち保護基−Ｌ−Ala−Ｌ−Tyr−Ｌ−
Leu−Ｌ−Val−PNAを得ることができる。な
お、該縮合物のアミノ保護基を常法により脱離さ
せ、遊離ポリペプチド誘導体Ｈ−Ｌ−Ala−Ｌ−
Tyr−Ｌ−Leu−Ｌ−Val−PNAを得る。さらに
この遊離したアミノ基をトリエチルアミン存在
下、酢酸エチルまたはピリジン中無水コハク酸に
てサクシニル化しサクシニル−Ｌ−Ala−Ｌ−
Tyr−Ｌ−Leu−Ｌ−Val−PNAとすればよい。
なお、本発明で使用するＬ−Alaは市販品が利
用できる。一方、保護されたアミノ基を持つＬ−
Tyr−Ｌ−Leu−Ｌ−Val−PNAは本発明者らが
先に出願した特許願昭55−131709号に記載の方法
で合成することができる。即ち、Ｎ−第三ブチル
オキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−
Ｐ−ニトロアニリド0.43ｇ（１ミリモル）を7.6
規定塩化水素ジオキサン溶液0.4mlに溶かし10分
間撹拌した後ジオキサン2.6mlを加えさらに室温
にて30分間撹拌した。
エーテル50mlを加え生じた沈澱を濾取し、苛性
カリ上で乾燥。得られたＬ−ロイシル−Ｌ−バリ
ン−Ｐ−ニトロアニリドの塩化水素塩をＮ，
N′−ジメチルホルムアミド５mlに溶解し、トリ
エチルアミンでPH８に調節し、そこへＮ−第三ブ
チルオキシカルボニル−Ｌ−チロシン0.34ｇ
（1.2ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール0.135ｇ（１ミリモル）を加え溶解し、氷−
食塩にて冷却し、Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド0.25ｇ（1.2ミリモル）を加え室温
にて18時間攪拌した。生じた沈澱を濾去し、溶媒
を減圧下留去した。残留物を酢酸エチルに溶解
し、氷冷下10％クエン酸、５％炭酸ナトリウム続
いて水で洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナト
リウム上で乾燥し、酢酸エチルを留去。残留物に
エーテルを加えると融点210〜211.5℃の無色結晶
の目的物が得られる。尚、第三ブチルオキシカル
ボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロ
アニリドはSato、K.、Nagai、U.、and Kawai、
M.、“Peptide Chemistry 1979”、H.Yonehara
編、Protein Research Foundation、Osaka、
1980年、149頁に記載の方法で、またＮ−第三ブ
チルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンは
Andeerson、G.W.、and McGregor、A.C.、J.
Am.Chem.、Soc.、79巻、6180頁、1957年に記載
の方法で得た。
本発明を実施するに必要な保護基はベンジルオ
キシカルボニル基、第三ブチルオキシカルボニル
基などペプチド合成に際し慣用されているアミノ
基の保護基をあげることができる。
また、保護基を脱離するにはペプチド合成の際
にアミノ基の保護基を脱離するのに慣用されてい
る手段に従つて容易に行なうことができる。
この様にして得た本発明の新規合成基質はSFP
の酵素作用によつてＰ−ニトロアニリンが生成せ
られるので、このものを比色定量することにより
SFP活性を求めることができる。本基質は以下に
記載の如くSFPを測定するためのすぐれた新規合
成基質である。下記にその一例を示す。
The present invention relates to human spleen fibulin degrading enzyme (hereinafter referred to as
It is abbreviated as SFP. ) and relates to a new synthetic substrate that specifically reacts with The present inventors developed SFP, a novel synthetic substrate succinyl-L-tyrosyl-L-leucyl- that can specifically and sensitively measure elastase-like enzymes in leukocytes.
Although we had previously filed a patent application (Japanese Patent Application No. 131709/1983) for L-valine-P-nitroanilide, the inventors of the present invention have conducted further research and discovered SFP.
