JPH0659219B2 - ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコートする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドを有する遺伝子に関する。

インターロイキン２（以下、「IL−２」と略記する。）
は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれており、レクチンあ
るいは抗原で活性化されたＴ細胞より産生される可溶性
たんぱく（一般には「リンホカイン」として知られてい
る）である(Morganら，Science,193,1007〜1008(1976),
Gillisら，J.Immunol.,120,2027〜2033(1978))。IL−２
はリンパ球の反応性を調節でき、抗原特異的なエフエク
ターＴ−リンパ球のin vitroにおける長期培養を可能な
らしめることができる(Gillisら，Nature,268,154〜156
(1977))。またIL−２は、胸腺細胞の分裂の促進(Chen
ら，Cell Immunol.,22,221〜22(1977),Shawら，J.Immun
ol.,120,1967〜1973(1978))，ヌードマウスの脾細胞の
培養系での細胞障害性Ｔリンパ球活性(Wagnerら，Natur
e,284,278〜280,(1980))や抗−SRBCプラーク形成細胞反
応の誘導(Gillisら，J.Exp.Med.149,1960〜1968(1979))
等の関連する他の生物活性をもつことが明らかにされて
いる。従って、このリンパ球調節因子は液体免疫や細胞
性免疫反応を増強したり免疫不全状態を正常な液体や細
胞性免疫の状態に回復させるのに有用である。これらの
明らかにされたIL−２の免疫学的活性は、IL−２が悪性
腫瘍，細菌またはウイルス感染，免疫不全，自己免疫疾
患等(Papermasterら，Adv.Immunopharm.,507,(1980))に
対する医科免疫療法に有用であることを示している。イ
ンターフェロンと同様に、IL−２はナチュラルキラー細
胞活性を増強することが示されてきたが、これは悪性腫
瘍治療への有用性を強く示唆している。更に、IL−２は
単クローン性の活性化Ｔ細胞の保持を可能とし、この事
は、Ｔ細胞分化の分子機構，Ｔ細胞機能の分化機構，Ｔ
細胞の抗原リセプターの機構を研究する上で重要な役割
を担っていることを示している。また、IL−２は単クロ
ーン性Ｔ細胞を長期培養することにより、他の種々の分
野で有用な様々なＴ細胞由来のリンホカインを製造する
ためにも使用できる。更に、IL−２の産生とリンパ球の
IL−２に対する応答性は、免疫学的機能の重要なパラメ
ーターであり、免疫異常の臨床診断に有用である。

IL−２は従来の技術では、マイトジェンでマウス，ラッ
トあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造さ
れてきた(Gillisら，Nature,268,154〜156,(1977)),Far
rarら，J.Immunol.,121,1353〜1360,(1978),Gillisら，
J.Immunol.,120,2027〜2033,(1978))。ヒトの末梢血リ
ンパ球をマイトジェンで刺激することにより(Gillis
ら，J.Immunol.,124,1954〜1962,(1980))、Gillisらは
Ｔリンホーマ細胞株からのマウスIL−２の製造(Gillis
ら，J.Immunol.,125,2570〜2578(1980))とヒト白血病細
胞株からのヒトIL−２の製造(Gillisら，J.Exp.Med.,15
2,1709〜1719,(1980))を報告している。

Gillisらによる上記の技法は、細胞培養法を用いてマイ
トジェンで活性化されたＴ白血病細胞株からヒトIL−２
を製造する方法に関するものである。しかしながら、こ
の方法では低濃度のヒトIL−２しか産生されないのが難
点で、大量の培養液から微量のIL−２を得るために、複
雑な精製工程を必要とする。更に、ヒトＴ白血病細胞株
は少量のヒトIL−２に酷似した他の生理活性物質も産生
するので、IL−２をこれらの他の免疫活性を有する分子
と分離、あるいは時として共存する細胞毒物質(toxic l
ectin)と分離するにはかなりの困難が伴う。

IL−２を製造する他の方法として、インターフェロンの
ような他の生理活性ヒト由来たんぱくを製造するために
用いられた組換えDNA（デオキシリボ核酸の略）法(Gray
ら，Nature 295,503〜508,(1981),Nagataら，Nature 28
4,316〜320(1980),Taniguchiら，Gene 10,11〜15,(198
0))が好ましいと思われる。しかしながら、本発明の以
前には組換えDNA法によってIL−２を製造する試みは成
功していなかった。例えば、組換えDNA体によってIL−
２を産生する生命体を作成しようとする試みは、恐らく
IL−２ポリペプチドをコードする遺伝子が未だクローン
化されていなかったために成功していないという事が、
“日経バイオテクノロジー，第１９号，1982年７月５
日”に報告されていた。

従って、IL−２をコードするクローン化遺伝子とその遺
伝子を持った組換えDNA体が渇望されてきた。また、組
換えDNA体を有する生細胞株と、その細胞株を使ってIL
−２を製造する方法が渇望されてきた。

本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白となる。
本発明の目的はIL−２活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を創出したことにある。

すなわち、本発明はヒトインターロイキン２活性をも
つ、次のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子を提供するものである。

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr GlN Leu GlN Le
u Glu His Leu Leu Leu Asp Leu GlN Met Ile Leu AsN
Ile AsN AsN Tyr Lys AsN Pro Lys Leu Thr Arg Met Le
u Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
Leu Lys His Leu GlN Cys Leu Glu Glu Leu Lys Pro Le
u Glu Glu Gul Val Leu AsN Leu Ala GlN Ser Lys AsN
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser AsN Ile As
N Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Va
l Glu Phe Leu AsN Arg Trp Ile Thr Phe Cys GlN Ser
Ile Ile Ser Thr Leu Thr 本発明の遺伝子を利用することによって、IL−２はIL−
２活性を有するポリペプチドを産生すべくコードされた
遺伝子の挿入と、細胞の中で複製され得るベクターDNA
の挿入で組換え法により修飾され、該遺伝子のコードシ
ーケンスが、プロモーターシーケンスの下流に位置する
DNAによってIL−２を産生すべく形質転換させた原核生
物細胞株、特にエシェリヒア・コリを培地に浮遊培養
（好気的）することによって製造される。

本発明のIL−２ポリペプチドをコードしたクローン化遺
伝子は、IL−２活性を有するポリペプチドを産生する能
力をもつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由
来するIL−２に相当するメッセンジャーRNA(mRNA；“RN
A"はリボ核酸の略，以下“IL−２ mRNA”という）を相
補的DNA(cDNA)に逆転写することによって得られる。得
られた２重鎖cDNA(ss-cDNA)は一重鎖cDNA(ds-cDNA)に変
換させることができる。

cDNAを調製するための鋳型として用いるmRNAは、IL−２
ポリペプチドを産生する哺乳動物細胞から単離すること
ができる。単離されたRNAはポリアデニル化され(GiLLis
ら，Immunological Rev.,63,167〜209(1982))、ポリア
デニル化されたRNAは、例えばショ糖密度勾配遠心法に
よって１１〜１２Ｓ画分に分画することができる。１３
ＳのmRNAにIL−２mRNA活性が現われることがあるが、こ
の場合は１１〜１２ＳmRNAの凝集物であることが考えら
れる。

mRNAの供給源となるIL−２を産出することができる哺乳
動物細胞は、哺乳動物より摘出できる末梢血単核球，扁
桃腺細胞，脾臓細胞のようなＴ−リンパ球で良い。細胞
にIL−２産生能を与えたり、またはIL−２活性を増強す
るために、ナイロンカラム処理，抗血清と捕体処理，密
度勾配分画，ノイラミニダーゼとガラクトースオキシダ
ーゼの組合せ処理，トリプシン処理のような様々な酵素
処理，Ｘ線照射など従来知られた方法で前処理しても良
い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞増殖因子存在下で培養後
得られるクローン化Ｔリンパ球もmRNAの供給源として用
いることができ、これはより好ましいＴ−リンパ球であ
る。白血病やリンパ腫細胞株に由来するＴリンパ球それ
自体または上記の方法で前処理または変異したそれらの
誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞株またはクロ
ーニングされた形質転換細胞株もmRNAの供給源として好
ましい。明らかに、クローン化した細胞株は通常クロー
ン化前の親株に比較して多重のIL−２mRNAを含んでい
る。上記したリンパ球由来細胞とCEM,Molt 4F,BW5147の
ごとき腫瘍細胞株を融合することによって得られたＴ細
胞ハイブリドーマもまた本発明に使用するのに好ましい
哺乳動物細胞である。この場合のリンパ球由来細胞は、
(1)IL−２の自発産生細胞および(2)IL−２産生を補助す
る他の細胞の存在下または非存在下に培養液中にマイト
ジェンが導入され存在している時のみIL−２を産生する
細胞を含む。

