JPH0141319B2 - - Google Patents
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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-
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Description
本発明はラクテートオキシダーゼの阻害に関
し、そして存在するラクテートオキシダーゼを阻
害することにより、乳酸又はラクテートの分析に
およぼす妨害を除去又は実質的に減少せしめた水
性液の酵素分析に関する。 多くの酵素試薬が種々の液体分析操作に用いら
れる。ほとんどすべてではないにしても多くのこ
れら酵素試薬の“触媒活性”は非常に特異的であ
るが、これら酵素は生化学的物質の複合混合物で
ある場合が多い。それ故、これら酵素試薬を分子
化学的基礎に基づいて特徴づけるのは困難であ
り、かつ完全に精製及び単離することも困難であ
る。そういつものことではないが多くのこれら酵
素試薬には望ましくない量の他の酵素が含まれて
おり、それの検出及び除去には費用のかかる精製
及び単離操作が必要とされる。従つて多くの場合
に酵素試薬を用いた特定の液体分析操作におい
て、望ましくない酵素活性を除去もしくは実質的
に減少させる“阻害剤（inhibitor）”を添加する
ことは費用が非常に安くてすみかつ好都合なこと
である。阻害剤は、望ましくない酵素の酵素活性
を物理的もしくは化学的に封じる働きをするか、
又は少なくとも実質的に減少させる働きをする。 米国特許第3956069号には、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（NAD）又は還元型のニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）
を用いることによる、グルコース及びクレアチン
ホスホキナーゼのような、血清中のいくつかの異
なる物質の存在又は濃度を測定する酵素分析が開
示されている。この特許には、LDHにより触媒
される以下の反応からわかるように、ラクテート
デヒドロゲナーゼ（LDH）が前記酵素分析を阻
害する旨記載されている。 ラクテート＋NAD○＋ （LDH） ―――――→ ピルベート＋NADH＋Ｈ○＋ 上記反応からわかるように、ラクテート又は乳
酸（PH約５未満ではラクテートは乳酸へ転化す
る）が存在する場合には、LDHによりラクテー
トが分析を阻害する。即ち、LDHはラクテート
に対して活性なので、NADのNADHへの転化に
対しても触媒作用することができ、このことは、
NAD−NADH反応対（reaction couple）に基
づく酵素分析の誤差の原因となる。この妨害源を
除く為に米国特許第3956069号には、シユウ酸、
オキサミド酸又はそれらの塩を酵素試薬へ添加す
ることにより、LDHのラクテートにおよぼす作
用を阻害することができる旨開示されている。 米国特許第3956069号には、ラクテートオキシ
ダーゼの阻害方法は記載されていない。酵素試薬
中にラクテートオキシダーゼが存在することによ
つても、ラクテート又は乳酸が存在する多くの液
体分析操作を行う際大きな妨害がもたらされる。
というのは過酸化水素が生成し、そしてラクテー
トオキシダーゼが次の反応に対して触媒作用する
酵素反応シーケンスが多くの液体分析操作に用い
られるからである。 ラクテート＋O2（ラクテートオキシダーゼ） ―――――――――――――→ →ピルベート＋H2O2 即ち、酵素的“過酸化水素合体（hydrogen
peroxide−linked）”液体分析、即ち過酸化水素
が生成する酵素反応シーケンスにより選定物質の
存在又は濃度を測定する分析は、これら分析を、
選定物質の他にラクテート又は乳酸を含む血清又
は全血液のような水性液体に関して行うときはい
つでも、酵素試薬に存在するラクテートオキシダ
ーゼの作用により明きらかに妨害されうる。従つ
てラクテートオキシダーゼの阻害剤を発見するこ
とは、業界に非常に有用な貢献を果たすであろ
う。 本発明はこのような阻害剤を提供する。更に詳
しくは、本発明は、ラクテートオキシダーゼと、
グリオキサル酸、シユウ酸、グリコール酸、これ
らの酸の塩又はこれらの混合物とを反応させるこ
とを特徴とする乳酸及びラクテートに対するラク
テートオキシダーゼの活性を阻害する方法であ
る。 本発明の特に有用な態様では、ラクテートオキ
シダーゼは、酸素のの存在下で、過酸化水素を発
生するに有効な一つ又はそれ以上の別の酵素及び
この別の酵素の基質と共に酵素試薬組成物中に存
在し、阻害性化合物がこの酵素試薬組成物中に添
加される。 本発明の好ましい態様では、上述の酵素試薬組
成物は、実質上乾式の分析要素の少なくとも一つ
の試薬ゾーンに存在する。一つ又はそれ以上の前
記酸又はそれらの塩の存在は、ラクテートオキシ
ダーゼの望ましくない酵素活性を完全にブロツク
するか又は少なくとも実質的に減じるのに有効で
あることが見い出された。 本発明は、Ｌ−α−グリセロフオスフエートオ
キシダーゼ（α−GPO）及び過酸化活性を示す
試薬（たとえばペルオキシダーゼ）が用いられ
る、血清、血液又は尿のような水性生物液の分析
に特に有用である。 α−GPOはグリセリン、トリグリセリド及び
アデノシン三燐酸（ATP）のような種々の血清
成分により生成する分解生成物、Ｌ−α−グリセ
ロフオスフエートと酸素の存在下において反応
し、過酸化水素を生成する。過酸化水素は過酸化
活性を示す試薬の存在下で過酸化水素検出体と反
応し検出可能な変化を生成することができる。 α−GPOはラクテートオキシダーゼにより汚
染されていることが多く、そして血清のような水
性生物液には乳酸又はラクテートが含まれている
場合が多いので、ラクテートオキシダーゼにより
汚染されたα−GPOを用いた酵素的過酸化水素
合体試薬組成物の使用による、乳酸又はラクテー
ト以外の物質に関する血清の分析は、いつわりの
過酸化水素生成をもたらし、従つて分析誤差が生
じる。この誤差源を取り除く為に、α−GPO含
有酵素試薬組成物を更に精製してラクラートオキ
シダーゼ汚染体を除去することができる。 しかしながら、本発明は、同じ結果、即ちラク
テートオキシダーゼ阻害剤の使用による望ましく
ないラクテートオキシダーゼ活性の排除又は除去
を達成する為の、かなり安価で非常に好都合な手
段を提供する。 阻害剤はグリコール酸、シユウ酸、グリオキサ
ル酸又はそれらの塩である。これらの混合物を用
いることもできる。塩の形の阻害剤を用いる時、
特定の塩（たとえばアルカリ金属、アンモニウム
又はアルカリ土類金属の塩）の選択は臨界的でな
く、公知の塩の形のこれら阻害剤が一般に有用で
あると考えられる。一つ又はそれ以上の前記阻害
剤の使用は本発明にとつて必須である。別の阻害
剤を発見する為に前記阻害剤の、種々の密接に関
連した化学的同族体及び類似体が試験されてきた
が、これら試験結果により、これら化学的同族体
及び類似体はラクテートオキシダーゼの阻害剤と
して役に立たないことが証明された。即ち、グリ
シン、ラクトアミド、メトキシ酢酸、リンゴ酸、
α−ケトグルタル酸及びβ−ヒドロキシ酪酸がそ
れぞれ試験され、そしてほとんど或いは全くラク
テートオキシダーゼ活性を阻害しないことが認め
られた。同様に、オキサミド酸、オキサミド、マ
ロン酸、グリセリン酸、α−ヒドロキシ酪酸のよ
うな化合物が阻害剤として試験され、そしたこれ
らはラクテートオキシダーゼをいくらか阻害しう
るけれども30℃で測定した時、これら各化合物
は、ラクテートオキシダーゼの酵素活性を50％又
はそれ以上阻害するのに効果のないことがわかつ
た。 本発明により阻害するラクテートオキシダーゼ
の活性とは、酸素の存在下で乳酸又はラクテート
をピルベート及び過酸化水素に転化しうるラクテ
ートオキシダーゼの作用である。これらラクテー
トオキシダーゼと、酸素の存在下において乳酸又
はラクテートの反応を触媒してアセテート、二酸
化炭素及び水を生成するオキシダーゼとを区別し
なければならない。過酸化水素よりもむしろ水を
生成する反応に触媒作用し、そしてそれ故本発明
の範囲外であるこれらオキシダーゼの例は、
Journal of Biological Chemistry、第226巻、第
395頁（1957年）にサツトンにより報告されてい
る。本発明の範囲外のこれらオキシダーゼは最近