The present invention has been completed by discovering a new synthetic substrate that has excellent specificity for. SFP is a neutral proteinase that specifically degrades fibrin and fibrinogen, and is a basic protein with a molecular weight of approximately 30,000. SFP is not present in germ-free animals. In intravascular coagulation syndrome caused by bacterial endotoxin administration, it increases with the onset of blood coagulation hyperactivity and recovers with its resolution. This enzyme is thought to be closely related to the microthrombus removal mechanism in reticuloendothelial system (hereinafter abbreviated as RES) cells. This enzyme is originally an insoluble intragranular enzyme, but
When its activity increases, it also appears in the blood as a soluble enzyme. Therefore, by measuring blood enzymes using this substrate, SFP can be measured separately from plasmin action.
It can be inferred that RES activity is increased. The novel polypeptide derivative according to the present invention is represented by the following general formula. (In the formula, A represents a tert-butyloxycarbonyl group or a succinyl group.) The principle of measurement of SFP using this substrate is shown as a chemical formula as follows. (In the formula, A is the same as above.) That is, the present substrate is mixed with the test serum in a pH 7 buffer solution, and the absorbance of P-nitroaniline produced in proportion to the concentration of SFP is measured. In addition, other color-forming substances or fluorescent substances can be used instead of P-nitroaniline, and direct measurement can be performed based on changes in absorbance in the visible region or changes in fluorescence spectrum, or it can be used to quantify aromatic amino compounds. Applying the diazo coloring reaction, indophenol coloring reaction, etc. that are carried out,
It is also possible to measure by increasing the degree of color development. As described above, the measurement system can be implemented in various combinations by applying known methods used in the field of clinical testing, but the scope of the present invention is not limited thereby. The polypeptide derivative can be obtained as follows. For example, L-alanine (hereinafter abbreviated as L-Ala) with a protected amino group and L-tyrosyl-L-leucyl-L-valine-P-nitroanilide (hereinafter L-Tyr-L-Leu-L-Val) -Abbreviated as PNA)
N,N′-dicyclohexylcarbodiimide method,
Condensation is performed using N,N'-dicyclohexylcarbodiimide and a conventional method such as an additive method, an amide method, or a mixed acid anhydride method to obtain an N-protected polypeptide derivative, that is, a protecting group -L-Ala-L-Tyr-L-
Leu-L-Val-PNA can be obtained. The amino protecting group of the condensate is removed by a conventional method to obtain a free polypeptide derivative H-L-Ala-L-
Tyr-L-Leu-L-Val-PNA is obtained. Furthermore, this free amino group was succinylated with succinic anhydride in ethyl acetate or pyridine in the presence of triethylamine to give succinyl-L-Ala-L-
Tyr-L-Leu-L-Val-PNA may be used. Note that commercially available L-Ala used in the present invention can be used. On the other hand, L- with a protected amino group
Tyr-L-Leu-L-Val-PNA can be synthesized by the method described in Patent Application No. 131709/1989 previously filed by the present inventors. That is, N-tert-butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-valine-
7.6 g (1 mmol) of P-nitroanilide
After dissolving in 0.4 ml of normal hydrogen chloride dioxane solution and stirring for 10 minutes, 2.6 ml of dioxane was added and further stirred for 30 minutes at room temperature. Add 50 ml of ether, collect the resulting precipitate by filtration, and dry over caustic potash. The obtained hydrogen chloride salt of L-leucyl-L-valine-P-nitroanilide was mixed with N,
Dissolve in 5 ml of N'-dimethylformamide, adjust the pH to 8 with triethylamine, and add 0.34 g of N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosine.
(1.2 mmol) and 0.135 g (1 mmol) of 1-hydroxybenzotriazole were added and dissolved, and ice-
The mixture was cooled with sodium chloride, 0.25 g (1.2 mmol) of N,N'-dicyclohexylcarbodiimide was added, and the mixture was stirred at room temperature for 18 hours. The resulting precipitate was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate and washed with 10% citric acid, 5% sodium carbonate, and then water under ice cooling. The ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the ethyl acetate was distilled off. When ether is added to the residue, the desired product is obtained as colorless crystals with a melting point of 210-211.5°C. In addition, tert-butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-valine-P-nitroanilide is described by Sato, K., Nagai, U., and Kawai,
M., “Peptide Chemistry 1979”, H. Yonehara
ed., Protein Research Foundation, Osaka;
1980, p. 149, and N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosine
Anderson, G.W., and McGregor, A.C., J.
