JPH0136480B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒト脾臓フイブリン分解酵素（以下
SFPと略す。）と特異的に反応する新規な合成基
質に関するものである。 本発明者らはSFP、白血球中のエラスターゼ様
酵素を特異的に且つ感度よく測定できる新規合成
基質サクシニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−
Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリドについて先に特
許出願（特願昭55−131709号）を行なつている
が、本発明者らはさらに研究を重さねた結果SFP
に対しすぐれた特異性を有する新規合成基質を見
い出し、本発明を完成した。 SFPは特異的にフイブリンおよびフイブリノー
ゲンを分解する中性プロテイナーゼであり、分子
量約30000の塩基性蛋白質である。SFPは無菌動
物には存在しない。細菌性内毒素投与により惹起
した血管内凝固症候群においては血液凝固機能亢
進の発現と共に増加し、その消退と共に回復す
る。この酵素は網内系（以下RESと略す。）細胞
における微細血栓除去機構と密接な関連を有する
ものと考えられる。 本酵素は元来不溶性細胞顆粒内酵素であるが、
活性増加時には溶性酵素として血中にも出現す
る。従つて本基質を使用しての血中酵素測定によ
りプラスミン作用とは分離してSFPが測定でき、
RESの活性亢進を推察することができる。本発
明に係る新規なポリペプチド誘導体は次の一般式
で示される。 （式中Ａは第三ブチルオキシカルボニル基又はサ
クシニル基を示す。） 本基質によるSFPの測定原理を化学式で示せば
下記の通りである。 （式中Ａは前記と同様である。） 即ち本基質をPH７の緩衝液中被検血清と混合
し、SFPの濃度に比例して生成するＰ−ニトロア
ニリンの吸光度を測定する。なお、Ｐ−ニトロア
ニリンの代りに他の発色性物質あるいは螢光性物
質を使用し、可視部の吸光度の変化、螢光スペク
トルの変化により直接測定したり、あるいは芳香
族アミノ化合物の定量で通常行なわれるジアゾ発
色反応、インドフエノール発色反応等を応用し、
発色度を高めて測定することも可能である。以上
の如く測定系は臨床検査の分野で行なわれている
公知方法を応用して種々の組合せにより実施する
ことができるが、本発明の範囲がそれにより限定
されるものではない。なお、該ポリペプチド誘導
体は次の如くして得ることができる。 例えば保護されたアミノ基をもつＬ−アラニン
（以下Ｌ−Alaと略す。）とＬ−チロシル−Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド（以下
Ｌ−Tyr−Ｌ−Leu−Ｌ−Val−PNAと略す。）
をＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド法、
Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドと添
加剤による方法、アチド法あるいは混合酸無水物
法等常法により縮合させ、Ｎ−保護ポリペプチド
誘導体即ち保護基−Ｌ−Ala−Ｌ−Tyr−Ｌ−
Leu−Ｌ−Val−PNAを得ることができる。な
お、該縮合物のアミノ保護基を常法により脱離さ
せ、遊離ポリペプチド誘導体Ｈ−Ｌ−Ala−Ｌ−
Tyr−Ｌ−Leu−Ｌ−Val−PNAを得る。さらに
この遊離したアミノ基をトリエチルアミン存在
下、酢酸エチルまたはピリジン中無水コハク酸に
てサクシニル化しサクシニル−Ｌ−Ala−Ｌ−
Tyr−Ｌ−Leu−Ｌ−Val−PNAとすればよい。 なお、本発明で使用するＬ−Alaは市販品が利
用できる。一方、保護されたアミノ基を持つＬ−
Tyr−Ｌ−Leu−Ｌ−Val−PNAは本発明者らが
先に出願した特許願昭55−131709号に記載の方法
で合成することができる。即ち、Ｎ−第三ブチル
オキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−
Ｐ−ニトロアニリド0.43ｇ（１ミリモル）を7.6
規定塩化水素ジオキサン溶液0.4mlに溶かし10分
間撹拌した後ジオキサン2.6mlを加えさらに室温
にて30分間撹拌した。 エーテル50mlを加え生じた沈澱を濾取し、苛性
カリ上で乾燥。得られたＬ−ロイシル−Ｌ−バリ
ン−Ｐ−ニトロアニリドの塩化水素塩をＮ，
N′−ジメチルホルムアミド５mlに溶解し、トリ
エチルアミンでPH８に調節し、そこへＮ−第三ブ
チルオキシカルボニル−Ｌ−チロシン0.34ｇ
（1.2ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール0.135ｇ（１ミリモル）を加え溶解し、氷−
食塩にて冷却し、Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド0.25ｇ（1.2ミリモル）を加え室温
にて18時間攪拌した。生じた沈澱を濾去し、溶媒
を減圧下留去した。残留物を酢酸エチルに溶解
し、氷冷下10％クエン酸、５％炭酸ナトリウム続
いて水で洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナト
リウム上で乾燥し、酢酸エチルを留去。残留物に
エーテルを加えると融点210〜211.5℃の無色結晶
の目的物が得られる。尚、第三ブチルオキシカル
ボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロ
アニリドはSato、K.、Nagai、U.、and Kawai、
M.、“Peptide Chemistry 1979”、H.Yonehara
編、Protein Research Foundation、Osaka、
1980年、149頁に記載の方法で、またＮ−第三ブ
チルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンは
Andeerson、G.W.、and McGregor、A.C.、J.
