JPH0145019B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、レーザー分光学に係り、特にマイク
ロカラムクロマトグラフイー（microcolumn
chromatography）用レーザー螢光検出器（laser
fluorometric detectors）に係り、螢光液体の超
痕跡量を検出するために使用できる。

従来の技術 次の要件、すなわち高感度、低い検出限界、低
いノイズレベル、広い直線性範囲（linearity
range）を達成することが、通常、LC検出器を開
発する目標である。加えて、クロマトグラフイー
のピーク分解能（peak resolution）もまた、セ
ルの設計にある種の制限を課している。セルは限
られた容積を持つべきであり、分離された成分は
混ざつてはならず、また検出器チヤンネルは非常
に速く洗浄され得るものである。

検出器の濃度感受性（concentrational
sensitivity）は測定用セル内の物質量に比例す
る。検出器の分解能を変化しないようにするため
に、次の条件を守るべきである。

V₀１／２V₁＝S1／√ (1) 〔上式中、V₀は、セル容積と、クロマトグラフ
イーカラムの出口から測定用セルまでの検出器チ
ヤンネルの容積とを含んでいる検出された容積で
あり、V₁はクロマトグラフイーピークにおける
流出液の容積であり、ＳはカラムのID面積であ
り、１はカラム長さである。〕 一方、V₀V₁の場合、検出器感度は下がる。
なぜならば、セル内の物質量がより少なくなるか
らである。従つて、各クロマトグラフイーカラム
には選択されるべき最適の検出容量がある。

光学的に接続された数種の構成部材、すなわち
レーザー、レーザー放射（laser emission）を形
成するための装置、クロマトグラフイーカラムと
連通させるために設計されたフロースルーセル
（flow−through cell）及び螢光放射のレシーバ
ー（receiver）を有してなるマイクロカラムクロ
マトグラフイー用レーザー螢光検出器は技術上知
られている〔例えば、エル．ダブリユー．ハーシ
ユバーガー（L.W.Hershberger）、ジエー．ビ
イ．カリス（J.B.Callis）及びジー．デイ．クリ
スチヤン（G.D.Christian）、アナリテイカル ケ
ミストリイ（Analytical Chemistry）、Vol.51、
No.９、1979年８月、1444−1446頁参照〕。

この検出器のフロースルーセルは、４つの側面
のそれぞれに石英の窓を有しているチヤンバーで
ある。チヤンバーの内容積は溶出液で満たされて
おり、この溶出液はまたクロマトグラフイーカラ
ムの流路内でも使用される。チヤンバーの下方部
分は流体力学的ジエツトノズルと適合させられて
おり、試料はこのノズルを通して注入される。螢
光放射（fluorescence emission）、励起放射線
（excitation radiation）に対して垂直な方向にお
けるレシーバーの対物レンズ（objective）によ
つて集められる。

この検出器の欠点は感度が不充分なことであ
る。

これは、流出液の検出容積がクロマトグラフイ
ーピークの容積に対して実質的により少ないとい
う事実による。なぜならば、セルを通して流れる
流れの横断面がクロマトグラフイーカラムの内径
の横断面よりも実質的に小さいからである。もう
一つの寄与するフアクターは、試料の流れがこの
試料の流れの直径を10乃至20倍だけ越えている厚
さを有する溶出液の流れによつて囲まれていると
いうことにある。ノイズレベルを増す溶出液の螢
光は、有用な信号記録に対する重大な障害であ
る。

また、光学的に接続された構成部材、すなわ
ち、レーザー、レーザー放射形成装置、クロマト
グラフイーカラムとの連絡を意図するフロースル
ーセル、セル内の試料容積を調整するためのダイ
ヤフラム及び螢光放射レシーバーを有してなるマ
イクロカラムクロマトグラフイー用レーザー螢光
検出器も技術上知られている〔例えば、エツチ．
トドリキ（H.Todoriki）、エイ．ヒラカワ（A.
Hirakawa）、ケミカル アンド フアーマセウ
テイカル ブレテイーン（Chemical＆
Pharmaceutical Bulletin）、Vol.28、No.４、
1980、1337−1339頁参照〕。

この装置のフロースルーセルは、石英管であ
り、この石英管はもつと小さい直径を有しかつ試
料入口としてこれに対して垂直に接続する別の石
英管を備えている。こののフローセルの上方端に
光学繊維が差し込まれており、この繊維の出口端
にマイクロレンズが取り付けられており、これは
レーザー放射形成装置である。

マイクロレンズは、繊維の後のレーザー光線の
発散を減ずるために、２つの管を接続せしめる領
域の幾分上部に置かれている。螢光信号は、流れ
ている試料がより小さい径の管から大径管へ入る
帯域で生じる。マイクロレンズを有する繊維は、
発散レーザー光線が螢光放射を集める帯域におい
て管壁に達しないように置かれている。この帯域
は、試料入口管を備えた１つの軸上に設置された
調整可能な丸形ダイヤフラムによつて選択されう
る。この様にして、光レシーバー
（photoreceiver）は散乱レーザー光から保護され
る。

この装置は、検出器の分解能が充分に高くない
という点で不充分である。試料流れがより小径の
管からより大径の管へと向つて進むとき、クロマ
トグラフイー画分（fractions）はひどくかき乱
され、そして流れの層流性（laminarity）がくつ
がえされる。

加えて、上記２つの検出器において、螢光は平
行でないレーザー光線によつて励起された。なぜ
ならば、このレーザー光線は球面レンズにより焦
点に集められるからである。これは、次々に、
種々の屈折率を有する媒質が出会う境界上で散乱
レーザー放射線を増す。

また、上記検出器は、種々のマイクロカラムに
対する試料容積の最適な選択を考えていない。マ
イクロカラムを別のものに取り替える場合、検出
感度又は分解能で影響を受ける可能性がある。

解決すべき問題点 本発明は、試料の層流をかき乱さないようにし
ながら、螢光放射のレシーバーに対する散乱レー
ザー放射の効果を取り除きかつ検出容積をなだら
かに調整することを可能にするような光学配置を
特徴としまたそのようにするレーザー放射形成装
置及びフロースルーセルを備えたマイクロカラム
クロマトグラフイー用レーザー螢光検出器を提供
するものである。

問題点を解決するための手段 光学的に接続された構成部材、すなわちレーザ
ー、レーザー放射を形成するための装置、クロマ
トグラフイーマイクロカラムとの連絡を意図する
フロースルーセル、セル内の試料容積を調整する
ためのダイヤフラム及び螢光放射のレシーバーを
有してなるマイクロカラムクロマトグラフイー用
レーザー螢光検出器において、本発明によれば、
レーザー放射形成装置は円筒形望遠鏡
（telescope）であり、フロースルーセルは内部ス
ルーゴーイング（through−going）方形チヤン
ネルを有する直角の平行六面体（right−angle
parallelepiped）であつてかつチヤンネルの軸線
が平行レーザー光の方向に対して垂直であるよう
に置かれており、検出試料容積を調整するための
ダイヤフラムは、円筒形望遠鏡とフロースルーセ
ルとの間に、台形のベースがチヤンネルの軸線に
対して平行であるように位置せしめた直角を持つ
ている台形（rectangular trapezium）であつて
またその平面内でかつ台形のベースに対して垂直
な方向に移動するための手段を備えているマイク
ロカラムクロマトグラフイー用螢光検出器が提供
される。

本発明の上記目的及び他の目的は添付図面と共
に説明する次の記載から明らかになる。

実施例 第１図は、本発明によるクロマトグラフイーマ
イクロカラムを特徴とするマイクロカラムクロマ
トグラフイー用レーザー螢光検出器の光学配置の
概略図を示す。第２図は、本発明による、第１図
の概略図であつて検出器の等角投影図を示すがマ
イクロカラムは示されていない。

第１図及び第２図に示されているマイクロカラ
ムクロマトグラフイー用レーザー螢光検出器
（fluorometric detector）は、光学的に接続され
かつ連続的に配置された構成部材、すなわちレー
ザー１、円筒形望遠鏡２であるレーザー放射を形
成するための装置、検出試料容積（detected
sample volume）を調整するためのダイヤフラ
ム３、検出器の測定用セルであるフロースルーセ
ル４、螢光放射のレシーバー５及び遮光装置６を
備えている。レシーバー５は、その入口対物レン
ズの光学軸がレーザー光線の軸に対して垂直であ
るよう置かれている。円筒形望遠鏡２は２枚のレ
ンズ２′及び２″、すなわち負のレンズ（発散レン
ズ（negative lens））２′及び正のレンズ（収束
レンズ（positive lens））２″から構成されてい
る。フロースルーセル４は、正方形の横断面を持
つているスローゴーイング内部チヤンネル７を有
する直方体である。フロースルーセル４は、チヤ
ンネル７の軸線（longitudinal axis）が平行レ
ーザー光の方向に対して垂直であるように置かれ
る。検出試料容積を調整するためのダイヤフラム
３は、円筒形望遠鏡２とフロースルーセル４との
間に、台形のベースがチヤンネル７の軸線に平行
であるように置かれている直角を持つている台形
（rectangular trepezium）である。ダイヤフラ
ム３は、その平面内でかつ第２図において矢印Ａ
によつて示されている台形のベースに対して垂直
な方向で移動するための手段８を備えている。手
段８は、例えば、マイクロメータねじであること
ができる。

クロマトグラフイーカラム９は、金属ホルダー
１０内に拘束されているフロースルーセル４の出
口突合わせ端部においてねじ込み接続によつて固
定されている。サーメツトフイルター１１を有す
るテフロン環がフロースルーセル４とカラム９と
の間に置かれている。

本発明によれば、レーザー螢光検出器は次の様
に動作する。

分析すべき物質の分離された画分からなるクロ
マトグラフイーカラム９の流出液を、サーメツト
フイルター１１を通して、フロースルーセル４の
スルーゴーイングチヤンネル７へ供給せしめ、層
流をかき乱さないようにする。レーザー光線
（laser beam）を、円筒形望遠鏡２によつて、円
形の光線（beam）から平べつたい（flat）光線
へと変換せしめる。平べつたい光線の横断面の幅
は、試料が流れるチヤンネル７の幅に等しい。レ
ーザー光線の横断面の長さは、検出器の測定用セ
ルであるフロースルーセル４の前方に位置してい
る台形形状のダイヤフラム３によつて調整するこ
とができる。レーザー光線を、セル４及び分析さ
れる液体のカラムを通過せしめる。螢光は、この
液体カラム内で励起されかつ遮光装置６内で消光
される。螢光放射を、レーザー光線に対して垂直
な平面内にある光電子倍増管であることができる
レシーバー５の対物レンズによつて集める。

レーザー放射線の散乱は、非発光石英
（nonluminescent quartz）で造られたフロース
ルーセル４の長方形形状（rectangular shape）
及び内部スルーゴーイングチヤンネル７の正方形
形状によつて、実質的に減少される。

直角を持つている台形である調整可能なダイヤ
フラム３は、そのベースに対して垂直な側面がフ
ロースルーセル４（これにクロマトグラフイーマ
イクロカラム９が取り付けられている）の壁体に
平行でもありかつセル４の突合せ端部と同一水平
面上に位置しているように置かれている。このよ
うなダイヤフラムの位置は、試料がカラム９を離
れた直後に試料内に螢光を励起せしめるという利
点を提供する。従つて、流出液容積を最小にする
ことができる。更に、ダイヤフラム３は矢印Ａの
方向に移動せしめることができ、そしてこのよう
にして、レーザー光によつて励起された液体のカ
ラムの高さは、出力密度を変えないままにしなが
ら、なめらかに調整することができる。これによ
り、分析の感度及び分解能に寄与する各特別のク
ロマトグラフイーカラムのための最適の試料検出
容積の選択が可能になる。

マイクロカラムクロマトグラフイー用レーザー
螢光検出器の原型が本発明に従つて製造された。

正方形形状の検出器（square−shaped
detector）の測定用セル４はレーザー放射線を受
けたときにどんなルミネセンスも生じない石英で
造られた。測定用セルの寸法は４×10×20mmであ
り、内部チヤンネルは0.5×0.5mmであつた。円筒
形望遠鏡は、横断面が0.5×７mmのストライプで
あるレーザー光線を生じせしめた。ダイヤフラム
３は、出力（Power）が均一に配分されているレ
ーザー光線の精確に長方形の横断面を生じせしめ
るために、ストライプを１ないし６mmの長さに限
定した。試料検出容積を0.25μから1.5μへと
なめらかに調整することができた。総ての場合
に、検出器のアフタカラム容積（after−
columnvolume）は0.05μを越えなかつた。螢
光放出は325nｍの波長において励起された、
550nｍにおいて記録された。0.6×170mmマイクロ
カラム（Ｍ＝８・10³）を用いると、検出器の限
界感度は、アミノ酸の二ナトリウム塩のクロマト
グラフイーピークにおいて２・10^-16モルであつ
た。

発明の効果 本発明によれば、マイクロカラムクロマトグラ
フー用レーザー螢光検出器は、使用する特別のク
ロマトグラフイーマイクロカラムの特性に応じて
試料検出容積のなめらかな調整を可能にする。検
出器の感度及び分解能は、試料検出容積の最適な
選択のために高い。フロースルーセルを平行レー
ザー放射線と組合せた設計により、螢光放射のレ
シーバーに対する散乱レーザー光の効果が最小に
なる。フロースルーセルは、試料の流れが螢光放
射線（fluorescence radiation）を集める帯域に
おいて層流のままでいるように設計される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるクロマトグラフイーマ
イクロカラムを特徴とするマイクロカラムクロマ
トグラフイー用レーザー螢光検出器の光学配置の
概略図を示す。第２図は、本発明による、第１図
の概略図であつて検出器の等角投影図を示すがマ
イクロカラムは示されていない。 図面中の参照番号、１……レーザー、２……円
筒形望遠鏡、２′，２″……レンズ、３……ダイヤ
フラム、４……フロースルーセル、５……螢光放
射のレシーバー、６……遮光装置、７……スルー
チヤンネル、８……ダイヤフラム３を移動するた
めの手段、９……クロマトグラフイーマイクロカ
ラム、１０……セルホルダー、１１……フイルタ
ー。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 光学的に接続される構成部材、すなわちレー
   ザー、レーザー放射形成装置、クロマトグラフイ
   ーカラムとの連絡のために設計されたフロースル
   ーセル、フロースルーセル内の流出液の検出容積
   を調整するためのダイヤフラム及び螢光放射レシ
   ーバーを有してなるマイクロカラムクロマトグラ
   フイー用レーザー螢光検出器において、 レーザー放射形成装置が円筒形望遠鏡であり、
   フロースルーセルが、横断面が長方形である内部
   スルーチヤンネルを有する直角の平行六面体であ
   りかつ該チヤンネルの軸線が平行レーザー光の方
   向に対して垂直であるように置かれており、流出
   液の検出容積を調整するためのダイヤフラムが、
   円筒形望遠鏡とフロースルーセルとの間に、台形
   のベースがチヤンネルの軸線に対して平行である
   ように位置せしめた直角を持つている台形であつ
   てかつその平面内でベースに対して垂直な方向に
   移動するための手段を備えていることを特徴とす
   るマイクロカラムクロマトグラフイー用レーザー
   螢光検出器。