Obtained by the method described in Am.Chem., Soc., vol. 79, p. 6180, 1957. Protective groups necessary for carrying out the present invention include protecting groups for amino groups commonly used in peptide synthesis, such as benzyloxycarbonyl group and tert-butyloxycarbonyl group. Further, the protecting group can be easily removed by a method commonly used for removing the protecting group of an amino group during peptide synthesis. The novel synthetic substrate of the present invention obtained in this way is SFP
P-nitroaniline is produced by the enzymatic action of
SFP activity can be determined. This substrate is an excellent new synthetic substrate for measuring SFP as described below. An example is shown below.
【表】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明す
る
実施例 １
Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン
−Ｐ−ニトロアニリド
Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−チロシ
ル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニ
リド1.2ｇ（0.002モル）に7.5規定塩化水素ジオキ
サン溶液1.8mlを加え、40分間撹拌した後エーテ
ル50mlを加え、生じた白色沈殿を遠心分離して集
めた。デシケーター中水酸化カリウム上で乾燥
し、得られたＬ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−
バリン−Ｐ−ニトロアニリドの塩化水素塩をＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）30mlに溶解
し、トリエチルアミンでPH８に調節した後Ｎ−第
三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン0.38ｇ
（0.002モル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル0.27ｇ（0.002モル）を加え溶解し、氷−食塩
にて冷却し、Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド0.45ｇ（0.0022モル）を加え室温にて18
時間撹拌した。生じた沈殿を去し、溶媒を減圧
下留去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、氷冷
下10％クエン酸、５％炭酸ナトリウム続いて水で
洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上
で乾燥し、酢酸エチルを留去。残渣オイルにエー
テルを加え、粗生成物を得た。シリカゲルクロマ
トグラフイーで精製し、クロロホルムーエーテル
より結晶化し、融点153〜155℃旋光度〔α〕25 D−
65.9゜（メタノール、Ｃ＝1.38）の目的化合物を得
た。収量540mg（収率39.4％）、このものはシリカ
ゲル薄層クロマトグラフイー（クロロホルム：メ
タノール：酢酸＝90：８：２；クロロホルム：メ
タノール：水＝８：３：１の下層）にて単一のス
ポツトを示した。
元素分析値（C34H48N7C9として）
計算値；Ｃ 59.64 Ｈ 7.06 Ｎ 12.27
実測値；Ｃ 59.44 Ｈ 7.01 Ｎ 12.23
実施例 ２
サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド
Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−
Ｐ−ニトロアニリド340mg（0.50ミリモル）に7.5
規定塩化水素ジオキサン溶液1.2mlを加え、室温
で撹拌した。20分後エーテル50mlを加え生じ沈殿
を吸引過で集め、デシケーター中水酸化カリウ
ム上で乾燥した。この化合物を水10mlに溶解し炭
酸ナトリウムを加えPH８〜９とした。生じたオイ
ルを酢酸エチルにて抽出するとＬ−アラニル−Ｌ
−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニ
トロアニリドが結晶として析出する。これを吸引
過で集めピリジン10mlに溶解し、トリエチルア
ミン0.07ml（0.50ミリモル）を加え氷冷し撹拌し
た。無水コハク酸150mg（1.5ミリモル）を５回に
分けて15分間隔で加え、さらに３時間撹拌した。
反応液を留去し、残留物を10％酢酸−酢酸エチル
（10ml＋10ml）に溶解し、酢酸エチル層を分離後
水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後酢酸エ
チルを留去した。残渣にエーテルを加え生じた白
色沈殿を吸引過で集めた。この粗サクシニル−
Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ
−バリン−Ｐ−ニトロアニリド240mg（0.35ミリ
モル）をメタノール15mlに溶解し、１規定水酸化
ナトリウム0.70ml（0.70ミリモル）を加え室温に
て40分間撹拌した。酢酸で中和の後メタノールを
留去し、残渣を酢酸エチル−10％酢酸（10ml−10
ml）に溶解した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで乾燥した後、酢酸エチルを留去し
た。残渣にエーテルを加え、生じた白色結晶を吸
引過で集め目的化合物を得た。収量180mg（収
率56.2％）、融点230〜234℃、旋光度〔α〕25 D−
28.0゜（メタノール、Ｃ＝1.0）、薄層クロマトグラ
フイー上（クロロホルム：メタノール：酢酸＝
90：８：２；クロロホルム：メタノール：水＝
８：３：１の下層）で単一スポツトを示した。
元素分析値（C33H44N6O10）
計算値；Ｃ 57.88 Ｈ 6.47 Ｎ 12.27
実測値；Ｃ 57.71 Ｈ 6.77 Ｎ 11.97[Table] Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. Example 1 N-tert-butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-valine-P-nitroanilide To 1.2 g (0.002 mol) of 3-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-valine-P-nitroanilide was added 1.8 ml of a 7.5N hydrogen chloride dioxane solution, and after stirring for 40 minutes, 50 ml of ether was added to give the resulting product. The white precipitate was collected by centrifugation. Dry over potassium hydroxide in a desiccator to obtain L-tyrosyl-L-leucyl-L-
The hydrogen chloride salt of valine-P-nitroanilide is N,
0.38 g of N-tert-butyloxycarbonyl-L-alanine was dissolved in 30 ml of N-dimethylformamide (DMF) and adjusted to pH 8 with triethylamine.