Am.Chem.、Soc.、79巻、6180頁、1957年に記載
の方法で得た。 本発明を実施するに必要な保護基はベンジルオ
キシカルボニル基、第三ブチルオキシカルボニル
基などペプチド合成に際し慣用されているアミノ
基の保護基をあげることができる。 また、保護基を脱離するにはペプチド合成の際
にアミノ基の保護基を脱離するのに慣用されてい
る手段に従つて容易に行なうことができる。 この様にして得た本発明の新規合成基質はSFP
の酵素作用によつてＰ−ニトロアニリンが生成せ
られるので、このものを比色定量することにより
SFP活性を求めることができる。本基質は以下に
記載の如くSFPを測定するためのすぐれた新規合
成基質である。下記にその一例を示す。

【表】 次に実施例により本発明をさらに詳細に説明す
る 実施例 １ Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン
−Ｐ−ニトロアニリド Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−チロシ
ル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニ
リド1.2ｇ（0.002モル）に7.5規定塩化水素ジオキ
サン溶液1.8mlを加え、40分間撹拌した後エーテ
ル50mlを加え、生じた白色沈殿を遠心分離して集
めた。デシケーター中水酸化カリウム上で乾燥
し、得られたＬ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−
バリン−Ｐ−ニトロアニリドの塩化水素塩をＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）30mlに溶解
し、トリエチルアミンでPH８に調節した後Ｎ−第
三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン0.38ｇ
（0.002モル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル0.27ｇ（0.002モル）を加え溶解し、氷−食塩
にて冷却し、Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド0.45ｇ（0.0022モル）を加え室温にて18
時間撹拌した。生じた沈殿を去し、溶媒を減圧
下留去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、氷冷
下10％クエン酸、５％炭酸ナトリウム続いて水で
洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上
で乾燥し、酢酸エチルを留去。残渣オイルにエー
テルを加え、粗生成物を得た。シリカゲルクロマ
トグラフイーで精製し、クロロホルムーエーテル
より結晶化し、融点153〜155℃旋光度〔α〕²⁵ _D−
65.9゜（メタノール、Ｃ＝1.38）の目的化合物を得
た。収量540mg（収率39.4％）、このものはシリカ
ゲル薄層クロマトグラフイー（クロロホルム：メ
タノール：酢酸＝90：８：２；クロロホルム：メ
タノール：水＝８：３：１の下層）にて単一のス
ポツトを示した。 元素分析値（C₃₄H₄₈N₇C₉として） 計算値；Ｃ 59.64 Ｈ 7.06 Ｎ 12.27 実測値；Ｃ 59.44 Ｈ 7.01 Ｎ 12.23 実施例 ２ サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−
Ｐ−ニトロアニリド340mg（0.50ミリモル）に7.5
規定塩化水素ジオキサン溶液1.2mlを加え、室温
で撹拌した。20分後エーテル50mlを加え生じ沈殿
を吸引過で集め、デシケーター中水酸化カリウ
ム上で乾燥した。この化合物を水10mlに溶解し炭
酸ナトリウムを加えPH８〜９とした。生じたオイ
ルを酢酸エチルにて抽出するとＬ−アラニル−Ｌ
−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニ
トロアニリドが結晶として析出する。これを吸引
過で集めピリジン10mlに溶解し、トリエチルア
ミン0.07ml（0.50ミリモル）を加え氷冷し撹拌し
た。無水コハク酸150mg（1.5ミリモル）を５回に
分けて15分間隔で加え、さらに３時間撹拌した。
反応液を留去し、残留物を10％酢酸−酢酸エチル
（10ml＋10ml）に溶解し、酢酸エチル層を分離後
水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後酢酸エ
チルを留去した。残渣にエーテルを加え生じた白
色沈殿を吸引過で集めた。この粗サクシニル−
Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ
−バリン−Ｐ−ニトロアニリド240mg（0.35ミリ
モル）をメタノール15mlに溶解し、１規定水酸化
ナトリウム0.70ml（0.70ミリモル）を加え室温に
て40分間撹拌した。酢酸で中和の後メタノールを
留去し、残渣を酢酸エチル−10％酢酸（10ml−10
ml）に溶解した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで乾燥した後、酢酸エチルを留去し
た。残渣にエーテルを加え、生じた白色結晶を吸
引過で集め目的化合物を得た。収量180mg（収
率56.2％）、融点230〜234℃、旋光度〔α〕²⁵ _D−
28.0゜（メタノール、Ｃ＝1.0）、薄層クロマトグラ
フイー上（クロロホルム：メタノール：酢酸＝
90：８：２；クロロホルム：メタノール：水＝
８：３：１の下層）で単一スポツトを示した。 元素分析値（C₃₃H₄₄N₆O₁₀） 計算値；Ｃ 57.88 Ｈ 6.47 Ｎ 12.27 実測値；Ｃ 57.71 Ｈ 6.77 Ｎ 11.97

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中Ａは第三ブチルオキシカルボニル基または
   サクシニル基を示す。） で示されるポリペプチド誘導体。