になつてラクテート２−モノオキシゲナーゼと改
名され、そして国際酵素番号1.13.12.4と番号をつ
けかえられた。International Union of Pure
and Applied Chemistry及びInternational
Union of BiochemistryのEnzyme
Nomenclature Recommendations （1972）、
エルセビア（EIsevier）科学出版社、第62，108，
109，346及び376頁（1975年再版）を参照された
い。 本発明の範囲内のラクテートオキシターゼ、即
ち酵素の存在下においてラクテート又は乳酸をピ
ルベート及び過酸化水素に転化するオキシダーゼ
の二つの公知の源は、エイシエル（Eichel）等に
より“Respiratory Enzyme Studies in
Tetrahymena Pyriformis”，Journal of
Biological Chemistry、第237巻、No.３、第940
頁（1962年）に報告されたテトラヒメナピリホル
ミス（Tetrahymena pyriformis）、及び好まし
くは米国特許第4166763号に記載のストレプトコ
ツカスフアエシウム（Streptcoccus faecium）
（正式にはストレプトコツカスフアエカリス
（Strept coccus faecalis）である。 ストレプトコツカスフアエシウムは、血清トリ
グリセリドの酵素分析に有利に用いることのでき
るα−GPOのような他のオキシダーゼの特に有
用な微生物源であるので、本発明の好ましいラク
テートオキシダーゼ阻害剤は、ストレプトコツカ
スフアエシウムに由来の他の過酸化水素生成オキ
シダーゼと共に使用しうるものである。これら好
ましいラクテートオキシダーゼ阻害剤は、グリコ
ール酸、シユウ酸及びそれらの塩である。ストレ
プトコツカスフアエシウムに由来する他の過酸化
水素生成オキシダーゼと共に用いる時、これら好
ましい阻害剤は、これら酵素調製物に存在する汚
染ラクテートオキシダーゼ活性を除去又は少なく
とも実質的に減少させるが、望まれるオキシダー
ゼ、たとえばα−GPOの活性を阻害しない。か
くして本発明の使用により望ましくないラクテー
トオキシダーゼ活性を除く為の、非常に高度の精
製及び単離操作を行うことなく、ストレプトコツ
カスフアエシウムに由来する他の過酸化水素生成
オキシダーゼを用いることができる。 たとえばResearch Disclosure（インダストリ
アルオポチユニテイーズ、LTdにより刊行；ホ
ムウエル、ハバント；ハンプシヤー州、
PO91EF、英国）刊行番号第16146号、第161巻、
1977年９月10日刊行には、血清のような水性液に
含まれるグリセリン又はトリグリセリドの定量的
測定用の酵素的分析法及び試薬組成物が記載され
ている。この酵素分析においては、酵素試薬組成
物を用いて血清トリグリセリドをグリセリンへ転
化し、次いでこのグリセリンをＬ−α−グリセロ
フオスフエートへ転化し、更にＬ−α−グリセロ
フオスフエートを、α−GPOを用いて酵素的に
酸化して定量可能な量の過酸化水素を生成する。
前記酵素分析で用いた好ましいα−GPOはスト
レプトコツカスフアエシウムに由来するものであ
る。この同じ微生物源からは非常に有効なラクテ
ートオキシダーゼ並びにα−GPOが得られるの
で、ストレプトコツカスフアエシウムに由来のα
−GPOからラクテートオキシダーゼ活性を除く
ことは非常に重要である。 ストレプトコツカスフアエシウムに由来するα
−GPOに存在するラクテートオキシダーゼ活性
が除かれないか又は実質的に減少されない場合、
ラクテート成分も血清中に存在するので、ラクテ
ートオキシダーゼ活性は血清グリセリン及びトリ
グリセリド分析を阻害する。従つて、誤つた量の
過酸化水素生成がもたらされこれは分析誤差源と
なる。本発明の好ましいラクテートオキシダーゼ
阻害剤を用いることにより、α−GPOの活性に
影響を与えることなく有効にこの分析誤差源が除
かれる。 特定の分析及び試薬組成物に用いるラクテート
オキシダーゼ阻害剤の量は、酵素組成物の望まし
くないラクテートオキシダーゼ活性、分析すべき
液体試料中に含まれるラクテートの量、分析下の
液体試料中の望まれる被検体の濃度、及び酵素試
薬組成物のその他のオキシダーゼ酵素成分の過酸
化水素生成活性のような数多くの要因に依存す
る。たとえば、検査中の血清被検体の濃度が比較
的低い場合（そういう場合が多い）、又は分析下
の液体の乳酸又はラクテート成分の濃度が望まれ
る被検体の濃度と比べて比較的高い場合、又は酵
素試薬組成物中のラクテートオキシダーゼの酵素
活性が試薬組成物のその他の過酸化水素生成オキ
シダーゼの望まれる活性と比べて比較的高い場
合、多量の本発明のラクテートオキシダーゼ阻害
剤の使用が非常に有利になつてくる。 通常、ラクテートオキシダーゼ及びラクテート
又は乳酸が共に存在していることが予想される場
合にのみ阻害剤の使用が望ましい。即ち、ラクテ
ートオキシダーゼ又はそのラクテート基質のいず
れかが確かに不存在である場合、理論的には阻害
剤なしですますことができる。しかしながら実際
上はラクテートオキシダーゼ又はラクテート基質
のいずれかが不存在であるかどうかを確かめるに
は、潜在的に費用がかかりかつ時間のかかる、ラ
クテートオキシダーゼに対する酵素試薬組成物
の、そしてラクテート基質に対する液体試料の分
析評価を行わねばならない。それ故、過酸化水素
生成用の酵素試薬組成物（及びこのような組成物
を用いた酵素分析）に、この組成物中にラクテー
トオキシダーゼが存在するか又は、分析下の液体
中にラクテート基質が存在するかにかかわりな
く、ラクテートオキシダーゼ阻害剤を含むことが
本発明の利点である。従つて阻害剤はラクテート
オキシダーゼと基質が共に存在する場合に阻害剤
として働くばかりでなく、それらが存在する可能
性がある場合に保証としての働きもする。かくし
て、ラクテート妨害に対する確実性を提供し、そ
して妨害物質の存在をしらべる分析を行う必要を
なくすることによりこの分野の技術水準は向上す
る。 ストレプトコツカスフアエシウムから得られた
過酸化水素生成酵素α−GPO使用の前記酵素分
析を用いた血清グリセリン又はトリグリセリドの
液体分析操作では、このような酵素分析組成物に
用いるラクテートオキシダーゼ阻害剤の濃度は典
型的には５ないし50ミリモルの範囲内である。 α−GPOを含む、血清グリセリン及び血清ト
リグリセリド酵素試薬組成物に加えて、本発明の
ラクテートオキシダーゼ阻害剤を、多くの他の過
酸化水素生成オキシダーゼ含有酵素試薬組成物中
に有利に組み入れることができる。たとえばラク
テートオキシダーゼ阻害剤は、血清グルコース測
定用のグルコースオキシダーゼ含有酵素試薬組成
物中に混入することができる。同様にこれら阻害
剤は、血清コレステロール測定用のコレステロー
ルオキシダーゼ含有酵素試薬組成物、又は尿酸分
析用のウリカーゼ含有組成物中に用いることがで
きる。 ラクテートオキシダーゼ阻害剤とラクテートと
の“反応”は、前記阻害剤がなければラクテート
オキシダーゼが非常に活性であることが予想され
る条件下において、この望まれる阻害剤とラクテ
ートオキシダーゼとを一緒にすることによつて行
われる。ある適用においては他のPH及び温度条件
が有用である場合があるけれども好ましくはこの
反応はPH5.5〜9.5及び温度20〜45℃において水性
媒質の存在下で行う。 同様に、この明細書記載のラクテートオキシダ
ーゼ阻害剤の存在下における酵素試薬組成物と望
まれる被検体との“反応”は、酵素試薬組成物の
種々の成分及びラクテートオキシダーゼが通常有
効である前述のようなPH及び温度条件下で行われ
る。ラクテートオキシダーゼ阻害剤はラクテート
オキシダーゼ活性を有効に減少又は封鎖するが、
好ましくは、酵素試薬組成物のその他の成分の望
まれる被検体に関する活性を不利に妨害しない
し、もし妨害するとしてもわずかである。 望ましくないラクテートオキシダーゼ活性を阻
害する為の本発明の酵素分析法及び試薬組成物を
液体分析法に用いることができる。これらは“湿
式化学（wet chemistry）”方法と呼ばれること
がある。本発明の分析法及び試薬組成物は、“乾
式化学（dry chemistry）”方法を用いた分析に
も用いることができる。 “湿式化学”方法においては分析を全く液体媒