(0.002 mol), 0.27 g (0.002 mol) of 1-hydroxybenzotriazole were added and dissolved, cooled with ice-salt, and 0.45 g (0.0022 mol) of N,N'-dicyclohexylcarbodiimide was added and heated to 18 mol at room temperature.
Stir for hours. The resulting precipitate was removed and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate and washed with 10% citric acid, 5% sodium carbonate, and then water under ice cooling. The ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the ethyl acetate was distilled off. Ether was added to the residual oil to obtain a crude product. Purified by silica gel chromatography and crystallized from chloroform-ether, melting point: 153-155℃ Optical rotation [α] 25 D −
The target compound of 65.9° (methanol, C=1.38) was obtained. The yield was 540 mg (yield 39.4%), and this product was analyzed using silica gel thin layer chromatography (chloroform:methanol:acetic acid = 90:8:2; lower layer of chloroform:methanol:water = 8:3:1). The spot was shown. Elemental analysis value (as C 34 H 48 N 7 C 9 ) Calculated value; C 59.64 H 7.06 N 12.27 Actual value; C 59.44 H 7.01 N 12.23 Example 2 Succinyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L
-Leucyl-L-valine-P-nitroanilide N-tert-butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-valine-
7.5 to 340 mg (0.50 mmol) of P-nitroanilide
1.2 ml of normal hydrogen chloride dioxane solution was added, and the mixture was stirred at room temperature. After 20 minutes, 50 ml of ether was added and the resulting precipitate was collected by suction filtration and dried over potassium hydroxide in a desiccator. This compound was dissolved in 10 ml of water, and sodium carbonate was added to adjust the pH to 8-9. When the resulting oil is extracted with ethyl acetate, L-alanyl-L
-Tyrosyl-L-leucyl-L-valine-P-nitroanilide precipitates as crystals. This was collected by suction filtration and dissolved in 10 ml of pyridine, and 0.07 ml (0.50 mmol) of triethylamine was added thereto, cooled on ice, and stirred. 150 mg (1.5 mmol) of succinic anhydride was added in 5 portions at 15 minute intervals, and the mixture was further stirred for 3 hours.
The reaction solution was distilled off, the residue was dissolved in 10% acetic acid-ethyl acetate (10 ml + 10 ml), and the ethyl acetate layer was separated, washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and then ethyl acetate was distilled off. Ether was added to the residue and the resulting white precipitate was collected by suction filtration. This crude succinyl
L-alanyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L
240 mg (0.35 mmol) of -valine-P-nitroanilide was dissolved in 15 ml of methanol, 0.70 ml (0.70 mmol) of 1N sodium hydroxide was added, and the mixture was stirred at room temperature for 40 minutes. After neutralization with acetic acid, methanol was distilled off, and the residue was diluted with ethyl acetate-10% acetic acid (10ml-10%
ml). The organic layer was washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and then ethyl acetate was distilled off. Ether was added to the residue, and the resulting white crystals were collected by suction filtration to obtain the target compound. Yield 180mg (yield 56.2%), melting point 230-234℃, optical rotation [α] 25 D −
28.0° (methanol, C = 1.0), on thin layer chromatography (chloroform: methanol: acetic acid =
90:8:2; Chloroform: Methanol: Water =
8:3:1 lower layer) showed a single spot. Elemental analysis value (C 33 H 44 N 6 O 10 ) Calculated value; C 57.88 H 6.47 N 12.27 Actual value; C 57.71 H 6.77 N 11.97