IL−２自発産生細胞においてIL−２mRNAを誘導するため
に、IL−２自発産生細胞は、細胞培養の分野でよく知ら
れた方法で培養される。マイトジェン存在下のみでIL−
２を産生する細胞においてmRNAを産生する場合は、培養
した細胞は培地で良く洗った後、血清を含むかまたは含
まないローズウエルパークメモリアルインスティテュー
ト1640（以下、“RPMI 1640”と略す。），ダルベッコ
ウ変法イーグル培地（以下“DMEM”と略す。）またはク
リック培地のごとき培地に再び浮遊する。これらの細胞
培養培地には、ペニシリン，ストレプトマイシンまたは
他の抗生物質，Ｌ−グルタミン，ヘペス緩衝液，または
炭酸水素ナトリウムのような種々の添加物を細胞培養の
分野で一般に使われる濃度で加えても良い。好ましい細
胞濃度は0.5〜４×１０^６細胞／mlである。mRNAの活性
化とIL−２の産生を誘導するために適当な刺激剤が加え
られる。この適当な刺激剤の中には、マイトジェン，ノ
イラミニダーゼ，ガラクトースオキシダーゼ，塩化亜鉛
の如き亜鉛化合物またはプロテインＡ，ストレプトリシ
ン−Ｏの如き細菌由来のリンパ球活性化因子が含まれ
る。刺激された細胞は回収され、洗浄される。マイトジ
ェン刺激の際、マクロファージまたはデンドリティック
細胞を共存させるとやはりmRNAを活性化し、あるいは活
性化mRNAの収容を増大させ得る。同様にRaji,Daudi,K56
2,BALL−１の如きＢリンパ球またはＢリンパ球細胞株に
由来する細胞株を共存させてもmRNAは活性化され、また
は活性化mRNAの収量を増大させ得る。

哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件下
でin vitroで細胞培養により、また組織適合動物の体内
で維持される。mRNAの供給源を調製するためにin vitro
培養による継代を行なう場合には、従来Ｔ細胞の生育を
促進することが知られている培地であればどのような培
地にもこれら細胞は生育する。これらの培地には哺乳動
物の血清，血清成分または血清アルブミンを添加しても
良い。mRNAの活性化のための培養時間は、mRNAを生成す
るための活性化に必要な時間に対応する。この時間は、
通常IL−２の培地中への産生が開始されるまでに必要な
時間と対応している。好ましい時間は、マイトジェン等
の刺激剤を添加してから３〜１２時間である。培養時間
が長すぎる場合、生成したIL−２mRNAが分解されること
がある。IL−２産生細胞の活性化に際し、PMAまたはTPA
の如きホルボールエステル類を１０〜５０ｎｇ／ml添加
して活性化レベルを上昇させることもできる。

IL−２mRNA活性化のための上記工程はpH7.０〜7.４，温
度範囲３２〜３８℃の飽和水蒸気の環境下で行なわれ
る。

IL−２を産生する哺乳動物細胞を取得し培養する方法を
以下に述べる。

(イ)IL−２自発産生株の取得 ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレッド・ハッチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ，ソーク研究所／サンジエゴ／アメリカ，西ドイツ
国立癌センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）を１×１０^６個／mlの細胞密度でクリック
培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度で
合計８，０００レントゲンのＸ線照射を行なう。この
後、本細胞を0.1細胞／２００μｌ培地の細胞密度で９
６穴の平底マイクロタイタープレート（「ファルコン３
０７２」）に添加し、５％牛胎児血清を含むクリック培
地中で３週間３７℃にて５％ＣＯ_２インキュベーター中
にて培養する（限界稀釈法によるクローニング）。細胞
の生育が認められた培養ウエル中の細胞は、細胞が底面
全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社製培
養プレートに移し、クリック培地中にて５日間細胞を増
殖させる。さらに、本細胞を１〜２×１０^６個／mlの細
胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含まない無血清
合成培地に懸濁して２日間培養し、本培養上清を遠心分
離操作で分離し、次いで0.2２μのミリポアフィルター
にてデブリス除去と無菌化を行なった。このようにして
得た培養上清のIL−２活性を測定することによってIL−
２を自発産生するＸ線処理変異株が選択され、かつクロ
ーニングされた。

(ロ)ヒト末梢血単核細胞よりIL−２産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球（以下、PBLと略
す）。を採取する。本PBLを１×１０^６個／mlの細胞密
度で５％FCSを含むクリック培地に懸濁し、各２ml宛２
４穴のヌンクの培養プレートに接種する。ここにフイト
ヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ社製）を５μｇ／mlの終末
濃度になるように１００μｌ添加し、上述の条件下に４
８時間培養し、次いで細胞を培養液で洗浄し、再び１×
１０^５個／mlの細胞密度でクリック培地１mlに接種す
る。さらに、コンカナバリンＡ（以下、ConAと略す。）
2.5μｇ／mlで４８時間刺激したヒト脾細胞から調製し
たコンディショニングした培地１mlを加え、該コンディ
ショニングした培地５０％を含む培地を３日毎に取り換
えて、PBLからのヒトＴリンパ球を長期継代培養する。
このように長期継代培養して得たＴリンパ球を、前述と
同様の限界稀釈法でコンディショニングした培地に由来
するヒト脾細胞の存在下、クローニングを行ない、かつ
同様に細胞増殖を行なう。こうして得られたクローン化
Ｔリンパ球を１×１０^６個／mlの細胞密度に１０μｇ／
mlのフイトヘマグルチニン（以下、ＰＨＡと略す。）の
存在下、２４穴のヌンク培養プレート中のRPMI 1640培
地１mlに接種し、２４時間，３７℃で7.5％ＣＯ_２イン
キュベーター中にて培養した。本培養上清を遠心分離操
作で分離し、次いで0.2２μのミリポアフィルターで無
菌化を行なった後、IL−２産生ヒト正常Ｔリンパ球クロ
ーンを同定するために、IL−２活性検定を行なった。

(ハ)マイトジェン刺激でIL−２を生産するヒトリンパ球
由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界稀釈法によりク
ローン化されたＪ−１１１株は、前記の無血清培地や血
清１〜２％を含むBPMI 1640培地中にてConA １０μｇ
／mlやPHA2.５μｇ／mlの存在下に２４時間培養する
と、１０〜4,０００単位／mlのIL−２を産生することが
できる。また、これらヒト悪性化細胞は塩化亜鉛，プロ
テインＡ，ピシバニール存在下に培養しても、IL−２を
産生する。

(ニ)他の細胞もしくはその細胞の産生する因子の存在下
にマイトジェンで刺激することによりIL−２を産生する
細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Molt ４Ｆや前述の限界稀釈法
でクローン化されたジュルカット細胞の１つのクロー
ン，ジュルカット９９株は、上述のごときレクチンやマ
イトジエンを広い濃度範囲で加えて２４〜７２時間培養
してもIL−２を産生しない。ところが、この間モノカイ
ンの１種であるインターロイキン１を５〜１０μ／mlま
たは５０％のＫ５６２やラージ(Raji)細胞を共存させて
３７℃，２４時間培養すると、IL−２を確認しうる量
（１０〜１００μ／ml）産生する。

このようにして活性化された細胞よりIL−２mRNAを抽出
するには、細胞の種類を問わず常法によって行なえばよ
い。たとえば、NP−４０，SDS,Triton−X100，デオキシ
コール酸などの界面活性剤を添加して細胞を部分的また
は完全に分解するか、ホモゲナイザーや凍結融解などの
物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破
壊，可溶化する。その際にRNaseによるRNAの分解を防ぐ
ために、抽出液中にRNaseインヒビター、たとえばヘパ
リン，ポリビニル硫酸，ベントナイト，マカロイド，ジ
エチルピロカーボネート，バナジウム複合体などを添加
しておくのが好ましい。また、場合に応じては、抗IL−
２抗体を用いてIL−２合成途上のポリゾームを沈降せし
め、これよりmRNAを界面活性剤などで抽出する方法も行
ない得る。

また、poliAを含むmRNAの精製についてはオリゴdT−セ
ルロース，セファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セフ
ァロースなどのアフィニティ・カラムあるいはバッチ法
による精製法，SDG遠心法による分画，アガロースゲル
電気泳動法等によって行なうことができる。

上記の如くして得られたmRNAがIL−２mRNA活性を有する
ものであることを確認するためには、mRNAを蛋白に翻訳
させ、その生理活性を調べるか、抗IL−２ペプチド単ク
ローン製抗体を用い該翻訳蛋白を同定する等の方法を行
なえばよい。たとえばmRNAは通常、アフリカツメガエル
(Xenopus laevis)の卵にマイクロインジェクションする
ことにより(Gurdonら，Nature,233,177〜182(1972))あ
るいは網状赤血球または小麦胚細胞翻訳システムを使用
することにより対応する蛋白に翻訳される。

IL−２活性は、先にGillisら(Gillisら，J.Immunol.,12
0,2027〜2033(1978))によって基本的には述べられてい
るミクロ検定法によって確認できる。この検定法では、
Gillisらによって確立された方法に従って作成した細胞
障害性Ｔリンパ球細胞株（以下、CTLLと略す。）のIL−
２に依存細胞のDNA合成上昇（IL−２ dependent cellu
lar proliferation）を指標としている。即ち、４×１
０^３個のCTLL細胞を２％のFCSを含むRPMI-1640培地１０
０μｌに懸濁し、１００μｌの連続稀釈した翻訳産物と
共に９６穴の平底マイクロプレートに接種する。３７
℃，５％CO₂下で２０時間培養した後、細胞を0.5μCi／
ウエルの^３Ｈ−TdRで４時間ラベルし、自動細胞ハーベ
スターを用いて帯状ガラス繊維上に細胞を回収し、細胞
が取り込んだ放射能を液体シンチレーション法で測定す
る。この検定により、IL−２存在下に培養されたCTLL細
胞が投与量に依存して^３Ｈ−TdRを取込むことが判明
し、このことから検体中に含まれるIL−２量を明確に計
算することができる。

IL−２はＴリンパ球の増殖を促す活性を有するので、IL
−２活性をＴリンパ球の増殖を指標として測定すること
ができる。即ち、５個のCTLL細胞を２％のFCSを含むDME
M１００μｌに懸濁し、１００μｌの連続稀釈した翻訳
産物と共に９６穴の平底マイクロプレートに接種する。
７２〜９６時間，３７℃，５％CO₂下で培養した後、活
性化し増殖した細胞の数を顕微鏡下で計測する。対照群
として１００Ｕ／ml，１０Ｕ／mlのIL−２を用い、この
対照群の増殖した生細胞数と比較して検体のIL−２活性
を求める。