質中で実施する。酵素試薬組成物は、乾燥試薬又
は液体試薬のいずれかとして液体媒質へ添加する
ことができる。ラクテートオキシダーゼ阻害剤
は、酵素試薬組成物のその他の成分と一緒に液体
分析媒質中に混入することができるか又は、液体
分析媒質へ単独に添加することができる。 前述のごとくラクテートオキシダーゼ阻害剤含
有酵素試薬組成物を製造することができ、そして
それは液体試薬（たとえば水性液の形）としてか
又は乾燥試薬（たとえば凍結乾燥粉末として）と
して用いることができる。乾燥試薬は包装し、貯
蔵しそして後に使用直前に水で再構成することが
できる。 本発明の酵素分析法及び試薬組成物を“乾式化
学”方法に用いる場合、ラクテートオキシダーゼ
阻害剤含有組成物を、たとえば吸収、含浸又は被
覆法により、実質的に乾式の（即ち、触れた際乾
燥している）分析要素の試薬ゾーン、たとえば、
米国特許第3992158号及び同第4042335号に記載の
“浸漬及び解読”繊維性試験ストリツプの試薬層
又は非繊維性多層分析要素の試薬層中へ組み入れ
ることができる。 “乾式化学”試験要素では、ラクテートオキシ
ダーゼ阻害剤含有酵素試薬組成物は乾燥試薬とし
て存在する。米国特許第3992158号に記載のごと
く、多層乾式化学分析要素には二つ以上の試薬層
を含めることができ、個々の試薬層のそれぞれは
使用条件下、即ち液体試料を分析要素へ適用する
際互いに流体接触する。このような場合、このよ
うな多層分析要素に含まれる酵素試薬組成物の
種々の成分のおのおのは、別々の試薬層のそれぞ
れに位置するか又は、試薬成分のあるものは一つ
の層に位置し、一方他の試薬成分は異なる層に位
置することができる。 以下の例により本発明を更に詳細に説明する。 例において酸化性酵素はストレプトコツカスフ
アエシウムATCC12755から製造した。Ｌ−ラク
テートオキシダーゼは米国特許第4166763号に記
載のごとくストレプトコツカスフアエシウムから
０〜50％硫酸アンモニウムフラクシヨンとして単
離した。Ｌ−α−グリセロフオスフエートオキシ
ダーゼは、Research Disclosure刊行番号第
16146号、1977年９月10日出版の第５巻に記載の
ごとくストレプトコツカスフアエシウムから精製
した。非常によく精製したＬ−α−グリセロフオ
スフエートオキシダーゼ（全精製工程を終えたも
の）のＬ−α−グリセロフオスフエートとラクテ
ートオキシダーゼとの活性の比は1700〜3000：１
であり、一方精製が完全ではないＬ−α−グリセ
ロフオスフエートオキシダーゼ（50〜80％硫酸ア
ンモニウムフラクシヨンとして単離したもの）の
Ｌ−α−グリセロフオスフエートとラクテートオ
キシダーゼとの活性の比は30〜100：１であつた。 例において、ラクテートオキシダーゼの酵素分
析は以下のごとく実施した。分析反応混合物は全
体積1.0ml中に、リン酸カリウム緩衝剤100マイク
ロモル（PH7.0）、乳酸25マイクロモル、ホースラ
デイツシユペルオキシダーゼ（プルプロガリン単
位4.6）25mg及びオルトジアニシジン0.25マイク
ロモルを含んだ。ラクテートオキシダーゼの潜在
的な阻害剤として試験すべき化合物を例１に示す
ごとく分析反応混合物へ添加した。試料を30℃に
おいて平衝にし、次いでストレプトコツカスフア
エシウムラクテートオキシダーゼの添加により反
応を開始した。430nmにおける吸光度をベツクマ
ン25分光光度計において測定した。初速度を曲線
の直線部分から計算した。 例において、Ｌ−α
−グリセロフオスフエートオキシダーゼの酵素分
析は以下のごとく実施した。分析反応混合物は全
体積1.0ml中に、リン酸カリウム緩衝剤100マイク
ロモル（PH7.0）オルトジアニシジン66μg、ホー
スラデイツシユペルオキシダーゼ（プルプロガリ
ン単位4.6）25μg及びDL−α−グリセロフオスフ
エート（PH7.0において）200マイクロモルを含ん
だ。潜在的な阻害剤として試験すべき化合物を例
１に記載のごとく反応混合物へ添加した。試料を
37℃において平衡にし、そして酵素の添加により
反応を開始した。430nmにおける吸光度をベツク
マン25分光光度計において測定した。初速度を曲
線の直線部分から計算した。 例において以下の構造及び組成の血清トリグリ
セリド測定用の非繊維性多層“乾式化学”分析要
素を用いた。
し、そして存在するラクテートオキシダーゼを阻
害することにより、乳酸又はラクテートの分析に
およぼす妨害を除去又は実質的に減少せしめた水
性液の酵素分析に関する。 多くの酵素試薬が種々の液体分析操作に用いら
れる。ほとんどすべてではないにしても多くのこ
れら酵素試薬の“触媒活性”は非常に特異的であ
るが、これら酵素は生化学的物質の複合混合物で
ある場合が多い。それ故、これら酵素試薬を分子
化学的基礎に基づいて特徴づけるのは困難であ
り、かつ完全に精製及び単離することも困難であ
る。そういつものことではないが多くのこれら酵
素試薬には望ましくない量の他の酵素が含まれて
おり、それの検出及び除去には費用のかかる精製
及び単離操作が必要とされる。従つて多くの場合
に酵素試薬を用いた特定の液体分析操作におい
て、望ましくない酵素活性を除去もしくは実質的
に減少させる“阻害剤（inhibitor）”を添加する
ことは費用が非常に安くてすみかつ好都合なこと
である。阻害剤は、望ましくない酵素の酵素活性
を物理的もしくは化学的に封じる働きをするか、
又は少なくとも実質的に減少させる働きをする。 米国特許第3956069号には、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（NAD）又は還元型のニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）
を用いることによる、グルコース及びクレアチン
ホスホキナーゼのような、血清中のいくつかの異
なる物質の存在又は濃度を測定する酵素分析が開
示されている。この特許には、LDHにより触媒
される以下の反応からわかるように、ラクテート
デヒドロゲナーゼ（LDH）が前記酵素分析を阻
害する旨記載されている。 ラクテート＋NAD○＋ （LDH） ―――――→ ピルベート＋NADH＋Ｈ○＋ 上記反応からわかるように、ラクテート又は乳
酸（PH約５未満ではラクテートは乳酸へ転化す
る）が存在する場合には、LDHによりラクテー
トが分析を阻害する。即ち、LDHはラクテート
に対して活性なので、NADのNADHへの転化に
対しても触媒作用することができ、このことは、
NAD−NADH反応対（reaction couple）に基
づく酵素分析の誤差の原因となる。この妨害源を
除く為に米国特許第3956069号には、シユウ酸、
オキサミド酸又はそれらの塩を酵素試薬へ添加す
ることにより、LDHのラクテートにおよぼす作
用を阻害することができる旨開示されている。 米国特許第3956069号には、ラクテートオキシ
ダーゼの阻害方法は記載されていない。酵素試薬
中にラクテートオキシダーゼが存在することによ
つても、ラクテート又は乳酸が存在する多くの液
体分析操作を行う際大きな妨害がもたらされる。
というのは過酸化水素が生成し、そしてラクテー
トオキシダーゼが次の反応に対して触媒作用する
酵素反応シーケンスが多くの液体分析操作に用い
られるからである。 ラクテート＋O2（ラクテートオキシダーゼ） ―――――――――――――→ →ピルベート＋H2O2 即ち、酵素的“過酸化水素合体（hydrogen
peroxide−linked）”液体分析、即ち過酸化水素
が生成する酵素反応シーケンスにより選定物質の
存在又は濃度を測定する分析は、これら分析を、
選定物質の他にラクテート又は乳酸を含む血清又
は全血液のような水性液体に関して行うときはい
つでも、酵素試薬に存在するラクテートオキシダ
ーゼの作用により明きらかに妨害されうる。従つ
てラクテートオキシダーゼの阻害剤を発見するこ
とは、業界に非常に有用な貢献を果たすであろ
う。 本発明はこのような阻害剤を提供する。更に詳
しくは、本発明は、ラクテートオキシダーゼと、
グリオキサル酸、シユウ酸、グリコール酸、これ
らの酸の塩又はこれらの混合物とを反応させるこ
とを特徴とする乳酸及びラクテートに対するラク
テートオキシダーゼの活性を阻害する方法であ
る。 本発明の特に有用な態様では、ラクテートオキ
シダーゼは、酸素のの存在下で、過酸化水素を発
生するに有効な一つ又はそれ以上の別の酵素及び
この別の酵素の基質と共に酵素試薬組成物中に存
在し、阻害性化合物がこの酵素試薬組成物中に添
加される。 本発明の好ましい態様では、上述の酵素試薬組
成物は、実質上乾式の分析要素の少なくとも一つ
の試薬ゾーンに存在する。一つ又はそれ以上の前
記酸又はそれらの塩の存在は、ラクテートオキシ
ダーゼの望ましくない酵素活性を完全にブロツク
するか又は少なくとも実質的に減じるのに有効で
あることが見い出された。 本発明は、Ｌ−α−グリセロフオスフエートオ
キシダーゼ（α−GPO）及び過酸化活性を示す
試薬（たとえばペルオキシダーゼ）が用いられ
る、血清、血液又は尿のような水性生物液の分析
に特に有用である。 α−GPOはグリセリン、トリグリセリド及び
アデノシン三燐酸（ATP）のような種々の血清
成分により生成する分解生成物、Ｌ−α−グリセ
ロフオスフエートと酸素の存在下において反応
し、過酸化水素を生成する。過酸化水素は過酸化
活性を示す試薬の存在下で過酸化水素検出体と反
応し検出可能な変化を生成することができる。 α−GPOはラクテートオキシダーゼにより汚
染されていることが多く、そして血清のような水
性生物液には乳酸又はラクテートが含まれている
場合が多いので、ラクテートオキシダーゼにより
汚染されたα−GPOを用いた酵素的過酸化水素
合体試薬組成物の使用による、乳酸又はラクテー
ト以外の物質に関する血清の分析は、いつわりの
過酸化水素生成をもたらし、従つて分析誤差が生
じる。この誤差源を取り除く為に、α−GPO含
有酵素試薬組成物を更に精製してラクラートオキ
シダーゼ汚染体を除去することができる。 しかしながら、本発明は、同じ結果、即ちラク
テートオキシダーゼ阻害剤の使用による望ましく
ないラクテートオキシダーゼ活性の排除又は除去
を達成する為の、かなり安価で非常に好都合な手
段を提供する。 阻害剤はグリコール酸、シユウ酸、グリオキサ
ル酸又はそれらの塩である。これらの混合物を用
いることもできる。塩の形の阻害剤を用いる時、
特定の塩（たとえばアルカリ金属、アンモニウム
又はアルカリ土類金属の塩）の選択は臨界的でな
く、公知の塩の形のこれら阻害剤が一般に有用で
あると考えられる。一つ又はそれ以上の前記阻害
剤の使用は本発明にとつて必須である。別の阻害
剤を発見する為に前記阻害剤の、種々の密接に関
連した化学的同族体及び類似体が試験されてきた
が、これら試験結果により、これら化学的同族体
及び類似体はラクテートオキシダーゼの阻害剤と
して役に立たないことが証明された。即ち、グリ
シン、ラクトアミド、メトキシ酢酸、リンゴ酸、
α−ケトグルタル酸及びβ−ヒドロキシ酪酸がそ
れぞれ試験され、そしてほとんど或いは全くラク
テートオキシダーゼ活性を阻害しないことが認め
られた。同様に、オキサミド酸、オキサミド、マ
ロン酸、グリセリン酸、α−ヒドロキシ酪酸のよ
うな化合物が阻害剤として試験され、そしたこれ
らはラクテートオキシダーゼをいくらか阻害しう
るけれども30℃で測定した時、これら各化合物
は、ラクテートオキシダーゼの酵素活性を50％又
はそれ以上阻害するのに効果のないことがわかつ
た。 本発明により阻害するラクテートオキシダーゼ
の活性とは、酸素の存在下で乳酸又はラクテート
をピルベート及び過酸化水素に転化しうるラクテ
ートオキシダーゼの作用である。これらラクテー
トオキシダーゼと、酸素の存在下において乳酸又
はラクテートの反応を触媒してアセテート、二酸
化炭素及び水を生成するオキシダーゼとを区別し
なければならない。過酸化水素よりもむしろ水を
生成する反応に触媒作用し、そしてそれ故本発明
の範囲外であるこれらオキシダーゼの例は、
Journal of Biological Chemistry、第226巻、第
395頁（1957年）にサツトンにより報告されてい
る。本発明の範囲外のこれらオキシダーゼは最近
になつてラクテート２−モノオキシゲナーゼと改
名され、そして国際酵素番号1.13.12.4と番号をつ
けかえられた。International Union of Pure
and Applied Chemistry及びInternational
Union of BiochemistryのEnzyme
Nomenclature Recommendations （1972）、
エルセビア（EIsevier）科学出版社、第62，108，
109，346及び376頁（1975年再版）を参照された
い。 本発明の範囲内のラクテートオキシターゼ、即
ち酵素の存在下においてラクテート又は乳酸をピ
ルベート及び過酸化水素に転化するオキシダーゼ
の二つの公知の源は、エイシエル（Eichel）等に
より“Respiratory Enzyme Studies in
Tetrahymena Pyriformis”，Journal of
Biological Chemistry、第237巻、No.３、第940
頁（1962年）に報告されたテトラヒメナピリホル
ミス（Tetrahymena pyriformis）、及び好まし
くは米国特許第4166763号に記載のストレプトコ
ツカスフアエシウム（Streptcoccus faecium）
（正式にはストレプトコツカスフアエカリス
（Strept coccus faecalis）である。 ストレプトコツカスフアエシウムは、血清トリ
グリセリドの酵素分析に有利に用いることのでき
るα−GPOのような他のオキシダーゼの特に有
用な微生物源であるので、本発明の好ましいラク
テートオキシダーゼ阻害剤は、ストレプトコツカ
スフアエシウムに由来の他の過酸化水素生成オキ
シダーゼと共に使用しうるものである。これら好
ましいラクテートオキシダーゼ阻害剤は、グリコ
ール酸、シユウ酸及びそれらの塩である。ストレ
プトコツカスフアエシウムに由来する他の過酸化
水素生成オキシダーゼと共に用いる時、これら好
ましい阻害剤は、これら酵素調製物に存在する汚
染ラクテートオキシダーゼ活性を除去又は少なく
とも実質的に減少させるが、望まれるオキシダー
ゼ、たとえばα−GPOの活性を阻害しない。か
くして本発明の使用により望ましくないラクテー
トオキシダーゼ活性を除く為の、非常に高度の精
製及び単離操作を行うことなく、ストレプトコツ
カスフアエシウムに由来する他の過酸化水素生成
オキシダーゼを用いることができる。 たとえばResearch Disclosure（インダストリ
アルオポチユニテイーズ、LTdにより刊行；ホ
ムウエル、ハバント；ハンプシヤー州、
PO91EF、英国）刊行番号第16146号、第161巻、
1977年９月10日刊行には、血清のような水性液に
含まれるグリセリン又はトリグリセリドの定量的
測定用の酵素的分析法及び試薬組成物が記載され
ている。この酵素分析においては、酵素試薬組成
物を用いて血清トリグリセリドをグリセリンへ転
化し、次いでこのグリセリンをＬ−α−グリセロ
フオスフエートへ転化し、更にＬ−α−グリセロ
フオスフエートを、α−GPOを用いて酵素的に
酸化して定量可能な量の過酸化水素を生成する。
前記酵素分析で用いた好ましいα−GPOはスト
レプトコツカスフアエシウムに由来するものであ
る。この同じ微生物源からは非常に有効なラクテ
ートオキシダーゼ並びにα−GPOが得られるの
で、ストレプトコツカスフアエシウムに由来のα
−GPOからラクテートオキシダーゼ活性を除く
ことは非常に重要である。 ストレプトコツカスフアエシウムに由来するα
−GPOに存在するラクテートオキシダーゼ活性
が除かれないか又は実質的に減少されない場合、
ラクテート成分も血清中に存在するので、ラクテ
ートオキシダーゼ活性は血清グリセリン及びトリ
グリセリド分析を阻害する。従つて、誤つた量の
過酸化水素生成がもたらされこれは分析誤差源と
なる。本発明の好ましいラクテートオキシダーゼ
阻害剤を用いることにより、α−GPOの活性に
影響を与えることなく有効にこの分析誤差源が除
かれる。 特定の分析及び試薬組成物に用いるラクテート
オキシダーゼ阻害剤の量は、酵素組成物の望まし
くないラクテートオキシダーゼ活性、分析すべき
液体試料中に含まれるラクテートの量、分析下の
液体試料中の望まれる被検体の濃度、及び酵素試
薬組成物のその他のオキシダーゼ酵素成分の過酸
化水素生成活性のような数多くの要因に依存す
る。たとえば、検査中の血清被検体の濃度が比較
的低い場合（そういう場合が多い）、又は分析下
の液体の乳酸又はラクテート成分の濃度が望まれ
る被検体の濃度と比べて比較的高い場合、又は酵
素試薬組成物中のラクテートオキシダーゼの酵素
活性が試薬組成物のその他の過酸化水素生成オキ
シダーゼの望まれる活性と比べて比較的高い場
合、多量の本発明のラクテートオキシダーゼ阻害
剤の使用が非常に有利になつてくる。 通常、ラクテートオキシダーゼ及びラクテート
又は乳酸が共に存在していることが予想される場
合にのみ阻害剤の使用が望ましい。即ち、ラクテ
ートオキシダーゼ又はそのラクテート基質のいず
れかが確かに不存在である場合、理論的には阻害
剤なしですますことができる。しかしながら実際
上はラクテートオキシダーゼ又はラクテート基質
のいずれかが不存在であるかどうかを確かめるに
は、潜在的に費用がかかりかつ時間のかかる、ラ
クテートオキシダーゼに対する酵素試薬組成物
の、そしてラクテート基質に対する液体試料の分
析評価を行わねばならない。それ故、過酸化水素
生成用の酵素試薬組成物（及びこのような組成物
を用いた酵素分析）に、この組成物中にラクテー
トオキシダーゼが存在するか又は、分析下の液体
中にラクテート基質が存在するかにかかわりな
く、ラクテートオキシダーゼ阻害剤を含むことが
本発明の利点である。従つて阻害剤はラクテート
オキシダーゼと基質が共に存在する場合に阻害剤
として働くばかりでなく、それらが存在する可能
性がある場合に保証としての働きもする。かくし
て、ラクテート妨害に対する確実性を提供し、そ
して妨害物質の存在をしらべる分析を行う必要を
なくすることによりこの分野の技術水準は向上す
る。 ストレプトコツカスフアエシウムから得られた
過酸化水素生成酵素α−GPO使用の前記酵素分
析を用いた血清グリセリン又はトリグリセリドの
液体分析操作では、このような酵素分析組成物に
用いるラクテートオキシダーゼ阻害剤の濃度は典
型的には５ないし50ミリモルの範囲内である。 α−GPOを含む、血清グリセリン及び血清ト
リグリセリド酵素試薬組成物に加えて、本発明の
ラクテートオキシダーゼ阻害剤を、多くの他の過
酸化水素生成オキシダーゼ含有酵素試薬組成物中
に有利に組み入れることができる。たとえばラク
テートオキシダーゼ阻害剤は、血清グルコース測
定用のグルコースオキシダーゼ含有酵素試薬組成
物中に混入することができる。同様にこれら阻害
剤は、血清コレステロール測定用のコレステロー
ルオキシダーゼ含有酵素試薬組成物、又は尿酸分
析用のウリカーゼ含有組成物中に用いることがで
きる。 ラクテートオキシダーゼ阻害剤とラクテートと
の“反応”は、前記阻害剤がなければラクテート
オキシダーゼが非常に活性であることが予想され
る条件下において、この望まれる阻害剤とラクテ
ートオキシダーゼとを一緒にすることによつて行
われる。ある適用においては他のPH及び温度条件
が有用である場合があるけれども好ましくはこの
反応はPH5.5〜9.5及び温度20〜45℃において水性
媒質の存在下で行う。 同様に、この明細書記載のラクテートオキシダ
ーゼ阻害剤の存在下における酵素試薬組成物と望
まれる被検体との“反応”は、酵素試薬組成物の
種々の成分及びラクテートオキシダーゼが通常有
効である前述のようなPH及び温度条件下で行われ
る。ラクテートオキシダーゼ阻害剤はラクテート
オキシダーゼ活性を有効に減少又は封鎖するが、
好ましくは、酵素試薬組成物のその他の成分の望
まれる被検体に関する活性を不利に妨害しない
し、もし妨害するとしてもわずかである。 望ましくないラクテートオキシダーゼ活性を阻
害する為の本発明の酵素分析法及び試薬組成物を
液体分析法に用いることができる。これらは“湿
式化学（wet chemistry）”方法と呼ばれること
がある。本発明の分析法及び試薬組成物は、“乾
式化学（dry chemistry）”方法を用いた分析に
も用いることができる。 “湿式化学”方法においては分析を全く液体媒
質中で実施する。酵素試薬組成物は、乾燥試薬又
は液体試薬のいずれかとして液体媒質へ添加する
ことができる。ラクテートオキシダーゼ阻害剤
は、酵素試薬組成物のその他の成分と一緒に液体
分析媒質中に混入することができるか又は、液体
分析媒質へ単独に添加することができる。 前述のごとくラクテートオキシダーゼ阻害剤含
有酵素試薬組成物を製造することができ、そして
それは液体試薬（たとえば水性液の形）としてか
又は乾燥試薬（たとえば凍結乾燥粉末として）と
して用いることができる。乾燥試薬は包装し、貯
蔵しそして後に使用直前に水で再構成することが
できる。 本発明の酵素分析法及び試薬組成物を“乾式化
学”方法に用いる場合、ラクテートオキシダーゼ
阻害剤含有組成物を、たとえば吸収、含浸又は被
覆法により、実質的に乾式の（即ち、触れた際乾
燥している）分析要素の試薬ゾーン、たとえば、
米国特許第3992158号及び同第4042335号に記載の
“浸漬及び解読”繊維性試験ストリツプの試薬層
又は非繊維性多層分析要素の試薬層中へ組み入れ
ることができる。 “乾式化学”試験要素では、ラクテートオキシ
ダーゼ阻害剤含有酵素試薬組成物は乾燥試薬とし
て存在する。米国特許第3992158号に記載のごと
く、多層乾式化学分析要素には二つ以上の試薬層
を含めることができ、個々の試薬層のそれぞれは
使用条件下、即ち液体試料を分析要素へ適用する
際互いに流体接触する。このような場合、このよ
うな多層分析要素に含まれる酵素試薬組成物の
種々の成分のおのおのは、別々の試薬層のそれぞ
れに位置するか又は、試薬成分のあるものは一つ
の層に位置し、一方他の試薬成分は異なる層に位
置することができる。 以下の例により本発明を更に詳細に説明する。 例において酸化性酵素はストレプトコツカスフ
アエシウムATCC12755から製造した。Ｌ−ラク
テートオキシダーゼは米国特許第4166763号に記
載のごとくストレプトコツカスフアエシウムから
０〜50％硫酸アンモニウムフラクシヨンとして単
離した。Ｌ−α−グリセロフオスフエートオキシ
ダーゼは、Research Disclosure刊行番号第
16146号、1977年９月10日出版の第５巻に記載の
ごとくストレプトコツカスフアエシウムから精製
した。非常によく精製したＬ−α−グリセロフオ
スフエートオキシダーゼ（全精製工程を終えたも
の）のＬ−α−グリセロフオスフエートとラクテ
ートオキシダーゼとの活性の比は1700〜3000：１
であり、一方精製が完全ではないＬ−α−グリセ
ロフオスフエートオキシダーゼ（50〜80％硫酸ア
ンモニウムフラクシヨンとして単離したもの）の
Ｌ−α−グリセロフオスフエートとラクテートオ
キシダーゼとの活性の比は30〜100：１であつた。 例において、ラクテートオキシダーゼの酵素分
析は以下のごとく実施した。分析反応混合物は全
体積1.0ml中に、リン酸カリウム緩衝剤100マイク
ロモル（PH7.0）、乳酸25マイクロモル、ホースラ
デイツシユペルオキシダーゼ（プルプロガリン単
位4.6）25mg及びオルトジアニシジン0.25マイク
ロモルを含んだ。ラクテートオキシダーゼの潜在
的な阻害剤として試験すべき化合物を例１に示す
ごとく分析反応混合物へ添加した。試料を30℃に
おいて平衝にし、次いでストレプトコツカスフア
エシウムラクテートオキシダーゼの添加により反
応を開始した。430nmにおける吸光度をベツクマ
ン25分光光度計において測定した。初速度を曲線
の直線部分から計算した。 例において、Ｌ−α
−グリセロフオスフエートオキシダーゼの酵素分
析は以下のごとく実施した。分析反応混合物は全
体積1.0ml中に、リン酸カリウム緩衝剤100マイク
ロモル（PH7.0）オルトジアニシジン66μg、ホー
スラデイツシユペルオキシダーゼ（プルプロガリ
ン単位4.6）25μg及びDL−α−グリセロフオスフ
エート（PH7.0において）200マイクロモルを含ん
だ。潜在的な阻害剤として試験すべき化合物を例
１に記載のごとく反応混合物へ添加した。試料を
37℃において平衡にし、そして酵素の添加により
反応を開始した。430nmにおける吸光度をベツク
マン25分光光度計において測定した。初速度を曲
線の直線部分から計算した。 例において以下の構造及び組成の血清トリグリ
セリド測定用の非繊維性多層“乾式化学”分析要
素を用いた。
【表】
前記“乾式化学”分析要素の酵素試薬層組成物
には、脱イオン化ゼラチン（5.4g／m2）；ゼラチ
ン硬化剤（32.4mg／m2）；ペルオキシダーゼ安定
剤としてポリ（メチルアクリレート−コ−２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸−
コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト）（モノマー重量比88.8：4.7：6.5）（5.4g／
m2）；リン酸カリウム緩衝剤0.05M（PH7.0）；トラ
イトン100界面活性剤（389mg／m2）；２，４−ジ
−ｎ−アミルフエノール（4.05g／m2）中に分散
した、ロイコ染料としての２−（３，５−ジメト
キシ−４−ヒドロキシフエニル）４，５−ビス
（４−ジメチルアミノフエノール）−イミダゾール
（405mg／m2）；酸化防止剤（５，５−ジメチル−
１，３−シクロヘキサンジオン）（324mg／m2）；
MgCl2（103mg／m2）アデノシントリフオスフエ
ート（1.35g／m2）；ペルオキシダーゼ（7020U／
m2）；グリセリンキナーゼ（324U／m2）及び精製
もしくは不完全精製のＬ−α−グリセロフオスフ
エートオキシダーゼ（2840U／m2）が含まれた。
部分精製のＬ−α−グリセロフオスフエートオキ
シダーゼを用いた時、以下の例２に記載の量のグ
リコレートを試薬層に組み入れた。 例１ ストレプトコツカスフアエシウムから得ら
れたＬ−ラクテートオキシダーゼの選択的阻害 Ｌ−α−グリセロフオスフエートオキシダーゼ
のような、同じ源からの他の酵素が存在している
場合でさえもＬ−ラクテートオキシダーゼを選択
的に阻害する化合物を見い出す為にいくつかの化
合物を反応混合物へ添加し、そして前述のごとく
酵素の分析を行つた。表からわかるように、シ
ユウ酸及びグリコール酸は非常にＬ−ラクテート
オキシダーゼを阻害する。グリオキサル酸もＬ−
ラクテートオキシダーゼを阻害し、そしてそれは
Ｌ−α−GPOをも阻害した。 各化合物は濃度５ミリモルで反応混合物へ添加
加した。化合物不存在における反応速度を100％
と考え、そして各化合物による反応の阻害百分率
をそれに応じて計算した。
には、脱イオン化ゼラチン（5.4g／m2）；ゼラチ
ン硬化剤（32.4mg／m2）；ペルオキシダーゼ安定
剤としてポリ（メチルアクリレート−コ−２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸−
コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト）（モノマー重量比88.8：4.7：6.5）（5.4g／
m2）；リン酸カリウム緩衝剤0.05M（PH7.0）；トラ
イトン100界面活性剤（389mg／m2）；２，４−ジ
−ｎ−アミルフエノール（4.05g／m2）中に分散
した、ロイコ染料としての２−（３，５−ジメト
キシ−４−ヒドロキシフエニル）４，５−ビス
（４−ジメチルアミノフエノール）−イミダゾール
（405mg／m2）；酸化防止剤（５，５−ジメチル−
１，３−シクロヘキサンジオン）（324mg／m2）；
MgCl2（103mg／m2）アデノシントリフオスフエ
ート（1.35g／m2）；ペルオキシダーゼ（7020U／
m2）；グリセリンキナーゼ（324U／m2）及び精製
もしくは不完全精製のＬ−α−グリセロフオスフ
エートオキシダーゼ（2840U／m2）が含まれた。
部分精製のＬ−α−グリセロフオスフエートオキ
シダーゼを用いた時、以下の例２に記載の量のグ
リコレートを試薬層に組み入れた。 例１ ストレプトコツカスフアエシウムから得ら
れたＬ−ラクテートオキシダーゼの選択的阻害 Ｌ−α−グリセロフオスフエートオキシダーゼ
のような、同じ源からの他の酵素が存在している
場合でさえもＬ−ラクテートオキシダーゼを選択
的に阻害する化合物を見い出す為にいくつかの化
合物を反応混合物へ添加し、そして前述のごとく
酵素の分析を行つた。表からわかるように、シ
ユウ酸及びグリコール酸は非常にＬ−ラクテート
オキシダーゼを阻害する。グリオキサル酸もＬ−
ラクテートオキシダーゼを阻害し、そしてそれは
Ｌ−α−GPOをも阻害した。 各化合物は濃度５ミリモルで反応混合物へ添加
加した。化合物不存在における反応速度を100％
と考え、そして各化合物による反応の阻害百分率
をそれに応じて計算した。
【表】
【表】
例２ グリコール酸によるラクテートブランク反
応の減少 Ａ 乾式化学試験要素方式 トリグリセリド測定用の乾式化学分析要素を、
前述のような精製又は不完全精製いずれかのＬ−
α−GPOを用いて製造した。グリコレートを表
に示すごとく要素へ添加した。各要素へ、DL
−ラクテート試料（20mg／dl）10μを適用し、
そして37℃で７分間インキユベートした後540nm
における要素の反射濃度、DRを要素の支持体を
通して測定した。阻害剤としてグリコレートの存
在下におけるラクテートブランク反応の減少を表
に示す。阻害剤の不存在下においては精製が完
全でない調製物はラクテートに対し高い応答を示
した（対照の3.4倍）、しかしグリコール酸
81mg／m2においてはブランクは実質的に低くな
り（対照の1.6倍）、そしてグリコール酸405mg／
m2においてはラクテートとの反応は、精製Ｌ−α
−グリセロフオスフエートオキシダーゼ（対照）
に関して見られた反応よりも低かつた。
応の減少 Ａ 乾式化学試験要素方式 トリグリセリド測定用の乾式化学分析要素を、
前述のような精製又は不完全精製いずれかのＬ−
α−GPOを用いて製造した。グリコレートを表
に示すごとく要素へ添加した。各要素へ、DL
−ラクテート試料（20mg／dl）10μを適用し、
そして37℃で７分間インキユベートした後540nm
における要素の反射濃度、DRを要素の支持体を
通して測定した。阻害剤としてグリコレートの存
在下におけるラクテートブランク反応の減少を表
に示す。阻害剤の不存在下においては精製が完
全でない調製物はラクテートに対し高い応答を示
した（対照の3.4倍）、しかしグリコール酸
81mg／m2においてはブランクは実質的に低くな
り（対照の1.6倍）、そしてグリコール酸405mg／
m2においてはラクテートとの反応は、精製Ｌ−α
−グリセロフオスフエートオキシダーゼ（対照）
に関して見られた反応よりも低かつた。
【表】
フエートオキシダーゼ
＋グリコール酸81mg／m2 0.04
＋グリコール酸405mg／m2 0.01
Ｂ 溶液方式 以下の記載からわかるように、不完全精製の
DL−α−グリセロフオスフエートを含む溶液系
において、大量のラクテートが存在する場合でさ
えもグリコレートの添加により血清ブランクが減
少することが証明された。 インキユベート溶液混合物は全体積1.0ml中に
リン酸カリウム緩衝剤100マイクロモル（PH7.0）、
４−アミノアンチピレン・HCl0.12mg、１，７
−ジヒドロキシナフタリン0.04mg、ホースラデ
イツシユペルオキシダーゼ（プルプロガリン単位
4.6）25μg、グリセリンキナーゼ0.36単位、不完
全精製DL−α−グリセロフオスフエートオキシ
ダーゼ4.6単位及びトライトンＸ−100 10mgを含
んだ。正常な血清20μ又は1mMDL−ラクテー
ト50μlの添加により反応を開始し、そして37℃で
10分後に490nmにおける吸光度を測定した。各場
合に試薬ブランク（基質を除くすべての成分）を
引き、490nmにおける吸光度の変化、ΔA490を得
た。 表は、基質として正常な血清及び1mMDL−
ラクテート50μの両方を用いた場合のグリコレ
ートの添加により得られたブランク反応の減少を
示す。
＋グリコール酸81mg／m2 0.04
＋グリコール酸405mg／m2 0.01
Ｂ 溶液方式 以下の記載からわかるように、不完全精製の
DL−α−グリセロフオスフエートを含む溶液系
において、大量のラクテートが存在する場合でさ
えもグリコレートの添加により血清ブランクが減
少することが証明された。 インキユベート溶液混合物は全体積1.0ml中に
リン酸カリウム緩衝剤100マイクロモル（PH7.0）、
４−アミノアンチピレン・HCl0.12mg、１，７
−ジヒドロキシナフタリン0.04mg、ホースラデ
イツシユペルオキシダーゼ（プルプロガリン単位
4.6）25μg、グリセリンキナーゼ0.36単位、不完
全精製DL−α−グリセロフオスフエートオキシ
ダーゼ4.6単位及びトライトンＸ−100 10mgを含
んだ。正常な血清20μ又は1mMDL−ラクテー
ト50μlの添加により反応を開始し、そして37℃で
10分後に490nmにおける吸光度を測定した。各場
合に試薬ブランク（基質を除くすべての成分）を
引き、490nmにおける吸光度の変化、ΔA490を得
た。 表は、基質として正常な血清及び1mMDL−
ラクテート50μの両方を用いた場合のグリコレ
ートの添加により得られたブランク反応の減少を
示す。
【表】
例 ３
精製Ｌ−α−グリセロフオスフエートオキシダ
ーゼを含む乾式化学トリグリセリド試験要素
と、不完全精製酵素及びグリコレートを含む乾
式化学トリグリセリド試験要素との比較 精製Ｌ−α−グリセロフオスフエートオキシダ
ーゼを含む乾式化学分析要素（前述）及び部分精
製の前記酵素と二つの異なるレベルのグリコレー
トとを含む乾式化学分析要素（前述）血清トリグ
リセリド及びグリセリンに対する応答を比較し
た。一組の分析要素には精製Ｌ−α−グリセロフ
オスフエートオキシダーゼ2840U／m2が含まれ
た。二つの他の組の要素には部分精製Ｌ−α−グ
リセロフオスフエートオキシダーゼ2840U／m2と
グリコレート81mg／m2又は405mg／m2がそれぞ
れ含まれた。試験流体は血清を主成分とする三つ
の較正体（（）低トリグリセリド濃度含有、
（）正常なトリグリセリド濃度含有、（）高ト
リグリセリド濃度含有較正体）及び正常な血清で
あつた。試験流体試料10μlを各要素へ適用した。
37℃で７分間インキユベートした後、540nmにお
ける反射濃度、DRを要素の支持体を通して測定
した。結果は２回行なつた平均を表わす。表の
欄Ａからわかるように、血清を主成分とする三つ
のトリグリセリド較正体及び正常な血清試料を用
いて試験した時、三つの要素はすべて同様の応答
を示した。即ち、グリコレートは有効にラクテー
トブランク反応を減少させたけれども（例２）、
トリグリセリド検出系のいずれの成分をも阻害し
なかつた。
ーゼを含む乾式化学トリグリセリド試験要素
と、不完全精製酵素及びグリコレートを含む乾
式化学トリグリセリド試験要素との比較 精製Ｌ−α−グリセロフオスフエートオキシダ
ーゼを含む乾式化学分析要素（前述）及び部分精
製の前記酵素と二つの異なるレベルのグリコレー
トとを含む乾式化学分析要素（前述）血清トリグ
リセリド及びグリセリンに対する応答を比較し
た。一組の分析要素には精製Ｌ−α−グリセロフ
オスフエートオキシダーゼ2840U／m2が含まれ
た。二つの他の組の要素には部分精製Ｌ−α−グ
リセロフオスフエートオキシダーゼ2840U／m2と
グリコレート81mg／m2又は405mg／m2がそれぞ
れ含まれた。試験流体は血清を主成分とする三つ
の較正体（（）低トリグリセリド濃度含有、
（）正常なトリグリセリド濃度含有、（）高ト
リグリセリド濃度含有較正体）及び正常な血清で
あつた。試験流体試料10μlを各要素へ適用した。
37℃で７分間インキユベートした後、540nmにお
ける反射濃度、DRを要素の支持体を通して測定
した。結果は２回行なつた平均を表わす。表の
欄Ａからわかるように、血清を主成分とする三つ
のトリグリセリド較正体及び正常な血清試料を用
いて試験した時、三つの要素はすべて同様の応答
を示した。即ち、グリコレートは有効にラクテー
トブランク反応を減少させたけれども（例２）、
トリグリセリド検出系のいずれの成分をも阻害し
なかつた。
【表】
例４ 乾式化学試験要素の安定性に関するグリコ
レートの影響 例３で試験した三つの要素を78〓、相対湿度50
％において４週間貯蔵し、そして再び試験した。
表の欄Ｂに示したごとく、部分精製酵素とグリ
コール酸とを含む要素は、78〓、相対湿度50％に
おいて４週間貯蔵した後も試験流体に対する応答
に減少は見られなかつたが、一方精製Ｌ−α−グ
リセロフオスフエートオキシダーゼを含む要素は
減少した応答を示した。このことは較正体（ト
リグリセリド含量の高い物質）及びグリセリン
5mMに関して特に明らかであつた。 例 ５ ラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）及びＬ
−ラクテートオキシダーゼ（LO）が独特に働き、
しかもLOの阻害剤を、LDHに関する特定化合物
により生じる阻害に基づいて選ぶことができない
ことを示す為に、LO及びLDHに関するシユウ
酸、グリコール酸及びグリオキサル酸の阻害効果
を比較した。LOに関するこれらの酸の影響は、
前記組成のLO分析反応混合物を検討することに
より評価した。LDHに関するこれらの酸の影響
は、リン酸カリウム緩衝剤50マイクロモル（PH
7.5）、ピルビン酸ナトリウム１マイクロモル、
NADH0.13マイクロモル、牛肉のラクテートデ
ヒドロゲナーゼ（320U／mg）0.02μg及び濃度
10mMの酸が全体積1.0mlに含まれるLDH分析反
応混合物を検討することにより評価した。酸の不
存在下における反応速度を100％と推定し、そし
て各反応の阻害百分率をそれに応じて計算した。
表の結果は、明きらかにある化合物がLDHを
阻害するかどうかに基づいてその化合物がLOの
阻害剤であるかどうかを予想することは不可能で
あることを示す。
レートの影響 例３で試験した三つの要素を78〓、相対湿度50
％において４週間貯蔵し、そして再び試験した。
表の欄Ｂに示したごとく、部分精製酵素とグリ
コール酸とを含む要素は、78〓、相対湿度50％に
おいて４週間貯蔵した後も試験流体に対する応答
に減少は見られなかつたが、一方精製Ｌ−α−グ
リセロフオスフエートオキシダーゼを含む要素は
減少した応答を示した。このことは較正体（ト
リグリセリド含量の高い物質）及びグリセリン
5mMに関して特に明らかであつた。 例 ５ ラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）及びＬ
−ラクテートオキシダーゼ（LO）が独特に働き、
しかもLOの阻害剤を、LDHに関する特定化合物
により生じる阻害に基づいて選ぶことができない
ことを示す為に、LO及びLDHに関するシユウ
酸、グリコール酸及びグリオキサル酸の阻害効果
を比較した。LOに関するこれらの酸の影響は、
前記組成のLO分析反応混合物を検討することに
より評価した。LDHに関するこれらの酸の影響
は、リン酸カリウム緩衝剤50マイクロモル（PH
7.5）、ピルビン酸ナトリウム１マイクロモル、
NADH0.13マイクロモル、牛肉のラクテートデ
ヒドロゲナーゼ（320U／mg）0.02μg及び濃度
10mMの酸が全体積1.0mlに含まれるLDH分析反
応混合物を検討することにより評価した。酸の不
存在下における反応速度を100％と推定し、そし
て各反応の阻害百分率をそれに応じて計算した。
表の結果は、明きらかにある化合物がLDHを
阻害するかどうかに基づいてその化合物がLOの
阻害剤であるかどうかを予想することは不可能で
あることを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ラクテートオキシダーゼと、グリオキサル
酸、シユウ酸、グリコール酸、これらの酸の塩又
はこれらの混合物とを反応させることを特徴とす
る乳酸及びラクテートに対するラクテートオキシ
ダーゼの活性を阻害する方法。 ２ ラクテートオキシダーゼが、酸素の存在下に
おいて過酸化水素を発生するに有効な一つ又はそ
れ以上の別の酵素及びこの酵素の基質と共に、酵
素試薬組成物中に存在し、そして前記阻害性化合
物が該試薬組成物へ添加されている特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３ 酵素試薬組成物が別の酵素の一つとしてα−
グリセロフオスフエートオキシダーゼを含み、そ
して阻害性化合物がシユウ酸、グリコール酸又は
それらの塩である特許請求の範囲第２項記載の方
法。 ４ α−グリセロフオスフエートオキシダーゼが
ストレプトコツカスフアエシウムに由来するもの
であり、そして前記酵素試薬組成物が更にペルオ
キシダーゼを含む特許請求の範囲第３項記載の方
法。 ５ 酵素試薬組成物が実質上乾式の分析要素の少
なくとも一つの試薬ゾーン中に存在する特許請求
の範囲第２ないし４項のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/141,026 US4322496A (en) | 1980-04-17 | 1980-04-17 | Inhibition of lactate oxidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56164788A JPS56164788A (en) | 1981-12-17 |
| JPH0141319B2 true JPH0141319B2 (ja) | 1989-09-05 |
Family
ID=22493836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5639681A Granted JPS56164788A (en) | 1980-04-17 | 1981-04-16 | Inhibition of lactate oxidase activity |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4322496A (ja) |
| EP (1) | EP0038753B1 (ja) |
| JP (1) | JPS56164788A (ja) |
| CA (1) | CA1156949A (ja) |
| DE (1) | DE3162935D1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5946854A (ja) * | 1982-09-10 | 1984-03-16 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多層分析材料 |
| US4463095A (en) * | 1982-11-26 | 1984-07-31 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Process for producing α-glycerophosphate oxidase |
| US4757001A (en) * | 1984-02-16 | 1988-07-12 | Fujirebio Kabushiki Kaisha | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase |
| US4937047A (en) * | 1986-04-01 | 1990-06-26 | Konishiroku Photo Industry Co., Ltd. | Analytical element |
| JPH0638730U (ja) * | 1992-11-06 | 1994-05-24 | フランスベッド株式会社 | スプリング構体 |
| US5690944A (en) * | 1994-12-20 | 1997-11-25 | Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. | Cosmetic compositions containing lactate dehydrogenase inhibitors |
| CN109916897A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-06-21 | 吉林省汇酉生物技术股份有限公司 | 一种定量测定甘油三酯浓度的干化学试剂片及其制备方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2000127C3 (de) * | 1970-01-02 | 1974-12-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur quantitativen Spaltung und zum quantitativen Nachweis von Tri-, Di- und Monoglyceriden |
| US3703591A (en) * | 1970-12-16 | 1972-11-21 | Calbiochem | Triglyceride hydrolysis and assay |
| AT324282B (de) * | 1972-06-19 | 1975-08-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von triglyceriden |
| US3992158A (en) * | 1973-08-16 | 1976-11-16 | Eastman Kodak Company | Integral analytical element |
| DE2349819A1 (de) | 1973-10-04 | 1975-04-17 | Eppendorf Geraetebau Netheler | Verfahren zur enzymkinetischen konzentrationsbestimmung eines substrats |
| US3898130A (en) * | 1974-03-18 | 1975-08-05 | American Hospital Supply Corp | Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides |
| US3956069A (en) * | 1974-04-29 | 1976-05-11 | Abbott Laboratories | Enzymatic assays for glucose, creatine phosphokinase or plasma ammonia |
| US4042335A (en) * | 1975-07-23 | 1977-08-16 | Eastman Kodak Company | Integral element for analysis of liquids |
| US4012287A (en) * | 1975-11-18 | 1977-03-15 | Dr. Bruno Lange Gmbh | Method and reagent for the quantitative analysis of triglycerides |
| US4166763A (en) * | 1976-12-10 | 1979-09-04 | Eastman Kodak Company | Analysis of lactic acid or lactate using lactate oxidase |
| US4166005A (en) * | 1976-12-10 | 1979-08-28 | Eastman Kodak Company | Process for the production of α-glycerophosphate oxidase |
| US4241178A (en) * | 1978-01-06 | 1980-12-23 | Eastman Kodak Company | Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides |
| JPS5910190B2 (ja) * | 1978-06-17 | 1984-03-07 | 東洋醸造株式会社 | 新規な乳酸オキシダ−ゼの製造法 |
-
1980
- 1980-04-17 US US06/141,026 patent/US4322496A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-03-06 CA CA000372503A patent/CA1156949A/en not_active Expired
- 1981-04-16 JP JP5639681A patent/JPS56164788A/ja active Granted
- 1981-04-17 EP EP81400614A patent/EP0038753B1/en not_active Expired
- 1981-04-17 DE DE8181400614T patent/DE3162935D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1156949A (en) | 1983-11-15 |
| EP0038753B1 (en) | 1984-04-04 |
| EP0038753A1 (en) | 1981-10-28 |
| US4322496A (en) | 1982-03-30 |
| JPS56164788A (en) | 1981-12-17 |
| DE3162935D1 (en) | 1984-05-10 |
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