JPH0141310B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0141310B2 JPH0141310B2 JP55175137A JP17513780A JPH0141310B2 JP H0141310 B2 JPH0141310 B2 JP H0141310B2 JP 55175137 A JP55175137 A JP 55175137A JP 17513780 A JP17513780 A JP 17513780A JP H0141310 B2 JPH0141310 B2 JP H0141310B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- kallikrein
- human urine
- supernatant
- aluminum silicate
- urine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は人尿中に含有されているカリクレイン
を収率よくかつ高純度に回収する方法に関するも
のである。
を収率よくかつ高純度に回収する方法に関するも
のである。
カリクレインは血漿中のキニノーゲンに作用し
てキニンを特異的に遊離させる酵素であり、種々
の組織や体液すなわち顎下腺、汗腺、唾液腺、肝
臓、小腸、血清、尿などに分布していることが知
られている。その薬理作用として平滑筋収縮作
用、毛細血管透過性亢進作用、血管拡張作用、血
圧降下作用、白血球凝集作用、疼痛誘発作用、カ
テコールアミン分泌作用等を示す。カリクレイン
製剤は各領域にわたつて広く使用されている有用
な医薬品であり、内科領域では脳血管障害、冠動
脈性心臓疾患及び高血圧症等の治療に使用され、
外科領域では種々の原因に依る四肢末梢血行障害
の治療に使用され、眼科領域では網膜末梢血管拡
張及び眼底血圧降下等に使用され、さらに耳鼻科
領域ではメニエル症候群や神経性耳鳴等の治療に
使用されている。
てキニンを特異的に遊離させる酵素であり、種々
の組織や体液すなわち顎下腺、汗腺、唾液腺、肝
臓、小腸、血清、尿などに分布していることが知
られている。その薬理作用として平滑筋収縮作
用、毛細血管透過性亢進作用、血管拡張作用、血
圧降下作用、白血球凝集作用、疼痛誘発作用、カ
テコールアミン分泌作用等を示す。カリクレイン
製剤は各領域にわたつて広く使用されている有用
な医薬品であり、内科領域では脳血管障害、冠動
脈性心臓疾患及び高血圧症等の治療に使用され、
外科領域では種々の原因に依る四肢末梢血行障害
の治療に使用され、眼科領域では網膜末梢血管拡
張及び眼底血圧降下等に使用され、さらに耳鼻科
領域ではメニエル症候群や神経性耳鳴等の治療に
使用されている。
カリクレインの回収法は従来からきわめて多数
の方法が提案されてきたが、従来の方法は操作が
複雑であり、収率や純度において必ずしも十分で
はなかつた。このため人尿からのカリクレイン製
剤は比較的高価であり、従来の方法はカリクレイ
ン製剤の工業的製法として満足できるものではな
かつた。
の方法が提案されてきたが、従来の方法は操作が
複雑であり、収率や純度において必ずしも十分で
はなかつた。このため人尿からのカリクレイン製
剤は比較的高価であり、従来の方法はカリクレイ
ン製剤の工業的製法として満足できるものではな
かつた。
本発明は人尿中に存在するカリクレインを収率
よくかつ高純度に回収する工業的製法を提供しよ
うとするものである。
よくかつ高純度に回収する工業的製法を提供しよ
うとするものである。
本発明は人尿とコロイド性含水ケイ酸アルミニ
ウムをPH4.0〜6.0において接触させ、カリクレイ
ン以外の生理活性物質の大部分をコロイド性含水
ケイ酸アルミニウムに吸着させて上清を分離し、
この上清にPH7.5〜9.5に平衡化した動物臓器由来
の水不溶性トリプシン阻害剤を接触させてカリク
レインを吸着し、吸着されたカリクレインをトリ
プシン阻害剤から溶出させるのである。
ウムをPH4.0〜6.0において接触させ、カリクレイ
ン以外の生理活性物質の大部分をコロイド性含水
ケイ酸アルミニウムに吸着させて上清を分離し、
この上清にPH7.5〜9.5に平衡化した動物臓器由来
の水不溶性トリプシン阻害剤を接触させてカリク
レインを吸着し、吸着されたカリクレインをトリ
プシン阻害剤から溶出させるのである。
本発明は腐敗していない新鮮な人尿を原料と
し、人尿はそのPHが5.5〜９であればそのまゝ使
用してもよいが、PHを4.0〜6.0に調整しておくの
が好ましい。また尿中の浮遊物及びPHの調整時に
生ずる沈殿物は常法例えば遠心分離、過、透析
などの処理で除去しておく。本発明に用いるコロ
イド性含水ケイ酸アルミニウムは人尿からカリク