このようにして最も高活性の画分から得られたIL−２mR
NAはds−cDNAを合成するための鋳型として用い、ds−cD
NAはベクターDNAと結合させる。cDNAの合成は従来の方
法によって行なう。

まず、mRNAを鋳型とし、オリゴdTをプライマーとしてdA
TP，dGTP，dCTP，dTTPの存在下で逆転写酵素によりmRNA
と相補的なss−cDNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNA
を分解除去した後、今度は単鎖cDNAを鋳型にして逆転写
酵素あるいはDNAポリメラーゼを用いてds−cDNAを合成
する。

このようにして得られたds−cDNAと原核生物で複製でき
るレプリコンを含むベクターDNAから組み換えDNA体が作
られる。しかる後、この組み換えDNA体は宿主細胞に組
み込まれる。

このds−cDNA及び原核生物で増殖し得るベクターDNA
は、これらを結合させる前にエキソヌクレアーゼ処理，
化学合成DNA断片の追加，ds−cDNAやベクターDNAの末端
に連結可能な端末をつけるためにＧ，Ｃ−鎖を伸ばすな
ど各種処理によって修飾される。これらの連結可能なDN
Aは、例えばATP共存下にＴ４ファージのDNAライゲース
によってつぎ合せることが出来る。

このようにして調製された組換えDNA体によってクロー
ン化されたcDNAを増巾させるため又はIL−２ポリペプチ
ドを製造するために生細胞を形質転換する。

IL−２生産のための適当な原核生物宿主としてはエシェ
リヒア・コリ，バチルス・ズブチリスなどが含まれる。
宿主細胞胞中でのDNA増巾のためにはエシェリヒア・コ
リを宿主とすることが出来るが、その他の宿主細胞とす
ることも出来る。

適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはＥＫ型プ
ラスミドベクター（ストリンゼント型）としてpSC101,p
RK353,pRK646,pRK248,pDF41など．，ＥＫタイププラス
ミドベクター（リラックスドタイプ）：ColE1,pVH51,pA
C105,RSF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR322,pBR324,pBR32
5,pBR327,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN80,pKC7,pKB158,
pMK2004,pACYC1,pACYC184,dul等．，λgtタイプファー
ジベクター：λgt．λｃ，λgt．λＢ，λWES，λＣ，
λWES．λＢ，λZJvir.,λＢ′，λALO，λＢ，λWES.T
s622,λDam等が含まれている。一般に、pBR322はエシェ
リヒア・コリ用ベクターとしてしばしば利用されてきた
が、この場合最も良いクローニング部位はPst1ならびに
EcoR１部位である。

組換えDNA体を用いた宿主細胞の形質転換には、通常よ
く用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリの如
き原核生物が宿主の場合、このDNAを取り込むことの出
来るコンピテント細胞は対数増殖期における細胞を回収
後、良く知られているCaCl₂法によって形質転換出来
る。形質転換反応液中にMgCl₂又はRbClを共存させれば
形質転換効率は向上する。また、宿主細胞のプロトプラ
スト調製後形質転換させることも可能である。

IL−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの方法の何れ
かを用いて形質転換後分離可能である。

(1)プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物細胞抽
出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて１１−１２Ｓ画分と
して部分精製したIL−２mRNAを調製し、この部分精製mR
NAを鋳型として^３２Ｐ−放射性ss−cDNAを合成する。ア
ルカリ処理にて鋳型mRNAを除去後、単離されたcDNAは、
抗原刺激しない哺乳動物細胞から抽出され、部分精製し
た１１−１２ＳmRNAでハイブリダイズする。引続いてハ
イブリダイズしなかったcDNAとハイブリダイズしたcDNA
はハイドロキシアパタイトカラムクロマトグフィーで分
画する。ハイブリダイズしなかったcDNAとハイブリダイ
ズしたcDNAをそれぞれプローブＡ、及びプローブＢと呼
ぶ。何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニトロ
セルロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のDNAを
アルカリ処理にて濾紙上に固定する。プローブＡ及びＢ
をそれぞれ、二つの異った濾紙上でDNAとハイブリダイ
ズさせる。その後、オートラジオグラフィーを行ってプ
ローズＡと陽性に反応する組換え体（プラス）、プロー
ブＢと僅か又は全然反応しない組換え体（マイナス）を
選別する（谷口ら；Proc.Jap.Acad.,V155B 464〜４６９
（１９７９）． (2)第２の方法は、例えば１０００〜１０，０００の組
換体クローンを２〜３０ないし２〜３００クローン宛の
クローングループに大別し、それぞれのクローングルー
プをそれぞれ常法によって培養しプラスミドDNAsを調製
する。次いで、これらプラスミドDNAsを例えば熱変性し
てss−cDNAをニトロセルロース濾紙上に固定し、活性化
IL−２−mRNAを含有する哺乳動物細胞から調製されたmR
NAと相補的にハイブリダイゼーションを行う。あるいは
また、IL−２mRNAを含有するmRNA（混合物）を熱変性し
たプラスミドDNA（混合物）とハイブリダイズさせるとD
NA−mRNAハイブリッドがニトロセルロース濾紙上に固定
される。この濾紙を１mMのHEPES、あるいは１０mMの食
塩水のごとき低塩類緩衝液で洗浄し、濾紙上に吸着され
たmRNAを0.5mM EDTA；0.1％SDS溶液含有液で例えば９５
℃，dT１分間処理して抽出する。精製mRNAはこれをolig
o−セルロースカラムクロマトグラフィーにて溶出回収
する。次いで、mRNAをアフリカツメガエル卵母細胞にマ
イクロインジェクションして蛋白質に翻訳してIL−２活
性を確認する。あるいはmRNAに依存性に網状赤血球系又
は小麦胚のin vitro無細胞合成系を用いてこのmRNAを蛋
白に翻訳させ、抗IL−２抗体を用いてIL−２−活性を分
析することが出来る。これらの方法によってIL−２活性
が検出されたグループをさらに少数の組換え体クローン
を含有する群に類別し最終的にはIL−２DNAを有する単
一クローンが得られるまで繰返し実施する。

IL−２産生能のある組換え体よりIL−２ポリペプチドを
コードするcDNAを得るには、先ずトランスフォーマント
中の組換えDNA体を分離し、これを制限酵素エンドヌク
レアーゼで切断する。切断によって得られるDNA分画よ
り組込まれたcDNA画分を分離する。

pIL−２−５０Ａを組換えたDNAよりIL−２ポリペプチド
をコードするPst1 DNAインサートの全ヌクレオチド配列
は、Maxam and Gilbert法(Meth.Enzym.65,499〜560,(19
80))；ならびに二デオキシヌクレオチド鎖末端法(Smit
h,A.j.M.Meth.Enzym.65,560〜580,(1980))にて決定され
た。

cDNAインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによる切
断図を第１図及び第２図(a)に示す。第２図(a)に示すご
とく、このcDNAはそれぞれBstN1,XbaI,BstNIなる制限酵
素エンドヌクレアーゼで切断される構造を有する。

本cDNAインサートのDNA配列は一つの大きなオープンリ
ーディングフレームを保有する。真核生物の読み取り開
始配列となることの多い第一のATG配列(Kozak,M.Cell.1
5,1109〜1123(1978))は、５′一端から４８−５０ヌク
レオチド位に存在し、読み終り配列TGAが存在するヌク
レオチド位５０７−５０９迄１５２の配列がこのATGに
つながっている。mRNAの３′−poly(A)末端に相当する
ＡのつながりがcDNA末端に見出され、通常真核生物mRNA
のほとんどに見出される６個からなるヌクレオチドAATA
AA（771-776位）が先に位置する。(Proudfoot,N.J.& Br
ownlee C.G.,Nature 263,211-214,(1976)) cDNAによってコードされるアミノ酸配列は第２図(b)
（アミノ酸配列１）のごとく演えきでき、しかもアミノ
酸配列Ｉのポリペプチドは１５３個のアミノ酸からな
り、その分子量は17631.7ダルトンと計算される。

今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると報告
されているように(Blobel G. et al,Sym.Soc.Exp.Med.,
33,9〜36(1979))、上記演えきIL−２ポリペプチドのＮ
末端領域はやはり疎水性である。本領域は成熟IL−２の
分泌時に切断されるシグナルペプチドの役割を果してい
るであろう。切断は２０−２１位のSerとAle間で起るか
２１−２２位間のAla-Pro間で切断され、アミノ酸配列I
IおよびIIIを有するポリペプチドを生成する。何故なら
ば同様な切断位置は今迄知られたその他の分泌蛋白にも
しばしば見出されているからである(Blobel,G.et al,Sy
mp.Soc.Exp.Med.,33,9〜36(1979))。従って、成熟IL−
２ポリペプチドは１３３ないし１３２個のアミノ酸から
成り、分子量は15420.5または15349.4ダルトンと算出さ
れる。本分子量値はジュルカット細胞から得られたヒト
IL−２蛋白の分子量（15000ダルトン）として報告され
たものを対比される(Gillis et al.,Immunological Re
v.,63,67〜209(1982))。また実施例３に示すごとく塩基
配列１１１〜１１３位にあるCCT配列から始まるDNA画
分、即ち、２２位に位置するProから始まるポリペプチ
ドに対するコード（第２(b)図中のアミノ酸配列III）は
IL−２活性を有するポリペプチドを表現していることが
確認された。塩基配列１０７〜１１０位にあるGCAから
始まるDNA画分、即ち第２(b)図のアミノ酸配列IIに示す
ごとく、２１位に位置するAlaから始まるポリペプチド
をコードするDNA画分は、実施例６と示すごとくIL−２
活性を有するポリペプチドを表現していることが確認さ
れた。

有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも知
られている様に多形現象を示すことが知られている（谷
口ら，Gene 10,11〜15(1980)，大野，谷口．，Proc.Nat
1.Acad.Sci.USA,77,5305〜5309(1981)；Gray er al,Nat
ure 295,501〜508(1981))。この多形現象によって、蛋
白生産物のアミノ酸のあるものが置換される場合もあれ
ば、塩基配列の変化はあっても全く変らない場合もあ
る。ヒトIL−２・cDNAの場合、pIL-2-50A cDNAの５０３
位のＡ残基がＧ残基で置き換えられた他のcDNAクローン
(pIL-2-503)も検出できる。pIL-2-50A cDNAとは塩基配
列が異なるその他のcDNAクローンの存在も期待できる。

上記説明からも明らかなごとく、本発明の遺伝子は、第
２(a)図に示された塩基配列を有するDNA，48−50位のAT
G配列から始まり、504〜506位にある少くともＡＣＴ−
配列に至る連続塩基配列を有するDNAs，108−110位のGC
A配列から始まり、GCA配列から少くともACT配列に至る
連続塩基配列を有するDNA，また111−113位のCCT配列か
ら少くともACT配列に至る連続塩基配列を有するDNAを包
含する。本発明の遺伝子はまた、504〜506位のACT配列
に終り、１位のＡに始まるDNA，48−50位のATGで始まる
DNA，108−110位のGCA配列で始まるDNA又は111−113位
のCCT配列で始まるDNAを含有する。更に本発明の遺伝子
は、507−509位のTGA配列に終り、１位のＡに始まるDN
A,48〜50位のATG配列で始まるDNA，108〜110位のGCA配
列で始まるDNAまたは111−113位のCCT配列で始まるDNA
を包含する。更に本発明の遺伝子は、801位のＣで終
り、１位のＡで始まるDNA，48−50位のATGで始まるDN
A，108−110位のＧＣＡで始まるDNAまたは111−113位の
CCT配列で始まるDNAを包含する。本発明の遺伝子はまた
poly(A)で終り、48−50位のATGコードンから始まるDN
A，108−110位のGCA配列で始まるDNAまたは111−113位
のCCT配列で始まるDNAを含む。また、本発明の遺伝子
は、アミノ酸配列Ｉ，II，IIIに相当する塩基配列を有
する遺伝子を含む。アミノ酸配列Ｉの中で１個ないしそ
れ以上のアミノ酸を欠くポリペプチド、あるいはアミノ
酸配列Ｉの中の１個ないしそれ以上のアミノ酸が１個な
いしそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチドはIL
−２活性を有することもあり、従ってこの様なポリペプ
チドをコードする遺伝子は本発明の遺伝子として使え
る。同様にアミノ酸配列Ｉ，IIまたはIIIに対して１個
ないしそれ以上のアミノ酸を表現し得る１個ないしそれ
以上の塩基を余分に結合した遺伝子であっても追加され
たアミノ酸が、ポリペプチドのIL−２活性表現に邪魔し
ない限り本発明の遺伝子の中に包含される。IL−２とし
てのポリペプチド機能を阻害する追加アミノ酸配列を有
する修飾領域であっても新たに追加された領域が容易に
除去出来るものならば本発明の遺伝子として利用出来
る。同じことはアミノ酸配列Ｉ，IIおよびIIIに対応す
る遺伝子のアミノ酸配列Ｉ，IIおよびIIIのＣ−末端に
アミノ酸追加をコードするDNAが３′−末端に追加結合
せしめたDNAの場合にも言える。

上記の如くして得られた本発明の遺伝子を利用してIL−
２を生産するには、まず本発明の遺伝子を含有する組換
えDNA体を作り、次いで該組換えDNA体により宿主細胞を
形質転換し、該形質転換された生物細胞を培地で培養す
ればよい。

生細胞中でIL−２産生をする組換えDNA体は、次の各種
方法で作られる。例えば、IL−２・cDNAをコードする配
列を発現ベクターのプロモーター配列下流に挿入する。
あるいはプロモーターの配列を持つcDNA片を発現ベクタ
ーのcDNA挿入の前あるいは後にIL−２をコードする配列
の上流に挿入することが出来る。

IL−２−cDNAを発現し、IL−２−ポリペプチドを産生す
る原該生物の造成法を詳述すれば以下の通りである。

(1)エシェリヒア・コリによるIL−２−cDNAの発現 エンシェリヒア・コリ中でIL−２−cDNAを発現させるに
は、先ずcDNAを各種細菌プロモーターと結合せしめた
後、プロモーター下流にcDNAを含有するハイブリドプラ
スミドを作る。このプラミドを、例えばエンシェリヒア
・コリHB101に感染させ、ヒトIL−２活性を有する蛋白
を生合成する細菌がクローンされる。本来細菌のプロモ
ーターならば如何なるものでもcDNAに適当に接続されて
いればIL−２−cDNAを発現する。この様なcDNAの発現例
は以下のとおりである。

IL−２をコードするクローン化cDNAは第２図に示される
様な１５３個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
する。本ポリペプチドの２０個のアミノ酸に相当するＮ
−末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌蛋白の
特徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配列と称
し分泌過程で切断される。故に、成熟IL−２ポリペプチ
ドは、１５３個のアミノ酸より少ない筈である。このこ
とから、成熟IL−２ポリペプチドをコードするcDNA部分
を発現させることが望ましく、IL−２シグナル配列相当
部分を発現させるのは望ましくはない。

(i)プラスミドベクターpTrS-3の構築 pTrS-3は、エンシェリヒア・コリTrpプロモーターを含
み、pTrS-3のリーダーペプチドのためのリボソーム結合
部位（SD配列）は既に報告されている(G.Miozzari and
Yanofsky J. Bacteriol.133,1457〜1466(1978))。SD配
列の下流13塩基対にあるATGコードンの存在も報告され
ている(Nishi et al,生化学54,NO.8.676(1982))。この
プラスミドベクターはまた、ATG開始配列（第３図）の
下流に一つのSph Ｉ部位を含んでいる。

IL−２・cDNAを発現させるため、先ずプラスミドをSph
Ｉで消化しエンシェリヒア・コリDNAポリメラーゼＩ
（クレノウ(Klenow)フラグメント）または、バクテリオ
ファージT4 DNAポリメラーゼＩで処理し３′−位突き出
し末端を除去する（第４図(a)）。プラスミドpIL-2-50A
をPst ＩおよびHgiAIで２回消化し、より大きいcDNA画
分を単離する。次いでDNAをエンシェリヒア・コリDNAポ
リメラーゼＩ（クレノウフラグメント）又はバクテリオ
ファージT4 DNAポリメラーゼで処理して３′−突き出し
末端を切りはなす。この処理をしたcDNAは１３２個のア
ミノ酸のIL−２ポリペプチドをコードする（第４(a)
図）。このcDNAを上述のごとく前処理したpTrS−３プラ
スミドDNAに結合せしめ、ATG開始コードンをIL−２cDNA
のCCT(Pro)配列につなぎ合せる。こうしてプラスミドpT
IL-2-22が得られる。Trpプロモーター配列とpT IL-2-2
2のIL−２cDNA配列の結合は第４(a)図に示す。

プラスミドpT IL-2-22はエンシェリヒア・コリによりプ
ロリンから始まる１３２個のアミノ酸からなるIL−２ポ
リペプチド合成を指令する。

(ii)成熟IL−２はプロリンの代りにＮ−末端アミノ酸と
してアラニン（２１位）を含むこともあり、１３３個の
アミノ酸から成るIL−２ポリペプチド合成を指示するプ
ラスミドを以下の如く作ることができる。

プラスミドpTrS−３はSD配列とATG配列との間に１つのC
la Ｉ切断部位がある（第３図）。本プラスミドはCla
ＩとSal Ｉで切断される。プラスミドpIL-2-50AをPs
t Ｉで部分分解し、エシェリヒア・コリDNAポリメラー
ゼＩで処理し、最も長いDNAを単離する。次いでDNAを制
限酵素Xho Ｉ切断部位を含む合成DNAリンカーと結合さ
せ、IL−２をコードする配列の３′−側下流にDNAリン
カーを導入したプラスミドpIL-2-50A(Xho)を含むクロー
ンを単離する。プラスミドpIL-2-50A(Xho)を先ずHgiAI
で切断し、エンシェリヒア・コリ クレノウフラグメン
トまたはT4 DNAポリメラーゼで処理し、Xho Ｉで消化
すればcDNA画分が単離できる。このcDNAフラグメントを
Cla ＩおよびSal Ｉで前処理したpTrS-3DNAに結合さ
せ第４(b)図の如く合成DNAにつなげる。かくしてAlaか
らスタートする１３３個のアミノ酸から成るIL−２ポリ
ペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラスミ
ドpTIL-2-21が得られる。（第４(b)図）。同様なことは
Xho Ｉリンカーを使用しなくとも作られる。

(iii)異ったＮ−末端アミノ酸を有する異った大きさのI
L−２ポリペプチドはpTrS-3発現プラスミドベクターを
用いても作られる。以下に示すごとく、pIL-2-50Aにク
ローンされたIL−２cDNAはヌクレオチド結合部位８１−
８５に唯一つだけDde Ｉ部分を有する。プラスミドpIL
-2-50A(Xho)を、Dbe Ｉで切断し、cDNAのより大きい区
分を含有するDNA画分を単離する。本画分はpBR322より3
000塩基対を有するDNAを含んでいる（第４(c)図）。DNA
画分をエクソヌクレアーゼBal ３１で処理し、次いでX
ho Ｉで切断する。ここで得られたDNAをSph Ｉで切断
したpTrS-3と結合せしめ、KlenowフラグメントまたはT4
DNAポリメラーゼで処理し次いでSal Ｉで消化する
（第４(c)図）。つなぎ合せたDNAをエシェリヒア・コリ
HB 101に感染させ、ヒトIL−２を発現するクローンを検
索する。これらのクローンは色色な大きさのヒトIL−２
を発現する筈である。何故ならばヒトIL−２のＮ−末端
領域に相当するDNAは種々切断除去されるからである。
かくしてIL−２cDNAを含有するpTIL-2-14と１５が得ら
れる。

(iv)IL−２cDNAはまたpKT 218(Talmageより提供を受け
た；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,P.3369〜3373(1980))
を用いても発現可能である。プラスミドpKT 218はPst
Ｉで切断し、pIL-2-50AをHgiAIとPst Ｉで切断（第５
図）して得たIL−２cDNA挿入部分とつなぎ合わせる。出
来上ったプラスミドpKIL-2-21は第５図に示したよう
に、蛋白合成開始の始発位に配列を有している。したが
って、このプラスミドpKIL-2-21はIL−２の１３３個の
アミノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ酸からなる両者が
融合したポリペプチドからなり、これをエシェリヒア・
コリ中で合成することが出来る筈である（最初のメチオ
ニンはエシェリヒア・コリでは切断除去される）。

(V)p-BR・322にtufBに対するプロモーター配列を挿入し
たプラスミドpTuBlp-5の発現は既に行なわれている（谷
口ら，生化学53 966(1981))。このプラスミドは一つのCl
a Ｉ切断部位を含み、第６図に示すごとく本切断部位
はSD配列の２塩基対だけ下流に位置する。pTrS-3もまた
SD配列とATG始発配列の間にある一つのCla Ｉ切断部位
を含み、同時にこのCla Ｉ部位はpTrS-3とIL−２cDNA
を用いて発現用プラスミドを作る過程で壊されないので
細菌TrpプロモーターをtufBプロモーターで置き換える
ことは極めて簡単である。従ってヒトIL−２cDNAはtufB
プロモーターの制御下で発現される。例えばpTIL-2-22
をCla ＩとPvu IIで切断し、IL−２cDNAを含むDNA画
分を分離する。次いでこの画分をpTuBlP-5でつなぎ合わ
せ、Cla ＩとPvu IIで予め切断後、第６図に図示され
る様にプラスミドpTuIL-2-22が造成される。IL−２活性
はプラスミドpTuIL-2-22を含むエシェリヒア・コリHB10
1の抽出液に検出できる。

(vi)例えばpTIL-2-21を使っても、また基本的にはpTrS-
3を用いて達成したすべての発現用プラスミドを用いる
ことによっても同様に造成できる。また例えばpTuIL-2-
22をCla Ｉで切断し、Bal31またはSIまたはDNAポリメ
ラーゼＩ（エシェリヒア・コリ）にてDNAの塩基対２−
３個を除去または補充し再度プラスミドをつなげること
によってSDおよびATG配列の距離を至適の長さにするこ
とも可能である。

次いで、組換えDNA体を挿入したエシェリヒア・コリ，
バチルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物細
胞を培養して組換えDNA体を増巾し、またははIL−２ポ
リペプチドを生産する。この培養は通常の方法で行なわ
れる。

細胞内または細胞外に生産されたIL−２は硫安沈澱，塩
類除去のための透析（常圧または減圧下），ゲル濾過，
クロマトグラフィー，等電点平板上濃縮，ゲル電気泳
動，高速液体クロマトグラフィー（以下HPLCと略記），
（イオン交換，ゲル濾過並びに逆相クロマトグラフィ
ー），及び色素結合担体，IL−２に対するモノクローナ
ル抗体を結合した活性化セファロース4B又はレクチン結
合セファロース4B等によるアフィニティクロマトグラフ
ィー等，公知の方法によって回収することができる。IL
−２の単離精製法はWatsonら(J.Exp.Med.,150,849-861
(1979),Gillis et al,J.Immunol.,124,1954-1962(198
0),Mochizuki et al,J.Immunol.Methods 39,185-201(19
80),Welte,K et al,J.Kxp.Med.,156,454-464(1982))に
よって報告されている。

かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激によ
って哺乳動物細胞から作られるIL−２について知られて
いるものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示しIL
−２活性を有する。分子量は約15000ダルトンでありIL
−２活性は、Igsorb(Enzyme Center)の様な免疫吸着剤
の有無にかかわらず完全に中和され、またはモノクロー
ナル抗IL−２抗体で沈澱した。免疫電気泳動において、
IL−２ポリペプチドは、対応する抗IL−２抗体に対して
唯１個の沈降線を示す。IL−２活性は２−メルカプトエ
タノールで還元後も安定であり、DNAse及びRNAse処理し
ても、又５６℃，３０分熱処理しても安定である。活性
はpH２〜９で安定である。この様にして生産されたIL−
２はモノクローナルな機能を有するＴ細胞（細胞障害性
Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の分裂を強め、
更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細胞障
害Ｔリンパ球への分化を惹き起こす。また、YAC-1細胞
やRL １細胞に対するナチュラルキラー細胞の活性化の
増強に役立つ。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ (1)ヒトＴ細胞系白血病細胞株であるジュルカット細胞
（日本、西独および米国では自由に入手可能である）を
１０％FCSを含むRPMI 1640培地にけん濁し、Ｘ線照射装
置Exs 150/300-4（東芝・日本）により５０秒間、室温
で10,000レントゲンに達するまで照射した。その後照射
された細胞は上述の培地中、初期細胞密度１×１０^５個
／mlで５％炭酸ガス、３７℃のインキュベーター中で５
日間培養した。

この変異細胞（0.2個／穴）を９６穴の平底のマイクロ
プレートの１０穴にまき、５％炭酸ガス、３７℃のイン
キュベーター中で２１日間培養した。生育してくる穴か
ら得られるクローンはクローン量を増加させるため新た
な培地へ移し、その増加したクローンはConA 50μｇ／m
l存在下で初期細胞密度１×１０^６個／mlで２４時間培
養した。そしてIL−２活性は前述の方法に従って測定し
た。

この結果、ジュルカット−１１１(ATCC CRL 8129)（以
後“Ｊ−１１１”と称する）と命名されたヒトＴ細胞株
が親株のジュルカットからクローン化、選択され、この
細胞のIL−２産生能は親株の４０倍に増加していた。

このクローン化したＪ−１１１細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。

(2)Ｊ−１１１細胞（１×１０^５個／ml）を無血清合成
培地RIT C 55-9(Sato,T.et al.,Exp.Cell Res.,138,127
-134,(1982))1000mlに接種し、ローラー培養ボトル（フ
ァルコン３０２７）内で３７℃、４日間培養し、増殖し
た細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再び４×
１０^６個／mlとなるよう上述のConA 25μｇ／ml含有培
地に接種した。ローラー培養ボトル（ファルコン）４バ
ッチの各々に細胞を接種した培養液100mlを入れ、６時
間回転培養した。

(3)このようにConA25μｇ／mlで６時間刺激したジュル
カット細胞（1.2×１０^６）は生理食塩−リン酸緩衝液
（以後PBSと略す）8,000mlに懸濁した。この細胞は遠心
操作により２回洗浄し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボ
ヌクレオシド−バナデイル複合体（１０mM）を含有する
RSB溶液（１０mlトリス−塩酸緩衝液、pH7.5、１０mM N
aCl、1.5mM MgCl₂）800mlに再懸濁した。その後、界面
活性剤ＮＰ−４０を最終濃度0.0５％となるように加
え、ゆっくり混合し、細胞核を3,000rpm、５分、４℃下
で遠心し分離した。SDS（0.5％）及びEDTA(5mM)を上清
液へ加え、細胞質RNAを上清液と同量のフェノールを加
え抽出した。フェノールによる抽出を３回繰返した後、
RNAは２倍量のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を
遠心により集め、pH7.5の１０mMトリス−塩酸に溶解し
た。得られたRNA量は１９６mgであった。

mRNAの分画はオリゴ(dT)−セルロース（Ｐ．Ｌ．Bioche
micals,Type 7）のアフィニティークロマトグラフィー
を使用し行った。吸着液は２０mMトリス−塩酸、0.5M N
aCl、１mM EDTA及び0.5％SDSを含むpH7.5の溶液であ
り、溶出はカラムを緩衝液（２０mMトリス−塩酸、pH7.
5、0.5M NaCl、１mM EDTA）で洗浄後、水と１０mMトリ
ス−塩酸（pH7.5）で交互に行った。溶出により得られ
たmRNAは3.6mgであった。次にこの得られたmRNA2.4mgを
蔗糖密度勾配遠心法（５０mMトリス−塩酸、１mM EDT
A、0.2 M NaClを含むpH7.5の溶液中で蔗糖密度勾配５−
２５％、26,000rpmで４℃下２４時間）により分画し
た。mRNAの１１から１２Ｓが分画NO.１２、１３、１４
へ分画され、各々５９μｇ、４６μｇ、６０μｇであっ
た。

(4)NO.１３の分画に得られたmRNAをアフリカツメガエル
(Xenopus Iaevis)の卵母細胞へ注入した（５０ng mRNA
／卵母細胞）。この卵母細胞の培養液をIL−２活性測定
した。表１に示す如く、^３Ｈ−チミジン(³H-TdR)の取込
みの上昇及び活性化Ｔリンパ球数の増加が確認され、明
らかにこの分画中のmRNAはヒトIL−２mRNAを含んでいる
事が立証された。

(5)その後IL−２mRNAを含む１１〜１２ＳmRNAのNO.１３
分画からin vitroでcDNAを合成した。

組換え体DNAはプラスミドベクターpBR 322と構成した。
組換え体DNAをエシェリヒア・コリに形質転換し、IL−
２cDNAクローンを獲得したクローンを以下に示す如き方
法により選択した。

（５−１）５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、３０m
M NaCl、６mM MgCl₂、５mMジチオスレイトール（以後DT
Tと略す）、0.5mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP（dCTPは
^３２Ｐは放射標識したものを含む）、0.7μｇオリゴ(d
T)_１０、１０μｇmRNA及び１５単位AMV逆転写酵素(J.W.
Beard)を混合し、４１℃下で９０分保った。反応終了
後、DNAはフェノール処理後エタノール沈澱物として回
収し、このDNAを２０mMトリスおよび１mM EDTAを含むpH
7.5の溶液に溶解した。

ss−cDNA2.5μｇが合成された。本反応液よりmRNAを除
くために反応液にNaOH溶液を加えて0.3３Ｎ NaOH溶液
とし、室温にて１５時間置き、次いでpH7.5の１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液を同量に加えて中和したセファデックス
Ｇ−５０カラムをカラムを通した。回収されたcDNAは1.
8μｇであった。

（５−２）５０mM リン酸緩衝液（pH7.5）、１０mM Mg
Cl₂、１０mM DTT、0.7５mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP
（dCTPは^３Ｈで標識したものを含む）、1.8μｇ ss-cD
NAおよび８単位ポリメレースＩ（BRL、米国）を混ぜ１
５時間、１５℃で反応を行った。反応終了後DNAをフェ
ノール及びクロロホルム処理後エタノール沈澱物として
回収した。1.1０μｇのds−cDNAが生成した。５０mM酢
酸ソーダ（pH4.5）、0.2ＭNaCl、１mM ZnCl₂および1.1
０μｇ二本鎖cDNAの混合物を３７℃で３０分間インキュ
ベートした後0.2５単位のヌクレアーゼＳ_１（三井、日
本）を加え、さらに１５分間インキュベートした。反応
終了後、フェノール処理を２回行った反応生成物をセフ
ァデックスＧ−５０へ供し、二本鎖cDNA0.5５μｇを得
た。

（５−３）0.1４Ｍカコジル酸カリウム、３０mMトリス
塩基、0.1mM DTT、１mM CoCl₂、0.6４mM³²P-dCTP（比活
性2.7×１０^６cpm/n mol）、0.5５μｇ ds−cDNAおよ
び５単位のターミナルトランスフェラーゼ(BRL)を混合
し、３７℃で７分間インキュベートした後フェノール処
理し、次いでセファデックスＧ−５０カラムに供し、エ
タノール沈澱物として0.5０μｇDNAを得た。回収したこ
のDNAは約５０個のdCMP残基が両３′末端に付加されて
いる事が判明した。

pBR 322 DNA １０μｇを制限酵素Pst Ｉで切断したの
ちdCTPのかわりにdGTPを用いたこと以外は前述のds−cD
NAにdCMP鎖を付加したときに用いた方法と全く同じ条件
により、切断したDNAの両３′末端にdGMPを付加した。

（５−４）５０mMトリス−塩酸（pH7.5）0.1Ｍ NaCl、
５mM DETA、0.0５μｇ dGMP残基付加pBR 322および0.0
１μｇ dCMP残基付加cDNAをまず６５℃で２時間、次い
で４６℃で１２０分間、さらに３７℃で６０分間、そし
て室温で６０分間インキュベートした。

エシェリヒア・コリχ1776(Curtiss III,R.et al.,in M
olecular Cloning of Recombinant DNA,(W.A.Scott &
R.Werner ed.)Academic Press,(1977))を５０mlのＬ培
地（100μｇ／mlのジアミノピメリン酸、５０μｇ／ml
のチミジン、１％トリプトファン、0.5％酵母エキス、
0.5％NaClおよび0.1％がグリコースを含む）に接種し培
養液の吸光度が５６２nmで0.3付近になるまで３７℃で
振とう培養した。培養終了後、培養液を３０分間０℃に
保持し、菌体を遠心分離により集め、５mMトリス−塩酸
（pH7.6）、0.1Ｍ NaCl、５mM MgCl₂および１０mM RbC
lを含む溶液２５mlで２回洗浄した。

得られた菌体を５mMトリス−塩酸（pH7.6）0.25 KCl、
５、mM MgCl₂、0.1Ｍ CaCl₂および１０mM RbClを含む
溶液２０mlに懸濁し、０℃で２５分間静置後、菌体を集
め上記と同じ溶液１mlに菌体を再懸濁し、得られた菌体
懸濁液の0.2mlに上記組換え体DNAを入れ、０℃で６０分
間静置した。その後Ｌ培地0.7mlを加え３７℃で３０分
間振とう培養した。こうして得られた培養液（0.1ml）
を１００μｇ／mlジアミノピメリン酸、５０μｇ／mlチ
ミジンおよび１５μｇ／mlテトラサイクリンを含むＬ培
地の1.5％寒天培地上に一面に塗抹し、３７℃で２日間
インキュベートした。

（５−５）出現した４３２のコロニーを１８のグループ
に分け、（その名グループは２４の異なるバクテリアク
ローンを含む）１００μｇ／mlのジアミノピメリン酸、
５０μｇ／mlのチミジンおよび１０μｇのテトラサイク
リンを含むＬ培地２００mlに接種し、３７℃で５〜７時
間振とう培養した。次に最終濃度１７０μｇ／mlとなる
ように加えられたクロラムフェニコールを含む新たなＬ
培地２００mlを加え、さらに一晩培養した。

このようにして増強されたプラスミドDNAを常法に従い
精製した。

IL−２cDNAを有するクローンはmRNAハイブリダイゼーシ
ョン−トランスレーションアッセイ（以後Ｈ−Ｔアッセ
イと略称する）により選択した。

ここで用いられたＨ−Ｔアッセイは以下に示す如く行っ
た。

純化したDNA（２５μｇ）を制限酵素Hind IIIにより開
裂しフェノールで３回、フェノール−クロロホルムおよ
びクロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱させ８
０％エタノールで洗浄し、８０％ホルムアミド４０mlに
溶解した。

反応液を変性させるため９０℃で５分間加熱後１０×SS
C（1.5Ｍ NaCl、0.1５Ｍ クエン酸ソーダ）で1.3mlに
稀釈した。その後、本DNAをニトロセルロース濾紙上に
固定し、これを８０℃で３時間乾燥させ、５０％ホルム
アミド、２０mM Pipes（pH6.5）、0.75Ｍ NaCl、５mM
EDTA、0.2％SDS及びＪ−１１１細胞由来のpoly(A)mRNA
２５０μｇを含む溶液中で３７℃、１８時間インキュベ
ートし、濾紙上に固定されたDNAとIL−２mRNAをハイブ
リダイズした。

次にその濾紙を６５℃で３回pH6.5の１０mM Pipes，0.1
５Ｍ NaCl溶液、１mM Pipes，１０mM NaCl溶液で洗浄
し0.5mM EDTA、0.1％SDS溶液で９５℃、１分間処理し濾
紙からハイブリダイズしたmRNAを回収した このようにして抽出したmRNAを常法に従ってオリゴdT−
セルロースカラム上で精製し、アフリカツメガエル卵母
細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−２活性を測定し
た。

各々２４クローンからなる１８グループのうちの１グル
ープが前述の^３Ｈ−TdR取込みによるアッセイで４８単
位／mlのIL−２活性陽性を示した。一方他のグープは明
らかに陰性であった。

次に、陽性のグループに属する２４の各単一コロニーを
既述と同じ組成のＬ培地２００mlへ接種し、３７℃で５
〜７時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニコール
含有のＬ培地をさらに添加した。

一晩培養して、プラスミドDNAを増強後、プラスミドDNA
を同様に標準法に従って精製した。Hind IIIで各プラス
ミドDNA約５μｇを開裂後、各プラスミドを同様にニト
ロセルロース濾紙へ固定した。その濾紙をIL−２mRNAと
ハイブリダイズし、ハイブリダイズしたmRNAをアフリカ
ツメガエル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−２
活性を測定するため回収した。

表２に示す如く、p3−16と標示した単一コロニーから精
製されたプラスミドDNAのみが陽性のIL−２活性を示し
た。それ故、本クローンがIL−２cDNAを有するクローン
(E.coli χ 1776/p3-16AJ11995(FERM-BP-225))と同定
された。このようにプラスミドDNA、p3−16はIL−２mRN
Aと特異的ハイブリッドを形成する能力のあるDNA（IL−
２遺伝子）を確かに有している事が確認された。

プラスミドp3−16のcDNAインサートは制限酵素Xba Ｉ
により１部位で、又Bst NIにより２部位（Xba Ｉ開裂
部位の上流及び下流）で切断されるという特徴を示し
た。しかしながら、プラスミドp3−16は約６５０塩基対
より構成されるcDNAインサートを含んでおり、これは明
らかに１１〜１２Ｓの大きさのIL−２mRNAの一部分に相
当するものである。それ故、他のcDNAライブラリーを、
鋳型としてIL−２mRNAを用い、Land等の方法(Land et a
l., Nucleic Acids Res.,vol 9,p2551,(1981))に従って
作製した。一本鎖cDNA（1.6μｇ）を、dCMP残基を付加
したIL−２mRNA４μｇを用いて合成し、そしてds−cDNA
を、DNAポリメラーゼＩ（Klenow 断片）によりプライ
マーとしてオリゴ(dG)１２＝１８を用いる事により合成
した。６８０塩基対DNAサイズマーカー(size marker)よ
り長いcDNA（0.6μｇ）は蔗糖密度勾配遠心法によって
得られ、標準的なＧ−Ｃテイリング法によりpBR 322のP
st Ｉ部位へ挿入出来た。

組換えDNA体によるエシェリヒア・コリ χ 1776の形
質転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳された
(nick-translated)p3-16 cDNAインサートを用いたGruns
tein-Hognessのハイブリダイゼーション法により約2000
コロニーを選別し、およそ８５０塩基対を含むプラスミ
ドpIL 2-50Aを含有するコロニー及び形質転換されたク
ローン（エシェリヒア・コリ χ 1776/pIL2-50A、AJ11
996(FERM-BP-226)）を同定した。pIL2-50AのcDNAインサ
ートの制限酵素切断図を第１図に示した。

形質転換されたエシェリヒア・コリ χ 1776/pIL2-50
AからのIL−２ペプタイドをコードしている遺伝子を単
離するため、プラスミドDNAを通常法に従い、菌体からD
NAを単離後制限酵素Pst Ｉにより切断した。この処理
により生成する２つのDNA断片のうちより小さな断片はI
L−２ペプタイドをコードしているDNA遺伝子であった。
pIL2-50AからのPst Ｉインサートの完全なヌクレオチ
ド配列はMaxam and Gilbertの方法(Maxam,A.W.et al.,E
nzym.65,,499-560,1980)により決定した。全構造を第２
図(a)に示す。

実施例２ 実施例１に記載された方法に従ってジュルカット細胞か
らクローン化された構成的IL−２産生細胞株J-A 1886(A
TCC CRL 8130)は同様にローラー培養ボトルで生育し
た。生育した細胞は初期細胞密度１×１０^６個／mlで新
鮮な合成培地RITC-55-9に再懸濁し、培養開始８時間後
に、実施例１で詳細に示したステップに従って３×１０
^９個の細胞から１１〜１２Ｓ分画としてのIL−２mRNA抽
出のために使用された。

ds−cDNAは実施例１と同様に合成され、６００塩基対よ
り長いcDNA（2.4μｇ）が蔗糖密度勾配遠心法による分
画により得られた。次にこのcDNAをターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、dCMP残基で
伸長し、その５０ngがdGMPで伸長したPst Ｉ切断pBR 3
22 250ngとアニールされた。

生成したハイブリッドプラスミドはエンシェリヒア・コ
リ χ 1776に形質転換され、約4,000クローンのトラ
ンスホーマントが得られた。

Grunstein-Hognessの方法に従い、プローブとして用い
たプラスミド3-16 cDNAと相補的な３個のクローンが選
択された。すなわち、このようにして選択された形質転
換されたクローンはヒトIL−２遺伝子を有するクローン
である。

実施例３ エシェリヒア・コリ細胞でヒトIL−２の合成を指令する
プラスミドを以下の如き方法で構築した。

プラスミドpT IL2-22は第４(a)図で図解されている如
く、一連の改変の方法によりpTrS-3(Nishi T.,Taniguch
i T.et al.,SEIKAGAKU 53,967,(1981),同54,676(1982))
及びIL−２cDNAを含むpIL2-50Aから構築した。プラスミ
ドpTrS-3はTrpプロモーターとpBR 322のEcoRI部位とCla
Ｉ部位の間にShine Dalgarno（以後SDと略号する）の
領域の挿入を含む。

本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一のSph
Ｉ部位と同様にSD配列の下流１３bpにATGイニシエーシ
ョンコードンを含んでいる。

言及している蛋白に対応するDNA配列がATGコードンの丁
度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの蛋白を
生産するには非常に効果的である。このATGコードンはp
TrS-3のSph Ｉ消化に引続きT4 DNAポリメラーゼによる
処理によって生成される。それ故プラスミドpTrS-3（30
μｇ）は制限酵素Sph Ｉで、常法により切断され、引
続きフェノール，クロロホルム処理，エタノール沈澱法
により回収され両末端がT4 DNAポリメラーゼ処理により
フラッシュにされた。

次に、同様の方法によりフェノール，クロロホルム処理
及びエタノール沈澱法によりDNA（21.4μｇ）を回収し
た。他方IL−２cDNAを含むpIL2-50A 380μｇはPst Ｉ
により切断され、IL−２cDNAインサートはアガロースゲ
ル電気泳動により単離された、cDNAインサート（１１μ
ｇ）はHgiAIにより切断され、T4 DNAポリメラーゼによ
って処理され、大きい方の部分のDNA１０μｇがアガロ
ースゲル電気泳動により単離された。本法に従って１３
２個のアミノ酸をコードするcDNA（7.2μｇ）が得ら
れ、このDNA断片はブラントエンドを有していた（第４
(a)図）。

次に、このようにして得られたcDNA断片をATG配列の丁
度下流で、前もってSpH Ｉにより消化されたT4 DNAポ
リメラーゼにより処理されたpTrS-3ベクターへ連結し
た。このように連結したプラスミドはそれから、常法に
従いエンシェリヒア・コリHB 101へ形質転換された。こ
の連結は次のようにして行った。IL−２cDNA（0.4μ
ｇ）の前述の大きい方の断片およびpTrS-3ベクターDNA
0.2μｇを6.6mM MgCl₂,１mM ATPおよび１０mM DTTを
含むpH7.5の６６mMトリス−塩酸中でT4 DNAリガーゼ0.8
単位と共に混合し、混合物を４℃，一晩反応させた。ア
ンピシリンを含むＬ培地寒天プレート上に出現するトラ
ンスホーマントの中で、１３２個のアミノ酸をコードし
ているIL−２cDNA部分を含むプラスミドを持つコロニー
をその場でコロニーハイブリダイゼーションアッセイ法
により選択した。こうして選択したコロニーを再び培養
（１０ml）し、リゾチーム処理および凍結，融解による
処理によりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドD
NAをPst ＩとXba Ｉで切断し、その結果の生成物をア
ガロースゲル電気泳動により分析し、cDNAがpTrS-3のAT
G配列の後に正しい方向で凍結しているpTIL-2-22を同定
した。

pTIL-2-22を含むエシェリヒア・コリHB 101を微生物の
増殖のために知られている通常法の下に培養した。細胞
は２５μｇ／mlストレプトマイシンおよび２５μｇ／ml
のアンピシリンを含みｘ培地（2.5％バクトトリプト
ン，１％酵母エキス，0.1％グルコース，２０mM MgS
O₄，５０mMトリス−塩酸，pH7.5（１０ml中で３７℃で
一晩生育させた。ついで培養懸濁液１mlを同じｘ培地
（１００ml）へ接種し、３７℃で培養した。６５０ｍμ
のO.D.がおよそ1.5−2.0に達した時点で３−インドール
アクリル酸(IAA)を加えた。インデューサーの添加３時
間後に、細胞を集め、２０mMトリス−塩酸（pH7.5，３
０mM NaClを含む）で洗浄し、同じ緩衝液８ml中に再び
懸濁した。

Trpプロモーターの効果的な機能発現のために、IAAの如
きインデューサーを最終濃度５０μｇ／mlになるように
添加した。かくして細菌細胞中に産生される蛋白をソニ
ック処理（０℃，２分間）またはリゾチーム（８μｇ）
消化（０℃，２０分）に引き続き凍結融解を３回行う事
により抽出した。この方法により、一般的にIL−２は細
胞から抽出された。抽出されたIL−２活性は10,000から
120,000単位／mlの範囲であった。

pTIL2-22を含むエシェリヒア・コリHB 101(AJ12009)はF
ERM-BP245として寄託されている。

実施例４ IL−２cDNAを有するプラスミドpTuIL2-22はpTuBlP-5(Ta
niguchi,T.et al.,Seikagaku,53,966,1981)および実施
例３に示したpTIL2-22から第６図に図解した方法により
構築された。プラスミドpTuBlP-5はpBR322中にtufBのプ
ロモーター配列が挿入されている。このプラスミドはま
た単一のCla Ｉ部位を含んでおり、これは第６図に示
した如くSD配列の２bp下流に位置している。pTrS-3もま
たSD配列とATGイニシェーションコードンの間にCla Ｉ
部位を含んでおり、このCla Ｉ部位は実施例３に記載
した如くpTrS-3およびIL−２cDNAを用いる事による発現
プラスミド構築中に破壊されないことから、Trpプロモ
ーターをtufBプロモーターに置き換える事はきわめて簡
単であり、その結果IL−２cDNAはtufBプロモーターの制
御下で発現される。

それ故、プラスミドpTIL2-22（３０μｇ）は制限酵素Cl
a ＩとPvu IIにより通常の方法で切断された。IL−２
cDNAを含む断片（約2.2kb）はアガロースゲル電気泳動
により単離精製され、３μｇのDNAが回収された。他
方，pTuBlP-5ベクター２０μｇが同様にCla ＩとPvu
IIにより切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大き
い方の断片（約3.4kb）がアガロースゲル電気泳動によ
り単離精製され、DNA3.5μｇが回収された。次にこのよ
うにして得られた２個の断片は１つはtufBプロモーター
を含み（約3.4kb）、他方はIL−２cDNAを含んでおり
（約2.2kb）以下に示す如く連結した。

IL−２cDNA（1.2μｇ）を含む断片およびtufBプロモー
ターを含む断片0.3μｇを6.6mM MgCl₂，１mM ATPおよび
１０mM DTTを含むpH7.5の６６mMトリス−塩酸中で、T4
DNAリガーゼ0.8単位と混合し、４℃で一晩反応した。次
にこのようにして連結したプラスミドは常法に従いエシ
ェリヒア・コリHB 101へ形質転換された。

アンピシリンを含むＬ培地寒天プレート上に出現するト
ランスホーマントの中で第６図のpTuIL2-22の如くIL−
２cDNA部分を含む組み換え体DNAを持つ８個のコロニー
が選択され、プラスミドDNAは実施例３に記載された如
く調製された。

pTuIL2-22を含むエシェリヒア・コリHB 101を３７℃で
Ｌ培地（１００ml）中で培養した。６５０ｍμのO.D.が
および0.5−1.0に達した時、菌体を集め、３０mM NaCl
を含む２０mMトリス−塩酸（pH7.5）で洗浄し、同じ緩
衝液２ml中に再び懸濁した。このようにして産生した蛋
白は実施例３と同様に抽出された。抽出液中のIL−２活
性は6,000から56,000単位／mlの範囲であった。

pTuIL2-22を含むエシェリヒア・コリHB 101(AJ12010)は
FERM-BP 246として寄託されている。

実施例５ IL−２cDNAを有するプラスミドpGIL2-22はpGL 101(Robe
rts,T.M.and Laucer G.D.,Meth Enzym.,68,473-483,(19
79),Gail Lauer,er al,J.Mol.Appl.Genet.,１，NO.2,13
9〜147(1981),T.Taniguchi,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,77,NO.9,5230〜5233(1980),Egon Amann,et al,Gen
e,25,167〜178(1983))と実施例３に示されたpTIL2-22と
から構築された。

すなわち、lacプロモーターを含むプラスミドpGL 101
（２０μｇ）が制限酵素Pvu IIで常法により切断され、
引き続きフェノール，クロロホルム処理およびエタノー
ル沈澱法により１７μｇのDNAが回収された。他方、pTI
L2-2（７５μｇ）の方はCla ＩおよびSal Ｉで切断
し、アガロースゲル電気泳動によりIL−２cDNAが含むDN
A断片2.2μｇを回収した。この断片はDNAポリメラーゼ
Ｉ（クレノウ断片）で処理する事によりフラッシュにさ
れた。次にこのようにして得られた２個の断片（0.2５
μｇおよび0.6６μｇ）を実施例４と同じ方法でT4 DNA
リガーゼ1.0単位でもって連結した。かくしてこの連結
したプラスミドは常法に従いエシェリヒア・コリHB 101
に形質転換された。トランスホーマントの中で、IL−２
cDNAを含むCla Ｉ−Sal Ｉ断片の挿入を有するトラン
スホーマント^３２ＰラベルしたIL−２cDNAをプローブと
して選択した。次にこれ等のトランスホーマントを、ア
ンピシリン２５μｇ／mlを含む１０mlのｘ培地中で溶媒
し、実施例３で記載した方法によりプラスミドDNAを調
製した。かくしてlacプロモーターの丁度下流にIL−２c
DNAの開始配列をATGを有するプラスミドDNAはPat Ｉお
よびXba Ｉでの切断部位を検定する事により得られ
た。このようにして得られたpGIL2-22を含むエシェリヒ
ア・コリHB 101は２５μｇ／mlアンピシリンおよび２５
μｇ／mlストレプトマイシンを含有するＬ培地１００ml
に接種し培養した。６５０ｍμのO.D.が約0.5に達した
時イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド(I
PTG)を１mMの濃度で加え、１時間後に菌体を集め、実施
例４に記載した方法に従って菌体抽出液を調製した。抽
出液のIL−２活性は6,000から80,000単位／mlの範囲で
あった。

pGIL2-22を含むエシェリヒア・コリHB 101(AJ12011)はF
ERM-BP 247として寄託されている。

実施例６ プラスミドpTrS-3（１０μｇ）を先ず制限酵素Sal Ｉ
で切断しSal Ｉ部位をDNAポリメラーゼ（クレノウ断
片）あるいはT4 DNAポリメラーゼ処理によりフラッシュ
(flush)にした。Cla Ｉで切断後、Trpプロモーター領域を有する大きい
方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳動により
単離精製し、DNA３μｇを回収した。

他方、pIL2-50AのPst Ｉ切断により得られるcDNAイン
サート１１μｇがHgiAlで切断され、T4 DNAポリメラー
ゼ処理され、大きい方の断片がアガロースゲル電気泳動
により単離，精製された。このようにしてIL−２の１３
２個のアミノ酸をコードするcDNA断片が7.2μｇ得られ
た。次に、trpプロモーター（上記）を含む断片0.4５μ
ｇ，IL−２cDNAを含むHgiAI-Pst Ｉ断片0.5μｇおよび
合成オリゴヌクレオチド(5′)CGATAAGCTATGGCA(3′）と
(3′)TATTCGATACCGT(5′)（各々２０pmole）は両方とも
５′末端でリン酸化されているが、これ等を実施例３に
記載されている方法と同じ方法でT4 DNAリガーゼ１単位
で連結した（第４図(b)）。このように連結されたプラ
スミドはエシェリヒア・コリHB 101に形質転換された。
出現したトランスホーマントの中で、目標とするトラン
スホーマントは次のようにして選択した。まず最初に、
IL−２cDNAおよび合成オリゴヌクレオチドの両方とハイ
ブリダイズ可能なトランスホーマントがコロニーハイブ
リダイゼーション法により選択された。次に、ATGGCA配
列の丁度下流に第２図(a)の１１１から１１３の位置のC
TT配列から始まるDNA断片（CCTACT………）が挿入され
ているプラスミドDNAを持ったトランスホーマントをPst
I,Xba I切断個所を検定することにより選択した。

pTIL2-21aまたはpTIL2-21bを含む上記のトランスホーマ
ントを実施例３に示す方法によりＬ培地中で培養し、そ
して実施例３に示す方法により分析した時トランスホー
マントの菌体抽出物には高いIL−２活性が認められた。
pTIL2-21aを有するエシェリヒア・コリHB 101(AJ 1201
3)およびpTIL2-21bを有するエシェリヒア・コリ(AJ 120
14)を有するエシェリヒア・コリHB 101はそれぞれFERM-
BP 248,FERM-BP 249として寄託されている。

上記の実施例で用いられた宿主，エシェリヒア・コリ
ｘ 1776およびHB 101(Boyer H.W.et al.,J.Mol.Biol.4
1,459,(1969))は公知であり、容易に入手可能である。
更につけ加えれば、トランスホーマント中の組換えDNA
体を遊離させるためにＬ培地で３７℃でトランスホーマ
ントを培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリンに
感受性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホー
マントから宿主は容易に得られる。

プラスミドベクターpBR 322（例えばベセスダリサーチ
ラボラトリーから購入可能），pCE-1,pTrS-3およびpGL
101は公知であり容易に入手可能である。更に、常法に
よりトランスホーマント中の組換え体プラスミドを分離
することによってさらにそれぞれの実施例での説明から
当然に明らかな如くプラスミドベクターを分離すること
によって寄託されたトランスホーマントからプラスミド
ベクターを得る事が出来る。pTrS-3およびpTuBlP-5はそ
れぞれエシェリヒア・コリ FERM-P6735(BP 328)および
エシェリヒア・コリ ATCC 31878として寄託されてい
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はIL−２活性を有するポリペプチドをコードした
クローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによる
切断マップを示し、第２図(a)はクローン化遺伝子の塩
基配列を示し、第２図(b)はIL−２活性を有するポリペ
プチドのアミノ酸配列Ｉ，IIおよびIIIを示す。 第３図はプラスミドベクターpTrS-3を示す。第４図
(a)，第４図(b)および第４図(c)はベクターとしてpTrS-
3を使用している組換えDNAs(pTIL2-22，pTIL2-21，pTIL
2-14およびpTIL2-15)の構成を示すフローチャートであ
る。第５図はベクターとしてpKT 218を使用している組
換えDNA(pKIL2-21)の構成を示すフローチャートであ
る。第６図はベクターとしてpTUBlP-5を使用している組
換えDNA(pTuIL2-22)の構成を示すフローチャートであ
る。 図中、“Ａ”，“Ｇ”，“Ｃ”および“Ｔ”はデオキシ
アデニル酸，デオキシグアニル酸，デオキシシチジル酸
およびチミジル酸をそれぞれ表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 松井 裕 神奈川県横浜市金沢区並木１丁目19―16― 101 (72)発明者 鹿島 信一 神奈川県横浜市旭区若葉台２―21―603 (72)発明者 羽室 淳爾 神奈川県横浜市戸塚区深谷町241―32 (56)参考文献 特開 昭59−140882（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトインターロイキン２活性をもつ、次の
   アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝
   子。 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr GlN Leu GlN Le
   u Glu His Leu Leu Leu Asp Leu GlN Met Ile Leu AsN
   Gly Ile AsN AsN Tyr Lys AsN Pro Lys Leu Thr Arg Me
   t Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
   Glu Leu Lys His Leu GlN Cys Leu Glu Glu Glu Leu Ly
   s Pro Leu Glu Gul Val Leu AsN Leu Ala GlN Ser Lys
   AsN Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser AsN Il
   e AsN Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
   Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Il
   e Val Glu Phe Leu AsN Arg Trp Ile Thr Phe Cys GlN
   Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr