JPH0559095B2 - - Google Patents
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- JPH0559095B2 JPH0559095B2 JP8358063A JP5806383A JPH0559095B2 JP H0559095 B2 JPH0559095 B2 JP H0559095B2 JP 8358063 A JP8358063 A JP 8358063A JP 5806383 A JP5806383 A JP 5806383A JP H0559095 B2 JPH0559095 B2 JP H0559095B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
-
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Description
本発明は、α−１−プロテイナーゼ阻害剤
（PI）を血漿（blood plasma）又は血漿画分
（blood plasma fractions）から分離するための
新規な方法に関する。本発明の更なる目的は以下
の記述から明らかになるであろう。ここに、本明
細書において部及びパーセントは特に断らない限
り重量によるものとする。 α−１−プロテイナーゼ阻害剤は、分子量
54000の糖蛋白質である。この蛋白質はいくつか
のオリゴ糖類単位が共有結合している単一のポリ
ペプチド鎖からなる。人間のPIは、内因性のセ
リンプロテイナーゼによる組織破壊を制御する役
割をもつている。血漿中のトリプシン阻害能力の
90％をもつPIの遺伝的欠陥は、肺気腫の早期発
達と関連していることが示されている。気腫と関
連する弾力素の分解は、多分弾力素線維分解酵素
及び天然産の組織及び血漿プロテイナーゼ阻害剤
の局所的不均衡に基因する。PIは人間の膵臓及
び白血球のエラスターゼを迅速に阻害する
（Biochem.Biophys.Res.Comm.，第72巻、１号、
33〜39頁、1976；同、第88巻、２号、346〜350
頁、1979）。 PIを血漿から分離するために多くの方法が用
いられてきた。これらの方法の多くは実験室的規
模での分離に関し、他は商業的規模での生産に関
するものであつた。 pannellら、Biochemistry，第13巻、5439〜
5445頁（1975）は、アルブミンの貧弱な血漿を集
め、固体硫酸アンモニウム（0.60〜0.80飽和）で
精密分離する方法を用いた。得られる沈殿を可溶
化し、透析し、DEAEセルロースのカラムに適用
する。0.05〜0.15MNaClの直線的グラジエントを
貯め、濃縮し、透析し、次いで再びDEAEセルロ
ースのカラムに適用する。0.05〜0.20NaClからの
直線的グラジエントを集め、貯え、濃縮してPI
を得る。 Saklatvalaら、Biochem.J.，第157巻、339〜
351頁（1976）の方法では、人間の血漿を硫酸ア
ンモニウム（80％飽和）を用いて分画し、これに
よつて沈殿を得、これを溶解し、透析し、DEAE
セルロースでのクロマトグラフイーにかける。
0.5MNaCl抽出物をコンカナバリンＡ−セフアロ
ーズのカラムに適用する。α−Ｄ−メチルグルコ
ピラノシド流出物を濃縮し、再びDEAEセルロー
スのカラムに適用する。0.0〜0.2MNaClでの流出
物はPIを含有する。 Musianiら、Biochem.，第15巻、798〜804頁
（1976年）では、50％飽和の硫酸アンモニウムに
よる沈殿を用いてPIに富む画分を分離し、これ
を溶解し、次いでDEAEイオン交換体、コンカナ
バリンＡ−セフイローズ、セフアデツクスＧ−
100、及び免疫吸着カラムを用いる連続的なクロ
マトグラフイーによる工程に供して精製された
PIを得る。 人間の血漿からPIを大規模で精製する方法は、
Kressら、Preparative Biochemistry，第３巻、
６号、541〜552号（1973）に開示されている。人
間の血漿の80％硫酸アンモニウムによる処理から
の沈殿を透析し、DEAEセルロースでのクロマト
グラフイーにかける。得られる濃厚物を再び透析
し、セフアデツクスＧ−100でゲル過する。PI
を含む画分をDE−52セルロースのクロマトグラ
フイーに２回かけてPIを得る。 Glaserら、同上、第５巻、４号、333〜348頁
（1975）は、PIをCohn Fraction −１から全
収率30％で分離している。溶解させた−１を
DEAEセルロース、QAEセフアローズ、コンカ
ナバリンＡ−セフアローズ、及びＧ−150セフア
デツクスによるクロマトグラフイーにかけてPI
を得る。 ポリエチレングリコール（PEG）に基づく累
積血漿分画系は、1977年９月７〜９日にReston，
Virginiaで開かれたHaoら、Proceedings of the
International Workshop on Technology for
Protein Separation and Improvement of
Blood Plasma Fractionationにおいて開示され
ている。公開された方法では、Cohnクリオプレ
シピテート（cryoprecipitate）を40ｇ／の量
でPEGと混合する。すべての操作を５℃で行な
う。 60分間撹拌した後、最初の画分を遠心分離によ
つて除去する。上澄液にPEGを更に60ｇ／添
加する（最終濃度約10％）。次いで10％PEG上澄
液からDEAEセルロースへのバツチ式吸着によつ
てプロトロンビン錯体（PTC）を抽出し、PEG
を更に100ｇ／添加して10〜20％PEG沈殿を得
る。このようにして得た４つの画分は０〜40％
PEG沈殿、４〜10％PEG沈殿、10〜20％PEG沈
殿及び20％PEG上澄液であり、画分Ａ、Ｂ、Ｃ
及びＤとしてそれぞれを表示する。これらの
PEG濃度はクリオスーパーネート
（cryosupernate）の元の容量に基づくものであ
ることを指摘しておく必要がある。 ４つのPEG画分中の蛋白質の分布は次の通り
である：画分Ａでは線維素源が主たる蛋白質で、
アルブミンが主な不純物である。画分Ａ、Ｂ及び
Ｃの不純物アルブミンのほとんどは、アルブミン
自体がこれらの条件下に沈殿しないから共沈殿及
び／又は上澄液の捕捉に基因するものである。画
分Ｂはプラスミノゲン、補体のC3成分、IgG及び
IgMに富む。更にβ−リポ蛋白質の実質的にすべ
てはこの画分中に存在する。画分Ｃは認めうる量
のα2マクログロブリン、IgAを含有し、プロトロ
ンビン及び所謂プロトロンビン錯体を構成する他
の凝集因子に富む。しかしながら、著者はPTC
のより良好な収率が10〜20％PEG沈殿からより
もむしろ10％PEG上澄液から得られるというこ
とを発見している。画分Ｄはアルブミンが主であ
るが、α−１−酸糖蛋白質のすべて並びにPI、
アンチトロンビン（AT）、セルロプラスミ
ン（Cp）、ヘプトグロビン、トランスフエリン
（Tf）及びClエステラーゼ阻害剤（Cl阻害剤）の
ほとんどを含有する。画分Ｄからは、プレアルブ
ミン（PA）、レチノール結合蛋白質（RBP）、ト
ランスコルチン、及びアンギオテン（angioten）
−シノゲン（sinogen）を含めていくつかの更な
る蛋白質も分離される。一般に小さい方の蛋白質
のほとんどは画分Ｄに存在する。 本発明は、α−１−プロテイナーゼ阻害剤を、
血漿又はPIを含有する血漿画分から分離する方
法に関する。本方法において、血漿をCohnエタ
ノール精密分離法又はその改良法（参照、例えば
Cohnら、J.Am.Chem.Soc.，68，459（1946）；
Dncleyら、同、71，541（1949）；米国特許第
2390075号；“The Plasma Proteins”、第２版、
第巻、548〜550頁、Academic Press，N.Y.）
に従つて分画してPIを含有するCohn Fractionを
準備する。PIを含有するCohn Fractionの水性溶
液を調製し、この溶液のPHを約6.5〜8.5に調節す
る。約0.2〜24時間２〜50℃に維持した後、この
溶液に重縮合ポリグリコール（Polycondensated
polyglycol）、例えばポリエチレングリコール
（PEG）を添加し、次いでそのPHを調節し、PIの
実質的な部分が保持されている流出物から所望で
ない蛋白質を選択的に沈殿させる。この流出液を
処理して、PIをそれれから直接に或いは更に精
製して分離する。 本発明の方法の主な利点は、PIが血漿から高
収率で分離できるということである。本方法で得
られるPIは、過去の方法の多くで得られた生成
物と比べて高い比活性を有する。 本発明の他の利点は、PIの血漿からの分離に
適用しうる方法の簡便さである。更に分離は本方
法で用いる試薬が安価であるが故に費用をかけず
に行なうことができる。 本発明の重要な特徴は、PEGの濃度及び続く
PHの調節がPIを残りの蛋白質から分離する能力
に著るしく影響するという発見である。溶解した
Fraction −１を処理するために約20％PEG
を用いる場合、PIは溶液に残り、PH5.1〜5.5に酸
性にすることによつてPEG上澄液から沈殿する。
しかしながら、他の蛋白質も生成する沈殿中に見
出される。しかし驚くことに、Fraction −１
を第１図に示す特別なPHにおいてある量の重縮合
ポリグリコールで処理すると、上澄液が酸性の場
合、PIが上澄液から沈殿しない状態があるとい
うことが発見された。上澄液中に存在する他の蛋
白質は沈殿する。沈殿を上澄液から分離すれば、
PIを含有する上澄液が得られ、これから約0.2以
上、普通約0.20〜0.27の比活性を有するPIを約60
％以上の収率で容易に得ることができる。 第１図は本発明の利点を達成するための、PHと
重縮合ポリグリコールの量との関係を示すグラフ
である。 上述のように、本発明の方法の出発物質は、
Cohnエタノール精密分離法或いはPIを含む濃厚
物例えば中でもCohn Fraction 及び−１を
与えるその改良法で分画された血漿であり、他の
蛋白質が最初に除去されたこれらの画分の再生物
（reworks）を含む。次の記述においては例示の
ためのFractior −１を強調するが、これは本
発明を限定するものではない。 Fraction −１ペーストは直接使用してよく
或は最初に例えば「冷」アセトン、発煙シリカ
（fumed silica）（Aerosil ，Pacific Coast
Chemicals，Emeryville，California），硫酸カ
ルシウム、デキストランサルフエートなどと接触
させることによつて含有される脂質を除去しても
よい。例えば、−１ペーストを、Fractior
−１の１部当りアセトン約10〜40部の割合でアセ
トンと混合することができる。この処理中の温度
は、約−30〜−35℃、冷アセトンの出発温度に維
持される。アセトンはFraction −１ペースト
から水も除去し、この結果アセトンを常法で除去
したときPIの実質的にすべてを含有する乾燥粉
末を与える。 上述の如きFraction −１ペースト又は粉末
の水性溶液又は懸濁液は、Fraction −１を水
100ml当りFraction −１の約８〜12ｇの割合
で水と混合することによつて調製される。この時
点において、生理学的に許容しうる試剤例えばト
リス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（TRIS）などを添加することにより、混合物の
PHを約6.5〜8.5に調節する。更に生理学的に許容
しうる塩例えば塩化ナトリウムなども、約0.01〜
0.1Mの濃度を達成するのに十分な量で水性混合
物に添加することができる。 Fraction −１を特別なPHの緩衝剤と混合し
て、得られる混合物が上述の範囲内のPH及び濃度
を有するようにすることも、本発明の範囲に入
り、好適である。緩衝剤としてはTRIS塩酸塩な
どが使用できる。更に緩衝剤は生理学的に許容し
うる塩を、Fraction −１及び緩衝剤の最終混
合物におけるその濃度が約0.01〜0.10Mとなるよ
うな量で含有しうる。 上記混合物は約２〜50℃の温度で調製され、次
いでこれを0.2〜24時間に亘つて上記範囲内の温
度に維持する。この段階では時間と温度とには逆
の関係がある。一般に温度を10℃上昇させる毎
に、維持時間は半分ずつ減少する。好適な条件は
約45℃で約0.5時間或いは約５℃で約８時間であ
る。 この維持時間に続いて、分子量約2000〜10000
の重縮合ポリグリコール、例えばPEGを混合物
に添加する。本発明の目的に対して、重縮合ポリ
グリコールの量は、混合物に関して調節しなけれ
ばならないPHの関数である。この関係を第１図に
示す。例えば、Fraction −１を含む水性混合
物１ml当り重縮合ポリグリコール約８〜10ｇをPH
約4.6で使用し、約９〜12ｇ／mlをPH約5.0で、約
12〜14ｇ／mlをPH約5.5で、約14〜16ｇ／mlをPH
約6.0で、約16〜18ｇ／mlをPH約6.5で及び約18〜
20ｇ／mlをPH約7.0で使用する。好ましくは、
Fraction −１を含有する水性混合物100ml当
り重縮合グリコール約10〜15ｇをPH約4.6〜5.7で
使用する。普通、使用する重縮合グリコールの量
は、本方法の最初の工程において水と混合される
Fraction −１ペーストの初期量によつて決定
される。即ちFraction −１の８ｇを水100ml
と混合する場合には、重縮合ポリグリコール約10
〜11ｇを、水性混合物100ml当たり使用すべきで
ある。一方、Fraction −１の10ｇを最初に水
100mlと混合する場合、この工程では水性混合物
100ml当り約14〜15ｇの重縮合ポリグリコールを
使用すべきである。それれ故に、Fraction −
１の初期量と重縮合ポリグリコールとの間の関係
は、Fraction −１の約0.5〜1.0ｇ当りグリコ
ール約１ｇである。この特別な工程における更に
好適な試剤及び量は、水性混合物100ml当り分子
量約3000〜4000のPEG約11ｇ及びFraction
−１の約８ｇである。 重縮合ポリグリコール及びFraction −１の
混合物は約１〜24時間約２〜10℃の温度に維持す
ることができる。 生成する沈殿は常法例えば遠心分離によつて分
離且つ除去することができ、流出液を下記のよう
に処理する。しかしながら、流出液と沈殿をこの
時点で分離することは好適でない。むしろ全混合
物のPHを、第１図の参照で決定される値に調節す
る。混合物100ml当り重縮合したポリグリコール
約10〜15ｇを使用する好適な事例においては、生
理学的に許容しうる酸例えば酢酸、塩酸、クエン
酸、燐酸などを添加してPHを約4.6〜5.7の範囲内
に調節する。この酸性にした混合物を０〜60分間
だけ、或いは活性PIの収率が時間と共に低下す
るからできるだけ短期間維持する。第１図に従つ
て重縮合ポリグリコールの量及びPHを選択するこ
とにより、PIを溶液中に保持し、一方所望でな
い蛋白質を沈殿させることができる。所望でない
蛋白質を含む生成した沈殿を、再び常法例えば遠
心分離によつて分離し、拾てる。残りの溶液のPH
を、生理学的に許容しうるアルカリ物質、例えば
酸化ナトリウムの添加によつて約5.5〜8.6、好ま
しくは約6.5に調節する。 このように調節した物質を、アニオン交換媒体
例えばDEAEセフアデツクス、QAEセフアデツ
クス、DEAEセフアセル、DEAEセルロース、
DEAEセフアローズなどと接触させる。この工程
では種々の条件を使用することができる。上記試
剤との接触はバツチ式で又は連続式で行なうこと
ができる。最良の結果に対しては、アニオン交換
媒体をクロマトグラフイーのカラム中に入れ、そ
れからPIを流出させる。一般に最初にアニオン
交換媒体をPH約5.5〜8.6の緩衝溶液中で平衡化さ
せる。次いでアニオン交換媒体を、交換体１容量
に対して溶液約10〜15容量の割合で、PIを含む
上記溶液と接触させる。このアニオン交換媒体を
緩衝溶液で、普通上述と同一の緩衝溶液で再び洗
浄する。この洗浄溶液の量は一般に交換体の容量
当り約３〜10容量である。 PIは、塩化ナトリウム0.0〜0.3M、燐酸二ナト
リウム0.01〜0.12Mなど或いはこれらの組合せ物
を含むPH約5.5〜8.6の緩衝溶液と接触させること
により、アニオン交換媒体からグラジエント流出
で又は段階的流出で取り出される。 アニオン交換媒体の使用とは別に、PIはPEG
を溶液100ml当り10〜30ｇの量で添加することに
よつて、PH4.6〜5.4に調節した後に溶液から分離
してもよい。PIを含む沈殿は溶液から分離され
る。 PIを含む溶液の、例えばアニオン交換媒体か
らの分離に続いて、溶液を処理してその含水量を
減じ、常法により例えばダイアフイルトレーシヨ
ン（diafiltration）、超過、凍結乾燥など或い
はこれらの組合せによつてイオン組成を変化させ
る。 PI濃厚物は治療、診断又は他の用途のために
製薬学的調合剤に処方することができる。静脈内
投与のための調合剤に対しては、組成物を普通生
理学的に適合しうる物質例えば塩化ナトリウム、
グリシンなどを含み且つ生理学的条件に適合しう
る緩衝されたPHを有する水中に溶解する。一般に
静脈内に投与される組成物のガイドラインは政府
の規則によつて確立されている。 PI濃厚物は肝炎非感染性（non−hepatitis
infective）であることが望ましい。この点にお
いては、濃厚物は肝炎感染性を減ずるために、例
えばパスツール法殺菌により、即ちPIを肝炎非
感染性（hepatitis non−infective）にするのに
十分な期間ある温度に、例えば約10時間までの期
間約60℃又はそれ以上の温度に加熱することによ
つて処理することができる。この熱処理期間中の
PIを安定化させるために、クエン酸イオン源が
加熱中のPIの安定化に十分な量で添加される。
一般に全蛋白質約20mgがPI濃厚物中に存在する
場合、溶液のクエン酸イオンを約0.25〜0.5Mと
する。この加熱工程中の混合物のPHは好ましくは
約6.0〜7.0にすべきである。 加熱中のPIの安定化を最高にするためには、
炭水化物を安定剤として単独で或いはクエン酸ナ
トリウムと共に使用することが望ましい。この目
的に対しては、単、二及び三糖類例えばアラビノ
ース、グルコース、ガラクトース、マルトース、
フルクトース、フイボース、マンノース、ラモー
ス、スクロースなど或いは糖アルコール例えばソ
ルビトール及びマンニトールなどを、炭水化物と
して約0.5〜2.4ｇ／PI溶液ml量で使用するとよ
い。 上述のように本発明のパスツール法で殺菌した
生成物は治療の目的に使用しうる製薬学的調合剤
に混入することができる。しかしながら、「製薬
学的調合剤」とは、広い意味において、治療の目
的ばかりでなく、技術的に公知の試薬又は診断の
目的に或いは組織培養に使用される、本発明の蛋
白質組成物を含む調合剤を包含することが意図さ
れる。治療の用途が意図される製薬学的調合剤は
PIを治療学的な量で、即ち防御的又は治癒的な
健康状態に必要な量で含有すべきである。製薬学
的調合剤を試剤又は診断薬として用いる場合、そ
れはPIを試剤的又は診断的量で含有すべきであ
る。 次の実施例は本発明を更に例示する。 評価 エラスターゼに対する色原体物質を用いること
により、PIのエラスターゼ阻害能力を評価した。
エラスターゼによるＮ−サクシニル−Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｐ−ニトロア
ニリド（SA3pNA）の加水分解は、450mmの吸収
の増加を引き起こす。この増加を普通37℃におい
て連続的に監視する。試料（PI）の存在及び不
存在における吸収の直線的変化を時間と共に比較
する。次いでエラスターゼ及びPIの公知の分子
量に、公知の１：１化学量論量に及び用いたエラ
スターゼの公知の量に基づいて阻害剤の量を計算
する。 また同様にトリプシン阻害能力によつてもPI
を評価することができる。 実施例 １ 上述のCohn精密分離によつてFraction −
１を得た。 Fraction −１ペースト（10.0ｇ）を、
0.1MのTRIS及び0.02Mの塩化ナトリウムを含有
するPH8.5の緩衝溶液0.1に溶解した。この混合
物を５℃で16時間攪拌した。 PEG4000（Union Carbide Corp.より）を14％
（ｗ／ｖ）の量まで添加した。この混合物を攪拌
してPEGを溶解し、次いで15000xgで遠心分離し
た。上澄液を集め、水0.22容量で希釈し、1N酢
酸の添加によつてPH5.1まで酸性にし、遠心分離
した。PIを含む上澄液を集め、前述の方法で分
析した。この結果を第１表に示す。
（PI）を血漿（blood plasma）又は血漿画分
（blood plasma fractions）から分離するための
新規な方法に関する。本発明の更なる目的は以下
の記述から明らかになるであろう。ここに、本明
細書において部及びパーセントは特に断らない限
り重量によるものとする。 α−１−プロテイナーゼ阻害剤は、分子量
54000の糖蛋白質である。この蛋白質はいくつか
のオリゴ糖類単位が共有結合している単一のポリ
ペプチド鎖からなる。人間のPIは、内因性のセ
リンプロテイナーゼによる組織破壊を制御する役
割をもつている。血漿中のトリプシン阻害能力の
90％をもつPIの遺伝的欠陥は、肺気腫の早期発
達と関連していることが示されている。気腫と関
連する弾力素の分解は、多分弾力素線維分解酵素
及び天然産の組織及び血漿プロテイナーゼ阻害剤
の局所的不均衡に基因する。PIは人間の膵臓及
び白血球のエラスターゼを迅速に阻害する
（Biochem.Biophys.Res.Comm.，第72巻、１号、
33〜39頁、1976；同、第88巻、２号、346〜350
頁、1979）。 PIを血漿から分離するために多くの方法が用
いられてきた。これらの方法の多くは実験室的規
模での分離に関し、他は商業的規模での生産に関
するものであつた。 pannellら、Biochemistry，第13巻、5439〜
5445頁（1975）は、アルブミンの貧弱な血漿を集
め、固体硫酸アンモニウム（0.60〜0.80飽和）で
精密分離する方法を用いた。得られる沈殿を可溶
化し、透析し、DEAEセルロースのカラムに適用
する。0.05〜0.15MNaClの直線的グラジエントを
貯め、濃縮し、透析し、次いで再びDEAEセルロ
ースのカラムに適用する。0.05〜0.20NaClからの
直線的グラジエントを集め、貯え、濃縮してPI
を得る。 Saklatvalaら、Biochem.J.，第157巻、339〜
351頁（1976）の方法では、人間の血漿を硫酸ア
ンモニウム（80％飽和）を用いて分画し、これに
よつて沈殿を得、これを溶解し、透析し、DEAE
セルロースでのクロマトグラフイーにかける。
0.5MNaCl抽出物をコンカナバリンＡ−セフアロ
ーズのカラムに適用する。α−Ｄ−メチルグルコ
ピラノシド流出物を濃縮し、再びDEAEセルロー
スのカラムに適用する。0.0〜0.2MNaClでの流出
物はPIを含有する。 Musianiら、Biochem.，第15巻、798〜804頁
（1976年）では、50％飽和の硫酸アンモニウムに
よる沈殿を用いてPIに富む画分を分離し、これ
を溶解し、次いでDEAEイオン交換体、コンカナ
バリンＡ−セフイローズ、セフアデツクスＧ−
100、及び免疫吸着カラムを用いる連続的なクロ
マトグラフイーによる工程に供して精製された
PIを得る。 人間の血漿からPIを大規模で精製する方法は、
Kressら、Preparative Biochemistry，第３巻、
６号、541〜552号（1973）に開示されている。人
間の血漿の80％硫酸アンモニウムによる処理から
の沈殿を透析し、DEAEセルロースでのクロマト
グラフイーにかける。得られる濃厚物を再び透析
し、セフアデツクスＧ−100でゲル過する。PI
を含む画分をDE−52セルロースのクロマトグラ
フイーに２回かけてPIを得る。 Glaserら、同上、第５巻、４号、333〜348頁
（1975）は、PIをCohn Fraction −１から全
収率30％で分離している。溶解させた−１を
DEAEセルロース、QAEセフアローズ、コンカ
ナバリンＡ−セフアローズ、及びＧ−150セフア
デツクスによるクロマトグラフイーにかけてPI
を得る。 ポリエチレングリコール（PEG）に基づく累
積血漿分画系は、1977年９月７〜９日にReston，
Virginiaで開かれたHaoら、Proceedings of the
International Workshop on Technology for
Protein Separation and Improvement of
Blood Plasma Fractionationにおいて開示され
ている。公開された方法では、Cohnクリオプレ
シピテート（cryoprecipitate）を40ｇ／の量
でPEGと混合する。すべての操作を５℃で行な
う。 60分間撹拌した後、最初の画分を遠心分離によ
つて除去する。上澄液にPEGを更に60ｇ／添
加する（最終濃度約10％）。次いで10％PEG上澄
液からDEAEセルロースへのバツチ式吸着によつ
てプロトロンビン錯体（PTC）を抽出し、PEG
を更に100ｇ／添加して10〜20％PEG沈殿を得
る。このようにして得た４つの画分は０〜40％
PEG沈殿、４〜10％PEG沈殿、10〜20％PEG沈
殿及び20％PEG上澄液であり、画分Ａ、Ｂ、Ｃ
及びＤとしてそれぞれを表示する。これらの
PEG濃度はクリオスーパーネート
（cryosupernate）の元の容量に基づくものであ
ることを指摘しておく必要がある。 ４つのPEG画分中の蛋白質の分布は次の通り
である：画分Ａでは線維素源が主たる蛋白質で、
アルブミンが主な不純物である。画分Ａ、Ｂ及び
Ｃの不純物アルブミンのほとんどは、アルブミン
自体がこれらの条件下に沈殿しないから共沈殿及
び／又は上澄液の捕捉に基因するものである。画
分Ｂはプラスミノゲン、補体のC3成分、IgG及び
IgMに富む。更にβ−リポ蛋白質の実質的にすべ
てはこの画分中に存在する。画分Ｃは認めうる量
のα2マクログロブリン、IgAを含有し、プロトロ
ンビン及び所謂プロトロンビン錯体を構成する他
の凝集因子に富む。しかしながら、著者はPTC
のより良好な収率が10〜20％PEG沈殿からより
もむしろ10％PEG上澄液から得られるというこ
とを発見している。画分Ｄはアルブミンが主であ
るが、α−１−酸糖蛋白質のすべて並びにPI、
アンチトロンビン（AT）、セルロプラスミ
ン（Cp）、ヘプトグロビン、トランスフエリン
（Tf）及びClエステラーゼ阻害剤（Cl阻害剤）の
ほとんどを含有する。画分Ｄからは、プレアルブ
ミン（PA）、レチノール結合蛋白質（RBP）、ト
ランスコルチン、及びアンギオテン（angioten）
−シノゲン（sinogen）を含めていくつかの更な
る蛋白質も分離される。一般に小さい方の蛋白質
のほとんどは画分Ｄに存在する。 本発明は、α−１−プロテイナーゼ阻害剤を、
血漿又はPIを含有する血漿画分から分離する方
法に関する。本方法において、血漿をCohnエタ
ノール精密分離法又はその改良法（参照、例えば
Cohnら、J.Am.Chem.Soc.，68，459（1946）；
Dncleyら、同、71，541（1949）；米国特許第
2390075号；“The Plasma Proteins”、第２版、
第巻、548〜550頁、Academic Press，N.Y.）
に従つて分画してPIを含有するCohn Fractionを
準備する。PIを含有するCohn Fractionの水性溶
液を調製し、この溶液のPHを約6.5〜8.5に調節す
る。約0.2〜24時間２〜50℃に維持した後、この
溶液に重縮合ポリグリコール（Polycondensated
polyglycol）、例えばポリエチレングリコール
（PEG）を添加し、次いでそのPHを調節し、PIの
実質的な部分が保持されている流出物から所望で
ない蛋白質を選択的に沈殿させる。この流出液を
処理して、PIをそれれから直接に或いは更に精
製して分離する。 本発明の方法の主な利点は、PIが血漿から高
収率で分離できるということである。本方法で得
られるPIは、過去の方法の多くで得られた生成
物と比べて高い比活性を有する。 本発明の他の利点は、PIの血漿からの分離に
適用しうる方法の簡便さである。更に分離は本方
法で用いる試薬が安価であるが故に費用をかけず
に行なうことができる。 本発明の重要な特徴は、PEGの濃度及び続く
PHの調節がPIを残りの蛋白質から分離する能力
に著るしく影響するという発見である。溶解した
Fraction −１を処理するために約20％PEG
を用いる場合、PIは溶液に残り、PH5.1〜5.5に酸
性にすることによつてPEG上澄液から沈殿する。
しかしながら、他の蛋白質も生成する沈殿中に見
出される。しかし驚くことに、Fraction −１
を第１図に示す特別なPHにおいてある量の重縮合
ポリグリコールで処理すると、上澄液が酸性の場
合、PIが上澄液から沈殿しない状態があるとい
うことが発見された。上澄液中に存在する他の蛋
白質は沈殿する。沈殿を上澄液から分離すれば、
PIを含有する上澄液が得られ、これから約0.2以
上、普通約0.20〜0.27の比活性を有するPIを約60
％以上の収率で容易に得ることができる。 第１図は本発明の利点を達成するための、PHと
重縮合ポリグリコールの量との関係を示すグラフ
である。 上述のように、本発明の方法の出発物質は、
Cohnエタノール精密分離法或いはPIを含む濃厚
物例えば中でもCohn Fraction 及び−１を
与えるその改良法で分画された血漿であり、他の
蛋白質が最初に除去されたこれらの画分の再生物
（reworks）を含む。次の記述においては例示の
ためのFractior −１を強調するが、これは本
発明を限定するものではない。 Fraction −１ペーストは直接使用してよく
或は最初に例えば「冷」アセトン、発煙シリカ
（fumed silica）（Aerosil ，Pacific Coast
Chemicals，Emeryville，California），硫酸カ
ルシウム、デキストランサルフエートなどと接触
させることによつて含有される脂質を除去しても
よい。例えば、−１ペーストを、Fractior
−１の１部当りアセトン約10〜40部の割合でアセ
トンと混合することができる。この処理中の温度
は、約−30〜−35℃、冷アセトンの出発温度に維
持される。アセトンはFraction −１ペースト
から水も除去し、この結果アセトンを常法で除去
したときPIの実質的にすべてを含有する乾燥粉
末を与える。 上述の如きFraction −１ペースト又は粉末
の水性溶液又は懸濁液は、Fraction −１を水
100ml当りFraction −１の約８〜12ｇの割合
で水と混合することによつて調製される。この時
点において、生理学的に許容しうる試剤例えばト
リス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（TRIS）などを添加することにより、混合物の
PHを約6.5〜8.5に調節する。更に生理学的に許容
しうる塩例えば塩化ナトリウムなども、約0.01〜
0.1Mの濃度を達成するのに十分な量で水性混合
物に添加することができる。 Fraction −１を特別なPHの緩衝剤と混合し
て、得られる混合物が上述の範囲内のPH及び濃度
を有するようにすることも、本発明の範囲に入
り、好適である。緩衝剤としてはTRIS塩酸塩な
どが使用できる。更に緩衝剤は生理学的に許容し
うる塩を、Fraction −１及び緩衝剤の最終混
合物におけるその濃度が約0.01〜0.10Mとなるよ
うな量で含有しうる。 上記混合物は約２〜50℃の温度で調製され、次
いでこれを0.2〜24時間に亘つて上記範囲内の温
度に維持する。この段階では時間と温度とには逆
の関係がある。一般に温度を10℃上昇させる毎
に、維持時間は半分ずつ減少する。好適な条件は
約45℃で約0.5時間或いは約５℃で約８時間であ
る。 この維持時間に続いて、分子量約2000〜10000
の重縮合ポリグリコール、例えばPEGを混合物
に添加する。本発明の目的に対して、重縮合ポリ
グリコールの量は、混合物に関して調節しなけれ
ばならないPHの関数である。この関係を第１図に
示す。例えば、Fraction −１を含む水性混合
物１ml当り重縮合ポリグリコール約８〜10ｇをPH
約4.6で使用し、約９〜12ｇ／mlをPH約5.0で、約
12〜14ｇ／mlをPH約5.5で、約14〜16ｇ／mlをPH
約6.0で、約16〜18ｇ／mlをPH約6.5で及び約18〜
20ｇ／mlをPH約7.0で使用する。好ましくは、
Fraction −１を含有する水性混合物100ml当
り重縮合グリコール約10〜15ｇをPH約4.6〜5.7で
使用する。普通、使用する重縮合グリコールの量
は、本方法の最初の工程において水と混合される
Fraction −１ペーストの初期量によつて決定
される。即ちFraction −１の８ｇを水100ml
と混合する場合には、重縮合ポリグリコール約10
〜11ｇを、水性混合物100ml当たり使用すべきで
ある。一方、Fraction −１の10ｇを最初に水
100mlと混合する場合、この工程では水性混合物
100ml当り約14〜15ｇの重縮合ポリグリコールを
使用すべきである。それれ故に、Fraction −
１の初期量と重縮合ポリグリコールとの間の関係
は、Fraction −１の約0.5〜1.0ｇ当りグリコ
ール約１ｇである。この特別な工程における更に
好適な試剤及び量は、水性混合物100ml当り分子
量約3000〜4000のPEG約11ｇ及びFraction
−１の約８ｇである。 重縮合ポリグリコール及びFraction −１の
混合物は約１〜24時間約２〜10℃の温度に維持す
ることができる。 生成する沈殿は常法例えば遠心分離によつて分
離且つ除去することができ、流出液を下記のよう
に処理する。しかしながら、流出液と沈殿をこの
時点で分離することは好適でない。むしろ全混合
物のPHを、第１図の参照で決定される値に調節す
る。混合物100ml当り重縮合したポリグリコール
約10〜15ｇを使用する好適な事例においては、生
理学的に許容しうる酸例えば酢酸、塩酸、クエン
酸、燐酸などを添加してPHを約4.6〜5.7の範囲内
に調節する。この酸性にした混合物を０〜60分間
だけ、或いは活性PIの収率が時間と共に低下す
るからできるだけ短期間維持する。第１図に従つ
て重縮合ポリグリコールの量及びPHを選択するこ
とにより、PIを溶液中に保持し、一方所望でな
い蛋白質を沈殿させることができる。所望でない
蛋白質を含む生成した沈殿を、再び常法例えば遠
心分離によつて分離し、拾てる。残りの溶液のPH
を、生理学的に許容しうるアルカリ物質、例えば
酸化ナトリウムの添加によつて約5.5〜8.6、好ま
しくは約6.5に調節する。 このように調節した物質を、アニオン交換媒体
例えばDEAEセフアデツクス、QAEセフアデツ
クス、DEAEセフアセル、DEAEセルロース、
DEAEセフアローズなどと接触させる。この工程
では種々の条件を使用することができる。上記試
剤との接触はバツチ式で又は連続式で行なうこと
ができる。最良の結果に対しては、アニオン交換
媒体をクロマトグラフイーのカラム中に入れ、そ
れからPIを流出させる。一般に最初にアニオン
交換媒体をPH約5.5〜8.6の緩衝溶液中で平衡化さ
せる。次いでアニオン交換媒体を、交換体１容量
に対して溶液約10〜15容量の割合で、PIを含む
上記溶液と接触させる。このアニオン交換媒体を
緩衝溶液で、普通上述と同一の緩衝溶液で再び洗
浄する。この洗浄溶液の量は一般に交換体の容量
当り約３〜10容量である。 PIは、塩化ナトリウム0.0〜0.3M、燐酸二ナト
リウム0.01〜0.12Mなど或いはこれらの組合せ物
を含むPH約5.5〜8.6の緩衝溶液と接触させること
により、アニオン交換媒体からグラジエント流出
で又は段階的流出で取り出される。 アニオン交換媒体の使用とは別に、PIはPEG
を溶液100ml当り10〜30ｇの量で添加することに
よつて、PH4.6〜5.4に調節した後に溶液から分離
してもよい。PIを含む沈殿は溶液から分離され
る。 PIを含む溶液の、例えばアニオン交換媒体か
らの分離に続いて、溶液を処理してその含水量を
減じ、常法により例えばダイアフイルトレーシヨ
ン（diafiltration）、超過、凍結乾燥など或い
はこれらの組合せによつてイオン組成を変化させ
る。 PI濃厚物は治療、診断又は他の用途のために
製薬学的調合剤に処方することができる。静脈内
投与のための調合剤に対しては、組成物を普通生
理学的に適合しうる物質例えば塩化ナトリウム、
グリシンなどを含み且つ生理学的条件に適合しう
る緩衝されたPHを有する水中に溶解する。一般に
静脈内に投与される組成物のガイドラインは政府
の規則によつて確立されている。 PI濃厚物は肝炎非感染性（non−hepatitis
infective）であることが望ましい。この点にお
いては、濃厚物は肝炎感染性を減ずるために、例
えばパスツール法殺菌により、即ちPIを肝炎非
感染性（hepatitis non−infective）にするのに
十分な期間ある温度に、例えば約10時間までの期
間約60℃又はそれ以上の温度に加熱することによ
つて処理することができる。この熱処理期間中の
PIを安定化させるために、クエン酸イオン源が
加熱中のPIの安定化に十分な量で添加される。
一般に全蛋白質約20mgがPI濃厚物中に存在する
場合、溶液のクエン酸イオンを約0.25〜0.5Mと
する。この加熱工程中の混合物のPHは好ましくは
約6.0〜7.0にすべきである。 加熱中のPIの安定化を最高にするためには、
炭水化物を安定剤として単独で或いはクエン酸ナ
トリウムと共に使用することが望ましい。この目
的に対しては、単、二及び三糖類例えばアラビノ
ース、グルコース、ガラクトース、マルトース、
フルクトース、フイボース、マンノース、ラモー
ス、スクロースなど或いは糖アルコール例えばソ
ルビトール及びマンニトールなどを、炭水化物と
して約0.5〜2.4ｇ／PI溶液ml量で使用するとよ
い。 上述のように本発明のパスツール法で殺菌した
生成物は治療の目的に使用しうる製薬学的調合剤
に混入することができる。しかしながら、「製薬
学的調合剤」とは、広い意味において、治療の目
的ばかりでなく、技術的に公知の試薬又は診断の
目的に或いは組織培養に使用される、本発明の蛋
白質組成物を含む調合剤を包含することが意図さ
れる。治療の用途が意図される製薬学的調合剤は
PIを治療学的な量で、即ち防御的又は治癒的な
健康状態に必要な量で含有すべきである。製薬学
的調合剤を試剤又は診断薬として用いる場合、そ
れはPIを試剤的又は診断的量で含有すべきであ
る。 次の実施例は本発明を更に例示する。 評価 エラスターゼに対する色原体物質を用いること
により、PIのエラスターゼ阻害能力を評価した。
エラスターゼによるＮ−サクシニル−Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｐ−ニトロア
ニリド（SA3pNA）の加水分解は、450mmの吸収
の増加を引き起こす。この増加を普通37℃におい
て連続的に監視する。試料（PI）の存在及び不
存在における吸収の直線的変化を時間と共に比較
する。次いでエラスターゼ及びPIの公知の分子
量に、公知の１：１化学量論量に及び用いたエラ
スターゼの公知の量に基づいて阻害剤の量を計算
する。 また同様にトリプシン阻害能力によつてもPI
を評価することができる。 実施例 １ 上述のCohn精密分離によつてFraction −
１を得た。 Fraction −１ペースト（10.0ｇ）を、
0.1MのTRIS及び0.02Mの塩化ナトリウムを含有
するPH8.5の緩衝溶液0.1に溶解した。この混合
物を５℃で16時間攪拌した。 PEG4000（Union Carbide Corp.より）を14％
（ｗ／ｖ）の量まで添加した。この混合物を攪拌
してPEGを溶解し、次いで15000xgで遠心分離し
た。上澄液を集め、水0.22容量で希釈し、1N酢
酸の添加によつてPH5.1まで酸性にし、遠心分離
した。PIを含む上澄液を集め、前述の方法で分
析した。この結果を第１表に示す。
【表】
実施例 ２
緩衝溶液中Fraction −１を、PEG4000の
添加に先立つて種々の時間維持する以外実施例１
の方法に従つた。結果を下表に示す。
添加に先立つて種々の時間維持する以外実施例１
の方法に従つた。結果を下表に示す。
【表】
実施例 ３
Fraction −１（50ｇ）を0.0MTRIS緩衝溶
液（PH7.5）500mlに溶解し、これにPEG4000を14
％（ｗ／ｖ）の量まで添加した。この試料を遠心
分離し、上澄液を４つの等しい部分に分割した。
各部分を、最終塩化ナトリウム濃度が０、0.01、
0.02及び0.03Mとなるように塩化ナトリウムを
種々の量で含有する0.1MのTRIS0.22容量で希釈
した。試料を遠心分離し、上澄液を分離し、アル
カリ（0.1MNaOH）の添加によつて、PH7.4に調
節した。 結果を下表に示す。
液（PH7.5）500mlに溶解し、これにPEG4000を14
％（ｗ／ｖ）の量まで添加した。この試料を遠心
分離し、上澄液を４つの等しい部分に分割した。
各部分を、最終塩化ナトリウム濃度が０、0.01、
0.02及び0.03Mとなるように塩化ナトリウムを
種々の量で含有する0.1MのTRIS0.22容量で希釈
した。試料を遠心分離し、上澄液を分離し、アル
カリ（0.1MNaOH）の添加によつて、PH7.4に調
節した。 結果を下表に示す。
【表】
実施例 ４
実施例１の方法に従つてPI酸上澄液を調製し
た。この上澄液1300mlを水650mlと併せ、0.01M
燐酸ナトリウムでPH6.5に平衡化させたDEAEセ
フアセルの100mlのカラム中に入れた。カラムを
0.01M燐酸ナトリウムのカラムと同一の容量で洗
浄した後、カラムを0.12M塩化ナトリウムまでの
直線的グラジエエントで流出させた（全洗浄容量
は1.51であつた）。活性画分を併せた。 アニオン交換媒体としてDEAEセフアセルの代
りにDEAEセフアローズを用いて上記工程を繰返
し、また流出媒体体として0.12M燐酸ニナトリウ
ムを用いてもこれを繰返した。結果を以下に要約
する。
た。この上澄液1300mlを水650mlと併せ、0.01M
燐酸ナトリウムでPH6.5に平衡化させたDEAEセ
フアセルの100mlのカラム中に入れた。カラムを
0.01M燐酸ナトリウムのカラムと同一の容量で洗
浄した後、カラムを0.12M塩化ナトリウムまでの
直線的グラジエエントで流出させた（全洗浄容量
は1.51であつた）。活性画分を併せた。 アニオン交換媒体としてDEAEセフアセルの代
りにDEAEセフアローズを用いて上記工程を繰返
し、また流出媒体体として0.12M燐酸ニナトリウ
ムを用いてもこれを繰返した。結果を以下に要約
する。
【表】
ローズ トリウム
実施例 ５ 実施例１の方法に従つてPI酸上澄液を製造し
た。この上澄液1300mlを注射用の水（WFI）650
ml及びアニオン交換媒体100mlと一緒にし、
0.01M燐酸ナトリウム、0.05M塩化ナトリウムで
緩衝させた（PH6.5）。この混合物を１時間攪拌
し、静置した。過後、媒体を上記緩衝剤250ml
で５回洗浄し、次いで0.15M塩化ナトリウムの上
記緩衝剤250mlで処理（５回洗浄）することによ
つて流出させた。結果を以下に要約する。
実施例 ５ 実施例１の方法に従つてPI酸上澄液を製造し
た。この上澄液1300mlを注射用の水（WFI）650
ml及びアニオン交換媒体100mlと一緒にし、
0.01M燐酸ナトリウム、0.05M塩化ナトリウムで
緩衝させた（PH6.5）。この混合物を１時間攪拌
し、静置した。過後、媒体を上記緩衝剤250ml
で５回洗浄し、次いで0.15M塩化ナトリウムの上
記緩衝剤250mlで処理（５回洗浄）することによ
つて流出させた。結果を以下に要約する。
【表】
実施例 ６
実施例５の方法に従つてPI上澄液を製造し、
これを中空繊維での超過によつて上澄液10mg
PI／mlの濃度で濃縮した。PHを７〜6.5に調節し
た。この濃縮した物質の１部をとり、下表に要約
するように安定剤と混合し又は混合しなかつた。
次いでこの部分を60℃に10時間加熱した。結果を
下表に示す。
これを中空繊維での超過によつて上澄液10mg
PI／mlの濃度で濃縮した。PHを７〜6.5に調節し
た。この濃縮した物質の１部をとり、下表に要約
するように安定剤と混合し又は混合しなかつた。
次いでこの部分を60℃に10時間加熱した。結果を
下表に示す。
第１図は本発明の利点を達成するための、PHと
重縮合ポリグリコールの量との関係を示すグラフ
である。
重縮合ポリグリコールの量との関係を示すグラフ
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a) 血漿画分の水性溶液を6.5〜8.5のPH及び
２〜50℃の温度に0.2〜24時間保持する工程、 (b) この溶液を重縮合ポリグリコールと混合し、
そして混合物のPHを調節してα−１−プロテイ
ナーゼ阻害剤を沈殿させずに望ましくない蛋白
質を該溶液から選択的に沈殿させ、その際上記
重縮合ポリグリコールの量及び上記混合物のPH
は第１図に従つて決定する工程、及び (c) α−１−プロテイナーゼ阻害剤を溶液から分
離する工程 からなることを特徴とする、α−１−プロテイナ
ーゼ阻害剤をそれを含有する血漿画分から分離す
る方法。 ２ 血漿画分0.5〜1.0部当り１部のポリグリコー
ルを用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 溶液のポリグリコールとの混合物を、該混合
物のPHの調節に先立つて、１〜24時間約２〜10℃
の温度に保持する特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ４ α−１−プロテイナーゼ阻害剤を処理してそ
れを肝炎非感染性にする工程を更に含む特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ５ α−１−プロテイナーゼ阻害剤の水性溶液
を、α−１−プロテイナーゼ阻害剤を肝炎非感染
性にするのに十分な時間及び温度及びPHにおい
て、熱安定剤の存在下に加熱することにより、α
−１−プロテイナーゼ阻害剤を肝炎非感染性にす
る特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 熱安定剤がクエン酸イオン源である特許請求
の範囲第５項記載の方法。 ７ 熱安定剤が炭水化物である特許請求の範囲第
５項記載の方法。 ８ 熱安定剤が炭水化物及びクエン酸イオン源の
混合物である特許請求の範囲第５項記載の方法。 ９ α−１−プロテイナーゼ阻害剤を、10時間ま
での期間に亘り、6.0〜7.0のPHで60℃又はそれ以
上の温度に加熱する特許請求の範囲第５項記載の
方法。 １０ 工程ｂにおいて沈殿を、混合物のPHの調節
に先立ち、混合物から分離する特許請求の範囲第
１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/389,202 US4379087A (en) | 1982-06-17 | 1982-06-17 | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| US389202 | 1982-06-17 | ||
| US461422 | 1983-01-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58225023A JPS58225023A (ja) | 1983-12-27 |
| JPH0559095B2 true JPH0559095B2 (ja) | 1993-08-30 |
Family
ID=23537279
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58058063A Granted JPS58225023A (ja) | 1982-06-17 | 1983-04-04 | α―１―プロテイナーゼ阻害剤の製法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4379087A (ja) |
| JP (1) | JPS58225023A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009191076A (ja) * | 1996-07-01 | 2009-08-27 | Baxter Healthcare Corp | タンパク質の収量増加方法 |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4439358A (en) * | 1982-06-17 | 1984-03-27 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| US4496689A (en) * | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
| US4683294A (en) * | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
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