JPH0142279B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性を有す
るポリペプチドに関する。 インターロイキン２（以下、「IL−２」と略記
する。）は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれてお
り、レクチンあるいは抗原で活性化されたＴ細胞
より産生される可溶性たんぱく（一般には「リン
ホカイン」として知られている）である
（Morganら、Science、193、1007〜1008（1976）、
Gillisら、J.Immunol.、120、2027〜2033
（1978））。IL−２はリンパ球の反応性を調節で
き、抗原特異的なエフエクターＴ−リンパ球のin
vitroにおける長期培養を可能ならしめることが
できる（Gillisら、Nature、268、154〜156
（1977））。またIL−２は、胸腺細胞の分裂の促進
（Chenら、Cell Immunol.、22、221〜224
（1977）、Shawら、J.Immunol.、120、1967〜
1973（1978））、ヌードマウスの脾細胞の培養系で
の細胞障害性Ｔリンパ球活性（Wagnerら、
Nature、284、278〜280、（1980））や抗−SRBC
プラーク形成細胞反応の誘導（Gillisら、J.Exp.
Med.149、1960〜1968（1979））等の関連する他の
生物活性をもつことが明らかにされてる。従つ
て、このリンパ球調節因子は液体免疫や細胞性免
疫反応を増強したり免疫不全状態を正常な液体や
細胞性免疫の状態に回復させるのに有用である。
これらの明らかにされたIL−２の免疫学的活性
は、IL−２が悪性腫瘍、細菌またはウイルス感
染、免疫不全、自己免疫疾患等（Papermaster
ら、Adv.Immunopharm.、507、（1980））に対す
る医科免疫療法に有用であることを示している。
インターフエロンと同様に、IL−２はナチユラ
ルキラー細胞活性を増強することが示されてきた
が、これは悪性腫瘍治療への有用性を強く示唆し
ている。更に、IL−２は単クローン性の活性化
Ｔ細胞の保持を可能とし、この事は、Ｔ細胞分化
の分子機構、Ｔ細胞機能の分化機構、Ｔ細胞の抗
原リセプターの機構を研究する上で重要な役割を
担つていることを示している。また、IL−２は
単クローン性Ｔ細胞を長期培養することにより、
他の種々の分野で有用な様々なＴ細胞由来のリン
ホカインを製造するためにも使用できる。更に、
IL−２の産生とリンパ球のIL−２に対する応答
性は、免疫学的機能の重要なパラメーターであ
り、免疫異常の臨床診断に有用である。 IL−２は従来の技術では、マイトジエンでマ
ウス、ラツトあるいはヒトのリンパ球を刺激する
ことにより製造されてきた（Gillisら、Nature、
268、154〜156、（1977））、Farrarら、J.
Immunol.、121、1353〜1360、（1978）、Gillisら、
J.Immunol.、120、2027〜2033、（1978））。ヒト
の末梢血リンパ球をマイトジエンで刺激すること
により（Gillisら、J.Immunol.、124、1954〜
1962、（1980））、GillisらはＴリンホーマ細胞株か
らのマウスIL−２の製造（Gillisら、J.
Immunol.、125、2570〜2578（1980））とヒト白血
病細胞株からのヒトIL−２の製造（Gillisら、J.
Exp.Med.、152、1709〜1719、（1980））を報告し
ている。 Gillisらによる上記の技法は、細胞培養法を用
いてマイトジエンで活性化されたＴ白血病細胞株
からヒトIL−２を製造する方法に関するもので
ある。しかしながら、この方法では低濃度のヒト
IL−２しか産生されないのが難点で、大量の培
養液から微量のIL−２を得るために、複雑な精
製工程を必要とする。更に、ヒト白血病細胞株は
少量のヒトIL−２に酷似した他の生理活性物質
も産生するので、IL−２をこれらの他の免疫活
性を有する分子と分離、あるいは時として共存す
る細胞毒物質（toxic lectin）と分離するにはか
なりの困難が伴う。 IL−２を製造する他の方法として、インター
フエロンのような他の生理活性ヒト由来たんぱく
を製造するために用いられた組換えDNA（デオキ
シリボ核酸の略）法（Grayら、Nature 295、
503〜508、（1981）、Nagataら、Nature 284、
316〜320（1980）、Taniguchiら、Gene 10、11
〜15、（1980））が好ましいと思われる。しかしな
がら、本発明の以前には組換えDNA法によつて
IL−２を製造する試みは成功していなかつた。
例えば、組換えDNA体によつてIL−２を産生す
る生命体を作成しようとする試みは、恐らくIL
−２ポリペプチドをコードする遺伝子が未だクロ
ーン化されていなかつたために成功していないと
いう事が、“日経バイオテクノロジー、第19号、
1982年７月５日”に報告されていた。 従つて、IL−２をコードするクローン化遺伝
子とその遺伝子を持つた組換えDNA体が渇望さ
れてきた。また、組換えDNA体を有する生細胞
株と、その細胞株を使つてIL−２を製造する方
法が渇望されてきた。 本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白
となる。本発明の目的はIL−２活性を有するポ
リペプチドを創出したことにある。 すなわち、本発明は遺伝子組換え手法によつて
得られ、糖類を伴なわず、ヒト由来の他の蛋白質
を実質的に含有しない、分子中に次のアミノ酸配
列を含むヒトインターロイキン２活性を有するポ
リペプチドに関する。 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr
GlN Leu GlN Leu Glu His Leu Leu Leu
Asp Leu GlN Met Ile Leu AsN Gly Ile AsN
AsN Tyr Lys AsN Pro Lys Leu Try Arg
Met Leu Thr Phe Lys Phe Try Met Pro
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu GlN
Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
Glu Val Leu AsN Leu Ala GlN Ser Lys
AsN Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
Ser AsN Ile AsN Val Ile Val Leu Glu Leu
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
Tys Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
Phe Leu AsN Arg Trp Ile Thr Phe Cys
GlN Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 本発明のポリペプチドの具体例として以下のも
のを挙げることができる。 次のアミノ酸配列を有するポリペプチド Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys
Thr GlN Leu GlN Leu Glu His Leu Leu
Leu Asp Leu GlN Met Ile Leu AsN Gly Ile
AsN AsN Tyr Lys AsN Pro Lys Leu Try
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Try Met
Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
GlN Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
Glu Glu Val Leu AsN Leu Ala GlN Ser Lys
AsN Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
Ser AsN Ile AsN Val Ile Val Leu Glu Leu
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
Tys Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
Phe Leu AsN Arg Trp Ile Thr Phe Cys
GlN Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 次のアミノ酸配列を有するポリペプチド Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr
GlN Leu GlN Leu Glu His Leu Leu Leu
Asp Leu GlN Met Ile Leu AsN Gly Ile AsN
AsN Tyr Lys AsN Pro Lys Leu Try Arg
Met Leu Thr Phe Lys Phe Try Met Pro
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu GlN
Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
Glu Val Leu AsN Leu Ala GlN Ser Lys
AsN Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
Ser AsN Ile AsN Val Ile Val Leu Glu Leu
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
Tys Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
Phe Leu AsN Arg Trp Ile Thr Phe Cys
GlN Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 本発明によつて、IL−２はIL−２活性を有す
るポリペプチドを産生すべくコードされた遺伝子
の挿入と、細胞の中で複製され得るベクター
DNAの挿入で組換え法により修飾され、該遺伝
子のコードシーケンスが、プロモーターシーケン
スの下流に位置するDNAによつてIL−２を産生
すべく形質転換させた原核生物細胞株、特にエシ
エリヒア・コリを培地に浮遊培養（好気的）する
ことによつてIL−２活性を有するポリペプチド
が製造される。 IL−２ポリペプチドをコードしたクローン化
遺伝子は、IL−２活性を有するポリペプチドを
産生する能力をもつことによつて特徴づけられる
哺乳動物細胞に由来するIL−２に相当するメツ
センジヤーRAM（mRNA；“RNA”はリボ核酸
の略、以下“IL−２ mRNA”という）を相補
的DNA（cDNA）に逆転写することによつて得て
も良い。得られた一重鎖cDNA（ss−cDNA）は
２重鎖cDNA（ds−cDNA）に変換させることが
できる。 cDNAを調製するための鋳型として用いる
mRNAは、IL−２ポリペプチドを産生する哺乳
動物細胞から単離することができる。単離された
RNAはポリアデニル化され（Gillisら、J.
