JPH0143552B2 - - Google Patents
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- JPH0143552B2 JPH0143552B2 JP57003278A JP327882A JPH0143552B2 JP H0143552 B2 JPH0143552 B2 JP H0143552B2 JP 57003278 A JP57003278 A JP 57003278A JP 327882 A JP327882 A JP 327882A JP H0143552 B2 JPH0143552 B2 JP H0143552B2
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- Japan
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- urokinase
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は分子内架橋高分子ウロキナーゼ及びそ
の製造法に関する。 従来、市販されているウロキナーゼ血栓溶解剤
は、有効成分が単一成分ではなく、低分子ウロキ
ナーゼ（UK−と略称する、分子量約33000）
と高分子ウロキナーゼUK−と略称する、分子
量約54000）の２種を含んでいる。〔Biochem.５、
2160（1966）．〕 最近、両ウロキナーゼの医薬品としての効果、
即ち実際に生体内に投与した場合の血栓溶解能に
ついて、UK−の方がUK−より優れている
ことを示唆する報告が増加している。 例えば、プラスミノーゲン活性化能
〔Thromposis and Haemostasis、38、257
（1977）．〕や、チヤンドラループ法による血栓溶
解能と生体内での安定性〔医薬ジヤーナル、14、
233（1978）．〕のいづれの報告もUK−の優秀性
を示している。しかしながら、このUK−は分
離、精製、製剤等の製造工程中および製剤保存中
に分解してUK−と不活性蛋白（分子量約
20000）に開裂し易く、特に還元剤例えば２−メ
ルカプトエタノール、ジチオスライトール、シス
テイン等の添加によりほぼ定量的に開裂すること
が知られている。本発明者等はこれらの点をふま
え、鋭意研究の結果、二価性架橋試薬を用いて
UK−に分子内架橋を形成することにより、安
定な分子内架橋高分子ウロキナーゼを製造するこ
とに成功した。 即ち本発明は、 「(1) 一般式（） （但し、式中ｎは６以下の整数を示す） で示される二価の基が高分子ウロキナーゼ（分
子量約54000）の分子内の遊離アミノ基とアミ
ジン型結合して架橋を形成していることを特徴
とする分子内架橋高分子ウロキナーゼ。 (2) 一般式（） （但し、式中Ｒは低級アルキル基、ｎは６以下
の整数を示す） で示される化合物と高分子ウロキナーゼ（分子
量約54000）とを反応させることを特徴とする
分子内架橋高分子ウロキナーゼの製造法」に関
するものである。 本発明の分子内架橋高分子ウロキナーゼは優
れた安定性により新規な血栓溶解剤や人工臓器
用基材として有用である。 本発明で使用する一般式（）で示されるビ
スイミデート類は、ウロキナーゼ蛋白分子内の
遊離アミノ基に対し高い反応性を示し、アミジ
ン型結合の架橋を形成する。 この分子内架橋の形成によりウロキナーゼは
経時的及び還元剤に対し、著しく安定になるこ
とが解つた。従来ビスイミデート類化合物は、
その優れた反応性によりタンパク分子内の２個
のアミノ酸残基間の距離の測定に利用されたこ
とがあるが、ウロキナーゼについて分子内架橋
を形成させ、その酵素活性が安定化させること
を見出したのは本発明者等が最初である。 本発明の架橋反応はPH７〜11の水溶液、好ま
しくは緩衝液中で、温度０〜37℃程度で容易に
進行する。一般に、0.1〜10mg蛋白／ml濃度の
UK−に対しビスイミデート類を固体又は少
量の緩衝液に使用直前に溶解した液を終濃度が
３〜30ｍＭになるよう撹拌しながら少量づつ添
加するのが好ましい。 反応の停止は酢酸、塩酸等の酸や高濃度の低
PH緩衝液を添加して反応液のPHを6.5〜7.0に下
げて架橋試薬を分解するか又は透析、限外濾
過、ゲル濾過等により反応液中の架橋試薬を分
離することにより行うことが出来る。 反応後、目的物の分離は、ゲル濾過、ゲル電
気泳動、クロマトグラフイー等、通常の蛋白質
分離技術を適宜利用して行う。 次に、本発明の分子内架橋高分子ウロキナー
ゼの理化学的特徴を説明する。 (1) 分子量は54000〜58000である。 (2) 化学構造は
の製造法に関する。 従来、市販されているウロキナーゼ血栓溶解剤
は、有効成分が単一成分ではなく、低分子ウロキ
ナーゼ（UK−と略称する、分子量約33000）
と高分子ウロキナーゼUK−と略称する、分子
量約54000）の２種を含んでいる。〔Biochem.５、
2160（1966）．〕 最近、両ウロキナーゼの医薬品としての効果、
即ち実際に生体内に投与した場合の血栓溶解能に
ついて、UK−の方がUK−より優れている
ことを示唆する報告が増加している。 例えば、プラスミノーゲン活性化能
〔Thromposis and Haemostasis、38、257
（1977）．〕や、チヤンドラループ法による血栓溶
解能と生体内での安定性〔医薬ジヤーナル、14、
233（1978）．〕のいづれの報告もUK−の優秀性
を示している。しかしながら、このUK−は分
離、精製、製剤等の製造工程中および製剤保存中
に分解してUK−と不活性蛋白（分子量約
20000）に開裂し易く、特に還元剤例えば２−メ
ルカプトエタノール、ジチオスライトール、シス
テイン等の添加によりほぼ定量的に開裂すること
が知られている。本発明者等はこれらの点をふま
え、鋭意研究の結果、二価性架橋試薬を用いて
UK−に分子内架橋を形成することにより、安
定な分子内架橋高分子ウロキナーゼを製造するこ
とに成功した。 即ち本発明は、 「(1) 一般式（） （但し、式中ｎは６以下の整数を示す） で示される二価の基が高分子ウロキナーゼ（分
子量約54000）の分子内の遊離アミノ基とアミ
ジン型結合して架橋を形成していることを特徴
とする分子内架橋高分子ウロキナーゼ。 (2) 一般式（） （但し、式中Ｒは低級アルキル基、ｎは６以下
の整数を示す） で示される化合物と高分子ウロキナーゼ（分子
量約54000）とを反応させることを特徴とする
分子内架橋高分子ウロキナーゼの製造法」に関
するものである。 本発明の分子内架橋高分子ウロキナーゼは優
れた安定性により新規な血栓溶解剤や人工臓器
用基材として有用である。 本発明で使用する一般式（）で示されるビ
スイミデート類は、ウロキナーゼ蛋白分子内の
遊離アミノ基に対し高い反応性を示し、アミジ
ン型結合の架橋を形成する。 この分子内架橋の形成によりウロキナーゼは
経時的及び還元剤に対し、著しく安定になるこ
とが解つた。従来ビスイミデート類化合物は、
その優れた反応性によりタンパク分子内の２個
のアミノ酸残基間の距離の測定に利用されたこ
とがあるが、ウロキナーゼについて分子内架橋
を形成させ、その酵素活性が安定化させること
を見出したのは本発明者等が最初である。 本発明の架橋反応はPH７〜11の水溶液、好ま
しくは緩衝液中で、温度０〜37℃程度で容易に
進行する。一般に、0.1〜10mg蛋白／ml濃度の
UK−に対しビスイミデート類を固体又は少
量の緩衝液に使用直前に溶解した液を終濃度が
３〜30ｍＭになるよう撹拌しながら少量づつ添
加するのが好ましい。 反応の停止は酢酸、塩酸等の酸や高濃度の低
PH緩衝液を添加して反応液のPHを6.5〜7.0に下
げて架橋試薬を分解するか又は透析、限外濾
過、ゲル濾過等により反応液中の架橋試薬を分
離することにより行うことが出来る。 反応後、目的物の分離は、ゲル濾過、ゲル電
気泳動、クロマトグラフイー等、通常の蛋白質
分離技術を適宜利用して行う。 次に、本発明の分子内架橋高分子ウロキナー
ゼの理化学的特徴を説明する。 (1) 分子量は54000〜58000である。 (2) 化学構造は
【式】（ｎは６
以下の整数）で示される二価の基がUK−の遊
離アミノ基とアミジン型結合して架橋が形成して
いる。 (3) 架橋の数は反応条件によりUK−の遊離の
アミノ基の数に対し任意の割合にすることが出
来る。 (4) 通常、遊離アミノ基の60〜70％程度架橋反応
した物は後述の試験例で示すように、経時的及
び還元剤に対し、著しく安定である。 以下本発明を詳細に説明するため実施例を示
す。なおウロキナーゼの活性測定は国立衛生試験
所の西崎氏等による平板法〔医薬品研究５、(3)、
295（1974）〕を用いた。単位は国際単位で表した。 実施例 １ 〔ジメチルスベロイミデートによる架橋反応〕 (A) ゲル電気泳動で単一バンドを示す高純度UK
−（比活性＝143000単位／mg蛋白）を0.1M
リン酸緩衝液（PH＝9.0）に溶解し、濃度１mg
蛋白／mlの溶液を調製した。このUK−溶液
３ml（総力価＝4.3×105単位）に使用直前に同
一緩衝液で調製したジメチルスベロイミデート
溶液（濃度＝８mg／ml）0.6mlを添加し、８℃
に保つて架橋反応を進めた。 12時間反応した後、0.5Mリン酸緩衝液（PH
＝6.5）３mlを加えて反応を停止させた。 反応終了液のウロキナーゼ力価はフイブリン
平板法で反応開始時の81％を示した。 この反応終了後の溶液６ml（3.2×105単位）
を採り、これに還元試薬としてＬ−システイン
を終濃度0.5％になるように添加し、４℃に１
夜保持して未反応のUK−を低分子に分解し
た後、0.1％Ｌ−システインと0.3M塩化ナトリ
ウムを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH＝7.0）を
溶出液として、セフアデツクスＧ−100による
ゲル濾過を行い、目的物の分子内架橋UK−
（総力価＝1.0×105単位、比活性＝75000単位／
mg蛋白）を取得した。 この物は、２−メルカプト９エタノール（以
下２−MEと略称する）の添加により分解され
ず、ドデシル硫酸ナトリウム（以下SDSと略称
する）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
子量約56000〜58000に対応する単一バンドを示
した。 トリニトロベンゼンスルホン酸を用いて、分
子内に残存する未反応のアミノ基を測定
〔Fielcls、R.、Biochem.J.、124、581（1971）〕
した結果、この分子内架橋UK−は元のアミ
ノ基の約70％がジメチルスベロイミデートによ
り修飾されていた。 (B) 実施例１(A)に於けるUK−とスベロイミデ
ートとの反応状況を詳しく知るため、原料UK
−溶液と反応（終了）液を少量サンプリング
した物及びそれぞれを還元分解処理した物の４
種を試料として、ゲル電気泳動法による分離分
析を行つた。 (1) 還元分解はSDSと2MEをそれぞれ終濃度
１％になるように添加し、37℃に１時間保つ
ことにより行つた。 (2) 分離はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により行つた。 (3) 発色と確認は泳動後の支持体ゲルをクマジ
ーブリリアントブル−Ｒ−250で染色し、７
％酢酸溶液で脱色後、島津２波長クロマトス
キヤナ−CS−900による蛋白バンドの追跡に
より行つた。 この分析の結果次のことが解つた。即ち、 (1) 原料UK−は分子量54000の単一成分で
あるが、2MEを添加するとこの成分は完全
に消失して、分子量約33000と21000の低分子
成分に分解した。 (2) 反応液は約分子量54000〜58000の成分を主
体とし、微量の分子量約34000の副生物を含
んでいた。 (3) 反応液の主体を構成する分子量約54000〜
58000の成分は反応目的物と未反応のUK−
の混合物であつた。 (4) 反応液を2MEで分解処理すれば、未反応
のUK−が完全に低分子化され残存する分
子量56000〜58000の成分は、目的とする分子
内架橋UK−のみになつた。 以上の分析結果を表示すれば第１表の通りで
ある。
離アミノ基とアミジン型結合して架橋が形成して
いる。 (3) 架橋の数は反応条件によりUK−の遊離の
アミノ基の数に対し任意の割合にすることが出
来る。 (4) 通常、遊離アミノ基の60〜70％程度架橋反応
した物は後述の試験例で示すように、経時的及
び還元剤に対し、著しく安定である。 以下本発明を詳細に説明するため実施例を示
す。なおウロキナーゼの活性測定は国立衛生試験
所の西崎氏等による平板法〔医薬品研究５、(3)、
295（1974）〕を用いた。単位は国際単位で表した。 実施例 １ 〔ジメチルスベロイミデートによる架橋反応〕 (A) ゲル電気泳動で単一バンドを示す高純度UK
−（比活性＝143000単位／mg蛋白）を0.1M
リン酸緩衝液（PH＝9.0）に溶解し、濃度１mg
蛋白／mlの溶液を調製した。このUK−溶液
３ml（総力価＝4.3×105単位）に使用直前に同
一緩衝液で調製したジメチルスベロイミデート
溶液（濃度＝８mg／ml）0.6mlを添加し、８℃
に保つて架橋反応を進めた。 12時間反応した後、0.5Mリン酸緩衝液（PH
＝6.5）３mlを加えて反応を停止させた。 反応終了液のウロキナーゼ力価はフイブリン
平板法で反応開始時の81％を示した。 この反応終了後の溶液６ml（3.2×105単位）
を採り、これに還元試薬としてＬ−システイン
を終濃度0.5％になるように添加し、４℃に１
夜保持して未反応のUK−を低分子に分解し
た後、0.1％Ｌ−システインと0.3M塩化ナトリ
ウムを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH＝7.0）を
溶出液として、セフアデツクスＧ−100による
ゲル濾過を行い、目的物の分子内架橋UK−
（総力価＝1.0×105単位、比活性＝75000単位／
mg蛋白）を取得した。 この物は、２−メルカプト９エタノール（以
下２−MEと略称する）の添加により分解され
ず、ドデシル硫酸ナトリウム（以下SDSと略称
する）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
子量約56000〜58000に対応する単一バンドを示
した。 トリニトロベンゼンスルホン酸を用いて、分
子内に残存する未反応のアミノ基を測定
〔Fielcls、R.、Biochem.J.、124、581（1971）〕
した結果、この分子内架橋UK−は元のアミ
ノ基の約70％がジメチルスベロイミデートによ
り修飾されていた。 (B) 実施例１(A)に於けるUK−とスベロイミデ
ートとの反応状況を詳しく知るため、原料UK
−溶液と反応（終了）液を少量サンプリング
した物及びそれぞれを還元分解処理した物の４
種を試料として、ゲル電気泳動法による分離分
析を行つた。 (1) 還元分解はSDSと2MEをそれぞれ終濃度
１％になるように添加し、37℃に１時間保つ
ことにより行つた。 (2) 分離はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により行つた。 (3) 発色と確認は泳動後の支持体ゲルをクマジ
ーブリリアントブル−Ｒ−250で染色し、７
％酢酸溶液で脱色後、島津２波長クロマトス
キヤナ−CS−900による蛋白バンドの追跡に
より行つた。 この分析の結果次のことが解つた。即ち、 (1) 原料UK−は分子量54000の単一成分で
あるが、2MEを添加するとこの成分は完全
に消失して、分子量約33000と21000の低分子
成分に分解した。 (2) 反応液は約分子量54000〜58000の成分を主
体とし、微量の分子量約34000の副生物を含
んでいた。 (3) 反応液の主体を構成する分子量約54000〜
58000の成分は反応目的物と未反応のUK−
の混合物であつた。 (4) 反応液を2MEで分解処理すれば、未反応
のUK−が完全に低分子化され残存する分
子量56000〜58000の成分は、目的とする分子
内架橋UK−のみになつた。 以上の分析結果を表示すれば第１表の通りで
ある。
【表】
表中の数字は各試料タンパクを100とした場
合のそれぞれの分子量に対応する成分のタンパ
ク量（％）を示す。 実施例 ２ 〔ジエチルマロンイミデートによる架橋反応〕 実施例１と同様に調製したUK−溶液0.25ml
（3.6×104単位）に対して、使用直前に同一緩衝
液に溶解したジエチルマロンイミデート溶液（濃
度＝35mg／ml）を50μ添加した。 25℃で12時間反応後、0.5Mリン酸緩衝液（PH
＝6.5）を0.25ml添加して反応を停止させた。 反応終了後のウロキナーゼ活性はフイブリン平
板法で反応前の67％であつた。 また、反応終了後の溶液を実施例１(B)と同様に
ゲル電気泳動し、クロマトスキヤナーによる蛋白
質の量を分析した結果、分子内架橋UK−の全
蛋白質に対する割合は約49％であつた。 実施例 ３ 〔ジメチルアジポイミデートによる架橋反応〕 溶解液として0.1M炭酸緩衝液（PH＝９）を使
用する外は、実施例１と同様に調製したUK−
溶液３ml（4.3×105単位）に対して、使用直前に
同一緩衝液に溶解して調製したジメチルアジポイ
ミデート溶液（濃度＝7.4mg／ml）を0.6ml添加し
た。 ８℃で12時間反応後0.5Mリン酸緩衝液（PH＝
6.5）を３ml加えて反応を停止させた。 反応液のウロキナーゼ活性はフイブリン平板法
で73％、分子内架橋UK−の全蛋白質に対する
割合は約33％であつた。 この反応液６ml（2.9×105単位）を採り、実施
例１(A)と同様にして、目的物を分離した。得られ
た分子内架橋UK−は7.1×104単位、比活性
78000単位／mg蛋白であり、2MEの添加有無にか
かわらずSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で単一バンドを示した。また、遊離アミノ基分析
の結果、この分子内架橋UK−は元のアミノ基
の約60％がジメチルアジポイミデートと反応した
物であることが確認された。 次に、本発明の分子内架橋UK−が、天然の
UK−に比較して著しく安定であることを説明
するため試験例を示す。 試験例 １ 〔還元剤に対する安定性試験〕 １％SDSを含む8M尿素液を溶解液とし、10ｍ
Ｍジチオスライトール、２％Ｌ−システイン及び
12％MEの溶液を調製した。それぞれの溶液で天
然のUK−と実施例１で得た分子内架橋UK−
を0.5mg蛋白／mlの濃度になるよう溶解し、37
℃に１時間保持した後、低分子分解の有無を前述
のゲル電気泳動法により分析した。その結果天然
UK−はこの条件で完全に低分子化したが、分
子内架橋UK−はいづれも全く分子量の変化が
認められなかつた。 試験例 ２ 〔経時的安定性（促進）試験〕 実施例１と３で得た分子内架橋UK−と天然
UK−を0.1Mリン酸緩衝液（PH＝7.0）で溶解
し、濃度0.1mg蛋白／mlの溶液を調製した。それ
ぞれの溶液を80℃の加熱状態に保つた時のウロキ
ナーゼの経時的残存活性をフイブリン平板法で測
定した。 その結果は第２表に示す通りであり、天然UK
−が１時間経過後に殆ど完全に失活したのに対
し、本発明の分子内架橋UK−は20％の活性残
存率を示した。
合のそれぞれの分子量に対応する成分のタンパ
ク量（％）を示す。 実施例 ２ 〔ジエチルマロンイミデートによる架橋反応〕 実施例１と同様に調製したUK−溶液0.25ml
（3.6×104単位）に対して、使用直前に同一緩衝
液に溶解したジエチルマロンイミデート溶液（濃
度＝35mg／ml）を50μ添加した。 25℃で12時間反応後、0.5Mリン酸緩衝液（PH
＝6.5）を0.25ml添加して反応を停止させた。 反応終了後のウロキナーゼ活性はフイブリン平
板法で反応前の67％であつた。 また、反応終了後の溶液を実施例１(B)と同様に
ゲル電気泳動し、クロマトスキヤナーによる蛋白
質の量を分析した結果、分子内架橋UK−の全
蛋白質に対する割合は約49％であつた。 実施例 ３ 〔ジメチルアジポイミデートによる架橋反応〕 溶解液として0.1M炭酸緩衝液（PH＝９）を使
用する外は、実施例１と同様に調製したUK−
溶液３ml（4.3×105単位）に対して、使用直前に
同一緩衝液に溶解して調製したジメチルアジポイ
ミデート溶液（濃度＝7.4mg／ml）を0.6ml添加し
た。 ８℃で12時間反応後0.5Mリン酸緩衝液（PH＝
6.5）を３ml加えて反応を停止させた。 反応液のウロキナーゼ活性はフイブリン平板法
で73％、分子内架橋UK−の全蛋白質に対する
割合は約33％であつた。 この反応液６ml（2.9×105単位）を採り、実施
例１(A)と同様にして、目的物を分離した。得られ
た分子内架橋UK−は7.1×104単位、比活性
78000単位／mg蛋白であり、2MEの添加有無にか
かわらずSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で単一バンドを示した。また、遊離アミノ基分析
の結果、この分子内架橋UK−は元のアミノ基
の約60％がジメチルアジポイミデートと反応した
物であることが確認された。 次に、本発明の分子内架橋UK−が、天然の
UK−に比較して著しく安定であることを説明
するため試験例を示す。 試験例 １ 〔還元剤に対する安定性試験〕 １％SDSを含む8M尿素液を溶解液とし、10ｍ
Ｍジチオスライトール、２％Ｌ−システイン及び
12％MEの溶液を調製した。それぞれの溶液で天
然のUK−と実施例１で得た分子内架橋UK−
を0.5mg蛋白／mlの濃度になるよう溶解し、37
℃に１時間保持した後、低分子分解の有無を前述
のゲル電気泳動法により分析した。その結果天然
UK−はこの条件で完全に低分子化したが、分
子内架橋UK−はいづれも全く分子量の変化が
認められなかつた。 試験例 ２ 〔経時的安定性（促進）試験〕 実施例１と３で得た分子内架橋UK−と天然
UK−を0.1Mリン酸緩衝液（PH＝7.0）で溶解
し、濃度0.1mg蛋白／mlの溶液を調製した。それ
ぞれの溶液を80℃の加熱状態に保つた時のウロキ
ナーゼの経時的残存活性をフイブリン平板法で測
定した。 その結果は第２表に示す通りであり、天然UK
−が１時間経過後に殆ど完全に失活したのに対
し、本発明の分子内架橋UK−は20％の活性残
存率を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式（） （但し、式中ｎは６以下の整数を示す） で示される二価の基が高分子ウロキナーゼ（分子
量約54000）の分子内の遊離アミノ基とアミジン
型結合して架橋を形成していることを特徴とする
分子内架橋高分子ウロキナーゼ。 ２ 一般式（） （但し、式中Ｒは低級アルキル基、ｎは６以下の
整数を示す） で示される化合物と高分子ウロキナーゼ（分子量
約54000）とを反応させることを特徴とする分子
内架橋高分子ウロキナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57003278A JPS58121792A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 分子内架橋高分子ウロキナ−ゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57003278A JPS58121792A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 分子内架橋高分子ウロキナ−ゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58121792A JPS58121792A (ja) | 1983-07-20 |
| JPH0143552B2 true JPH0143552B2 (ja) | 1989-09-21 |
Family
ID=11552954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57003278A Granted JPS58121792A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 分子内架橋高分子ウロキナ−ゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58121792A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2514954Y2 (ja) * | 1989-11-13 | 1996-10-23 | 株式会社牧野フライス製作所 | ワイヤ放電加工機 |
-
1982
- 1982-01-14 JP JP57003278A patent/JPS58121792A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58121792A (ja) | 1983-07-20 |
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