レイン以外の生理活性物質を選択的に吸着する機
能を有し、PH4.0〜6.0において人尿中のカリクレ
イン以外の生理活性物質は約94〜100％が吸着さ
れる。このコロイド性含水ケイ酸アルミニウムと
はSiO2とAl2O3を主とし、SiO2／Al2O3の比が4.4
〜7.7（平均5.9）からなる化合物である。使用量
は原料尿の１に対して50〜500mgで十分である
が、収量の問題を別にすればこれ以上多く使用し
てもよい。
し、人尿はそのPHが5.5〜９であればそのまゝ使
用してもよいが、PHを4.0〜6.0に調整しておくの
が好ましい。また尿中の浮遊物及びPHの調整時に
生ずる沈殿物は常法例えば遠心分離、過、透析
などの処理で除去しておく。本発明に用いるコロ
イド性含水ケイ酸アルミニウムは人尿からカリク
レイン以外の生理活性物質を選択的に吸着する機
能を有し、PH4.0〜6.0において人尿中のカリクレ
イン以外の生理活性物質は約94〜100％が吸着さ
れる。このコロイド性含水ケイ酸アルミニウムと
はSiO2とAl2O3を主とし、SiO2／Al2O3の比が4.4
〜7.7（平均5.9）からなる化合物である。使用量
は原料尿の１に対して50〜500mgで十分である
が、収量の問題を別にすればこれ以上多く使用し
てもよい。
コロイド性含水ケイ酸アルミニウムは前処理と
して十分に洗浄したのち必要量を人尿中に添加
し、尿中に含有されている生理活性物質と接触さ
せ、ウロキナーゼなどのカリクレイン以外の生理
活性物質（蛋白分解酵素）を吸着させる。接触時
間は約30分から５時間であり、処理法はカラムク
ロマト法でもよいがバツチ法で十分であり、バツ
チ法の場合は撹拌する。処理温度は室温でよい
が、より好ましくは５〜30℃である。吸着が十分
に行われた後、傾斜法又は遠心分離により吸着剤
と上清を分離する。分離されたコロイド性含水ケ
イ酸アルミニウムは洗浄したのち吸着した生理活
性物質を溶出させて再使用する。
して十分に洗浄したのち必要量を人尿中に添加
し、尿中に含有されている生理活性物質と接触さ
せ、ウロキナーゼなどのカリクレイン以外の生理
活性物質（蛋白分解酵素）を吸着させる。接触時
間は約30分から５時間であり、処理法はカラムク
ロマト法でもよいがバツチ法で十分であり、バツ
チ法の場合は撹拌する。処理温度は室温でよい
が、より好ましくは５〜30℃である。吸着が十分
に行われた後、傾斜法又は遠心分離により吸着剤
と上清を分離する。分離されたコロイド性含水ケ
イ酸アルミニウムは洗浄したのち吸着した生理活
性物質を溶出させて再使用する。
吸着剤を分離した上清はカリクレインの原料と
して利用される。この上清はそのまま又は遠心分
離を行つたのち、PHを7.5〜9.5好ましくはPH８〜
９に調整する。この上清に動物臓器由来の水不溶
性トリプシン阻害剤を加えてカリクレインを吸着
させる。こゝに動物臓器由来の水不溶性トリプシ
ン阻害剤は公知の動物臓器由来のトリプシン阻害
剤を常法の水不溶化方法によつて固定化したもの
である。動物臓器由来のトリプシン阻害剤として
はKunitzのトリプシンインヒビター〔J.Gen.
Physiol.，19 991（1936）〕、例えばアプロチニン
が好適である。このトリプシン阻害剤は洗浄し、
PH7.5〜9.5に調整し、好ましくはこの範囲のPHを
有する緩衝液で平衡化したのち、バツチ法又はカ
ラムクロマトグラフイ法によつてカリクレインを
含有する前記上清に接触させる。接触条件として
時間は約30分から20時間、温度は室温でよいが好
ましくは５〜30℃である。使用量はカリクレイン
を含む上清10に対して約0.5〜10mlであり、カ
リクレインを吸着したのち、バツチ法の場合は傾
斜法又は濾過により吸着体を回収し、カラムクロ
マト法の場合はカラムを洗浄したのち、溶離用緩
衝液で吸着体からカリクレインを溶出させる。溶
出はPH３〜５の酸性水溶液で行われるのが好適で
あり、例えばPH４の0.01〜0.2M酢酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液、コハク酸緩衝液等が用いられる。
このようにして得た溶出液は純度の高いカリクレ
インを多量に含有しており、この溶出液を精製し
て目的とするカリクレインを回収する。なお精製
工程においてウイルス不活化のための加熱処理を
行う。
して利用される。この上清はそのまま又は遠心分
離を行つたのち、PHを7.5〜9.5好ましくはPH８〜
９に調整する。この上清に動物臓器由来の水不溶
性トリプシン阻害剤を加えてカリクレインを吸着
させる。こゝに動物臓器由来の水不溶性トリプシ
ン阻害剤は公知の動物臓器由来のトリプシン阻害
剤を常法の水不溶化方法によつて固定化したもの
である。動物臓器由来のトリプシン阻害剤として
はKunitzのトリプシンインヒビター〔J.Gen.
Physiol.，19 991（1936）〕、例えばアプロチニン
が好適である。このトリプシン阻害剤は洗浄し、
PH7.5〜9.5に調整し、好ましくはこの範囲のPHを
有する緩衝液で平衡化したのち、バツチ法又はカ
ラムクロマトグラフイ法によつてカリクレインを
含有する前記上清に接触させる。接触条件として
時間は約30分から20時間、温度は室温でよいが好
ましくは５〜30℃である。使用量はカリクレイン
を含む上清10に対して約0.5〜10mlであり、カ
リクレインを吸着したのち、バツチ法の場合は傾
斜法又は濾過により吸着体を回収し、カラムクロ
マト法の場合はカラムを洗浄したのち、溶離用緩
衝液で吸着体からカリクレインを溶出させる。溶
出はPH３〜５の酸性水溶液で行われるのが好適で
あり、例えばPH４の0.01〜0.2M酢酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液、コハク酸緩衝液等が用いられる。
このようにして得た溶出液は純度の高いカリクレ
インを多量に含有しており、この溶出液を精製し
て目的とするカリクレインを回収する。なお精製
工程においてウイルス不活化のための加熱処理を
行う。
本発明は人尿に含有されているカリクレインを
収率よくかつ高純度に回収することができ、人尿
由来カリクレインの工業的製法として満足しうる
ものであり、医療分野における価値は極めて高
い。
収率よくかつ高純度に回収することができ、人尿
由来カリクレインの工業的製法として満足しうる
ものであり、医療分野における価値は極めて高
い。
本発明による人尿からのカリクレインの回収率
は45〜75％であり、得られたカリクレインの比活
性は660〜730KU／A280〔単位Frey.E.K.，
Kraut，H.，and Werle，E.，1950，
“Kallikrein，Padutin”，Enke，Verlag，
Stuttgart〕、その純度はポリアクリルアミドゲル
のデイスク電気泳動により90〜100％〔Davis，
O.，1964，Ann.N.Y.Acad.Sci.，121，Art.2，
305〕であつた。
は45〜75％であり、得られたカリクレインの比活
性は660〜730KU／A280〔単位Frey.E.K.，
Kraut，H.，and Werle，E.，1950，
“Kallikrein，Padutin”，Enke，Verlag，
Stuttgart〕、その純度はポリアクリルアミドゲル
のデイスク電気泳動により90〜100％〔Davis，
O.，1964，Ann.N.Y.Acad.Sci.，121，Art.2，
305〕であつた。
なおカリクレイン活性の測定は、Ｈ−Ｄ−Val
−Ｌ−Leu−Ｌ−Arg−Ｐ−nitroanilide
（Testzyme Ｓ−2266，Kabi Diagnostica
Sweden）を基質として行つた。この基質は人尿
由来のカリクレインに特異性の高い基質であるこ
とが知られている。しかし、尿中のカリクレイン
以外の生理活性物質によつても分解を受けるた
め、正確にカリクレインのみを定量するとはいえ
ない。そこで反応系にSBTI（Soybean trypsin
inhibitor）及びアプロチニンを添加してこれら
をコントロールとした。すなわちカリクレインは
SBTIに阻害されないが、アプロチニンには阻害
される。これに対して人尿中に存在することが知
られているウロキナーゼはSBTIとアプロチニン
の両方に阻害を受けず、またトリプシン等の多く
の蛋白分解酵素はSBTIにより阻害される。この
ようにカリクレインに特異性の高い基質を用いる
のに加えて、カリクレインを特異的に定量する測
定条件を用いることによりカリクレインを正確に
定量した。
−Ｌ−Leu−Ｌ−Arg−Ｐ−nitroanilide
（Testzyme Ｓ−2266，Kabi Diagnostica
Sweden）を基質として行つた。この基質は人尿
由来のカリクレインに特異性の高い基質であるこ
とが知られている。しかし、尿中のカリクレイン
以外の生理活性物質によつても分解を受けるた
め、正確にカリクレインのみを定量するとはいえ
ない。そこで反応系にSBTI（Soybean trypsin
inhibitor）及びアプロチニンを添加してこれら
をコントロールとした。すなわちカリクレインは
SBTIに阻害されないが、アプロチニンには阻害
される。これに対して人尿中に存在することが知
られているウロキナーゼはSBTIとアプロチニン
の両方に阻害を受けず、またトリプシン等の多く
の蛋白分解酵素はSBTIにより阻害される。この
ようにカリクレインに特異性の高い基質を用いる
のに加えて、カリクレインを特異的に定量する測
定条件を用いることによりカリクレインを正確に
定量した。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。
る。
実施例 １
成人男子より採集した新鮮尿約150をPH5.0に
調整し、蒸留水で洗浄したコロイド性含水ケイ酸
アルミニウム（乾燥重量50ｇ）と接触させる。室
温で約１時間撹拌して十分に接触させたのち、遠
心分離により上清を採取する。上清130にトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン787ｇを加
えて溶かし、3N−HClにてPH8.5に調整する。次
に0.05Mのトリス塩酸緩衝液でPH8.5に平衡化し
た50mlのアプロチニン・セフアロース4Bを加え、
室温で約20時間撹拌して吸着反応を行つた。反応
液を過してゲルをカラムに充填したのち、PH
8.5の0.05Mトリス塩酸緩衝液でカラムを洗浄し、
0.05M酢酸緩衝液PH4.0によりカリクレインを溶
出させた。このようにして純度90％の人尿由来の
カリクレインを70％の収率で回収し、その比活性
は700KU／A280であつた。
調整し、蒸留水で洗浄したコロイド性含水ケイ酸
アルミニウム（乾燥重量50ｇ）と接触させる。室
温で約１時間撹拌して十分に接触させたのち、遠
心分離により上清を採取する。上清130にトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン787ｇを加
えて溶かし、3N−HClにてPH8.5に調整する。次
に0.05Mのトリス塩酸緩衝液でPH8.5に平衡化し
た50mlのアプロチニン・セフアロース4Bを加え、
室温で約20時間撹拌して吸着反応を行つた。反応
液を過してゲルをカラムに充填したのち、PH
8.5の0.05Mトリス塩酸緩衝液でカラムを洗浄し、
0.05M酢酸緩衝液PH4.0によりカリクレインを溶
出させた。このようにして純度90％の人尿由来の
カリクレインを70％の収率で回収し、その比活性
は700KU／A280であつた。
実施例 ２
実施例１と同じコロイド性含水ケイ酸アルミニ
ウム処理を行つたのち、カリクレインの有効画分
をPH7.5に調整し、このものを限外分子量10000の
ホローフアイバーを用いて100倍に濃縮し、60℃，
10時間の加熱処理を行つた。次にトリス（ヒドロ
キシアミノ）メチルメタン7.9ｇを加えて溶解し、
以下実施例１と同じアプロチニン・セフアロース
処理を行なつた。得られたカリクレインの収率は
70％、比活性は700KU／A280であつた。
ウム処理を行つたのち、カリクレインの有効画分
をPH7.5に調整し、このものを限外分子量10000の
ホローフアイバーを用いて100倍に濃縮し、60℃，
10時間の加熱処理を行つた。次にトリス（ヒドロ
キシアミノ）メチルメタン7.9ｇを加えて溶解し、
以下実施例１と同じアプロチニン・セフアロース
処理を行なつた。得られたカリクレインの収率は
70％、比活性は700KU／A280であつた。
Claims (1)
- １ 人尿とコロイド性含水ケイ酸アルミニウムを
PH4.0〜6.0において接触させ、カリクレイン以外
の生理活性物質の大部分をコロイド性含水ケイ酸
アルミニウムに吸着させて上清を分離し、この上
清にPH7.5〜9.5にて動物臓器由来の水不溶性トリ
プシン阻害剤を接触させてカリクレインを吸着
し、吸着されたカリクレインをトリプシン阻害剤
から溶出させることを特徴とする人尿中のカリク
レインの回収法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55175137A JPS5798214A (en) | 1980-12-10 | 1980-12-10 | Recovery of kallikrein from human urine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55175137A JPS5798214A (en) | 1980-12-10 | 1980-12-10 | Recovery of kallikrein from human urine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5798214A JPS5798214A (en) | 1982-06-18 |
| JPH0141310B2 true JPH0141310B2 (ja) | 1989-09-05 |
Family
ID=15990930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55175137A Granted JPS5798214A (en) | 1980-12-10 | 1980-12-10 | Recovery of kallikrein from human urine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5798214A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60224632A (ja) * | 1984-04-24 | 1985-11-09 | Shunichi Naito | 皮膚疾患治療用外用剤 |
| CN109172815B (zh) * | 2018-10-17 | 2019-10-08 | 广东天普生化医药股份有限公司 | 人尿激肽原酶在制备治疗高血压合并高血脂药物中的应用 |
-
1980
- 1980-12-10 JP JP55175137A patent/JPS5798214A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5798214A (en) | 1982-06-18 |
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