Immunological Rev.、63、167〜209（1982））、
ポリアデニル化されたRNAは、例えばシヨ糖密
度勾配遠心法によつて11〜12S画分に分画するこ
とができる。13SのmRNAはIL−2mRNA活性が
現われることがあるが、この場合は11〜
12SmRNAの凝集物であることが考えられる。 mRNAの供給源となるIL−２を産生すること
ができる哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出でき
る末梢血単核球、扁桃腺細胞、脾臓細胞のような
Ｔ−リンパ球で良い。細胞にIL−２産生能を与
えたり、またはIL−２活性を増強するために、
ナイロンカラム処理、抗血清と捕体処理、密度勾
配分画、ノイラミニダーゼとガラクトースオキシ
ダーゼの組合せ処理、トリプシン処理のような
様々な酵素処理、Ｘ線照射など従来知られた方法
で前処理しても良い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞
増殖因子存在下で培養後得られるクローン化Ｔリ
ンパ球もmRNAの供給源として用いることがで
き、これはより好ましいＴ−リンパ球である。白
血病やリンパ腫細胞株に由来するＴリンパ球それ
自体または上記の方法で前処理または変異したそ
れらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞
株またはクローニングされた形質転換細胞株も
mRNAの供給源として好ましい。明らかに、ク
ローン化した細胞株は通常クローン化前の親株に
比較して多量のIL−2mRNAを含んでいる。上記
したリンパ球由来細胞とCEM、Molt 4F、
BW5147のごとき腫瘍細胞株を融合することによ
つて得られたＴ細胞ハイブリドーマもまた本発明
に使用するのに好ましい哺乳動物細胞である。こ
の場合のリンパ球由来細胞は、(1)IL−２の自発
産生細胞および(2)IL−２産生を補助する他の細
胞の存在下または非存在下に培養液中にマイトジ
エンが導入され存在している時のみIL−２を産
生する細胞を含む。 IL−２自発産生細胞においてIL−2mRNAを誘
導するために、IL−２自発産生細胞は、細胞培
養の分野でよく知られた方法で培養される。マイ
トジエン存在下のみでIL−２を産生する細胞に
おいてmRNAを産生する場合は、培養した細胞
は培地で良く洗つた後、血清を含むかまたは含ま
ないローズウエルパークメモリアルインステイテ
ユート1640（以下、“RPMI 1640”と略す。）、ダ
ルベツコウ変法イーグル培地（以下“DMEM”
と略す。）またはクリツク培地のごとき培地に再
び浮遊する。これらの細胞培養培地には、ペニシ
リン、ストレプトマイシンまたは他の抗生物質、
Ｌ−グルタミン、ヘペス緩衝液、または炭酸水素
ナトリウムのような種々の添加物を細胞培養の分
野で一般に使われる濃度で加えても良い。好まし
い細胞濃度は0.5〜４×10⁶細胞／mlである。
mRNAの活性化とIL−２の産生を誘導するため
に適当な刺激剤が加えられる。この適当な刺激剤
の中には、マイトジエン、ノイラミニダーゼ、ガ
ラクトースオキシダーゼ、塩化亜鉛の如き亜鉛化
合物またはプロテインＡ、ストレプトリシン−Ｏ
の如き細胞由来のリンパ球活性化因子が含まれ
る。刺激された細胞は回収され、洗浄される。マ
イトジエン刺激の際、マクロフアージまたはデン
ドリテイツク細胞を共存させるとやはりmRNA
を活性化し、あるいは活性化mRNAの収量を増
大させ得る。同様にRaji、Daudi、K562、BALL
−１の如きＢリンパ球またはＢリンパ球細胞株に
由来する細胞株を共存させてもmRNAは活性化
され、また活性化mRNAの収量を増大させ得る。 哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常
の条件下でin vitroで細胞培養により、または組
織適合動物の体内で維持される。mRNAの供給
源を調製するためのin vitro培養による継代を行
なう場合には、従来Ｔ細胞の生育を促進すること
が知られている培地であればどのような培地にも
これら細胞は生育する。これらの培地には哺乳動
物の血清、血清成分または血清アルブミンを添加
しても良い。mRNAの活性化のための培養時間
は、mRNAを生成するための活性化に必要な時
間に対応する時間を採用する。この時間は、通常
IL−２の培地中への産生が開始されるまでに必
要な時間と対応している。好ましい時間は、マイ
トジエン等の刺激剤を添加してから３〜12時間で
ある。培養時間が長すぎる場合、生成したIL−
2mRNAが分解されることがある。IL−２産生細
胞の活性化に際し、PMAまたはTPAの如きホル
ボールエステル類を10〜50nｇ／ml添加して活性
化レベルを上昇させることもできる。 IL−2mRNA活性化のための上記工程はPH7.0
〜7.4、温度範囲32〜38℃の飽和水蒸気の環境下
で行なわれる。 IL−２を産生する哺乳動物細胞を取得し培養
する方法を以下に述べる。 (イ) IL−２自発産生株の取得 ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジユル
カツト細胞（フレツド・ハツチンソン・癌研究
所／シアトル／アメリカ、ソーク研究所／サン
ジエゴ／アメリカ、西ドイツ国立癌センター／
ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に手に入
る。）を１×10⁶個／mlの細胞密度でクリツク培
地中に懸濁させ、150レントゲン／分の照射速
度で合計8000レントゲンのＸ線照射を行なう。
この後、本細胞を0.1細胞／200μ培地の細胞
密度で96穴の平底マイクロタイタープレート
（「フアルコン3072」）に添加し、５％牛胎児血
清を含むクリツク培地中で３週間37℃にて５％
CO₂インキユベーター中にて培養する（限界希
釈法によるクローニング）。細胞の生育が認め
られた培養ウエル中の細胞は、細胞が底面全体
をおおう密度に到達する前に24穴のヌンク社製
培養プレートに移し、クリツク培地中にて５日
間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を１〜２
×10⁶個／mlの細胞密度にて血清も血清由来ア
ルブミンも含まない無血清合成培地に懸濁して
２日間培養し、本培養上清を遠心分離操作で分
離し、次いで0.22μのミリポアフイルターにて
デブリス除去と無菌化を行なつた。このように
して得た培養上清のIL−２活性を測定するこ
とによつてIL−２を自発産生するＸ線処理変
異株が選択され、かつクローニングされた。 (ロ) ヒト末梢血単核細胞よりIL−２産生株の取
得 ヒトの末梢血を採血し、フイコール・ハイパ
ークの密度勾配遠心法により末梢血リンパ球
（以下、PBLと略す）。を採取する。本PBLを
１×10⁶個／mlの細胞密度で５％FCSを含むク
リツク培地に懸濁し、各２ml宛24穴のヌンクの
培養プレートに接種する。ここにフイトヘマグ
ルチニン−Ｍ（ギブコ社製）を5μｇ／mlの終末
濃度になるように100μ添加し、上述の条件
下に48時間培養し、次いで細胞を培養液で洗浄
し、再び１×10⁵個／mlの細胞密度でクリツク
培地１mlに接種する。さらに、コンカナバリン
Ａ（以下、ConAと略す）。2.5μｇ／mlで48時間
刺激したヒト脾細胞から調製したコンデイシヨ
ニングした培地１mlを加え、該コンデイシヨニ
ングした培地50％を含む培地を３日毎に取り換
えて、PBLからのヒトＴリンパ球を長期継代
培養する。このような長期継代培養して得たＴ
リンパ球を、前述と同様の限界希釈法でコンデ
イシヨニングした培地に由来するヒト脾細胞の
存在下、クローニングを行ない、かつ同様に細
胞増殖を行なう。こうして得られたクローン化
Ｔリンパ球を１×10⁶個／mlの細胞密度に10μ
ｇ／mlのフイトヘマグルチニン（以下、PHA
と略す。）の存在下、24穴のヌンク培養プレー
ト中のRPMI 1640培地１mlに接種し、24時間、
37℃で7.5％CO₂インキユベーター中にて培養
した。本培養上清を遠心分離操作で分離し、次
いで0.22μのミリポアフイルターで無菌化を行
なつた後、IL−２産生ヒト正常Ｔリンパ球ク
ローンを同定するために、IL−２活性検定を
行なつた。 (ハ) マイトジエン刺激でIL−２を生産するヒト
リンパ球由来悪性化細胞の取得 前述のジユルカツト細胞や前記した限界希釈
法によりクローン化されたＪ−111株は、前記
の無血清培地や血清１〜２％を含むBPMI
1640培地中にてConA10μｇ／mlやPHA2.5μ
ｇ／mlの存在下に24時間培養すると、10〜4000
単位／mlのIL−２を産生することができる。
また、これらヒト悪性化細胞は塩化亜鉛、プロ
テインＡ、ピシバニール存在下に培養しても、
IL−２を産生する。 (ニ) 他の細胞もしくはその細胞の産生する因子の
存在下にマイトジエンで刺激することにより
IL−２を産生する細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Molt 4Fや前述の限
界希釈法でクローン化されたジユルカツト細胞
の１つのクローン、ジユルカツト99株は、上述
のごときレクチンやマイトジエンを広い濃度範
囲で加えて24〜72時間培養してもIL−２を産
生しない。ところが、この間モノカインの１種
であるインターロイキン１を５〜10u／mlまた
は50％のK562やラージ（Raji）細胞を共存さ
せて37℃、24時間培養すると、IL−２を確認
しうる量（10〜100u／ml）産生する。 このようにして活性化された細胞よりIL−
2mRNAを抽出するには、細胞の種類を問わず常
法によつて行なえばよい。たとえば、NP−40、
SDS、Triton−X100、デオキシコール酸などの
界面活性剤を添加して細胞を部分的または完全に
分解するか、ホモゲナイザーや凍結融解などの物
理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に
破壊、可溶化する。その際にRNaseによるRNA
の分解を防ぐために、抽出液中にRNaseインヒ
ビター、たとえばヘパリン、ポリビニル硫酸、ベ
ントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーボネ
ート、バナジウム複合体などを添加しておくのが
好ましい。また、場合に応じては、抗IL−２抗
体を用いてIL−２合成途上のポリゾームを沈降
せしめ、これよりmRNAを界面活性剤などで抽
出する方法も行ない得る。 また、poliAを含むmRNAの精製についてはオ
リゴdT−セルロース、セフアロース2Bを担体と
するポリＵ−セフアロースなどのアフイニテイ・
カラムあるいはバツチ法による精製法、SDG遠
心法による分画、アガロースゲル電気泳動法等に
よつて行なうことができる。 上記の如くして得られたmRNAがIL−
2mRNA活性を有するものであることを確認する
ためには、mRNAを蛋白に翻訳させ、その生理
活性を調べるか、抗IL−２ペプチド単クローン
性抗体を用い該翻訳蛋白を同定する等の方法を行
なえばよい。たとえばmRNAは通常、アフリカ
ツメガエル（Xenops laevis）の卵にマイクロイ
ンジエクシヨンすることにより（Gurdonら、
Nature、233、177〜182（1972））あるいは網状赤
血球または小麦胚無細胞翻訳システムを使用する
ことにより対応する蛋白に翻訳される。 IL−２活性は、先にGillisら（Gillisら、J.
Immunol.、120、2027〜2033（1978））によつて基
本的には述べられているミクロ検定法によつて確
認できる。この検定法では、Gillisらによつて確
立された方法に従つて作成した細胞障害性Ｔリン
パ球細胞株（以下、CTLLと略す。）のIL−２に
依存細胞のDNA合成上昇（IL−２ dependent
cellular proliferation）を指標としている。即
ち、４×10³個のCTLL細胞を２％のFCSを含む
RPMI−1640培地100μに懸濁し、100μの連続
希釈した翻訳産物と共に96穴の平底マイクロプレ
ートに接種する。37℃、５％CO₂下で20時間培養
した後、細胞を0.5μCi／ウエルの ³H−TdRで４
時間ラベルし、自動細胞ハーベスターを用いて帯
状ガラス繊維上に細胞を回収し、細胞が取り込ん
が放射能を液体シンチレーシヨン法で測定する。
この検定により、IL−２存在下に培養された
CTLL細胞が投与量に依存して ³H−TdRを取込
むことが判明し、このことから検体中に含まれる
IL−２量を明確に計算することができる。 IL−２はＴリンパ球の増殖を促す活性を有す
るので、IL−２活性をＴリンパ球の増殖を指標
として測定することができる。即ち、５個の
CTLL細胞を２％のFCSを含むDMEM100μに
懸濁し、100μの連続希釈した翻訳産物と共に
96穴の平底マイクロプレートに接種する。72〜96
時間、37℃、５％CO₂下で培養した後、活性化し
増殖した細胞の数を顕微鏡下で計測する。対照群
として100U／ml、10U／mlのIL−２を用い、こ
の対照群の増殖した生細胞数と比較して検体の
IL−２活性を求める。 このようにして最も高活性の画分から得られた
IL−2mRNAはds−cDNAを合成するための鋳型
として用い、ds−cDNAはベクターDNAと結合
させる。cDNAの合成は従来の方法によつて行な
う。 まず、mRNAを鋳型とし、オリゴdTをプライ
マーとしてdATP、dGTP、dCTP、dTTPの存
在下で逆転写酵素によるmRNAと相補的なss−
cDNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNAを
分解除去した後、今度は単鎖cDNAを鋳型にして
逆転写酵素あるいはDNAポリメラーゼを用いて
ds−cDNAを合成する。 このようにして得られたds−cDNAと原核生物
で複製できるレプリコンを含むベクターDNAか
ら組み換えDNA体が作られる。しかる後、この
組み換えDNA体は宿主細胞に組み込まれる。 このds−cDNA及び原核生物で増殖し得るベク
ターDNAは、これらを結合させる前にエキソヌ
クレアーゼ処理、化学合成DNA断片の追加、ds
−cDNAやベクターDNAの末端に連結可能な端
末をつけるためにＧ、Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処
理によつて修飾される。これらの連結可能な
DNAは、例えばATP共存下にT4フアージの
DNAライゲースによつてつぎ合せることが出来
る。 このようにして調製された組換えDNA体によ
つてクローン化されたcDNAを増巾させるため又
はIL−２ポリペプチドを製造するために生細胞
を形質転換する。 IL−２生産のための適当な原核生物宿主とし
てはエシエリヒア・コリ、バルチス・ズブチリス
などが含まれる。宿主細胞中でのDNA増巾のた
めにエシエリヒア・コリを宿主とすることが出来
るが、その他の宿主細胞とすることも出来る。 適当なエシエリヒア・コリ用ベクターとしては
EK型プラスミドベクター（ストリンゼント型）
としてpSC101、pRK353、pRK646、pRK248、
pDF41など．、EKタイププラスミドベクター（リ
ラツクスドタイプ）：ColE1、pVH51、pAC105、
RSF2124、pCR1、pMB9、pBR313、pBR322、
pBR324、pBR325、pBR327、pBR328、
pKY2289、pKY2700、pKN80、pKC7、
pKB158、pMK2004、pACYC1、pACYC184、
dul等．、λgtタイプフアージベクター：λgt.λc、
λgt.λB、λWES、λC、λWES.λB、λZJvir.、
λB′、λALO、λB、λWES.Ts622、λDam等が含
まれている。一般に、pBR322はエシエリヒア・
コリ用ベクターとしてしばしば利用されてきた
が、この場合最も良いクローニング部位はPst1な
らびにEcoR1部位である。 組換えDNA体を用いた宿主細胞の形質転換に
は、通常よく用いられる次の方法がある。エシエ
リヒア・コリの如き原核生物が宿主の場合、この
DNAを取り込むことの出来るコンピテント細胞
は対数増殖期における細胞を回収後、良く知られ
ているCaCl₂法によつて形質転換出来る。形質転
換反応液中にMgCl₂又はRbClを共存させれば形
質転換効率は向上する。また、宿主細胞のプロト
プラスト調製後形質転換させることも可能であ
る。 IL−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの
方法の何れかを用いて形質転換後分離可能であ
る。 (1) プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物
細胞抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて11−
12S画分として部分精製したIL−2mRNAを調
製し、この部分精製mRNAを鋳型として ³²P
−放射性ss−cDNAを合成する。アルカリ処理
にて鋳型mRNAを除去後、単離されたcDNA
は、抗原刺激しない哺乳動物細胞から抽出さ
れ、部分精製した11−12SmRNAでハイブリダ
イズする。引続いてハイブリダイズしなかつた
cDNAとハイブリダイズしたcDNAはハイドロ
キシアパタイトカラムクロマトグラフイーで分
画する。ハイブリダイズしなかつたcDNAとハ
イブリダイズしたcDNAをそれぞれプローブ
Ａ、及びプローブＢと呼ぶ。何れの組換え体も
同一の方法によりそれぞれニトロセルロース濾
紙上で生育させる。そして、細胞のDNAをア
ルカリ処理にて濾紙上に固定する。プローブＡ
及びＢをそれぞれ、二つの異つた濾紙上で
DNAとハイブリダイズさせる。その後、オー
トラジオグラフイーを行つてプローブＡと陽性
に反応する組換え体（プラス）、プローブＢと
僅か又は全然反応しない組換え体（マイナス）
を選別する（谷口ら；Proc.Jap.Acad.、
V155B 464〜469（1979）． (2) 第２の方法は、例えば1000〜10000の組換体
クローンを２〜30ないし２〜300クローン宛の
クローングループに大別し、それぞれのクロー
ングループをそれぞれ常法によつて培養しプラ
スミドDNAsを調製する。次いで、これらプラ
スミドDNAsを例えば熱変性してss−cDNAを
ニトロセルロース濾紙上に固定し、活性化IL
−２−mRNAを含有する哺乳動物細胞から調
製されたmRNAと相補的にハイブリダイゼー
シヨンを行う。あるいはまた、IL−２
mRNAを含有するmRNA（混合物）を熱変性
したプラスミドDNA（混合物）とハイブリダイ
ズさせるとDNA−mRNAハイブリツドがニト
ロセルロース濾紙上に固定される。この濾紙を
１ｍＭのHEPES、あるいは10ｍＭの食塩水の
ごとき低塩類緩衝液で洗浄し、濾紙上に吸着さ
れたmRNAを0.5ｍＭ EDTA；0.1％SDS溶液
含有液で例えば95℃、１分間処理して抽出す
る。精製mRNAはこれをoligo dT−セルロー
スカラムクロマトグラフイーにて溶出回収す
る。次いで、mRNAをアフリカツメガエル卵
母細胞にマイクロインジエクシヨンして蛋白質
に翻訳してIL−２活性を確認する。あるいは
mRNAに依存性の網状赤血球系又は小麦胚の
in vitro無細胞合成系を用いてこのmRNAを蛋
白に翻訳させ、抗IL−２抗体を用いてIL−２
−活性を分析することが出来る。これらの方法
によつてIL−２活性が検出されたグループを
さらに少数の組換え体クローンを含有する群に
類別し最終的にはIL−２ DNAを有する単一
クローンが得られるまで繰返し実施する。 IL−２産生能のある組換え体よりIL−２ポリ
ペプチドをコードするcDNAを得るには、先ずト
ランスフオーマント中の組換えDNA体を分離し、
これを制限酵素エンドヌクレアーゼで切断する。
切断によつて得られるDNA分画より組込まれた
cDNA画分を分離する。 pIL−２−50Aを組換えたDNAよりIL−２ポリ
ペプチドをコードするPst1 DNAインサートの全
ヌクレオチド配列は、Maxam and Gilbert法
（Meth.Enzym.65、499〜560、（1980））；ならび
に二デオキシヌクレオチド鎖末端法（Smith、A.
J.M.Meth.Enzym.65、560〜580、（1980））にて
決定された。 cDNAインサートの制限酵素エンドヌクレアー
ゼによる切断図を第１図及び第２図ａに示す。第
２図ａに示すごとく、このcDNAはそれぞれ
BstN1、Xba 、BstN なる制限酵素エン
ドヌクレアーゼで切断される構造を有する。 本cDNAインサートのDNA配列は一つの大き
なオープンリーデイングフレームを保有する。真
核生物の読み取り開始配列となることの多い第一
のATG配列（Kozak、M.Cell.15、1109〜1123
（1978））は、5′−端から48−50ヌクレオチド位に
存在し、読み終り配列TGAが存在するヌクレオ
チド位507−509迄152の配列がこのATGにつなが
つている。mRNAの3′−poly(A)末端に相当する
ＡのつながりがcDNA末端に見出され、通常真核
生物mRNAのほとんどに見出される６個からな
るヌクレオチドAATAAA（771−776位）が先に
位置する。（Proudfoot、N.J.＆ Brownlee C.
G.、Nature 263、211−214、（1976）） cDNAによつてコードされるアミノ酸配列は第
２図ｂ（アミノ酸配列１）のごとく演えきでき、
しかもアミノ酸配列のポリペプチドは153個の
アミノ酸からなり、その分子量は17631.7ダルト
ンと計算される。今日迄知られている分泌蛋白の
殆んどに見られると報告されているように
（Blobel G.et al、Sym.Soc.Exp.Med.、33、９〜
36（1979））、上記演えきIL−２ポリペプチドのＮ
末端領域はやはり疎水性である。本領域は成熟
IL−２の分泌時に切断されるシグナルペプチド
の役割を果しているであろう。切断は20−21位の
SerとAla間で起るか21−22位間のAla−Pro間で
切断され、アミノ酸配列およびを有するポリ
ペプチドを生成する。何故ならば同様な切断位置
は今迄知られたその他の分泌蛋白にもしばしば見
出されているからである（Blobel、G.et al、
Symp.Soc.Exp.Med.、33、９〜36（1979））。従つ
て、成熟IL−２ポリペプチドは133ないし132個
のアミノ酸から成り、分子量は15420.5または
15349.4ダルトンと算出される。本分子量値はジ
ユルカツト細胞から得られたヒトIL−２蛋白の
分子量（15000ダルトン）として報告されたもの
を対比される（Gillis et al.、Immunological
Rev.、63、67〜209（1982））。また実施例３に示
すごとく塩基配列111〜113位にあるCCT配列か
ら始まるDNA画分、即ち、22位に位置するPro
から始まるポリペプチドに対するコード（第２ｂ
図中のアミノ酸配列）はIL−２活性を有する
ポリペプチドを表現していることが確認された。
塩基配列107〜110位にあるGCAから始まるDNA
画分、即ち第２ｂ図のアミノ酸配列に示すごと
く、21位に位置するAlaから始まるポリペプチド
をコードするDNA画分は、実施例６に示すごと
くIL−２活性を有するポリペプチドを表現して
いることが確認された。 有核生物の遺伝子はヒトインターフエロン遺伝
子でも知られている様に多形現象を示すことが知
られている（谷口ら、Gene 10、11〜15（1980）、
大野、谷口．、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、
5305〜5309（1981）；Gray et al、Nature 295、
507〜508（1981））。この多形現象によつて、蛋白
生産物のアミノ酸のあるものが置換される場合も
あれば、塩基配列の変化はあつても全く変らない
場合もある。ヒトIL−２・cDNAの場合、pIL−
２−50A cDNAの503位のＡ残基がＧ残基で置き
換えられた他のcDNAクローン（pIL−２−503）
も検出できる。pIL−２−50A cDNAとは塩基配
列が異なるその他のcDNAクローンの存在も期待
できる。 上記説明から明らかなごとく、本発明のポリペ
プチドを得るための遺伝子（以下、本発明に係る
遺伝子と略称する。）は、第２ａ図に示された塩
基配列を有するDNA、48−50位のATG配列から
始まり、504〜506位にある少くともACT配列に
至る連続塩基配列を有するDNAs、108−110位の
GCA配列から始まり、GCA配列から少くとも
ACT配列に至る連続塩基配列を有するDNA、ま
た111−113位のCCT配列から少くともACT配列
に至る連続塩基配列を有するDNAを包含する。
本発明に係る遺伝子はまた、504〜506位のACT
配列に終り、１位のＡに始まるDNA、48−50位
のATGで始まるDNA、108−110位のGCA配列
で始まるDNA又は111−113位のCCT配列で始ま
るDNAを包含する。更に本発明に係る遺伝子は、
507〜509位のTGA配列に終り、１位のＡに始ま
るDNA、48−50位のATG配列で始まるDNA、
108〜110位のGCA配列で始まるDNA又は111〜
113位のCCT配列で始まるDNAを包含する。更
に本発明に係る遺伝子は、801位のＣで終り、１
位のＡで始まるDNA、48−50位のATGで始まる
DNA、108−110位のGCAで始まるDNAまたは
111−113位のCCT配列で始まるDNAを包含す
る。本発明に係る遺伝子はまたpoly(A)で終り、48
−50位のATG配列から始まるDNA、108−110位
のGCA配列で始まるDNAまたは111−113位の
CCT配列で始まるDNAを含む。また、本発明に
係る遺伝子は、アミノ酸配列、、に相当す
る塩基配列を有する遺伝子を含む。アミノ酸配列
の中で１個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポ
リペプチド、あるいはアミノ酸配列の中の１個
ないしそれ以上のアミノ酸が１個ないしそれ以上
のアミノ酸で置換されたポリペプチドはIL−２
活性を有することもあり、従つてこの様なポリペ
プチドをコードする遺伝子は本発明に係る遺伝子
として使える。同様にアミノ酸配列、または
に対して１個ないしそれ以上のアミノ酸を表現
し得る１個ないしそれ以上の塩基を余分に結合し
た遺伝子であつても追加されたアミノ酸が、ポリ
ペプチドのIL−２活性発現に邪魔しない限り本
発明の中に包含される。IL−２としてのポリペ
プチド機能を阻害する追加アミノ酸配列を有する
修飾領域であつても新たに追加された領域が容易
に除去出来るものならば本発明に係る遺伝子とし
て利用出来る。同じことはアミノ酸配列、お
よびに対応する遺伝子のアミノ酸配列、お
よびのＣ−末端にアミノ酸追加コードする
DNAが3′−末端に追加結合せしめたDNAの場合
にも言える。従つて、この様なポリペプチドをコ
ードする遺伝子の利用は、本発明に包含される。 生細胞中でIL−２産生をする組換えDNA体
は、次の各種方法で作られる。例えば、IL−
２・cDNAをコードする配列を発現ベクターのプ
ロモーター配列下流に挿入する。あるいはプロモ
ーター配列を持つcDNA片を発現ベクターの
cDNA挿入の前あるいは後にIL−２をコードす
る配列の上流に挿入することが出来る。 IL−２−cDNAを発現し、IL−２−ポリペプ
チドを産生する原核生物の造成法を詳述すれば以
下の通りである。 (1) エシエリヒア・コリによるIL−２−cDNA
の発現 エシエリヒア・コリ中でIL−２−cDNAを
発現させるには、先ずcDNAを各種細菌プロモ
ーターと結合せしめた後、プロモーター下流に
cDNAを含有するハイブリドプラスミドを作
る。このプラスミドを、例えばエシエリヒア・
コリHB101に感染させ、ヒトIL−２活性を有
する蛋白を生合成する細菌がクローンされる。
本来細菌のプロモーターならば如何なるもので
もcDNAに適当に接続されていればIL−２−
cDNAを発現する。この様なcDNAの発現例は
以下のとおりである。 IL−２をコードするクローン化cDNAは第
２図に示される様な153個のアミノ酸からなる
ポリペプチドをコードする。本ポリペプチドの
20個のアミノ酸に相当するＮ−末端領域は極め
て疎水性であり、殆んどの分泌蛋白の特徴でも
ある。この様な疎水性配列はシグナル配列と称
し分泌過程で切断される。故に、成熟IL−２
ポリペプチドは、153個のアミノ酸より少ない
筈である。このことから、成熟IL−２ポリペ
プチドをコードするcDNA部分を発現させるこ
とが望ましく、IL−２シグナル配列相当部分
を発現させるのは望ましくはない。 (i) プラスミドベクターpTrS−３の構築 pTrS−３は、エシエリヒア・コリTrpプ
ロモーターを含み、pTrS−３のリーダーペ
プチドのためのリボソーム結合部位（SD配
列）、は既に報告されている（G.Miozzari
and Yanofsky J.Bacteriol.133、1457〜
1466（1978））。SD配列の下流13塩基対にある
ATGコードンの存在も報告されている
（Nishi et al、生化学54、No.8.676（1982））。
このプラスミドベクターはまた、ATG開始
配列（第３図）の下流に一つのSph 部位
を含んでいる。 IL−２・cDNAを発現させるため、先ず
プラスミドをSph で消化しエシエリヒ
ア・コリDNAポリメラーゼ（クレノウ
（Klenow）フラグメント）または、バクテ
リオフアージT4 DNAポリメラーゼで処
理し3′−位突き出し末端を除去する（第４図
ａ）。プラスミドpIL−２−50AをPst お
よびHgiA で２回消化し、より大きい
cDNA画分を単離する。次いでDNAをエシ
エリヒア・コリDNAポリメラーゼ（クレ
ノウフラグメント）又はバクテリオフアージ
T4 DNAポリメラーゼで処理して3′−突き
出し末端を切りはなす。この処理をした
cDNAは132個のアミノ酸のIL−２ポリペプ
チドをコードする（第４ａ図）。このcDNA
を上述のごとく前処理したpTrS−３プラス
ミドDNAに結合せしめ、ATG開始コードン
をIL−2cDNAのCCT（Pro）配列につなぎ合
せる。こうしてプラスミドpT IL−２−22が
得られる。Trpプロモーター配列とpT IL−
２−22のIL−２ cDNA配列の結合は第４
ａ図に示す。 プラスミドpT IL−２−22はエシエリヒ
ア・コリによりプロリンから始まる132個の
アミノ酸からなるIL−２ポリペプチド合成
を指令する。 (ii) 成熟IL−２はプロリンの代りにＮ−末端
アミノ酸としてアラニン（21位）を含むこと
もあり、133個のアミノ酸から成るIL−２ポ
リペプチド合成を指示するプラスミドを以下
の如く作ることができる。 プラスミドpTrS−３はSD配列とATG配
列との間に１つのCla 切断部位がある
（第３図）。本プラスミドはCla とSal
で切断される。プラスミドpIL−２−50A
をPst で部分分解し、エシエリヒア・コ
リDNAポリメラーゼで処理し、最も長い
DNAを単離する。次いでDNAを制限酵素
Xho 切断部位を含む合成DNAリンカー
と結合させ、IL−２をコードする配列の3′−
側下流にDNAリンカーを導入したプラスミ
ドpIL−２−50A（Xho）を含むクローンを単
離する。プラスミドpIL−２−50A（Xho）を
先ずHgiA で切断し、エシエリヒア・コ
リ クレノウフラグメントまたはT4 DNA
ポリメラーゼで処理し、Xho で消化すれ
ばcDNA画分が単離できる。このcDNAフラ
グメントをCla およびSal で前処理
したpTrS−３ DNAに結合させ第４ｂ図の
如く合成DNAにつなげる。かくしてAlaか
らスタートする133個のアミノ酸から成るIL
−２ポリペプチドをエシエリヒア・コリ中で
合成させるプラスミドpTIL−２−21が得ら
れる。（第４ｂ図）。同様なことはXho リ
ンカーを使用しなくとも作られる。 (iii) 異つたＮ−末端アミノ酸を有する異つた大
きさのIL−２ポリペプチドはpTrS−３発現
プラスミドベクターを用いても作られる。以
下に示すごとく、pIL−２−50Aにクローン
されたIL−２ cDNAはヌクレオチド結合
部位81−85に唯一つだけDde 部分を有す
る。プラスミドpIL−２−50A（Xho）を、
Dbe で切断し、cDNAのより大きい区分
を含有するDNA画分を単離する。本画分は
pBR322より3000塩基対を有するDNAを含
んでいる（第４ｃ図）。DNA画分をエクソヌ
クレアーゼBal 31で処理し、次いでXho
で切断する。ここで得られたDNAをSph
で切断したpTrS−３と結合せしめ、
KlenowフラグメントまたはT4 DNAポリメ
ラーゼで処理し次いでSal で消化する
（第４ｃ図）。つなぎ合せたDNAをエシエリ
ヒア・コリHB 101に感染させ、ヒトIL−２
を発現するクローンを検索する。これらのク
ローンは色色な大きさのヒトIL−２を発現
する筈である。何故ならばヒトIL−２のＮ
−末端領域に相当するDNAは種々切断除去
されるからである。かくしてIL−２
cDNAを含有するpTIL−２−14と15が得ら
れる。 (iv) IL−２ cDNAはまたpKT 218（Talmage
より提供を受けた；Proc.Natl.Acad.Sci.
USA、77、P.3369〜3373（1980））を用いて
も発現可能である。プラスミドpKT 218は
Pst で切断し、pIL−２−50AをHgiA
とPst で切断（第５図）して得たIL−
２ cDNA挿入部分とつなぎ合わせる。出来
上つたプラスミドpKIL−２−21は第５図に
示したように、蛋白合成開始の始発位に配列
を有している。したがつて、このプラスミド
pKIL−２−21はIL−２の133個のアミノ酸と
β−ラクタマーゼのアミノ酸からなる両者が
融合したポリペプチドからなり、これをエシ
エリヒア・コリ中で合成することが出来る筈
である（最初のメチオニンはエシエリヒア・
コリでは切断除去される）。 (v) ｐ−BR・322にtufBに対するプロモータ
ー配列を挿入したプラスミドpTuBlp−５の
発現は既に行なわれている（谷口ら、生化学
53 966（1981））。このプラスミドは一つの
Cla 切断部位を含み、第６図に示すごと
く本切断部位はSD配列の２塩基対だけ下流
に位置する。pTrS−３もまたSD配列と
ATG始発配列の間にある一つのCal 切断
部位を含み、同時にこのCla 部位はpTrS
−３とIL−２ cDNAを用いて発現用プラ
スミドを作る過程で壊されないので細菌Trp
プロモーターをtufBプロモーター置き換え
ることは極めて簡単である。従つてヒトIL
−２ cDNAはtufBプロモーターの制御下
で発現される。例えばpTIL−２−22をCal
とPvu で切断し、IL−２ cDNAを含
むDNA画分を分離する。 次いでこの画分をpTuBlP−５でつなぎ合
わせ、Cla とPvu で予め切断後、第
６図に図示される様にプラスミドpTuIL−２
−22が造成される。IL−２活性はプラスミ
ドpTuIL−２−22を含むエシエリヒア・コリ
HB101の抽出液に検出できる。 (vi) 例えばpTIL−２−21を使つても、また基
本的にはpTrS−３を用いて達成したすべて
の発現用プラスミドを用いることによつても
同様に造成できる。また例えばpTuIL−２−
22をCla で切断し、Bal 31またはSIまた
はDNAポリメラーゼ（エシエリヒア・コ
リ）にてDNAの塩基対２−３個を除去また
は補充し再度プラスミドをつなげることによ
つてSDおよびATG配列の距離を至適の長さ
にすることも可能である。 組換えDNA体を挿入したエシエリヒア・
コリまたはバルチス・ズブチリスの如き形質
転換された原核生物細胞を培養して組換え
DNA体を増巾し又はIL−２ポリペプチドを
生産する。この培養は通常の方法で行なわれ
る。 細胞内または細胞外に生産されたIL−２
は硫安沈澱、塩類除去のための透析（常圧ま
たは減圧下）、ゲル濾過、クロマトグラフイ
ー、等電点平板上濃縮、ゲル電気泳動、高速
液体クロマトグラフイー（以下HPLCと略
記）、（イオン交換、ゲル濾過並びに逆相クロ
マトグラフイー）、及び色素結合担体、IL−
２に対するモノクロナール抗体を結合した活
性化セフアロース4B又はレクチン結合セフ
アロース4B等によるアフイニテイクロマト
グラフイー等、公知の方法によつて回収する
ことができる。IL−２の単離精製法は
Watsonら（J.Exp.Med.、150、849−861
（1979）、Gilliss et al、J.Immunol.、124、
1954−1962（1980）、Mochizuki et al、J.
Immunol.Methods 39、185−201（1980）、
Welte、Ｋ et al、J.Kxp.Med.、156、454
−464（1982））によつて報告されている。 かくして得られたポリペプチドはマイトジ
エン刺激によつて哺乳動物細胞から作られる
IL−２について知られているものと同一の
生化学的並びに生物学的挙動を示しIL−２
活性を有する。分子量は約15000ダルトンで
ありIL−２活性は、Igsorb（Enzyme
Center）の様な免疫吸着剤の有無にかかわ
らず完全に中和され、またはモノクロナール
抗IL−２抗体で沈澱した。免疫電気泳動に
おいて、IL−２ポリペプチドは、対応する
抗IL−２抗体に対して唯１個の沈降線を示
す。IL−２活性は２−メルカプトエタノー
ルで還元後も安定であり、DNAse及び
RNAse処理しても、又56℃、30分熱処理し
ても安定である。活性はPH２〜９で安定であ
る。この様にして生産されたIL−２はモノ
クローナルな機能を有するＴ細胞（細胞障害
性Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の
分裂を強め、更に抗原非存在下、メモリー状
態から抗癌特異的細胞障害Ｔリンパ球への分
化を惹き起こす。また、YAC−１細胞やRL
１細胞に対するナチユラルキラー細胞の活性
化の増強に役立つ。 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 実施例 １ (1) ヒトＴ細胞系白血病細胞株であるジユルカツ
ト細胞（日本、西独および米国では自由に入手
可能である）を10％FCSを含むRPMI 1640培
地にけん濁し、Ｘ線照射装置Exs 150／300−
４（東芝・日本）により50秒間、室温で10000レ
ントゲンに達するまで照射した。その後照射さ
れた細胞は上述の培地中、初期細胞密度１×
10⁵個／mlで５％炭酸ガス、37℃のインキユベ
ーター中で５日間培養した。 この変異細胞（0.2個／穴）を96穴の平底の
マイクロプレートの10穴にまき、５％炭酸ガ
ス、37℃のインキユベーター中で21日間培養し
た。生育してくる穴から得られるクローンはク
ローン量を増加させるため新たな培地へ移し、
その増加したクローンはConA 50μｇ／ml存在
下で初期細胞密度１×10⁶個／mlで24時間培養
した。そしてIL−２活性は前述の方法によつ
て測定した。 この結果、ジユルカツト−111（ATCC CRL
8129）（以後“Ｊ−111”と称する）と命名され
たヒトＴ細胞株が親株のジユルカツトからクロ
ーン化、選択され、この細胞のIL−２産生能
は親株の40倍に増加していた。 このクローン化したＪ−111細胞株は通常条
件下で増殖し、その増殖速度は通常のジユルカ
ツト細胞とほとんど同じであつた。 (2) Ｊ−111細胞（１×10⁵個／ml）を無血清合成
培地RIT Ｃ 55−９（Sato、T.et al.、Exp.
Cell Res.、138、127−134、（1982））1000mlに
接種し、ローラー培養ボトル（フアルコン
3027）内で37℃、４日間培養し、増殖した細胞
を遠心分離により取得した。この細胞を再び４
×10⁶個／mlとなるよう上述のConA 25μｇ／
ml含有培地に接種した。ローラー培養ボトル
（フアルコン）４バツチの各々に細胞を接種し
た培養液100mlを入れ、６時間回転培養した。 (3) このようにConA 25μｇ／mlで６時間刺激し
たジユルカツト細胞（1.2×10⁶）は生理食塩−
リン酸緩衝液（以後PBSと略す）8000mlに懸
濁した。この細胞は遠心操作により２回洗浄
し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボヌクレオシ
ド−バナデイル複合体（10ｍＭ）を含有する
RSB溶液（10mlトリス−塩酸緩衝液、PH7.5、
10ｍＭ NaCl、1.5ｍＭ MgCl₂）800mlに再
懸濁した。その後、界面活性剤NP−40を最終
濃度0.05％となるように加え、ゆつくり混合
し、細胞核を3000rpm、５分、４℃下で遠心し
分離した。SDS（0.5％）及びEDTA（５ｍＭ）
を上清液へ加え、細胞質RNAを上清液と同量
のフエノールを加え抽出した。フエノールによ
る抽出を３回繰返した後、RNAは２倍量のエ
タノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心によ
り集め、PH7.5の10ｍＭトリス−塩酸に溶解し
た。得られたRNA量は196mgであつた。 mRNAの分画はオリゴ（dT）−セルロース
（P.L.Biochemicals、Type ７）のアフイニテ
イ−クロマトグラフイーを使用し行つた。吸着
液は20ｍＭトリス−塩酸、0.5M NaCl、１ｍ
Ｍ EDTA及び0.5％SDSを含むPH7.5の溶液で
あり、溶出はカラムを緩衝液（20ｍＭトリス−
塩酸、PH7.5、0.5M NaCl、１ｍＭ EDTA）
で洗浄後、水と10ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）
で交互に行つた。溶出により得られたmRNA
は3.6mgであつた。次にこの得られたmRNA2.4
mgを蔗糖密度勾配遠心法（50ｍＭトリス−塩
酸、１ｍＭ EDTA、0.2M NaClを含むPH7.5
の溶液中で蔗糖密度勾配５−25％、26000rpm
で４℃下24時間）により分画した。mRNAの
11から12Sが分画No.12、13、14へ分画され、
各々59μｇ、46μｇ、60μｇであつた。 (4) No.13の分画に得られたmRNAをアフリカツ
メガエル（Xenopus Iaevis）の卵母細胞へ注
入した（50nｇ mRNA／卵母細胞）。この卵
母細胞の培養液をIL−２活性測定した。表１
に示す如く、 ³H−チミジン（ ³H−TdR）の
取込みの上昇及び活性化Ｔリンパ球数の増加が
確認され、明らかにこの分画中のmRNAはヒ
トIL−２ mRNAを含んでいる事が立証され
た。 【表】 成物
×32 10165
【表】 成物
×16 55
＊ 単位は標準IL−２（10単位／ml）の ³H−
TdR取込み量と比較する事により算出した。 (5) その後IL−２ mRNAを含む11〜12S
mRNAのNo.13分画からin vitroでcDNAを合成
した。 組換え体DNAはプラスミドベクターpBR
322と構成した。組換え体DNAをエシエリヒ
ア・コリに形質転換し、IL−２ cDNAクロ
ーンを獲得したクローンを以下に示す如き方法
により選択した。 (5‐1) 50ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、30ｍ
Ｍ NaCl、６ｍＭ MgCl₂、５ｍＭジチオ
スレイトール（以後DTTと略す）、0.5ｍＭ
の各dATP、dGTP、dCTP、dTTP（dCTP
は ³²P放射標識したものを含む）、0.7μｇオ
リゴ（dT）₁₀、10μｇ mRNA及び15単位
AMV逆転写酵素（J.W.Bread）を混合し、
41℃下で90分保つた。反応終了後、DNAは
フエノール処理後エタノール沈澱物として回
収し、このDNAを20ｍＭトリスおよび１ｍ
Ｍ EDTAを含むPH7.5の溶液に溶解した。 ss−cDNA2.5μｇが合成された。本反応液
よりmRNAを除くために反応液にNaOH溶
液を加えて0.33N NaOH溶液とし、室温に
て15時間置き、次いでPH7.5の1Mトリス−塩
酸緩衝液を同量加えて中和したセフアデツク
スＧ−50カラムをカラムを通した。回収され
たcDNAは1.8μｇであつた。 (5‐2) 50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）、10ｍＭ
MgCl₂、10ｍＭ DTT、0.75ｍＭの各
dATP、dGTP、dCTP、dTTP（dCTPは
³Hで標識したものを含む）、1.8μｇ ss−
cDNAおよび８単位ポリメレース（BRL、
米国）を混ぜ15時間、15℃で反応を行つた。
反応終了後DNAをフエノール及びクロロホ
ルム処理後エタノール沈澱物として回収し
た。1.10μｇのds−cDNAが生成した。50ｍ
Ｍ酢酸ソーダ（PH4.5）、0.2M NaCl、１ｍＭ
ZnCl₂および1.10μｇ二本鎖cDNAの混合物
を37℃で30分間インキユベートした後0.25単
位のヌクレアーゼS₁（三井、日本）を加え、
さらに15分間インキユベートした。反応終了
後、フエノール処理を２回行つた反応生成物
をセフアデツクスＧ−50へ供し、二本鎖
cDNA0.55μｇを得た。 (5‐3) 0.14Mカコジル酸カリウム、30ｍＭトリス
塩基、0.1ｍＭ DTT、１ｍＭ CoCl₂、
0.64ｍＭ ³²P−dCTP（比活性2.7×10⁶cpm／
ｎ mol）、0.55μｇ ds−cDNAおよび５単
位のターミナルトランスフエラーゼ（BRL）
を混合し、37℃で７分間インキユベートした
後フエノール処理し、次いでセフアデツクス
Ｇ−50カラムに供し、エタノール沈澱物とし
て0.50μｇ DNAを得た。回収したこの
DNAは約50個のdCMP残基が両3′末端に付
加されている事が判明した。 pBR 322 DNA 10μｇを制限酵素Pst
で切断したのちdCTPのかわりにdGTPを用
いたこと以外は前述のds−cDNAにdGTP鎖
を付加したときに用いた方法と全く同じ条件
により、切断したDNAの両3′末端にdGMP
鎖を付加した。 (5‐4) 50ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）0.1M NaCl、
５ｍＭ DETA、0.05μｇ dGMP残基付加
pBR 322および0.01μｇ dCMP残基付加
cDNAをまず65℃で２時間、次いで46℃で
120分間、さらに37℃で60分間、そして室温
で60分間インキユベートした。 エシエリヒア・コリχ1776（Curtiss 、
R.et al.、in Molecular Cloning of
Reocmbinant DNA、（W.A.Scott ＆ R.
Werner ed.）Academic Press、（1977））を
50mlのＬ培地（100μｇ／mlのジアミノピメ
リン酸、50μｇ／mlのチミジン、１％トリプ
トフアン、0.5％酵母エキス、0.5％NaClおよ
び0.1％グルコースを含む）に接種し培養液
の吸光度が562nｍで0.3付近になるまで37℃
で振とう培養した。培養終了後、培養液を30
分間０℃に保持し、菌体を遠心分離により集
め、５ｍＭトリス−塩酸（PH7.6）、0.1M
NaCl、５ｍＭ MgCl₂および10ｍＭ RbCl
を含む溶液25mlで２回洗浄した。 得られた菌体を５ｍＭトリス−塩酸（PH
7.6）、0.25M KCl、５ｍＭ MgCl₂、0.1M
CaCl₂および10ｍＭ RbClを含む溶液20mlに
懸濁し、０℃で25分間静置後、菌体を集め上
記と同じ溶液１mlに菌体を再懸濁し、得られ
た菌体懸濁液の0.2mlに上記組換え体DNAを
入れ、０℃で60分間静置した。その後Ｌ培地
0.7mlを加えて37℃で30分間振とう培養した。
こうして得られた培養液（0.1ml）を100μ
ｇ／mlジアミノピメリン酸、50μｇ／mlチミ
ジンおよび15μｇ／mlテトラサイクリンを含
むＬ培地１の1.5％寒天培地上に一面に塗抹
し、37℃で２日間インキユベートした。 (5‐5) 出現した432のコロニーを18のグループに
分け、（その各グループは24の異なるバクテ
リアクローンを含む）100μｇ／mlのジアミ
ノピメリン酸、50μｇ／mlのチミジンおよび
10μｇのテトラサイクリンを含むＬ培地200
mlに接種し、37℃で５〜７時間振とう培養し
た。次に最終濃度170μｇ／mlとなるように
加えられたクロラムフエニコールを含む新た
なＬ培地200mlを加え、さらに一晩培養した。 このようにして増強されたプラスミド
DNAを常法に従い精製した。 IL−２ cDNAを有するクローンは
mRNAハイブリダイゼーシヨン−トランス
レーシヨンアツセイ（以後Ｈ−Ｔアツセイと
略称する）により選択した。 ここで用いられたＨ−Ｔアツセイは以下に
示す如く行つた。 純化したDNA（25μｇ）を制限酵素Hind
により開裂しフエノールで３回、フエノー
ル−クロロホルムおよびクロロホルムで各々
処理し、エタノールで沈澱させ80％エタノー
ルで洗浄し、80％ホルムアミド40mlに溶解し
た。 反応液を変性させるため90℃で５分間加熱
後10×SSC（1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ソ
ーダ）で1.3mlに希釈した。その後、本DNA
をニトロセルロース濾紙上に固定し、これを
80℃で３時間乾燥させ、50％ホルムアミド、
20ｍＭ Pipes（PH6.5）、0.75M NaCl、５ｍ
Ｍ EDTA、0.2％SDS及びＪ−111細胞由来
のpoly(A)mRNA250μｇを含む溶液中で37℃、
18時間インキユベートし、濾紙上に固定され
たDNAとIL−２ mRNAをハイブリダイズ
した。 次にその濾紙を65℃で３回PH6.5の10ｍＭ
Pipes、0.15M NaCl溶液、１ｍＭ
Pipes、10ｍＭ NaCl溶液で洗浄し、0.5ｍ
Ｍ EDTA、0.1％SDS溶液で95℃、１分間
処理し濾紙からハイブリダイズしたmRNA
を回収した。 このようにして抽出したmRNAを常法に
従つてオリゴdT−セルロースカラム上で精
製し、アフリカツメガエル卵母細胞へ注入
し、翻訳された蛋白のIL−２活性を測定し
た。 各々24クローンからなる18グループのうち
の１グループが前述の ³H−TdR取込みによ
るアツセイで48単位／mlのIL−２活性陽性
を示した。一方他のグループは明らかに陰性
であつた。 次に、陽性のグループに属する24の各単一
コロニーを既述と同じ組成のＬ培地200mlへ
接種し、37℃で５〜７時間好気的に培養し、
同様にクロラムフエニコール含有のＬ培地を
さらに添加した。 一晩培養して、プラスミドDNAを増強後、
プラスミドDNAを同様に標準法に従つて精
製した。Hind で各プラスミドDNA約5μ
ｇを開裂後、各プラスミドを同様にニトロセ
ルロース濾紙へ固定した。その濾紙をIL−
２ mRNAとハイブリダイズし、ハイブリ
ダイズしたmRNAをアフリカツメガエル卵
母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−２
活性を測定するため回収した。 表２に示す如く、p3−16と表示した単一
コロニーから精製されたプラスミドDNAの
みが陽性のIL−２活性を示した。それ故、
本クローンがIL−２ cDNAを有するクロ
ーン（E.coli χ 1766／p3−16 AJ11995
（FERM−BP−225））と同定された。この
ようにプラスミドDNA、p3−16はIL−２
mRNAと特異的ハイブリツドを形成する能
力のあるDNA（IL−２遺伝子）を確かに有
している事が確認された。 【表】 物
×32 20961
【表】 プラスミドp3−16のcDNAインサートは
制限酵素Xba により１部位で、又Bst
NIにより２部位（Xba 開裂部位の上流
及び下流）で切断されるという特徴と示し
た。しかしながら、プラスミドp3−16は約
650塩基対より構成されるcDNAインサート
を含んでおり、これは明らかに11〜12Sの大
きさのIL−２ mRNAの一部分に相当する
ものである。それ故、他のcDNAライブラリ
ーを、鋳型としてIL−２ mRNAを用い、
Land等の方法（Land et al.、Nucleic
Acids Res.、vol ９、p2551、（1981））に
従つて作製した。一本鎖cDNA（1.6μｇ）を、
dCMP残基を付加したIL−２ mRNA 4μｇ
を用いて合成し、そしてds−cDNAを、
DNAポリメラーゼ（Klenow断片）によ
りプライマーとしてオリゴ（dG）12＝18を
用いる事により合成した。680塩基対DNAサ
イズマーカー（size marker）より長い
cDNA（0.6μｇ）は蔗糖密度勾配遠心法によ
つて得られ、標準的なＧ−Ｃテイリング法に
よりpBR 322のPst 部位へ挿入出来た。 組換えDNA体によるエシエリヒア・コリ
χ 1766の形質転換後、その場所でプロー
ブとしてニツク翻訳された（nick−
translated）p3−16 cDNAインサートを用
いたGrunstein−Hognessのハイブリダイゼ
ーシヨン法により約2000コロニーを選別し、
およそ850塩基対を含むプラスミドpIL ２−
50Aを含有するコロニー及び形質転換された
クローン（エシエリヒア・コリ χ 1776／
pIL2−50A、AJ11996（FERM−BP−26））
を同定した。pIL2−50AのcDNAインサート
の制限酵素切断図を第１図に示した。 形質転換されたエシエリヒア・コリ χ
1776／pIL2−50AからのIL−２ペプタイドを
コードしている遺伝子を単離するため、プラ
スミドDNAを通常法に従い、菌体からDNA
を単離後制限酵素Pst により切断した。
この処理により生成する２つのDNA断片の
うちより小さな断片はIL−２ペプタイドを
コードしているDNA遺伝子であつた。pIL2
−50AからのPst インサートの完全なヌ
クレオチド配列はMaxam and Gilbertの方
法（Maxam、 A.W.et al.、Enzym.65、、
499−560、1980）により決定した。全構造を
第２図ａに示す。 実施例 ２ 実施例１に記載された方法に従つてジユルカツ
ト細胞からクローン化された構成的IL−２産生
細胞株Ｊ−Ａ 1886（ATCC CRL 8130）は同様
にローラー培養ボトルで生育した。生育した細胞
は初期細胞密度１×10⁶個／mlで新鮮な合成培地
RITC−55−９に再懸濁し、培養開始８時間後
に、実施例１で詳細に示したステツプに従つて３
×10⁹個の細胞から11〜12S分画としてのIL−2_n
RNA抽出のために使用された。 ds−cDNAは実施例１と同様に合成され、600
塩基対より長いcDNA（2.4μｇ）が蔗糖密度勾配
遠心法による分画により得られた。次にこの
cDNAをターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼを用い、dCMP残基で伸長し、そ
の50ngがdGMPで伸長したPst 切断pBR 322
250ngとアニールされた。 生成したハイブリツドプラスミドはエシエリヒ
ア・コリ χ 1776に形質転換され、約4000クロ
ーンのトランスホーマントが得られた。 Grunstein−Hognessの方法に従い、プローブ
として用いたプラスミド３−16 cDNAと相補助
な３個のクローンが選択された。すなわち、この
ようにして選択された形質転換されたクローンは
ヒトIL−２遺伝子を有するクローンである。 実施例 ３ エシエリヒア・コリ細胞でヒトIL−２の合成
を指令するプラスミドを以下の如き方法で構築し
た。 プラスミドpT IL2−22は第４ａ図で図解され
ている如く、一連の改変の方法によりpTrS−３
（Nishi T.、Taniguchi T.et al.、SEIKAGAKU
53、967、（1981）、同54、676（1982））及びIL
−２ cDNAを含むpIL2−50Aから構築した。プ
ラスミドpTrS−３はTrpプロモーターとpBR
322のEcoR 部位とCla 部位の間にShine
Dalgarno（以後SDと略号する）の領域の挿入を
含む。 本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一
のSph 部位と同様にSD配列の下流13bpに
ATGイニシエーシヨンコードンを含んでいる。 言及している蛋白に対応するDNA配列がATG
コードンの丁度下流の部位に挿入されるとそのベ
クターこの蛋白を生産するには非常に効果的であ
る。このATGコードンはpTr−３のSph 消化
に引続きT4 DNAポリメラーゼによる処理によ
つて生成される。それ故プラスミドpTrS−３
（30μｇ）は制限酵素Sph で、常法により切断
され、引続きフエノール、クロロホルム処理、エ
タノール沈澱法により回収され両末端がT4
DNAポリメラーゼ処理によりフラツシユにされ
た。 次に、同様の方法によりフエノール、クロロホ
ルム処理及びエタノール沈澱法によりDNA
（21.4μｇ）を回収した。他方IL−２ cDNAを含
むpIL2−50A 380μｇはPst により切断され、
IL−２ cDNAインサートはアガロースゲル電
気泳動により単離された。cDNAインサート
（11μｇ）はHgiA により切断され、T4 DNA
ポリメラーゼによつて処理され、大きい方の部分
のDNA 10μｇがアガロースゲル電気泳動により
単離された。本法に従つて132個のアミノ酸をコ
ードするcDNA（7.2μｇ）が得られ、このDNA断
片はブラントエンドを有していた（第４ａ図）。 次に、このようにして得られたcDNA断片を
ATG配列の丁度下流で、前もつてSpH によ
り消化されたT4 DNAポリメラーゼにより処理
されたpTrS−３ベクターへ連結した。このよう
に連結したプラスミドはそれから、常法に従いエ
シエリヒア・コリHB 101へ形質転換された。こ
の連結は次のようにして行つた。IL−２
cDNA（0.4μｇ）の前述の大きい方の断片および
pTrS−３ベクターDNA0.2μｇを6.6ｍＭ
MgCl₂、１ｍＭ ATPおよび10ｍＭ DTTを含
むPH7.5の66ｍＭトリス−塩酸中でT4 DNAリガ
ーゼ0.8単位と共に混合し、混合物を４℃、一晩
反応させた。アンピシリンを含むＬ培地寒天プレ
ート上に出現するトランスホーマントの中で、
132個のアミノ酸をコードしているIL−２
cDNA部分を含むプラスミドを持つコロニーをそ
の場でコロニーハイブリダイゼーシヨンアツセイ
法により選択した。こうして選択したコロニーを
再び培養（10ml）し、リゾチーム処理および凍
結、融解による処理によりプラスミドDNAを調
製した。このプラスミドDNAをPst とXba
で切断し、その結果の生成物をアガロースゲル
電気泳動により分析し、cDNAがpTrS−３の
ATG配列の後に正しい方向で凍結しているpTIL
−２−22を同定した。 pTIL−２−22を含むエシエリヒア・コリHB
101を微生物の増殖のために知られている通常法
の下に培養した。細胞は25μｇ／mlストレプトマ
イシンおよび25μｇ／mlのアンピシリンを含むχ
培地（2.5％バクトトリプトン、１％酵母エキス、
0.1％グルコース、20ｍＭ MgSO₄、50ｍＭトリ
ス−塩酸、PH7.5）10ml中で37℃で一晩生育させ
た。ついで培養懸濁液１mlを同じχ培地（100ml）
へ接種し、37℃で培養した。650ｍμのO.D.がお
よそ1.5−2.0に達した時点で３−インドールアク
リル酸（IAA）を加えた。インデユーサーの添
加３時間後に、細胞を集め、20ｍＭトリス−塩酸
（PH7.5、30ｍＭ NaClを含む）で洗浄し、同じ
緩衝液８ml中に再び懸濁した。 Trpプロモーターの効果的な機能発現のため
に、IAAの如きインデユーサーを最終濃度50μ
ｇ／mlになるように添加した。かくして細菌細胞
中に産生される蛋白をソニツク処理（０℃、２分
間）またはリゾチーム（8μｇ）消化（０℃、20
分）に引き続き凍結融解を３回行う事により抽出
した。この方法により、一般的にIL−２は細胞
から抽出された。抽出されたIL−２活性は10000
から120000単位／mlの範囲であつた。 pTIL2−22を含むエシエリヒア・コリ HB
101（AJ 12009）はFERM−BP245として寄託さ
れている。 実施例 ４ IL−２ cDNAを有するプラスミドpTuIL2−
22はpTuBlP−５（Taniguchi、T.et al.、
Seikagaku、53、966、1981）および実施例３に
示したpTIL2−22から第６図に図解した方法によ
り構築された。プラスミドpTuBlP−５は
pBR322中にtufBのプロモーター配列が挿入され
ている。このプラスミドはまた単一のCla 部
位を含んでおり、これは第６図に示した如くSD
配列の2bp下流に位置している。pTrS−３もま
たSD配列とATGイニシエーシヨンコードンの間
にCla 部位を含んでおり、このCal 部位
は実施例３に記載した如くpTrS−３およびIL−
２ cDNAを用いる事による発現プラスミド構築
中に破壊されないことから、Trpプロモーターを
tufBプロモーターに置き換える事はきわめて簡
単であり、その結果IL−２ cDNAはtufBプロ
モーターの制御下で発現される。 それ故、プラスミドpTIL2−22（30μｇ）は制限
酵素Cla とPvu により通常の方法で切断
された。IL−２ cDNAを含む断片（約2.2kb）
はアガロースゲル電気泳動により単離精製され、
3μｇのDNAが回収された。他方、pTuBlP−５
ベクター20μｇが同様にCal とPvu により
切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい
方の断片（約3.4kb）がアガロースゲル電気泳動
により単離精製され、DNA3.5μｇが回収された。
次にこのようにして得られた２個の断片は１つは
tufBプロモーターを含み（約3.4kb）、他方はIL
−２ cDNAを含んでおり（約2.2kb）以下に示
す如く連結した。 IL−２ cDNA（1.2μｇ）を含む断片および
tufBプロモーターを含む断片0.3μｇを6.6ｍＭ
MgCl₂、１ｍＭ ATPおよび10ｍＭ DTTを含
むPH7.5の66ｍＭトリス−塩酸中で、T4 DNAリ
ガーゼ0.8単位と混合し、４℃で一晩反応した。
次にこのようにして連結したプラスミドは常法に
従いエシエリヒア・コリHB 101へ形質転換され
た。 アンピシリンを含むＬ培地寒天プレート上に出
現するトランスホーマントの中で第６図の
pTuIL2−22の如くIL−２ cDNA部分を含む組
み換え体DNAを持つ８個のコロニーが選択され、
プラスミドDNAは実施例３に記載された如く調
製された。 pTuIL2−22を含むエシエリヒア・コリ HB
101を37℃でＬ培地（100ml）中で培養した。650
ｍμのO.D.がおよそ0.5−1.0に達した時、菌体を
集め、30ｍＭ NaClを含む20ｍＭトリス−塩酸
（PH7.5）で洗浄し、同じ緩衝液２ml中に再び懸濁
した。このようにして産生した蛋白は実施例３と
同様に抽出された。抽出液中のIL−２活性は
6000から56000単位／mlの範囲であつた。 pTuIL2−22を含むエシエリヒア・コリ HB
101（AJ 12010）はFERM−BP 246として寄託さ
れている。 実施例 ５ IL−２ cDNAを有するプラスミドpGIL2−22
はpGL 101（Roberts、T.M.and Laucer G.D.、
Meth Enzym.、68、473−483、（1979）、Gail
Lauer、et al、J.Mol.Appl.Genet.、１、No.２、
139〜147（1981）、T.Taniguchi、et al、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、77、No.９、5230〜5233
（1980）、Egon Amann et al、Gene、25、167〜
178（1983））と実施例３に示されたpTIL2−22と
から構築された。 すなわち、lacプロモーターを含むプラスミド
pGL 101（20μｇ）が制限酵素Pvu で常法によ
り切断され、引続きフエノール、クロロホルム処
理およびエタノール沈澱法により17μｇのDNA
が回収された。他方、pTIl2−22（75μｇ）の方は
Cla およびSal で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動によりIL−２ cDNAが含むDNA断
片2.2μｇを回収した。この断片はDNAポリメラ
ーゼ（クレノウ断片）で処理する事によりフラ
ツシユにされた。次にこのようにして得られた２
個の断片（0.25μｇおよび0.66μｇ）を実施例４と
同じ方法でT4 DNAリガーゼ1.0単位でもつて連
結した。かくしてこの連結したプラスミドは常法
に従いエシエリヒア・コリ HB 101に形質転換
された。トランスホーマントの中で、IL−２
cDNAを含むCla −Sal 断片の挿入を有
するトランスホーマント ³²PラベルしたIL−２
cDNAをプローブとして選択した。次にこれ等の
トランスホーマントを、アンピシリン25μｇ／ml
を含む10mlのχ培地中で培養し、実施例３で記載
した方法によりプラスミドDNAを調製した。か
くしてlacプロモーターの丁度下流にIL−２
cDNAの開始配列ATGを有するプラスミドDNA
はPst およびXba での切断部位を検定す
る事により得られた。このようにして得られた
pGlL2−22を含むエシエリヒア・コリ HB 101
は25μｇ／mlアンピシリンおよび25μｇ／mlスト
レプトマイシンを含有するＬ培地100mlに接種し
培養した。650ｍμのO.D.が約0.5に達した時イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド
（IPTG）を１ｍＭの濃度で加え、１時間後に菌
体を集め、実施例４に記載した方法に従つて菌体
抽出液を調製した。抽出液のIL−２活性は6000
から80000単位／mlの範囲であつた。 pGIL2−22を含むエシエリヒア・コリ HB
101（AJ 12011）はFERM−BP 247として寄託さ
れている。 実施例 ６ プラスミドpTrS−３（10μｇ）を先ず制限酵素
Sal で切断しSal 部位をDNAポリメラー
ゼ（クレノウ断片）あるいはT4 DNAポリメラ
ーゼ処理によりフラツシユ（flush）にした。 Cla で切断後、Trpプロモーター領域を有
する大きい方の断片を常法に従つてアガロースゲ
ル電気泳動により単離精製し、DNA3μｇを回収
した。 他方、pIL2−50AのPst 切断により得られ
るcDNAインサート11μｇがHgiAIで切断され、
T4 DNAポリメラーゼ処理され、大きい方の断
片がアガロースゲル電気泳動により単離、精製さ
れた。このようにしてIL−２の132個のアミノ酸
をコードするcDNA断片が7.2μｇ得られた。次
に、trpプロモーター（上記）を含む断片0.45μ
ｇ、IL−２ cDNAを含むHgiAI−Pst 断片
0.5μｇおよび合成オリゴヌクレオチド（5′）
CGATAAGCTATGGCA（3′）と（3′）
TATTCGATACCGT（5′）（各々20pmole）は両
方とも5′未満でリン酸化されているが、これ等を
実施例３に記載されている方法と同じ方法でT4
DNAリガーゼ１単位で連結した（第４図ｂ）。こ
のように連結されたプラスミドはエシエリヒア・
コリ HB 101に形質転換された。出現したトラ
ンスホーマントの中で、目標とするトランスホー
マントは次のようにして選択した。まず最初に、
IL−２ cDNAおよび合成オリゴヌクレオチド
の両方とハイブリダイズ可能なトランスホーマン
トがコロニーハイブリダイゼーシヨン法により選
択された。次に、ATGGCA配列の丁度下流に第
２図ａの111から113の位置のCTT配列から始ま
るDNA断片（CCTACT…）が挿入されているプ
ラスミドDNAを持つたトランスホーマントをPst
、Xba 切断個所を検定することにより選
択した。 pTIL2−21aまたはpTIL2−21bを含む上記のト
ランスホーマントを実施例３に示す方法によりＬ
培地中で培養し、そして実施例３に示す方法によ
り分析した時トランスホーマントの菌体抽出物に
は高いIL−２活性が認められた。pTIL2−21aを
有するエシエリヒア・コリHB101（AJ12013）お
よびpTIL2−21bを有するエシエリヒア・コリ
（AJ12014）を有するエシエリヒア・コリHB101
はそれぞれFERM−BP248、FERM−BP249と
して寄託されている。 上記の実施例で用いられた宿主、エシエリヒ
ア・コリx1776およびHB101（Boyer H.W.et al.、
J.Mol.Biol.41、459、（1969）は公知であり、容
易に入手可能である。更につけ加えれば、トラン
スホーマント中の組換えDNA体を遊離させるた
めにＬ培地で37℃でトランスホーマントを培養
し、テトラサイクリンおよびアンピシリンに感受
性となつた菌体を分離すれば寄託したトランスホ
ーマントから宿主は容易に得られる。 プラスミドベクターpBR322（例えばベセスダ
リサーチラボラトリーから購入可能）、pCE−１、
pTrS−３およびpGL101は公知であり容易に入手
可能である。更に、常法によりトランスホーマン
ト中の組換え体プラスミドを分離することによつ
てさらにそれぞれの実施例での説明から当然に明
らかな如くプラスミドベクターを分離することに
よつて寄託されたトランスホーマントからプラス
ミドベクターを得る事が出来る。pTrS−３およ
びpTuBIP−５はそれぞれエシエリヒア・コリ
FERM−P6735（BP328）およびエシエリヒア・
コリATCC31878として寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はIL−２活性を有するポリペプチドを
コードしたクローン化遺伝子の制限酵素エンドヌ
クレアーゼによる切断マツプを示し、第２図ａは
クローン化遺伝子の塩基配列を示し、第２図ｂは
IL−２活性を有するポリペプチドのアミノ酸配
列、およびを示す。第３図はプラスミドベ
クターpTrS−３を示す。第４図ａ、第４図ｂお
よび第４図ｃはベクターとしてpTrS−３を使用
している組換えDNAs（pTIL2−22、pTIL2−21、
pTIL2−14およびpTIL2−15）の構成を示すフロ
ーチヤートである。第５図はベクターとして
pKT218を使用している組換えDNA（pKIL2−
21）の構成を示すフローチヤートである。第６図
はベクターとしてpTUBIP−５を使用している
組換えDNA（pTuIL2−22）の構成を示すフロー
チヤートである。 図中、“Ａ”、“Ｇ”、“Ｃ”および“Ｔ”はデオ
キシアデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシ
シチジル酸およびチミジル酸をそれぞれ表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 遺伝子組換え手法によつて得られ、糖類を伴
   なわず、ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有し
   ない、分子中の次にアミノ酸配列を含むヒトイン
   ターロイキン２活性を有するポリペプチド。 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr
   GlN Leu GlN Leu Glu His Leu Leu Leu
   Asp Leu GlN Met Ile Leu AsN Gly Ile AsN
   AsN Tyr Lys AsN Pro Lys Leu Try Arg
   Met Leu Thr Phe Lys Phe Try Met Pro
   Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu GlN
   Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
   Glu Val Leu AsN Leu Ala GlN Ser Lys
   AsN Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
   Ser AsN Ile AsN Val Ile Val Leu Glu Leu
   Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
   Tys Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
   Phe Leu AsN Arg Trp Ile Thr Phe Cys
   GlN Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr。 ２ 次のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第
   １項記載のポリペプチド。 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys
   Thr GlN Leu GlN Leu Glu His Leu Leu
   Leu Asp Leu GlN Met Ile Leu AsN Gly Ile
   AsN AsN Tyr Lys AsN Pro Lys Leu Try
   Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Try Met
   Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
   GlN Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
   Glu Glu Val Leu AsN Leu Ala GlN Ser Lys
   AsN Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
   Ser AsN Ile AsN Val Ile Val Leu Glu Leu
   Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
   Tys Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
   Phe Leu AsN Arg Trp Ile Thr Phe Cys
   GlN Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr。 ３ 次のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第
   １項記載のポリペプチド。 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr
   GlN Leu GlN Leu Glu His Leu Leu Leu
   Asp Leu GlN Met Ile Leu AsN Gly Ile AsN
   AsN Tyr Lys AsN Pro Lys Leu Try Arg
   Met Leu Thr Phe Lys Phe Try Met Pro
   Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu GlN
   Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
   Glu Val Leu AsN Leu Ala GlN Ser Lys
   AsN Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
   Ser AsN Ile AsN Val Ile Val Leu Glu Leu
   Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
   Tys Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
   Phe Leu AsN Arg Trp Ile Thr Phe Cys
   GlN Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr。