JPH0145355B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、細胞系への核酸の取込み、そのよう
な取込みを行なわせるベクター、および、そのよ
うなベクターにより形質転換された、ストレプト
マイセス及び大腸菌から選択された微生物に関す
るものである。 より明確に言うと、本発明は、特にプラスミド
pVE1の宿主株である例えば、ストレプトマイセ
ス・アベルミタイリス（Streptomyces
avermitilis）MA4990、エス・リビタント（S.
lividans）もしくは、その類以のものを含む細菌
などの微生物クローニング用ベクターとして有用
な新規プラスミドpVE1それ自体；そのゲノム；
もしくは全域または断片としての遺伝成分
（DNA）；およびその誘導体（その欠失および雑
種変形体）に関するものである。その結果、修飾
を受けた細胞は新規のものであり、細胞の複製を
通して異種核酸及び／または、その生産物を生成
する手段として、あるいはその中にある異種核酸
の存在によつて、細胞に有益な性質を与えること
によつて有用である。 プラスミドのクローニング用ベクターとしての
利用は、確立された手法である。しかし、これら
の技法の放線菌（Streptomyces）への応用は比
較的新らしい。 プラスミドベクターと放線菌とでのDNAクロ
ーニングは、最初に、S.lividansおよび、S.
coelicolorA3(2)でなされた、31Kb（キロ塩基）の
低コピー数プラスミドSCP2は、メチレンマイシ
ン耐性のクローニング〔(1)Bibb、M.J.、
Schottel、J.L.、Cohen、S.N.、1980年．“抗生物
質生産性放線菌における種間遺伝子転移のための
DNAクローニング・システム”ネイチヤー
（Nature）．248巻526−531頁〕；および栄養要求
性変異を相補するS.coelicolor遺伝子のクローニ
ング〔(2)Thompson、C.J.、Ward、J.および
Hopwood、D.、1982年“放線菌における抗生物
質耐性および栄養性遺伝子のクローニング”細菌
学雑誌（J.Bacteriol.）、151巻：668−677頁〕に
用いられた。ネオマイシン、チオストレプトン、
およびバイオマイシンに対する耐性を指示する遺
伝子は、S.coelicolorA3(2)染色体より得られた一
群の低コピー数プラスミドであるSLP1プラスミ
ド族中にクローンされている〔(3)Bibb、M.J.、
Ward、J.M.、Kieser.T.、Cohen、S.N.および
Hopwood、D.、1981年“Streptomyces
coelicolorの染色体DNA配列の切出しは、
Streptomyces lividans中で検出可能な新規なプ
ラスミド族を形成する“分子一般遺伝学（Mol.
Gen.Genet.）、184巻：230−240頁；(4)
Thompson、C.J.、Ward、J.M.、および
Hopwood、D.A.、1980年“放線菌における
DNAクローニング：抗生物質生産種からの耐性
遺伝子”、ネイチヤー（Nature）、286巻：525−
527頁；Thompson、C.J.、Ward、J.M.および
Hopwood、D.A.、1982年、前出〕。ネオマイシ
ン、チオストレプトンおよびバイオマイシン耐性
（各々、aph、tsrおよびvph）は又、S.lividans
ISP5434から得られた高コピー数、広宿主域プラ
スミドpIJ101中にもクローンされた〔(5)Kieser、
T.、Hopwccd、D.A.、Wright、Ｈ−M.および
Thompson、C.J.、1982年、pIJ101、“多コピー
広宿主域放線菌プラスミド：DNAクローニング
ベクターの機能的解析および開発”分子一般遺伝
学（Mol.Gen.Genet.）185巻：223−238頁〕。こ
のプラスミドはS.coelicolor ATTCC10147から
も単離されている〔(6)Pernodet、J.および
Guerineau.1981年、“放線菌プラスミドの単離と
物理的特性”分子一般遺伝学（Mol.Gen.Genet.、
182巻：53−59頁〕。SCP2、SLP1およびpIJ101は
全て自己伝達可能なプラスミドである。これらプ
ラスミドの１つを含む株をプラスミドを含まない
株の上に塗布すると、ポツク（pock.アバタ）と
して知られる小さな生育阻止域が、プラスミド含
有株の周辺につくられる。プラスミドDNAは、
プロトプラストのポリエチレングリコール
（PEG）媒介形筒転換により、放線菌中に導入さ
れる〔(7)Okanishi、M.、Suzuki、K.、および
Umezawa、H.、1974年、“放線菌プロトプラス
トの形成と回復：培養条件および形態学的研究、”
一般微生物学雑誌（J.Gen.Microbiol.）80巻：
389−400頁；(8)Bibb、M.J.、ward、J.M.および
Hopwood、D.A.、1978年、“放線菌中への高頻
度でのプラスミドDNA形質転換、”ネイチヤー
（Nature）、274巻：398−400頁〕。 バクテリオフアージも放線菌へのクローニング
ベクターとして用いられている〔(9)Isogai、T.、
Takahashi、H.、およびSaito、H.、1981年、
“放線菌におけるDNAクローニングベクターとし
ての放線菌フアージR4”、一般応用微生物学雑誌
（J.Gen.Appl.Microbiol.）27巻：373−379頁；(10)
Suarez、J.E.およびChater、K.F.、1980年、“放
線菌におけるDNAクローニング：放線菌フアー
ジ中に挿入されたpBR322からなる２機能レプリ
コン”、ネイチヤー（Nature）、286巻：527−529
頁〕。放線菌クローニングにおける方法および最
近の進歩についての総説は、(11)Chater、K.F.、
Hopwood、D.A.、Kieser T.およびThompson、
C.J.、1982年、“放線菌における遺伝子クローニ
ング、”微生物・免疫学における最近の話題
（Curr.Top.Microbiol.Immunol.）96巻：69−95
頁、中に見出される。 大腸菌（E.coli）および放線菌中で機能する雑
種レプリコンは、大腸菌プラスミドである
pBR322を放線菌フアージφC31（Suarez、J.E.お
よびChater、K.F.、1980年、前出）、SLP1の誘
導体（Chater、K.F.、Hopwood、D.A.、
Kieser、T.およびThompson、C.J.1982年、前
出）およびStreptomyces espinosusプラスミド
pUC6〔(12)ヨーロツパ特許出願第0035914A2号；第
81301009.7号；1981年９月16日公開〕への連結お
よびpACYC177あるいはpACYC184を、SLP1の
誘導体に結合〔（13）Schottel、J.L.、Bibb、H.
J.およびCohen、S.N.、1981年、“Streptomyces
lividansにおける大腸菌から得られた抗生物質耐
性遺伝子のクローニングおよび発現”細菌学雑誌
（J.Bacteriol.）146巻：360−308頁〕することに
よつても構築されている。 多種類のプラスミドが多くの異なる放線菌中に
観察されており、クローニング用のベクターとし
て開発される可能性を有する。例えば、以下を参
照： (14) Chung.S.−T.、1982年“放線菌フアージ
φSF1のプロフアージであるStreptomyces
fradiaeプラスミドの単離とその特性”遺伝子
（Gene）、17巻：239−246頁 (15) Manis、J.J.およびHighlander、S.K.1982
年、“Streptomyces espinosusからの小型多コ
ピープラスミドの部分特性および高コピー数欠
失変異株の誘導”遺伝子（Gene）、18巻：13−
20頁 (16) kirby.R.、Lewis、E.およびBotha、C.、
1982年、“放線菌種における種々の方法を用い
た閉環状（CCC）DNAの探索”、FEMS微生物
学通信（FEMS Microbiol.Let.）、13巻：79−
82頁 (17) Omura.S.、Ikeda、H.およびTanaka、
H.、1981年、“マクロライド抗生物質生産放線
菌からのプラスミドの抽出と特性”抗生物質雑
誌（J.Antibiotics）34巻：478−481頁 (18) Yi−Guang、W.、Davies、J.および
Hutchinson、C.R.、1982年、“エリスロマイシ
ン生産微生物Streptomyces erythreus NRRL
2338中のプラスミドDNA”抗生物質雑誌（J.
Antibiotics）35巻：335−342頁 (19) Toyama、H.、Hayashi、E.Nojiri、C.、
Katsumata、K.、Miyata、A.および
Yamada、Y.、1982年、“放線菌からの小型プ
ラスミドの単離と特性”抗生物質雑誌（J.
Antibiotics）35巻：369−373頁 (20) Okanishi、M.、Manome、T.および
Umezawa、H.、1980年、“放線菌におけるプ
ラスミドDNAの単離と特性、”抗生物質雑誌
（J.Antibiotics）83巻：88−91頁 (21) Hayakawa、T.、Otake、N.、Yonehara、
H.、Tanaka、T.およびSakaguchi、K.、1979
年、“放線菌からのプラスミドの単離および特
性、”抗生物質雑誌（J.Antibiotics）32巻：
1348−1350頁 (22) イギリス特許出願G.B.第2045253A号；第
8007080号；1980年10月29日公開（pUC1） (23) イギリス特許出願G.B.第2045252A号；第
8007079号；1980年10月29日公開（pUC2） (24) イギリス特許出願G.B.第2044773A号；第
8007077号；1980年10月22日公開（pUC3） (25) イギリス特許出願G.B.第2043652A号；第
8007158号；1980年10月８日公開（pUC6） (26) イギリス特許出願G.B.第2046272A号；第
8011000号；1980年11月12日公開（pUC7） (27) イギリス特許出願G.B.第2045251A号；第
8007078号；1980年10月22日公開（pUC8） (28) イギリス特許出願G.B.第2045254A号；第
8007081号；1980年10月29日公開（pUC9） (29) ヨーロツパ特許出願第0038156A2号；第
81301482.6号；1981年10月21日公開（pUC10） (30) ヨーロツパ特許出願第0035914A2号；第
81301009.7号；1981年９月16日公開（pUC1012
およびpUC1013） (31) ヨーロツパ特許出願第0020251A2号；第
80400722.7号；1980年12月10日公開（Ｂ型肝炎
プラスミドベクター） (32) イギリス特許出願G.B.第2031434A号；第
7928156号；1980年４月23日公開（Ｂ型肝炎抗
原を作るためのキメラ蛋白） プラスミドpVE1は、ある特殊環境下では、他
のクローニング用ベクターを越える特異な利点を
もたらす物理的および遺伝的性質の独特な組合せ
を備えたプラスミドである。その特異な制限地図
から、pVE1のみに適するような制限酵素もしく
は酵素の組合せの使用が可能である。放線菌にお
けるクローニングに多コピーおよび１コピープラ
スミドが用いられている。ある種の実験において
は、例えば、クローンされた遺伝子産物量を最大
にするために、細胞当りにクローンされた遺伝子
が多コピー存在することが望まれる。多コピー数
クローニング用ベクターは、この目標に至る一つ
の方法である。pVE1は、そのような多コピー数
プラスミドである。pVE1は、自己伝達性プラス
ミドでもある。この性質は、宿主にプラスミドを
移入する際のもう一つの方法として有利である。
例えば、ある放線菌宿主が、再生するプロトプラ
ストを作製することが困難なために形質転換され
得ない場合に、先ずpVE1誘導体をS.lividansの
プロトプラストに形質転換し、次にこの株を興味
の対象である放線菌宿主と接合させることが可能
である。プラスミドは放線菌種間において、狭い
あるいは非常に広い異なる宿主域を有する。
pVE1は、S.venezuelae、S.lividansおよびS.
avermitilis中で保持され、他の放線菌種に対し
ても可能性のあるクローニング用ベクターである
ことができる。 このプラスミド核酸は、長さ11.0キロ塩基対の
環状２本鎖DNA分子である。図１はこのプラス
ミドの制限エンドヌクレ−アーゼ開裂部位の位置
を示す地図である。この位置は、Hind 制限
酵素による開裂によりつくられたプラスミド
DNAの末端からの、その部位の距離をキロ塩基
対で与えてある。地図は、アガロースとポリアク
リルアミドのゲル電気泳動および0.1キロ塩基対
およびそれ以上の断片の臭化エチジウム染色で決
定された酵素Hind 、Eco Ｒ、Eco Ｒ、
Bam HI、Pvu、Bcl、PstI、Sph Ｉ、Pvu
、Stu 、Not およびNru につい
ての全ての（開裂）部位を示している。以下の酵
素は、このDNAを開裂しなかつた：Hap、
Kpn、Nco、Nde、PaeR7、およびXho
、ある種のプラスミド欠失変種および雑種フア
ージ誘導体は、同様に以下に述べられている。プ
ラスミドpVE1は、以下により詳細に述べられて
いる；そこでは単離、保持、特に大きさと制限地
図で明らかにされたプラスミドの増殖に関連する
はつきりした情報が記されている。さらに、以下
に述べるように、pVE1および代表的なpVE1誘
導体を含む微生物は、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブタペスト条約により認め
られた保存菌株中に寄託されている（表参照）。 ここに開示されるように、プラスミドpVE1お
よびその組換え誘導体もしくは、その部分はなか
んずく組換えDNA方法におけるクローニングビ
ヒクルとして有用性を有する。 pVE1は、放線菌におけるクローニング用ベク
ターとして種々の方法で用い得る独特のプラスミ
ドである。このプラスミドのいくつかの性質が、
これを有用なクローニングビヒクルとしている。
一つの重要な特徴は、高コピー数で、かつ小型の
プラスミドであることである。この性質により、
多量のプラスミドDNAの単離が実行可能であり
簡易となる。プラスミドが高コピー数であること
は、その中にクローンされたどのような遺伝子も
また細胞当り多コピー存在することを意味する。
このことは、クローンされた遺伝子産物あるい
は、その遺伝子産物によりつくられる代謝産物を
多量に生産する手段を与える。pVE1のもう一つ
の有利な特徴は、pVE28中における7Kb欠失によ
つて明らかとなつたプラスミド保持に必須でない
と思われるプラスミドの大領域があるということ
である。このことは、異種DNAがクローンされ
得る種々の制限部位をもつた、恐らくは大きな広
がりを有するDNAを与えることになる。このよ
うにして、この領域内のBam HI、EcoR、
BglおよびBcl 部位がクローニングに用い
られた。 ここでの例で説明されているクローニングに用
いられた方法は、tsr遺伝子のpVE1のいくつかの
部位への直接クローニングと同時に相互取込みプ
ラスミドpVE3およびpVE4の構築をも含んでい
る。これらの方法およびそれに加えた有用なクロ
ーニング技術は、前に引用した手引き（Davis.R.
W.、Botstein、D.およびRoth、J.R.、1980年、
前出；Maniatis、T.、Fritsch、E.F.および
Sambrook、J.、1982年、前出）に豊富に述べら
れている。 クローニング手法は、種々の方法に改変するこ
とが出来る。先ず、ここに述べられたpVE1から
構築されたどの誘導体を用いることも可能であ
る。例えば、ネオマイシンに対する耐性のような
他の選択マーカーを挿入することにより、pVE1
レプリコンを基礎とする新たなベクターを構築す
ることも可能である（Thompson、C.J.、Ward、
J.M.およびHopwood、D.A.、1980年、前出）。
追加の有用なベクターは、試験管内でつくられた
欠失によつても構築されることができる。pVE1
を制限酵素で消化し、その断片もしくは断片の小
集団を結合し、そして放線菌中に形質転換するこ
とにより、短かくなつたプラスミドを得ることも
できよう。 異種（foreign）DNAは、種々の方法でpVE1
中に挿入し得る。両DNA分子は、同じ制限酵素
により切断され、相同の末端をもつこれらの分子
は相互に結合され得る。ベクターおよび挿入
DNAを効率のよいペア形成と、結合を可能とす
る同一の一本鎖伸長部分を生成するような異なる
酵素で消化することも出来る。ベクターおよび挿
入DNAを、全く異なる制限酵素で開裂し、開裂
DNAを、S1ヌクレアーゼまたはDNAポリメラ
ーゼで処理することにより各々一本鎖突出末端を
除去するか、そのような末端の相補鎖を合成して
もよい。この方法で二本鎖末端（bluntended）
DNA分子ができ、相互に結合し得る。もう一つ
の利用し得る修飾法は、末端デオキシヌクレオチ
ド転移酵素系により、直鎖のベクターおよび異種
DNAの3′末端に短かいホモポリマーの伸長を付
加するものである。相補のホモポリマー尾部をも
つベクターおよび挿入DNAをアニール
（anneal）した後、前以つた結合（ligate）する
ことなしに細菌宿主中に形質転換する。 pVE1およびその誘導体は、放線菌の第一次代
謝産物遺伝子、例えば、アミノ酸、ビタミン、プ
リンおよびピリミジンの生合成に関与する遺伝子
をクローンするのに用いることができる。そのよ
うな組換えプラスミドを検出するのに結合した
DNAを、個々の栄養要求株のプロトプラストに
形質転換する。形質転換体は、最初にベクターに
よつて与えられる表現型、例えばThior（チオス
トレプトン耐性）によつて選択される。これらプ
ラスミド含有株は、栄養要求性によつて要求され
る栄養素の無いところでの生育を試験される。組
換え体プラスミド中の野生型相遺伝子を獲得した
株のみが、生育可能である。 pVE1は、抗生物質の生産に関与する遺伝子の
ような二次代謝の遺伝子をクローンするのに利用
できる。組換えプラスミドは、代謝産物の生産が
遮断された変異株中に形質転換される。形質転換
株は、プラスミド表現型により選択される。次
に、これらの形質転換株につき、二次代謝産物の
生産を遮断する変異を相補するプラスミドを有す
るものを同定するための試験をする。変異および
二次代謝の遺伝子は、通常生育に影響しないの
で、この試験は幾分より複雑であり、関与する特
異な代謝産物により左右される。生産物が抗生物
質の場合は、形質転換集落に抗生物質感受性菌を
重層する。クローンされた相補遺伝子を含む集落
は抗生物質を生産し、この感受性試験菌の生育阻
止域に囲まれるであろう。その生産物に対する簡
単な生物学的試験が存在しない際は、物理的ある
いは化学的な検出法の適用が可能である。例え
ば、S.avermitilisによる駆虫性化合物アバメクチ
ン群（avermectines）の生産（Burg、R.W.ほ
か、1979年、抗微生物剤と化学療法
（Antimicrobial Agents and Chemothererapy）
15巻：361−367頁）は、通常高圧液体クロマトグ
ラフイーにより試験されている。 クローンされた遺伝子を含む組換えプラスミド
には、多くの実験的な用途がある。精製遺伝子の
このような豊富な供給源によつて、遺伝子の制御
領域および構造遺伝子のコード領域を同定するた
めの詳細な遺伝学的ならびに物理的解析を行なう
ことが可能である。遺伝子あるいはその部分の
DNA配列が決定され得る。興味の対象である遺
伝子が、大腸菌および放線菌の両方で複製する
pVE3あるいはpVE4のような二機能レプリコン
であるベクター中にクローンされるなら、多くの
付加的な実験も可能である。大腸菌の徹底的な遺
伝的な特性付けのおかげで、pVE3およびpVE4
のようなベクターでは、放線菌中では未だ可能で
ないような種々の生体内遺伝的操作を大腸菌にお
いて行なうことが可能となる。 クローンされた遺伝子を含むプラスミドは、そ
の二次代謝産物の生合成経路中の遺伝子を、高コ
ピー数にした際の効果を検討する目的で、野生型
宿主生物中に再移入することもできる。例えば、
経路中の律速段階がクローンされている場合は、、
この遺伝子を、細胞当り多数コピー供給すれば、
その代謝産物の収量が大きく増大するかも知れな
い。特定の代謝経路のいくつか、あるいは全ての
遺伝子がクローンされている場合は、試験管内
で、完全な経路を含む単一プラスミドを構成する
ことが可能かも知れない。このことは、内包され
る全段階の遺伝子量を増やすことになり、恐らく
は、それによつて、その株の生産能を高めるであ
ろう。 クローンされた遺伝子は、その発現程度を増大
させるために、試験管内で種々の方法で操作され
得る。そのDNAの試験管内変異誘起は、その遺
伝子の発現に対し、正および負の両方の効果をも
たらすと思われる。高効率プロモーターのような
制御配列を、クローンされた遺伝子の隣に取込ま
せることにより、その発現程度を増大し得る。全
ての変異による効果は、変換したクローン遺伝子
を、宿主放線菌中に再移入することにより監察さ
れる。 pVE1レプリコンを、異種蛋白の生産をさせる
ために、非放線菌源からのDNAをクローンする
のに用いることができる。この型の操作のために
は、その異種遺伝子を、既に放線菌の制御配列の
支配下で転写され、翻訳されているベクターの領
域に挿入することが必要である。例えば、S.
fradiaeからpIJ2にクローンされた、ネオマイシ
ン耐性のためのaph遺伝子を用いることが可能で
ある（Thampson、A.J.、Ward、J.N.および
Hopwood、D.A.、1980年、前出）。この遺伝子
は高水準で転写ならびに翻訳される（J.Davis、
1982年６月、第４回工業微生物の遺伝学に関する
国際シンポジウムで提示）。異種遺伝子がaph中
に挿入されるとaph蛋白と異種蛋白間の融合蛋白
を高水準でつくることが可能となろう。 プラスミド宿主Streptomyces avermitilisは、
非常に強力な駆虫活性を示すアバメクチンと呼ば
れる化学的に関連した物質複合体を生産する
（R.J.Burgほか、15、抗微生物剤および化学療法
（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）
361−367頁（1979年）参照）。プラスミドは、こ
れら遺伝子中の変異に対する遺伝的相補によつ
て、これら重要な化合物の合成および合成の制御
に関与している遺伝子および遺伝子産物の同定、
単離および解析に用い得る（例えば、例1.G節参
照）。 プラスミドpVE1のある種の雑種誘導体は、他
の方法に有用である。構成と性質が、例1.D節に
述べてあるこれら雑種群は、pVE1ベクター誘導
体が、大腸菌中でプラスミドとして複製できるよ
うにする。これらプラスミド−プラスミドベクタ
ー雑種は、形質転換により種間での転移が可能で
ある。この性質により、大腸菌のために開発され
た遺伝技法を用い得るようになるので非常に有用
である。例えば、放線菌種からの遺伝子が、大腸
菌の変異を相補し得ることが見出されるかも知れ
ない。例えば、トランスポゾン変異法により大腸
菌中で、放線菌遺伝子中に変異を導入することも
できるようにあるいは、ナンセンスサプレツサー
によりサプレスされ得るような変異（翻訳停止コ
ドン）が単離されるかも知れない。後者の変異遺
伝子は、放線菌中に逆戻しされ、放線菌中で翻訳
停止コドンをサプレスし得るような変異を単離す
るのに用いられる。このようなサプレツサー変異
は、このような生物学的研究に非常に有用であ
る。
な取込みを行なわせるベクター、および、そのよ
うなベクターにより形質転換された、ストレプト
マイセス及び大腸菌から選択された微生物に関す
るものである。 より明確に言うと、本発明は、特にプラスミド
pVE1の宿主株である例えば、ストレプトマイセ
ス・アベルミタイリス（Streptomyces
avermitilis）MA4990、エス・リビタント（S.
lividans）もしくは、その類以のものを含む細菌
などの微生物クローニング用ベクターとして有用
な新規プラスミドpVE1それ自体；そのゲノム；
もしくは全域または断片としての遺伝成分
（DNA）；およびその誘導体（その欠失および雑
種変形体）に関するものである。その結果、修飾
を受けた細胞は新規のものであり、細胞の複製を
通して異種核酸及び／または、その生産物を生成
する手段として、あるいはその中にある異種核酸
の存在によつて、細胞に有益な性質を与えること
によつて有用である。 プラスミドのクローニング用ベクターとしての
利用は、確立された手法である。しかし、これら
の技法の放線菌（Streptomyces）への応用は比
較的新らしい。 プラスミドベクターと放線菌とでのDNAクロ
ーニングは、最初に、S.lividansおよび、S.
coelicolorA3(2)でなされた、31Kb（キロ塩基）の
低コピー数プラスミドSCP2は、メチレンマイシ
ン耐性のクローニング〔(1)Bibb、M.J.、
Schottel、J.L.、Cohen、S.N.、1980年．“抗生物
質生産性放線菌における種間遺伝子転移のための
DNAクローニング・システム”ネイチヤー
（Nature）．248巻526−531頁〕；および栄養要求
性変異を相補するS.coelicolor遺伝子のクローニ
ング〔(2)Thompson、C.J.、Ward、J.および
Hopwood、D.、1982年“放線菌における抗生物
質耐性および栄養性遺伝子のクローニング”細菌
学雑誌（J.Bacteriol.）、151巻：668−677頁〕に
用いられた。ネオマイシン、チオストレプトン、
およびバイオマイシンに対する耐性を指示する遺
伝子は、S.coelicolorA3(2)染色体より得られた一
群の低コピー数プラスミドであるSLP1プラスミ
ド族中にクローンされている〔(3)Bibb、M.J.、
Ward、J.M.、Kieser.T.、Cohen、S.N.および
Hopwood、D.、1981年“Streptomyces
coelicolorの染色体DNA配列の切出しは、
Streptomyces lividans中で検出可能な新規なプ
ラスミド族を形成する“分子一般遺伝学（Mol.
Gen.Genet.）、184巻：230−240頁；(4)
Thompson、C.J.、Ward、J.M.、および
Hopwood、D.A.、1980年“放線菌における
DNAクローニング：抗生物質生産種からの耐性
遺伝子”、ネイチヤー（Nature）、286巻：525−
527頁；Thompson、C.J.、Ward、J.M.および
Hopwood、D.A.、1982年、前出〕。ネオマイシ
ン、チオストレプトンおよびバイオマイシン耐性
（各々、aph、tsrおよびvph）は又、S.lividans
ISP5434から得られた高コピー数、広宿主域プラ
スミドpIJ101中にもクローンされた〔(5)Kieser、
T.、Hopwccd、D.A.、Wright、Ｈ−M.および
Thompson、C.J.、1982年、pIJ101、“多コピー
広宿主域放線菌プラスミド：DNAクローニング
ベクターの機能的解析および開発”分子一般遺伝
学（Mol.Gen.Genet.）185巻：223−238頁〕。こ
のプラスミドはS.coelicolor ATTCC10147から
も単離されている〔(6)Pernodet、J.および
Guerineau.1981年、“放線菌プラスミドの単離と
物理的特性”分子一般遺伝学（Mol.Gen.Genet.、
182巻：53−59頁〕。SCP2、SLP1およびpIJ101は
全て自己伝達可能なプラスミドである。これらプ
ラスミドの１つを含む株をプラスミドを含まない
株の上に塗布すると、ポツク（pock.アバタ）と
して知られる小さな生育阻止域が、プラスミド含
有株の周辺につくられる。プラスミドDNAは、
プロトプラストのポリエチレングリコール
（PEG）媒介形筒転換により、放線菌中に導入さ
れる〔(7)Okanishi、M.、Suzuki、K.、および
Umezawa、H.、1974年、“放線菌プロトプラス
トの形成と回復：培養条件および形態学的研究、”
一般微生物学雑誌（J.Gen.Microbiol.）80巻：
389−400頁；(8)Bibb、M.J.、ward、J.M.および
Hopwood、D.A.、1978年、“放線菌中への高頻
度でのプラスミドDNA形質転換、”ネイチヤー
（Nature）、274巻：398−400頁〕。 バクテリオフアージも放線菌へのクローニング
ベクターとして用いられている〔(9)Isogai、T.、
Takahashi、H.、およびSaito、H.、1981年、
“放線菌におけるDNAクローニングベクターとし
ての放線菌フアージR4”、一般応用微生物学雑誌
（J.Gen.Appl.Microbiol.）27巻：373−379頁；(10)
Suarez、J.E.およびChater、K.F.、1980年、“放
線菌におけるDNAクローニング：放線菌フアー
ジ中に挿入されたpBR322からなる２機能レプリ
コン”、ネイチヤー（Nature）、286巻：527−529
頁〕。放線菌クローニングにおける方法および最
近の進歩についての総説は、(11)Chater、K.F.、
Hopwood、D.A.、Kieser T.およびThompson、
C.J.、1982年、“放線菌における遺伝子クローニ
ング、”微生物・免疫学における最近の話題
（Curr.Top.Microbiol.Immunol.）96巻：69−95
頁、中に見出される。 大腸菌（E.coli）および放線菌中で機能する雑
種レプリコンは、大腸菌プラスミドである
pBR322を放線菌フアージφC31（Suarez、J.E.お
よびChater、K.F.、1980年、前出）、SLP1の誘
導体（Chater、K.F.、Hopwood、D.A.、
Kieser、T.およびThompson、C.J.1982年、前
出）およびStreptomyces espinosusプラスミド
pUC6〔(12)ヨーロツパ特許出願第0035914A2号；第
81301009.7号；1981年９月16日公開〕への連結お
よびpACYC177あるいはpACYC184を、SLP1の
誘導体に結合〔（13）Schottel、J.L.、Bibb、H.
J.およびCohen、S.N.、1981年、“Streptomyces
lividansにおける大腸菌から得られた抗生物質耐
性遺伝子のクローニングおよび発現”細菌学雑誌
（J.Bacteriol.）146巻：360−308頁〕することに
よつても構築されている。 多種類のプラスミドが多くの異なる放線菌中に
観察されており、クローニング用のベクターとし
て開発される可能性を有する。例えば、以下を参
照： (14) Chung.S.−T.、1982年“放線菌フアージ
φSF1のプロフアージであるStreptomyces
fradiaeプラスミドの単離とその特性”遺伝子
（Gene）、17巻：239−246頁 (15) Manis、J.J.およびHighlander、S.K.1982
年、“Streptomyces espinosusからの小型多コ
ピープラスミドの部分特性および高コピー数欠
失変異株の誘導”遺伝子（Gene）、18巻：13−
20頁 (16) kirby.R.、Lewis、E.およびBotha、C.、
1982年、“放線菌種における種々の方法を用い
た閉環状（CCC）DNAの探索”、FEMS微生物
学通信（FEMS Microbiol.Let.）、13巻：79−
82頁 (17) Omura.S.、Ikeda、H.およびTanaka、
H.、1981年、“マクロライド抗生物質生産放線
菌からのプラスミドの抽出と特性”抗生物質雑
誌（J.Antibiotics）34巻：478−481頁 (18) Yi−Guang、W.、Davies、J.および
Hutchinson、C.R.、1982年、“エリスロマイシ
ン生産微生物Streptomyces erythreus NRRL
2338中のプラスミドDNA”抗生物質雑誌（J.
Antibiotics）35巻：335−342頁 (19) Toyama、H.、Hayashi、E.Nojiri、C.、
Katsumata、K.、Miyata、A.および
Yamada、Y.、1982年、“放線菌からの小型プ
ラスミドの単離と特性”抗生物質雑誌（J.
Antibiotics）35巻：369−373頁 (20) Okanishi、M.、Manome、T.および
Umezawa、H.、1980年、“放線菌におけるプ
ラスミドDNAの単離と特性、”抗生物質雑誌
（J.Antibiotics）83巻：88−91頁 (21) Hayakawa、T.、Otake、N.、Yonehara、
H.、Tanaka、T.およびSakaguchi、K.、1979
年、“放線菌からのプラスミドの単離および特
性、”抗生物質雑誌（J.Antibiotics）32巻：
1348−1350頁 (22) イギリス特許出願G.B.第2045253A号；第
8007080号；1980年10月29日公開（pUC1） (23) イギリス特許出願G.B.第2045252A号；第
8007079号；1980年10月29日公開（pUC2） (24) イギリス特許出願G.B.第2044773A号；第
8007077号；1980年10月22日公開（pUC3） (25) イギリス特許出願G.B.第2043652A号；第
8007158号；1980年10月８日公開（pUC6） (26) イギリス特許出願G.B.第2046272A号；第
8011000号；1980年11月12日公開（pUC7） (27) イギリス特許出願G.B.第2045251A号；第
8007078号；1980年10月22日公開（pUC8） (28) イギリス特許出願G.B.第2045254A号；第
8007081号；1980年10月29日公開（pUC9） (29) ヨーロツパ特許出願第0038156A2号；第
81301482.6号；1981年10月21日公開（pUC10） (30) ヨーロツパ特許出願第0035914A2号；第
81301009.7号；1981年９月16日公開（pUC1012
およびpUC1013） (31) ヨーロツパ特許出願第0020251A2号；第
80400722.7号；1980年12月10日公開（Ｂ型肝炎
プラスミドベクター） (32) イギリス特許出願G.B.第2031434A号；第
7928156号；1980年４月23日公開（Ｂ型肝炎抗
原を作るためのキメラ蛋白） プラスミドpVE1は、ある特殊環境下では、他
のクローニング用ベクターを越える特異な利点を
もたらす物理的および遺伝的性質の独特な組合せ
を備えたプラスミドである。その特異な制限地図
から、pVE1のみに適するような制限酵素もしく
は酵素の組合せの使用が可能である。放線菌にお
けるクローニングに多コピーおよび１コピープラ
スミドが用いられている。ある種の実験において
は、例えば、クローンされた遺伝子産物量を最大
にするために、細胞当りにクローンされた遺伝子
が多コピー存在することが望まれる。多コピー数
クローニング用ベクターは、この目標に至る一つ
の方法である。pVE1は、そのような多コピー数
プラスミドである。pVE1は、自己伝達性プラス
ミドでもある。この性質は、宿主にプラスミドを
移入する際のもう一つの方法として有利である。
例えば、ある放線菌宿主が、再生するプロトプラ
ストを作製することが困難なために形質転換され
得ない場合に、先ずpVE1誘導体をS.lividansの
プロトプラストに形質転換し、次にこの株を興味
の対象である放線菌宿主と接合させることが可能
である。プラスミドは放線菌種間において、狭い
あるいは非常に広い異なる宿主域を有する。
pVE1は、S.venezuelae、S.lividansおよびS.
avermitilis中で保持され、他の放線菌種に対し
ても可能性のあるクローニング用ベクターである
ことができる。 このプラスミド核酸は、長さ11.0キロ塩基対の
環状２本鎖DNA分子である。図１はこのプラス
ミドの制限エンドヌクレ−アーゼ開裂部位の位置
を示す地図である。この位置は、Hind 制限
酵素による開裂によりつくられたプラスミド
DNAの末端からの、その部位の距離をキロ塩基
対で与えてある。地図は、アガロースとポリアク
リルアミドのゲル電気泳動および0.1キロ塩基対
およびそれ以上の断片の臭化エチジウム染色で決
定された酵素Hind 、Eco Ｒ、Eco Ｒ、
Bam HI、Pvu、Bcl、PstI、Sph Ｉ、Pvu
、Stu 、Not およびNru につい
ての全ての（開裂）部位を示している。以下の酵
素は、このDNAを開裂しなかつた：Hap、
Kpn、Nco、Nde、PaeR7、およびXho
、ある種のプラスミド欠失変種および雑種フア
ージ誘導体は、同様に以下に述べられている。プ
ラスミドpVE1は、以下により詳細に述べられて
いる；そこでは単離、保持、特に大きさと制限地
図で明らかにされたプラスミドの増殖に関連する
はつきりした情報が記されている。さらに、以下
に述べるように、pVE1および代表的なpVE1誘
導体を含む微生物は、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブタペスト条約により認め
られた保存菌株中に寄託されている（表参照）。 ここに開示されるように、プラスミドpVE1お
よびその組換え誘導体もしくは、その部分はなか
んずく組換えDNA方法におけるクローニングビ
ヒクルとして有用性を有する。 pVE1は、放線菌におけるクローニング用ベク
ターとして種々の方法で用い得る独特のプラスミ
ドである。このプラスミドのいくつかの性質が、
これを有用なクローニングビヒクルとしている。
一つの重要な特徴は、高コピー数で、かつ小型の
プラスミドであることである。この性質により、
多量のプラスミドDNAの単離が実行可能であり
簡易となる。プラスミドが高コピー数であること
は、その中にクローンされたどのような遺伝子も
また細胞当り多コピー存在することを意味する。
このことは、クローンされた遺伝子産物あるい
は、その遺伝子産物によりつくられる代謝産物を
多量に生産する手段を与える。pVE1のもう一つ
の有利な特徴は、pVE28中における7Kb欠失によ
つて明らかとなつたプラスミド保持に必須でない
と思われるプラスミドの大領域があるということ
である。このことは、異種DNAがクローンされ
得る種々の制限部位をもつた、恐らくは大きな広
がりを有するDNAを与えることになる。このよ
うにして、この領域内のBam HI、EcoR、
BglおよびBcl 部位がクローニングに用い
られた。 ここでの例で説明されているクローニングに用
いられた方法は、tsr遺伝子のpVE1のいくつかの
部位への直接クローニングと同時に相互取込みプ
ラスミドpVE3およびpVE4の構築をも含んでい
る。これらの方法およびそれに加えた有用なクロ
ーニング技術は、前に引用した手引き（Davis.R.
W.、Botstein、D.およびRoth、J.R.、1980年、
前出；Maniatis、T.、Fritsch、E.F.および
Sambrook、J.、1982年、前出）に豊富に述べら
れている。 クローニング手法は、種々の方法に改変するこ
とが出来る。先ず、ここに述べられたpVE1から
構築されたどの誘導体を用いることも可能であ
る。例えば、ネオマイシンに対する耐性のような
他の選択マーカーを挿入することにより、pVE1
レプリコンを基礎とする新たなベクターを構築す
ることも可能である（Thompson、C.J.、Ward、
J.M.およびHopwood、D.A.、1980年、前出）。
追加の有用なベクターは、試験管内でつくられた
欠失によつても構築されることができる。pVE1
を制限酵素で消化し、その断片もしくは断片の小
集団を結合し、そして放線菌中に形質転換するこ
とにより、短かくなつたプラスミドを得ることも
できよう。 異種（foreign）DNAは、種々の方法でpVE1
中に挿入し得る。両DNA分子は、同じ制限酵素
により切断され、相同の末端をもつこれらの分子
は相互に結合され得る。ベクターおよび挿入
DNAを効率のよいペア形成と、結合を可能とす
る同一の一本鎖伸長部分を生成するような異なる
酵素で消化することも出来る。ベクターおよび挿
入DNAを、全く異なる制限酵素で開裂し、開裂
DNAを、S1ヌクレアーゼまたはDNAポリメラ
ーゼで処理することにより各々一本鎖突出末端を
除去するか、そのような末端の相補鎖を合成して
もよい。この方法で二本鎖末端（bluntended）
DNA分子ができ、相互に結合し得る。もう一つ
の利用し得る修飾法は、末端デオキシヌクレオチ
ド転移酵素系により、直鎖のベクターおよび異種
DNAの3′末端に短かいホモポリマーの伸長を付
加するものである。相補のホモポリマー尾部をも
つベクターおよび挿入DNAをアニール
（anneal）した後、前以つた結合（ligate）する
ことなしに細菌宿主中に形質転換する。 pVE1およびその誘導体は、放線菌の第一次代
謝産物遺伝子、例えば、アミノ酸、ビタミン、プ
リンおよびピリミジンの生合成に関与する遺伝子
をクローンするのに用いることができる。そのよ
うな組換えプラスミドを検出するのに結合した
DNAを、個々の栄養要求株のプロトプラストに
形質転換する。形質転換体は、最初にベクターに
よつて与えられる表現型、例えばThior（チオス
トレプトン耐性）によつて選択される。これらプ
ラスミド含有株は、栄養要求性によつて要求され
る栄養素の無いところでの生育を試験される。組
換え体プラスミド中の野生型相遺伝子を獲得した
株のみが、生育可能である。 pVE1は、抗生物質の生産に関与する遺伝子の
ような二次代謝の遺伝子をクローンするのに利用
できる。組換えプラスミドは、代謝産物の生産が
遮断された変異株中に形質転換される。形質転換
株は、プラスミド表現型により選択される。次
に、これらの形質転換株につき、二次代謝産物の
生産を遮断する変異を相補するプラスミドを有す
るものを同定するための試験をする。変異および
二次代謝の遺伝子は、通常生育に影響しないの
で、この試験は幾分より複雑であり、関与する特
異な代謝産物により左右される。生産物が抗生物
質の場合は、形質転換集落に抗生物質感受性菌を
重層する。クローンされた相補遺伝子を含む集落
は抗生物質を生産し、この感受性試験菌の生育阻
止域に囲まれるであろう。その生産物に対する簡
単な生物学的試験が存在しない際は、物理的ある
いは化学的な検出法の適用が可能である。例え
ば、S.avermitilisによる駆虫性化合物アバメクチ
ン群（avermectines）の生産（Burg、R.W.ほ
か、1979年、抗微生物剤と化学療法
（Antimicrobial Agents and Chemothererapy）
15巻：361−367頁）は、通常高圧液体クロマトグ
ラフイーにより試験されている。 クローンされた遺伝子を含む組換えプラスミド
には、多くの実験的な用途がある。精製遺伝子の
このような豊富な供給源によつて、遺伝子の制御
領域および構造遺伝子のコード領域を同定するた
めの詳細な遺伝学的ならびに物理的解析を行なう
ことが可能である。遺伝子あるいはその部分の
DNA配列が決定され得る。興味の対象である遺
伝子が、大腸菌および放線菌の両方で複製する
pVE3あるいはpVE4のような二機能レプリコン
であるベクター中にクローンされるなら、多くの
付加的な実験も可能である。大腸菌の徹底的な遺
伝的な特性付けのおかげで、pVE3およびpVE4
のようなベクターでは、放線菌中では未だ可能で
ないような種々の生体内遺伝的操作を大腸菌にお
いて行なうことが可能となる。 クローンされた遺伝子を含むプラスミドは、そ
の二次代謝産物の生合成経路中の遺伝子を、高コ
ピー数にした際の効果を検討する目的で、野生型
宿主生物中に再移入することもできる。例えば、
経路中の律速段階がクローンされている場合は、、
この遺伝子を、細胞当り多数コピー供給すれば、
その代謝産物の収量が大きく増大するかも知れな
い。特定の代謝経路のいくつか、あるいは全ての
遺伝子がクローンされている場合は、試験管内
で、完全な経路を含む単一プラスミドを構成する
ことが可能かも知れない。このことは、内包され
る全段階の遺伝子量を増やすことになり、恐らく
は、それによつて、その株の生産能を高めるであ
ろう。 クローンされた遺伝子は、その発現程度を増大
させるために、試験管内で種々の方法で操作され
得る。そのDNAの試験管内変異誘起は、その遺
伝子の発現に対し、正および負の両方の効果をも
たらすと思われる。高効率プロモーターのような
制御配列を、クローンされた遺伝子の隣に取込ま
せることにより、その発現程度を増大し得る。全
ての変異による効果は、変換したクローン遺伝子
を、宿主放線菌中に再移入することにより監察さ
れる。 pVE1レプリコンを、異種蛋白の生産をさせる
ために、非放線菌源からのDNAをクローンする
のに用いることができる。この型の操作のために
は、その異種遺伝子を、既に放線菌の制御配列の
支配下で転写され、翻訳されているベクターの領
域に挿入することが必要である。例えば、S.
fradiaeからpIJ2にクローンされた、ネオマイシ
ン耐性のためのaph遺伝子を用いることが可能で
ある（Thampson、A.J.、Ward、J.N.および
Hopwood、D.A.、1980年、前出）。この遺伝子
は高水準で転写ならびに翻訳される（J.Davis、
1982年６月、第４回工業微生物の遺伝学に関する
国際シンポジウムで提示）。異種遺伝子がaph中
に挿入されるとaph蛋白と異種蛋白間の融合蛋白
を高水準でつくることが可能となろう。 プラスミド宿主Streptomyces avermitilisは、
非常に強力な駆虫活性を示すアバメクチンと呼ば
れる化学的に関連した物質複合体を生産する
（R.J.Burgほか、15、抗微生物剤および化学療法
（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）
361−367頁（1979年）参照）。プラスミドは、こ
れら遺伝子中の変異に対する遺伝的相補によつ
て、これら重要な化合物の合成および合成の制御
に関与している遺伝子および遺伝子産物の同定、
単離および解析に用い得る（例えば、例1.G節参
照）。 プラスミドpVE1のある種の雑種誘導体は、他
の方法に有用である。構成と性質が、例1.D節に
述べてあるこれら雑種群は、pVE1ベクター誘導
体が、大腸菌中でプラスミドとして複製できるよ
うにする。これらプラスミド−プラスミドベクタ
ー雑種は、形質転換により種間での転移が可能で
ある。この性質により、大腸菌のために開発され
た遺伝技法を用い得るようになるので非常に有用
である。例えば、放線菌種からの遺伝子が、大腸
菌の変異を相補し得ることが見出されるかも知れ
ない。例えば、トランスポゾン変異法により大腸
菌中で、放線菌遺伝子中に変異を導入することも
できるようにあるいは、ナンセンスサプレツサー
によりサプレスされ得るような変異（翻訳停止コ
ドン）が単離されるかも知れない。後者の変異遺
伝子は、放線菌中に逆戻しされ、放線菌中で翻訳
停止コドンをサプレスし得るような変異を単離す
るのに用いられる。このようなサプレツサー変異
は、このような生物学的研究に非常に有用であ
る。
【表】
本発明のいくつかの具体化が“例示”の形でこ
の節で代表的に開示されている。この体裁は、開
示の便宜的な形としてのみ選ばれたものであり、
本発明を、上文に開示されたものとして制限する
ものではないと理解されるべきである。 例 １ pVE1ベクターの単離、構築、保持及び増殖 このプラスミドDNAは、クローニング用ベク
ターとして用いられる他のプラスミドについての
業績により確立されたような方法とほとんど違わ
ない手法により単離され、取扱われた。良い手法
の手引きは、R.W.Davis、D.Botstein、およびJ.
R.Roth.“遺伝子工学の手引き：上級細菌遺伝
学”、ニユーヨーク州、コールドスプリングハー
バー、コールドスプリングハーバー研究所（1980
年）である。この仕事で用いられた独特の手法
は、上述の手引きに与えられているものと同一で
ない場合は、ここに記述されている。pVE1ベク
ターおよびその誘導体の性格付けに与つたり、そ
れらを他のクローニング用ベクターから区別する
のに役立つ結果は、適当なところに指摘されてい
る。 Ａ プラスミド単離の目的でのStreptomyces
venezuelae MA4192（ATCC 14585）の生育 単一集落を、250mlの邪魔板つきフラスコ中
のYEME（１中に３ｇ酵母エキス、５ｇペプ
トン、３ｇ麦芽エキス、１ｇグリコースを含
む）に、34％蔗糖および５ｍＭ塩化マグネシウ
ムとともに植菌した（Bibb、M.J.、Freeman、
R.F.およびHopwood、D.A.1977年、分子一般
遺伝学（Molec.Gen.Genet.）154巻：155−166
頁）。培養は、27℃220rpmの振盪で２日間行つ
た。この培養は、２フラスコ中の500mlの同
一培地中に稀釈し、上記同様、更に２日間続け
た。菌糸を14000xｇ15分の遠心により収獲し、
0.85％生理食塩水で１回洗浄した。 プラスミドの単離：手法１ 前出のBibbほ
か、（1977年）により記載された方法の変法を
用いた。菌糸を34％蔗糖を含む25mlのTE緩衝
液〔0.01Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（Tris）および0.001Mエチレンジアミ
ンテトラアセテート（EDTA）〕PH7.9中に再懸
濁した。この混合物を37℃20分インキユベート
し、氷浴中に移し、34％蔗糖を含む20mlのTE
緩衝液を添加した。TE緩衝液に溶解したドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）を終濃度１％にな
るように添加し、次いで塩化ナトリウムを終濃
度1Mになるように加えた。SDS沈殿をベツク
マン（Beckman）61Tiローター、30000rpm45
分４℃の遠心により除去した。上澄に平均分子
量6000のポリエチレングリコール（PEG）を
終濃度10％に加え、混合物を２時間ないし、一
夜４℃でインキユベートした。DNA−PEG沈
殿を5000xｇ15分４℃遠心により収獲した。こ
のペレツトを塩化セシウム密度勾配に用いた。 プラスミドの単離：手法２ Holmes、D.S.
およびQuigley、M.、1981年分析生化学
（Anal.Biochem.）70巻：431−441頁に記載さ
れた方法の変法を用いた。洗浄菌糸を20mlの
STET緩衝液（８％蔗糖、５％トリトンＸ−
100、50ｍＭ EDTAおよび50ｍＭ Tris.PH
8.0）中に懸濁した。0.5mlのリゾチム（50mg／
ml0.01M Tris中）を添加し、その混合物を30
分37℃でインキユベートした。その混合物を沸
騰水浴中に2.5分移した。これをベツクマン
60Tiローター中で、30000rpm45分４℃で遠心
した。上澄に等量のイソプロパノールを添加し
た。その混合物を少なくとも１時間−20℃で冷
却し、12000xg15分４℃で遠心した。DNA−
PEGペレツト（手法１より）、あるいはイソプ
ロパノール沈殿からのDNAペレツトを13mlの
10倍濃度TE緩衝液中に再懸濁した。15.6ｇの
塩化セシウムを加え、次いで0.5mlの臭化エチ
ジウム（15mg／ml水中）を加えた。その勾配
を、ベツクマン50Tiローターで、37000rpm48
時間遠心した。プラスミド・バンドを集め、次
の塩化セシウム密度勾配により再精製した。臭
化エチジウムを等量のイソアミルアルコールで
３回抽出することにより除去した。塩化セシウ
ムは、1000倍量のDNA緩衝液（10ｍＭ Tris
PH7.9、10ｍＭ Nacl.0.1ｍＭ EDTA）を３
回交換する透析により除去した。プラスミド
DNAを等量の平衡化フエノールで一回、ジエ
チルエーテルで３回抽出した。プラスミド
DNAはエタノール沈殿により濃縮した。0.1容
の3M酢酸ナトリウムPH６および３容の100％エ
タノールをDNAに加えた。混合物を−20℃で
少なくとも２時間冷却し、次いで15000xｇ15
分４℃で遠心した。DNAペレツトを0.5から1.0
mlのDNA緩衝液中に再懸濁し、４℃で貯蔵し
た。500mlの細胞からのDNAの収量は300から
600μｇであつた（このプラスミドが高コピー
数−１細胞当り50コピー以上であることを示唆
する）。 プラスミドの単離：手法３ Holmes、D.S.
およびQuigley、M.、（1981年前出）から改変
した方法を用いた。これは、多数の小規模培養
から少量のプラスミドDNAを速やかに得るこ
とを目的として考案されたものである。 250mlの邪魔板つきフラスコ中の20mlの
YEME−35蔗糖−５ｍＭ MgCl2にプラスミ
ドの存在を試験するべき菌株の単一集落を植菌
する。これを27℃220rpm振盪で３から５日間
生育させた。細胞を10000xg10分の遠心で収獲
し、0.85％生理食塩水で１回洗浄した。細胞ペ
レツトはこの段階で凍結保存が可能であつた。
このペレツトを約0.8mlのSTET緩衝液中に再
懸濁した。0.05mlのリゾチム（50mg／mlTE中）
を加え、混合物を37℃30分、次いで沸騰水浴中
90秒インキユベートした。溶菌液を12000xg15
分間遠心した。0.5mlの上澄を回収し、等量の
平衡化フエノールで一回抽出、核酸を等量のイ
ソプロパノールで沈殿させた。ペレツトを
100μのDNA緩衝液に再懸濁した。このDNA
は放線菌または大腸菌中への形質転換に適用し
た。このDNA1乃至10μを制限酵素で開裂
し、20μｇ／mlリボヌクレアーゼＡで15分間37
℃で処理し、アガロースゲル電気泳動で解析す
ることが可能だつた。 すぐ上に述べたプラスミド微量調製法を、
pIJ6（細胞当りコピー数１から２のSLP1.2の誘
導体）、pIJ303（細胞当り50コピー以上存在する
pIJ101の誘導体）、およびpVE1とここに述べる
その誘導体を担つているS.lividausからのプラ
スミドDNAを調べるのに用いた。各々の試料
は平行して、アガロース電気泳動により分析し
た。プラスミドは、臭化エチジウムで染色した
ゲルの紫外線の下での写真により視覚化した。
プラスミドバンドの螢光の量は、プラスミド
DNA量に直接比例する。pIJ6は、その低コピ
ー数故に、常にかすかに螢光を発するバンドと
して出現した。pIJ303は常に、光る螢光を発す
るバンドとして出現した。pVE1とその誘導体
は常に、pIJ303と同等もしくはそれ以上の光る
バンドを形成した。この結果は、pVE1が高コ
ピー数プラスミドであることを示唆した。 Ｂ プラスミドDNAの制限分析 DNAの制限分析およびアガロースゲル電気
泳動の手法は、他の組換えDNA工学の標準技
術と同様に、２の有能な手引き中に十分記載さ
れている：Davis、R.W.、Botstein、D.および
Roth、J.R.1980年、上級細菌遺伝学、コール
ドスプリングハーバー、コールドスプリングハ
ーバー研究所；およびManiatis、T.、
Fritsch、E.E.およびSambrook、J.、1982年、
分子クローニング、コールドスプリングハーバ
ー、コールドスプリングハーバー研究所、
pVE1 DNAを種々の制限酵素および酵素の組
合せにより開裂した。DNA断片は、0.8M
Tris・アセテート−0.004M EDTAを緩衝液と
して用いる0.8％アガロース中での電気泳動に
より分析した。pVE1断片の大きさは、既知分
子量のフアージDNA断片との対比により決定
した。pVE1は、11.0kbのプラスミドである。
それは、制限酵素Hind （０／11.0kb標準
点として選択した）、EcoR、BamHiおよび
Pvuに対し、単一部位を有する。Bcl、
Bgl、Cla、Not、Nru、Pst、pvu
、SphおよびStuに対し多数部位を有す
る。これら酵素に対する制限部位は、マツプさ
れ、図１に示してある。このプラスミドは、酵
素Acc、Ava、Ava、Bgl、BstE、
Hae、Hea、HgiA、Hine、Hph、
Mbo、Mbo、Nar、Rsa、Sal、
Sma、Sst、Tac、Taq、および
Tth111により多数個開裂される。以下の酵
素は、pVE1を開裂しない：Hpa、Kpn、
Nco、Nde、PaeR71およびXho。 Ｃ pVE1による放線菌の形質転換 (1) プロトプラスト形成 形質転換は、プロト
プラストによるPEG−介在DNA取込みによ
りなされた。プロトプラストを作るのに用い
られた手法は、基本的にThcmpson、C.J.、
Ward、J.M.およびHopwood、D.A.（1982
年、前出）に記載されたものであつた。34％
蔗糖、５ｍＭ Mgcl2および、S.lividans用
には0.5％グリシン（S.avermitilis用には１
％グリシン）を含む25mlYEMEに、108胞子
を植菌した。これを250mlの邪摩板つきフラ
スコ中で、２日間27℃220rpm振盪でインキ
ユベートした。細胞を遠心により収獲し、
0.85％生理食塩水で１回洗浄した。ペレツト
を１mg／mlリゾチムを含む培地Ｐ約10ml中に
再懸濁した。培地Ｐ（Okanishi、M.、
Suzuki、K.およびUmezawa、H.1974年、
前出）は、１当り、103ｇ蔗糖、0.25ｇ
K2SO4、203ｇMgCl・6H2O、２mlの微量成
分溶液を含む。微量成分溶液は、１当り40
mgZnCl2、200mgFecl3・6H2O、10ngCuCl2・
2H2O、10mgMnCl2・4H2O、10mg
Na2B4O7・10H2Oおよび10mg
（NH4）6MO7O24・4H2Oを含む。10mlの滅菌
０、57、KH2PO4の後に10mlの2.5M CaCl2
および40mlの250ｍＭ TESPH7.2（Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノ
エタン−スルホン酸）を加えて完全な培地Ｐ
をつくる。S.avermitilisについては、TES
の代りに40mlの250ｍＭ MES、PH6.0（２−
（Ｍ−モルクオリノ）エタンスルホン酸）を
用いた。菌糸をリゾチムと共に37℃１時間イ
ンキユベートした。懸濁液を３c.c.のグラスウ
ールで過し、液を4000xg5分遠心した。
ペレツトを２から５mlの培地ｐ中に再懸濁し
た。プロトプラストは直ちに用いるか、−70
℃で凍結した。 (2) 形質転換法 形質転換には、洗浄のため
に、0.2mlのプロトプラスト（約108／ml）
を、2.0mlの培地Ｐ中に稀釈し、3000xｇ５分
遠心、残りの培地中に再懸濁した。DNA試
料（10mlのDNA緩衝液中0.01から1.0μｇ）
をプロトプラストと混合した。0.5mlの培地
Ｔを加え、混合物を室温で１分インキユベー
トした。培地Ｔは、異なる濃度の蔗糖（2.5
％）およびCaCl2（0.1M）を含み、50ｍＭト
リス−マレイン酸（PH８）で緩衝化し、50％
（we／vol）PEG1000を含むことを除いては、
培地Ｐと同様である、混合物を培地Ｐで逐次
稀釈し、0.1ml量をS.Iividans用には、
R2YE、S.avermitilis用にはRM14の再生培
地上に平板塗布し、プロトプラストが細胞壁
を再生出来るようにした。R2YEは、１当
り170ｇ蔗糖、３ｇプロリンおよび0.25ｇ
K2SO4、10.1ｇMgCl2・6H2O、10ｇグリコ
ース、0.1ｇカザミノ酸、２mlの微量成分溶
液、３ｇの酵母エキスおよび、15ｇ寒天を含
む。後でのCaCl2、KH2PO4およびTESの無
菌添加は、培地Ｐの場合と同じである。
RM14は、１当り205ｇ蔗糖、20ｇ寒天お
よび、３ｇオートミール寒天の追加を含む事
を除き、R2YEとほぼ同様である。添加する
緩衝液は、培地Ｐについて記載したものと同
じである。 (3) 形質転換の検出 形質転換したプロトプラ
ストを稀釈し、再生培地上に平板塗布しし
た。平板を27℃でインキユベートした。形質
転換DNAが、tsr遺伝子をもつたpVE1の誘
導体の場合、平板を24時間目に、終濃度50μ
ｇ／ml濃度を与えるに十分なチオストレプト
ンを含む0.7％寒天の再生培生４mlで重層し
た。更に、３から４日のインキユベーシヨン
の後にThior（チオストレプトン耐性）集落
が生成した。形質転換株は、もとの再生平板
を４から７日インキユベートし、これを10か
ら50μｇ／mlチオストレプトン含有の同様培
地に平板転写する事によつても検出された。
形質転換DNAが、pVE1のように選択マー
カーをもたないプラスミドであるか、又は、
なお自己伝達能のある誘導体である場合は形
質転換株は、ポツク形成により検出された。
もとの再生平板は４乃至７日27℃でインキユ
ベートした。ポツクとして知られる生育阻害
又は気菌糸形成の阻害による小さな領域（１
−２mm）が、再生した生育面に出現する。こ
れはプラスミドが、もとの形質転換された細
胞から、周囲のプラスミドをもたない細胞中
に伝達されることにより、菌糸の生育を阻害
したことによるものである。 上述の方法によるpVE1のS.lividans中へ
の形質転換が、ポツクの生成をもたらしたこ
とは、このプラスミドが、自己伝達能をもつ
ことを示唆する。細胞はポツクの領域からの
胞子を新鮮培地に再塗布することにより純化
した。単一集落を取上げ、生育させ、上述の
プラスミド微量調製法により分析した。ポツ
クから得られた全ての集落がpVE1が、自己
伝達能をもつプラスミドであることが結論さ
れた。 Ｄ pVE1とpIJ39との間の相互組込みプラスミド
の形成 この実験は、異種DNAをpVE1中へクロー
ニングすることが可能であることを示してい
る。pIJ39は、プラスミドpIJ6（Thompson、C.
J.、Ward、J.M.およびHopwood、D.A.1980
年、前出）から、アンピシリン耐性大腸菌プラ
スミドpBR322〔Sutcliff、I.G.1978年、核酸研
究（Nucleic Acids Res.）５巻：2721−2728
頁〕のBamH部位へクローンしたtsr（チオス
トレプトン耐性）遺伝子を含む1.9kb BamH
断片を含んでいる。pVE1およびpIJ39は各々
別々に標準法に従つてEcoRにより直鎖化し
た。2μｇの直鎖にしたpVE1を15μｇ（５分子
量過剰）の直鎖化したpIJ39と混合し、終DNA
濃度を600μｇとした。これを、Davis、R.V.、
Botstein、D.およびRoth、J.R.、1980年、前出
に記載されている標準法により、リガーゼ緩衝
液中で、T4DNAリガーゼで処理した。結合し
た混合物をE.coli ｋ−12RR1〔Bolivar、F.、
Rodriquez、R.L.、Betlach、M.C.および
Boyer、H.W.、1977年、遺伝子（Gene）２
巻：75−93頁〕のコンピテント細胞の形質転換
に用いた。RR1は、Mandel、M.およびHiga、
A.、1970年分子生物学雑誌（J.Mol.Biol）53
巻：159−162頁の方法によりコンピテントにし
た。細胞をLB培地（１中に10ｇトリプトン、
５ｇ酵母エキス、５ｇNaCl）中でA600＝0.45
まで生育させ、氷上で20分インキユーベートし
た。細胞をペレツトにし、0.1M CaCl2中に最
初の半量で再懸濁した。氷上で20分の後、細胞
を再びペレツトにし、0.1CaCl2中に最初の0.1
量で再懸濁した。これらのコンピテント細胞を
形質転換に用いるか、グリセロール中で15％に
して−70℃で保存した。 形質転換には、0.2mlのコンピテント細胞を、
10％pVE1とpIJ39との間のライゲーシヨン反応
からのDNAと混合した。混合物を37℃で２分、
次いで氷上で１時間インキユベートした。18×
100mm試験管内の混合物中に３mlのLB培地を加
え、それを220rpm、37℃1.5時間振盪した。
pIJ39で形質転換した細胞を選択するために一
部を100μｇ／mlアンピシリンを加えたLB寒天
上に平板塗布した。 望みの組換えプラスミドを含む株を同定する
ために、Ampr形質転換株について、上述と同
様のプラスミド微量調製分析を行つた。単一集
落を５mlのアンピシリン含有LB中に植菌し、
一夜培養遠心によりペレツトとし、0.4mlの
STET緩衝液に再懸濁した。0.05mlのリゾチム
（50mg／mlTE中）を加えた。混合物を沸騰水中
60秒インキユベートし、12000xg12分遠心、上
澄を、等量のイソプロパノールで沈殿させた。
核酸を100μのDNA緩衝液中に再懸濁し、制
限消化およびアガロースゲル電気泳動により分
析した。 両方の可能な組換えプラスミドが得られた、
pVE3およびpVE4は、pIJ39とpVE1とが、そ
れらのEcoR部位で２つの可能な方向で結合
された相互組込みプラスミドである。pVE3お
よびpVE4は、500mlの細胞からClewell、D.B.
およびHelinski、D.R.、1969年、アメリカ科学
アカデミー会報（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）
62巻：1159・1166頁のトリトンＸ−100クリア
ード・ライゼイト法により精製された。 S.lividansの形質転換には、上述のようにプ
ラスミドpVE3 DNAを用いた。７日生育の
後、再生平板にポツク形成が示された。これら
の平板を10μｇ／mlチオストレプトンを含む
R2YE培地に転写平板し、３日間27℃インキユ
ベートした。Thior集落の位置は正確にもとの
再生平板中のポツクに対応し、相互組込みプラ
スミドによる形質転換が行われ、また、pVE3
がなお自己伝達能を有することが示された。10
個のThior集落を純化し、プラスミド微量調製
法のために培養するのに用いた。得られた
DNAの制限分析により、これらの集落が、プ
ラスミドpVE3を含むことが示された。 これら集落をS.lividansのストレプトマイシ
ン耐性誘導株との接合実験に用いた。全ての株
を、18×100mm試験管中、２mlのYEME−34％
蔗糖−５ｍＭ MgCl2で２時間生育させた。
R2YE寒天平板またはYD平板（１中４ｇ酵
母エキス、10ｇ麦芽エキス、４ｇデキストロー
スおよび15ｇ寒天、10ｍMCaCl2、および10ｍ
Ｍ MgCl2）に、0.1mlの受容菌S.lividansスト
レプトマイシン耐性培養を塗布した。この生育
叢の上に、各供与菌Thior培養液5μをスポツ
トした。35℃で７日インキユベーシヨン後、接
合平板を、非接合供与菌および受容菌細胞の平
板と共に、10μｇ／mlチオストレプトンおよび
100μｇ／mlストレプトマイシンを含むR2YE平
板に転写し、接合体を選択した。 35℃で３から４日インキユベーシヨン後に、
選択平板は、pVE3が供与菌からストレプトマ
イシン耐性受容菌に伝達されることにより生じ
たチオストレプトン耐性ストレプトマイシン耐
性の集落を含んでいた。非接合対照培養液に
は、二重耐性集落は出現しなかつた。この結果
は、相互組込みプラスミドpVE3が、自己伝達
し得ることを示した。 Ｅ pVE1中へのtsr遺伝子のクローニング (1) 組換えプラスミドの構築 以下の実験で、
チオストレプトン耐性（pBRのDNAは含ま
ない）をコードしているDNAのみを含む断
片をpVE1の種々の制限部位中にクローンし
た。この実験は、DNAを開裂した際に、酵
素BamH、BglおよびBclが、同じ４
塩基5′伸長部GATCを与える事実を利用し
た。このことから、これら酵素の各々により
生成した断片を、これら酵素のどれか１つに
より生成した断片とアニールし、ライゲート
（ligate）することが可能となる。 プラスミドpIJ39は、tsr遺伝子をもつ
1.9kb BamH断片を含む（図６参照）。こ
のBamH断片中に、完全なtsr遺伝子を含
むBcl1.1kb断片がある。Bclはdam遺伝
子による修飾の結果メチル化された大腸菌
DNAを開裂しない〔Hattmen、S.、
Brooks、J.E.およびMasurekar、M.、1978
年、分子生物学雑誌（J.Mol、Biol）126
巻：267−380〕から、プラスミドpIJ39試料
は、dam−dcm−宿主GM272〔Marinus、Ｍ
−G.およびKonrad、E.B.、1976年、分子一
般遺伝学（Mol.Gen、Genet.）149巻：273−
277頁〕から調製した。1.1kbのBcl tsr断
片をpVE1の、１個所あるBamH部位およ
び、４個所あるBcl部位の少なくとも２個
所に挿入した。さらに、1.9kb BamH
tsr断片を、pVE1中にクローンした。この手
法の詳細は以下のようである。 pVE1および、pIJ39を各々別々にBamH
で開裂した。制限酵素を不活化した後、
2μｇに直鎖にしたpVE1を、５モル過剰、6μ
ｇ、のBamH開裂pIJ39と混合し、リガー
ゼ緩衝液中DNA濃度400μｇ／mlで、16℃一
夜T4DNAリガーゼと共にインキユベートし
た。この反応混合物の半量を、S.lividansプ
ロトプラストの形質転換に用いた。Thior形
質転換株は、上述の重層法により検出した。 pVE1は、３個所のBgl部位および４つ
のBcl部位を含む。可能な部位の各々にtsr
をもつた独立の組換えプラスミドを得ること
が望まれた。従つて、pVE1との制限酵素の
インキユベーシヨンにより、DNA試料が、
その酵素で部分的にのみ消化され、その酵素
で一度だけ開裂されたプラスミド分子がかな
りの数得られるように条件を設定した。これ
らの直鎖にした分子は、ライゲーシヨンに好
ましい基質となつた。この集団は、pVE1を
各々の可能な部位で直鎖にしたものの混合物
であると思われる。pVE1をμｇDNA当り
BglまたはBcl0.1から1.0単位酵素濃度で
インキユベートした。試料を５、10、20、40
および80分に取出し、アガロースゲル電気泳
動で分析することによつて完全消化産物の量
が最小で直鎖状分子が大部分を占めるような
条件を決定した。これらの条件は、各酵素バ
ツチに対し、経験的に決定しなくてはならな
かつた。 Bclで部分開裂したpVE1およびBglで
部分開裂したpVE1を、Bclで開裂した
pIJ39と、他のライゲーシヨンで述べた条件
下で混合、連結し、Thior形質転換株を、上
述の重層法により検出した。 (2) 組換えプラスミドの解析 チオストレプトン耐性集落を２度R2YE−
thio培地上で純化し、各ライゲーシヨンから
のいくつかの培養液を、プラスミド微量調製
分析により解析した。tsr挿入部位と、
BamH 1.9kb tsr断片またはBcl
1.1kb tsr断片の方向性を決定するために制
限消化を行つた。全てのライゲーシヨン実験
について、方向と位置を決めるために制限酵
素Claを用いた。Bclで部分開裂した
pVE1を検討した実験では、酵素Pvuも用
いた。各々が、pVE1を３回（図１参照）お
よびtsr断片を１回（図６参照）開裂するの
で、これらの実験には、この２つの酵素が有
用であつた。tsr BamHまたはBcl断片
は、各々１つの非対照的に位置するCla部
位およびpvu部位を含んでいる。このこと
で、tsr断片に対する方向の決定が可能とな
る。tsr中のPvu部位は、tsrからの２つの
Cla−Bcl断片の小さい方にあるCla部
位のごく近くにマツプされることが決定され
た。組換えThiorプラスミドをClaまたは
Pvuで消化することにより、pVE1および
tsrの制限地図から予言され得た断片が生じ
た。方向１は、BamHまたはBclのtsr断
片が、図２で描かれた組換えプラスミドの回
りを、時計廻りに動いたとき、tsr断片の中
点を過ぎてからClaまたはPvu部位に出
会うような方向と定義した。方向２は、この
向きの反対であつた。 以下の組換えDNAを、プラスミド微量調
製DNAの消化から得られたClaおよびPvu
制限パターンの解析により同定した。
pVE9およびpVE11は、1.9kbのBamH
tsr断片を、pVE1のBamH部位に各々、方
向１および２で含んでいた。pVE13および
pVE17は、1.1kbのBcl断片を、BamH
部位に各々方向１および２で含んでいた。
pVE19およびpVE21は、Bcl tsr断片を、
6.15kbのBgl部位に各々方向２および１で
含んでいた。pVE23は、1.1kbのBcl tsr
断片を、7.15kbのBgl部位に含む。pVE24
およびpVE26は、このtsr断片を、Bcl
1.5kb部位に各々方向２および１で含んでい
た。pVE33およびpVE35は、1.1kb Bcl
tsr断片を、pVE1上の0.33または0.4kbのBcl
部位に各々方向２および１で含んでいた。
しかし、これら２つの部位のどちらに挿入が
位置しているかは決定されなかつた。
pVE37およびpVE39は、この断片をBcl
4.3kb部位中に各々方向２および１で含んで
いた。 pVE1 DNA中に欠失を有する２つの組換
えプラスミドも得られた。欠失の範囲は、図
１中に示した酵素を利用した制限分析により
明らかにした。pVE30は、1.1kb Bcl tsr
断片を、6.15および7.15kbにある２つのBgl
部位間での1.0kbの欠失を伴つたBgl
6.15kb部位に方向２で含んでいた。その結
果、pVE30は、1.5kbの位置にただ１個所の
Bgl部位を有した。pVE28は、1.1kb Bcl
tsr断片を、Bgl6.15kb部位に方向２で
含んでいた。このプラスミドは、ほほ7kbの
欠失によつて、大きさわずかに5.1kbであつ
た。その欠失は、10kbのPvu部位を除去す
ることなく、その近傍に始まり、０／11kb
部位を越えて続き、ほぼ、tsrが挿入された
ところであるBgl6.15kb部位までのpVE1
DNAを除去した。 Ｆ 組換えプラスミドの伝達性の決定 各組換えプラスミドを含むS.lividansの菌株
を用いて接合を行ない、pVE1の自己伝達能に
とつて、どの部位への挿入が必須および必須で
ないかを決定した。S.lividansのストレプトマ
イシン耐性誘導株への接合は、相互組込みプラ
スミドpVE3を用いて、接合実験の項で述べた
ように実施した。接合は、R2YE平板上で行
い、次に、チオストレプトンおよびストレプト
マイシンを含むR2YE培地に転写した。 挿入を、pVE1のBamH部位にもつ４つの
プラスミド（pVE9、11、13および17）は、非
自己伝達性であつた。tsrをBamH部位から
約1.0kb離れたBgl1.5部位に含むpVE24およ
びpVE26も非自己伝達性であつた。大きな7kb
欠失をもつプラスミドpVE28もThiorを伝達し
得なかつた。他の全ての組換え体プラスミド
は、自己伝達（Tra+）であつた。この中には、
Bgl6.15または7.15kb部位どちらかに挿入し
たプラスミド、同様にこれら２つの部位間に
DNAの欠失をもつたpVE30が含まれていた。
0.33または0.4および4.3kbのBcl部位への挿
入を有する４種のプラスミドは、全てTra+で
あつた。 Ｇ pVE1誘導体のS.avermitilis中への形質転換 pVE1がS.avermitilisに対して有用なクロー
ニングベクターであるかを確かめるために、S.
avermitilis MA 4990のプロトプラストを
pVE17（BamH部位に1.1kb Bcl tsrをも
つたpVE1）およびpVE28（7kbの欠失をもつた
プラスミド）のプラスミドDNAで形質転換し
た。プロトプラストの調製ならびにプラスミド
DNAによる形質転換は、上述の如くであつた。
Thior形質転換株は、チオストレプトンを含む
軟寒天による重層再生平板法により検出した。
pVE17およびpVE28の両形質転換共S.
avermitilisのチオストレプトン耐性集落をも
たらした。各形質転換より、10個の集落を純化
し、プラスミド微量調製分析により解析した。
制限解析の結果は、全株が、形質転換に用いた
完全なpVE17およびpVE28を高コピー数含ん
でいることを示唆した。本実験は、pVE1の誘
導体がS.avermitilisでのクローニングベクター
として、成功裡に用い得ることを示した。 pVE1レプリコンが、どのように用いられ得
るかについての２つの詳細な例を以下に述べ
た。 例 ２ アバメクチン遺伝子のクローニング pVE17および、pVE28は、成功裡にS.
avermitilis中に導入された。従つて、好適なク
ローニングベクターである。pVE1レプリコン関
連のものはどれも、この目的に機能すると思われ
る。pVE17をBclまたはBglにより部分的に
消化する。同様に、pVE28をBglにより直鎖に
する。S.avermitilisの染色体DNAをSau3Aによ
り部分的に消化する。これらの酵素は、同じ5′4
塩基伸長部を産生する。アガロース・ゲル電気泳
動による分離の後に３から10kbのS.avermitilis
染色体断片を抽出する。これらの断片を開発した
プラスミドDNAと連結する。連結混合物を、ア
バメクチン合成系が遮断されたS.avermitilisの変
異株をチオストレプトン耐性に形質転換するのに
用いる。アバメクチン産生を模索するための簡単
な重層が開発されるまでは、アバメクチン生産を
可能とする組換えDNA上の野生型の相補遺伝子
を含んだ集落を同定するために、チオストレプト
ン耐性集落からの少量の培養液を、高圧液体クロ
マトグラフイーで検索する必要がある。 例 ３ 放線菌中へのＢ型肝炎表面抗原のクローニング Ｂ型肝炎表面抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原のＣ−
末端部の大部分をS.lividans中で発現される遺伝
子中に挿入することによりクローニングすること
ができる。表面抗原挿入部分が正しい方向および
翻訳あるいは、リーデイング・フレーム
（reading frame読みとり枠）にある場合は、Ｂ
型肝炎表面抗原の抗原性を有する融合蛋白が生産
される〔Edman、J.C.、Hallewell、R.H.、
Valenzuela、P.、Goodman、H.M.および
RnHer、W.J.、1981年“Ｂ型肝炎表面および、
コアー抗原の大腸菌中での合成”ネイチヤ
（Nature）291巻：503−506頁〕。本例において
は、Ｂ型肝炎表面抗原を、ネオマイシン耐性を与
える遺伝子中に挿入した。 Neor（図６参照）を与えるaph遺伝子は、pIJ2
DNAをSstにより開裂して得られた。この
1.0kb断片は、アガロースゲル電気泳動で純化し
た。そのベクターDNA（pVE1の唯一のBamH
部位にBcl tsr断片を挿入したpVE1の誘導体
で、例えば、pVE13またはpVE17）を、Sstで
部分的に消化した。pVE1は、数個所のSst部位
を有するので、直鎖分子を高収率で得るために
は、部分消化が必要である。開裂ベクターDNA
を、1.0kbのaph断片と連結し、S.lividansを
Thior Neorに形質転換するのに用いた。 Neor ThiorプラスミドのDNAをBamHで
開裂する。ベクターは、ネオマイシン耐性をコー
ドしている遺伝子の中央に近い位置に唯一の
BamH部位を有する。ベクターに、末端デオ
キシヌクレオチド転移酵素により約10から15デオ
キシグアノシン・ヌクレオチド残基を末端付加す
る。クローンしたＢ型肝炎ウイルスDNAをHinc
で消化し、Ｂ型肝炎表面抗原の部分（22アミノ
末端アミノ酸を欠く）を含む744塩基対をポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Edman、J.C.ほか、
1981年、前出）により単離する。この断片に約10
から15ヂオキシ・シチジンヌクレオチド残基を末
端付加する。この断片を次に、末端付加したベク
ターと対合させ、その混合物をS.lividansプロト
プラストの形質転換に用いてThiorを得、aph遺
伝子中への挿入に由来するネオマイシン感受性に
ついて検索する。これらの株からのプラスミド微
量調製DNAと、制限分析により検討し、Ｂ型肝
炎表面抗原断片の挿入されたプラスミドを同定す
る。これらの株を、期待されるネオマイシン燐酸
転移酵素−Ｂ型肝炎表面抗原融合蛋白の生産に関
して調べる。
の節で代表的に開示されている。この体裁は、開
示の便宜的な形としてのみ選ばれたものであり、
本発明を、上文に開示されたものとして制限する
ものではないと理解されるべきである。 例 １ pVE1ベクターの単離、構築、保持及び増殖 このプラスミドDNAは、クローニング用ベク
ターとして用いられる他のプラスミドについての
業績により確立されたような方法とほとんど違わ
ない手法により単離され、取扱われた。良い手法
の手引きは、R.W.Davis、D.Botstein、およびJ.
R.Roth.“遺伝子工学の手引き：上級細菌遺伝
学”、ニユーヨーク州、コールドスプリングハー
バー、コールドスプリングハーバー研究所（1980
年）である。この仕事で用いられた独特の手法
は、上述の手引きに与えられているものと同一で
ない場合は、ここに記述されている。pVE1ベク
ターおよびその誘導体の性格付けに与つたり、そ
れらを他のクローニング用ベクターから区別する
のに役立つ結果は、適当なところに指摘されてい
る。 Ａ プラスミド単離の目的でのStreptomyces
venezuelae MA4192（ATCC 14585）の生育 単一集落を、250mlの邪魔板つきフラスコ中
のYEME（１中に３ｇ酵母エキス、５ｇペプ
トン、３ｇ麦芽エキス、１ｇグリコースを含
む）に、34％蔗糖および５ｍＭ塩化マグネシウ
ムとともに植菌した（Bibb、M.J.、Freeman、
R.F.およびHopwood、D.A.1977年、分子一般
遺伝学（Molec.Gen.Genet.）154巻：155−166
頁）。培養は、27℃220rpmの振盪で２日間行つ
た。この培養は、２フラスコ中の500mlの同
一培地中に稀釈し、上記同様、更に２日間続け
た。菌糸を14000xｇ15分の遠心により収獲し、
0.85％生理食塩水で１回洗浄した。 プラスミドの単離：手法１ 前出のBibbほ
か、（1977年）により記載された方法の変法を
用いた。菌糸を34％蔗糖を含む25mlのTE緩衝
液〔0.01Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（Tris）および0.001Mエチレンジアミ
ンテトラアセテート（EDTA）〕PH7.9中に再懸
濁した。この混合物を37℃20分インキユベート
し、氷浴中に移し、34％蔗糖を含む20mlのTE
緩衝液を添加した。TE緩衝液に溶解したドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）を終濃度１％にな
るように添加し、次いで塩化ナトリウムを終濃
度1Mになるように加えた。SDS沈殿をベツク
マン（Beckman）61Tiローター、30000rpm45
分４℃の遠心により除去した。上澄に平均分子
量6000のポリエチレングリコール（PEG）を
終濃度10％に加え、混合物を２時間ないし、一
夜４℃でインキユベートした。DNA−PEG沈
殿を5000xｇ15分４℃遠心により収獲した。こ
のペレツトを塩化セシウム密度勾配に用いた。 プラスミドの単離：手法２ Holmes、D.S.
およびQuigley、M.、1981年分析生化学
（Anal.Biochem.）70巻：431−441頁に記載さ
れた方法の変法を用いた。洗浄菌糸を20mlの
STET緩衝液（８％蔗糖、５％トリトンＸ−
100、50ｍＭ EDTAおよび50ｍＭ Tris.PH
8.0）中に懸濁した。0.5mlのリゾチム（50mg／
ml0.01M Tris中）を添加し、その混合物を30
分37℃でインキユベートした。その混合物を沸
騰水浴中に2.5分移した。これをベツクマン
60Tiローター中で、30000rpm45分４℃で遠心
した。上澄に等量のイソプロパノールを添加し
た。その混合物を少なくとも１時間−20℃で冷
却し、12000xg15分４℃で遠心した。DNA−
PEGペレツト（手法１より）、あるいはイソプ
ロパノール沈殿からのDNAペレツトを13mlの
10倍濃度TE緩衝液中に再懸濁した。15.6ｇの
塩化セシウムを加え、次いで0.5mlの臭化エチ
ジウム（15mg／ml水中）を加えた。その勾配
を、ベツクマン50Tiローターで、37000rpm48
時間遠心した。プラスミド・バンドを集め、次
の塩化セシウム密度勾配により再精製した。臭
化エチジウムを等量のイソアミルアルコールで
３回抽出することにより除去した。塩化セシウ
ムは、1000倍量のDNA緩衝液（10ｍＭ Tris
PH7.9、10ｍＭ Nacl.0.1ｍＭ EDTA）を３
回交換する透析により除去した。プラスミド
DNAを等量の平衡化フエノールで一回、ジエ
チルエーテルで３回抽出した。プラスミド
DNAはエタノール沈殿により濃縮した。0.1容
の3M酢酸ナトリウムPH６および３容の100％エ
タノールをDNAに加えた。混合物を−20℃で
少なくとも２時間冷却し、次いで15000xｇ15
分４℃で遠心した。DNAペレツトを0.5から1.0
mlのDNA緩衝液中に再懸濁し、４℃で貯蔵し
た。500mlの細胞からのDNAの収量は300から
600μｇであつた（このプラスミドが高コピー
数−１細胞当り50コピー以上であることを示唆
する）。 プラスミドの単離：手法３ Holmes、D.S.
およびQuigley、M.、（1981年前出）から改変
した方法を用いた。これは、多数の小規模培養
から少量のプラスミドDNAを速やかに得るこ
とを目的として考案されたものである。 250mlの邪魔板つきフラスコ中の20mlの
YEME−35蔗糖−５ｍＭ MgCl2にプラスミ
ドの存在を試験するべき菌株の単一集落を植菌
する。これを27℃220rpm振盪で３から５日間
生育させた。細胞を10000xg10分の遠心で収獲
し、0.85％生理食塩水で１回洗浄した。細胞ペ
レツトはこの段階で凍結保存が可能であつた。
このペレツトを約0.8mlのSTET緩衝液中に再
懸濁した。0.05mlのリゾチム（50mg／mlTE中）
を加え、混合物を37℃30分、次いで沸騰水浴中
90秒インキユベートした。溶菌液を12000xg15
分間遠心した。0.5mlの上澄を回収し、等量の
平衡化フエノールで一回抽出、核酸を等量のイ
ソプロパノールで沈殿させた。ペレツトを
100μのDNA緩衝液に再懸濁した。このDNA
は放線菌または大腸菌中への形質転換に適用し
た。このDNA1乃至10μを制限酵素で開裂
し、20μｇ／mlリボヌクレアーゼＡで15分間37
℃で処理し、アガロースゲル電気泳動で解析す
ることが可能だつた。 すぐ上に述べたプラスミド微量調製法を、
pIJ6（細胞当りコピー数１から２のSLP1.2の誘
導体）、pIJ303（細胞当り50コピー以上存在する
pIJ101の誘導体）、およびpVE1とここに述べる
その誘導体を担つているS.lividausからのプラ
スミドDNAを調べるのに用いた。各々の試料
は平行して、アガロース電気泳動により分析し
た。プラスミドは、臭化エチジウムで染色した
ゲルの紫外線の下での写真により視覚化した。
プラスミドバンドの螢光の量は、プラスミド
DNA量に直接比例する。pIJ6は、その低コピ
ー数故に、常にかすかに螢光を発するバンドと
して出現した。pIJ303は常に、光る螢光を発す
るバンドとして出現した。pVE1とその誘導体
は常に、pIJ303と同等もしくはそれ以上の光る
バンドを形成した。この結果は、pVE1が高コ
ピー数プラスミドであることを示唆した。 Ｂ プラスミドDNAの制限分析 DNAの制限分析およびアガロースゲル電気
泳動の手法は、他の組換えDNA工学の標準技
術と同様に、２の有能な手引き中に十分記載さ
れている：Davis、R.W.、Botstein、D.および
Roth、J.R.1980年、上級細菌遺伝学、コール
ドスプリングハーバー、コールドスプリングハ
ーバー研究所；およびManiatis、T.、
Fritsch、E.E.およびSambrook、J.、1982年、
分子クローニング、コールドスプリングハーバ
ー、コールドスプリングハーバー研究所、
pVE1 DNAを種々の制限酵素および酵素の組
合せにより開裂した。DNA断片は、0.8M
Tris・アセテート−0.004M EDTAを緩衝液と
して用いる0.8％アガロース中での電気泳動に
より分析した。pVE1断片の大きさは、既知分
子量のフアージDNA断片との対比により決定
した。pVE1は、11.0kbのプラスミドである。
それは、制限酵素Hind （０／11.0kb標準
点として選択した）、EcoR、BamHiおよび
Pvuに対し、単一部位を有する。Bcl、
Bgl、Cla、Not、Nru、Pst、pvu
、SphおよびStuに対し多数部位を有す
る。これら酵素に対する制限部位は、マツプさ
れ、図１に示してある。このプラスミドは、酵
素Acc、Ava、Ava、Bgl、BstE、
Hae、Hea、HgiA、Hine、Hph、
Mbo、Mbo、Nar、Rsa、Sal、
Sma、Sst、Tac、Taq、および
Tth111により多数個開裂される。以下の酵
素は、pVE1を開裂しない：Hpa、Kpn、
Nco、Nde、PaeR71およびXho。 Ｃ pVE1による放線菌の形質転換 (1) プロトプラスト形成 形質転換は、プロト
プラストによるPEG−介在DNA取込みによ
りなされた。プロトプラストを作るのに用い
られた手法は、基本的にThcmpson、C.J.、
Ward、J.M.およびHopwood、D.A.（1982
年、前出）に記載されたものであつた。34％
蔗糖、５ｍＭ Mgcl2および、S.lividans用
には0.5％グリシン（S.avermitilis用には１
％グリシン）を含む25mlYEMEに、108胞子
を植菌した。これを250mlの邪摩板つきフラ
スコ中で、２日間27℃220rpm振盪でインキ
ユベートした。細胞を遠心により収獲し、
0.85％生理食塩水で１回洗浄した。ペレツト
を１mg／mlリゾチムを含む培地Ｐ約10ml中に
再懸濁した。培地Ｐ（Okanishi、M.、
Suzuki、K.およびUmezawa、H.1974年、
前出）は、１当り、103ｇ蔗糖、0.25ｇ
K2SO4、203ｇMgCl・6H2O、２mlの微量成
分溶液を含む。微量成分溶液は、１当り40
mgZnCl2、200mgFecl3・6H2O、10ngCuCl2・
2H2O、10mgMnCl2・4H2O、10mg
Na2B4O7・10H2Oおよび10mg
（NH4）6MO7O24・4H2Oを含む。10mlの滅菌
０、57、KH2PO4の後に10mlの2.5M CaCl2
および40mlの250ｍＭ TESPH7.2（Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノ
エタン−スルホン酸）を加えて完全な培地Ｐ
をつくる。S.avermitilisについては、TES
の代りに40mlの250ｍＭ MES、PH6.0（２−
（Ｍ−モルクオリノ）エタンスルホン酸）を
用いた。菌糸をリゾチムと共に37℃１時間イ
ンキユベートした。懸濁液を３c.c.のグラスウ
ールで過し、液を4000xg5分遠心した。
ペレツトを２から５mlの培地ｐ中に再懸濁し
た。プロトプラストは直ちに用いるか、−70
℃で凍結した。 (2) 形質転換法 形質転換には、洗浄のため
に、0.2mlのプロトプラスト（約108／ml）
を、2.0mlの培地Ｐ中に稀釈し、3000xｇ５分
遠心、残りの培地中に再懸濁した。DNA試
料（10mlのDNA緩衝液中0.01から1.0μｇ）
をプロトプラストと混合した。0.5mlの培地
Ｔを加え、混合物を室温で１分インキユベー
トした。培地Ｔは、異なる濃度の蔗糖（2.5
％）およびCaCl2（0.1M）を含み、50ｍＭト
リス−マレイン酸（PH８）で緩衝化し、50％
（we／vol）PEG1000を含むことを除いては、
培地Ｐと同様である、混合物を培地Ｐで逐次
稀釈し、0.1ml量をS.Iividans用には、
R2YE、S.avermitilis用にはRM14の再生培
地上に平板塗布し、プロトプラストが細胞壁
を再生出来るようにした。R2YEは、１当
り170ｇ蔗糖、３ｇプロリンおよび0.25ｇ
K2SO4、10.1ｇMgCl2・6H2O、10ｇグリコ
ース、0.1ｇカザミノ酸、２mlの微量成分溶
液、３ｇの酵母エキスおよび、15ｇ寒天を含
む。後でのCaCl2、KH2PO4およびTESの無
菌添加は、培地Ｐの場合と同じである。
RM14は、１当り205ｇ蔗糖、20ｇ寒天お
よび、３ｇオートミール寒天の追加を含む事
を除き、R2YEとほぼ同様である。添加する
緩衝液は、培地Ｐについて記載したものと同
じである。 (3) 形質転換の検出 形質転換したプロトプラ
ストを稀釈し、再生培地上に平板塗布しし
た。平板を27℃でインキユベートした。形質
転換DNAが、tsr遺伝子をもつたpVE1の誘
導体の場合、平板を24時間目に、終濃度50μ
ｇ／ml濃度を与えるに十分なチオストレプト
ンを含む0.7％寒天の再生培生４mlで重層し
た。更に、３から４日のインキユベーシヨン
の後にThior（チオストレプトン耐性）集落
が生成した。形質転換株は、もとの再生平板
を４から７日インキユベートし、これを10か
ら50μｇ／mlチオストレプトン含有の同様培
地に平板転写する事によつても検出された。
形質転換DNAが、pVE1のように選択マー
カーをもたないプラスミドであるか、又は、
なお自己伝達能のある誘導体である場合は形
質転換株は、ポツク形成により検出された。
もとの再生平板は４乃至７日27℃でインキユ
ベートした。ポツクとして知られる生育阻害
又は気菌糸形成の阻害による小さな領域（１
−２mm）が、再生した生育面に出現する。こ
れはプラスミドが、もとの形質転換された細
胞から、周囲のプラスミドをもたない細胞中
に伝達されることにより、菌糸の生育を阻害
したことによるものである。 上述の方法によるpVE1のS.lividans中へ
の形質転換が、ポツクの生成をもたらしたこ
とは、このプラスミドが、自己伝達能をもつ
ことを示唆する。細胞はポツクの領域からの
胞子を新鮮培地に再塗布することにより純化
した。単一集落を取上げ、生育させ、上述の
プラスミド微量調製法により分析した。ポツ
クから得られた全ての集落がpVE1が、自己
伝達能をもつプラスミドであることが結論さ
れた。 Ｄ pVE1とpIJ39との間の相互組込みプラスミド
の形成 この実験は、異種DNAをpVE1中へクロー
ニングすることが可能であることを示してい
る。pIJ39は、プラスミドpIJ6（Thompson、C.
J.、Ward、J.M.およびHopwood、D.A.1980
年、前出）から、アンピシリン耐性大腸菌プラ
スミドpBR322〔Sutcliff、I.G.1978年、核酸研
究（Nucleic Acids Res.）５巻：2721−2728
頁〕のBamH部位へクローンしたtsr（チオス
トレプトン耐性）遺伝子を含む1.9kb BamH
断片を含んでいる。pVE1およびpIJ39は各々
別々に標準法に従つてEcoRにより直鎖化し
た。2μｇの直鎖にしたpVE1を15μｇ（５分子
量過剰）の直鎖化したpIJ39と混合し、終DNA
濃度を600μｇとした。これを、Davis、R.V.、
Botstein、D.およびRoth、J.R.、1980年、前出
に記載されている標準法により、リガーゼ緩衝
液中で、T4DNAリガーゼで処理した。結合し
た混合物をE.coli ｋ−12RR1〔Bolivar、F.、
Rodriquez、R.L.、Betlach、M.C.および
Boyer、H.W.、1977年、遺伝子（Gene）２
巻：75−93頁〕のコンピテント細胞の形質転換
に用いた。RR1は、Mandel、M.およびHiga、
A.、1970年分子生物学雑誌（J.Mol.Biol）53
巻：159−162頁の方法によりコンピテントにし
た。細胞をLB培地（１中に10ｇトリプトン、
５ｇ酵母エキス、５ｇNaCl）中でA600＝0.45
まで生育させ、氷上で20分インキユーベートし
た。細胞をペレツトにし、0.1M CaCl2中に最
初の半量で再懸濁した。氷上で20分の後、細胞
を再びペレツトにし、0.1CaCl2中に最初の0.1
量で再懸濁した。これらのコンピテント細胞を
形質転換に用いるか、グリセロール中で15％に
して−70℃で保存した。 形質転換には、0.2mlのコンピテント細胞を、
10％pVE1とpIJ39との間のライゲーシヨン反応
からのDNAと混合した。混合物を37℃で２分、
次いで氷上で１時間インキユベートした。18×
100mm試験管内の混合物中に３mlのLB培地を加
え、それを220rpm、37℃1.5時間振盪した。
pIJ39で形質転換した細胞を選択するために一
部を100μｇ／mlアンピシリンを加えたLB寒天
上に平板塗布した。 望みの組換えプラスミドを含む株を同定する
ために、Ampr形質転換株について、上述と同
様のプラスミド微量調製分析を行つた。単一集
落を５mlのアンピシリン含有LB中に植菌し、
一夜培養遠心によりペレツトとし、0.4mlの
STET緩衝液に再懸濁した。0.05mlのリゾチム
（50mg／mlTE中）を加えた。混合物を沸騰水中
60秒インキユベートし、12000xg12分遠心、上
澄を、等量のイソプロパノールで沈殿させた。
核酸を100μのDNA緩衝液中に再懸濁し、制
限消化およびアガロースゲル電気泳動により分
析した。 両方の可能な組換えプラスミドが得られた、
pVE3およびpVE4は、pIJ39とpVE1とが、そ
れらのEcoR部位で２つの可能な方向で結合
された相互組込みプラスミドである。pVE3お
よびpVE4は、500mlの細胞からClewell、D.B.
およびHelinski、D.R.、1969年、アメリカ科学
アカデミー会報（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）
62巻：1159・1166頁のトリトンＸ−100クリア
ード・ライゼイト法により精製された。 S.lividansの形質転換には、上述のようにプ
ラスミドpVE3 DNAを用いた。７日生育の
後、再生平板にポツク形成が示された。これら
の平板を10μｇ／mlチオストレプトンを含む
R2YE培地に転写平板し、３日間27℃インキユ
ベートした。Thior集落の位置は正確にもとの
再生平板中のポツクに対応し、相互組込みプラ
スミドによる形質転換が行われ、また、pVE3
がなお自己伝達能を有することが示された。10
個のThior集落を純化し、プラスミド微量調製
法のために培養するのに用いた。得られた
DNAの制限分析により、これらの集落が、プ
ラスミドpVE3を含むことが示された。 これら集落をS.lividansのストレプトマイシ
ン耐性誘導株との接合実験に用いた。全ての株
を、18×100mm試験管中、２mlのYEME−34％
蔗糖−５ｍＭ MgCl2で２時間生育させた。
R2YE寒天平板またはYD平板（１中４ｇ酵
母エキス、10ｇ麦芽エキス、４ｇデキストロー
スおよび15ｇ寒天、10ｍMCaCl2、および10ｍ
Ｍ MgCl2）に、0.1mlの受容菌S.lividansスト
レプトマイシン耐性培養を塗布した。この生育
叢の上に、各供与菌Thior培養液5μをスポツ
トした。35℃で７日インキユベーシヨン後、接
合平板を、非接合供与菌および受容菌細胞の平
板と共に、10μｇ／mlチオストレプトンおよび
100μｇ／mlストレプトマイシンを含むR2YE平
板に転写し、接合体を選択した。 35℃で３から４日インキユベーシヨン後に、
選択平板は、pVE3が供与菌からストレプトマ
イシン耐性受容菌に伝達されることにより生じ
たチオストレプトン耐性ストレプトマイシン耐
性の集落を含んでいた。非接合対照培養液に
は、二重耐性集落は出現しなかつた。この結果
は、相互組込みプラスミドpVE3が、自己伝達
し得ることを示した。 Ｅ pVE1中へのtsr遺伝子のクローニング (1) 組換えプラスミドの構築 以下の実験で、
チオストレプトン耐性（pBRのDNAは含ま
ない）をコードしているDNAのみを含む断
片をpVE1の種々の制限部位中にクローンし
た。この実験は、DNAを開裂した際に、酵
素BamH、BglおよびBclが、同じ４
塩基5′伸長部GATCを与える事実を利用し
た。このことから、これら酵素の各々により
生成した断片を、これら酵素のどれか１つに
より生成した断片とアニールし、ライゲート
（ligate）することが可能となる。 プラスミドpIJ39は、tsr遺伝子をもつ
1.9kb BamH断片を含む（図６参照）。こ
のBamH断片中に、完全なtsr遺伝子を含
むBcl1.1kb断片がある。Bclはdam遺伝
子による修飾の結果メチル化された大腸菌
DNAを開裂しない〔Hattmen、S.、
Brooks、J.E.およびMasurekar、M.、1978
年、分子生物学雑誌（J.Mol、Biol）126
巻：267−380〕から、プラスミドpIJ39試料
は、dam−dcm−宿主GM272〔Marinus、Ｍ
−G.およびKonrad、E.B.、1976年、分子一
般遺伝学（Mol.Gen、Genet.）149巻：273−
277頁〕から調製した。1.1kbのBcl tsr断
片をpVE1の、１個所あるBamH部位およ
び、４個所あるBcl部位の少なくとも２個
所に挿入した。さらに、1.9kb BamH
tsr断片を、pVE1中にクローンした。この手
法の詳細は以下のようである。 pVE1および、pIJ39を各々別々にBamH
で開裂した。制限酵素を不活化した後、
2μｇに直鎖にしたpVE1を、５モル過剰、6μ
ｇ、のBamH開裂pIJ39と混合し、リガー
ゼ緩衝液中DNA濃度400μｇ／mlで、16℃一
夜T4DNAリガーゼと共にインキユベートし
た。この反応混合物の半量を、S.lividansプ
ロトプラストの形質転換に用いた。Thior形
質転換株は、上述の重層法により検出した。 pVE1は、３個所のBgl部位および４つ
のBcl部位を含む。可能な部位の各々にtsr
をもつた独立の組換えプラスミドを得ること
が望まれた。従つて、pVE1との制限酵素の
インキユベーシヨンにより、DNA試料が、
その酵素で部分的にのみ消化され、その酵素
で一度だけ開裂されたプラスミド分子がかな
りの数得られるように条件を設定した。これ
らの直鎖にした分子は、ライゲーシヨンに好
ましい基質となつた。この集団は、pVE1を
各々の可能な部位で直鎖にしたものの混合物
であると思われる。pVE1をμｇDNA当り
BglまたはBcl0.1から1.0単位酵素濃度で
インキユベートした。試料を５、10、20、40
および80分に取出し、アガロースゲル電気泳
動で分析することによつて完全消化産物の量
が最小で直鎖状分子が大部分を占めるような
条件を決定した。これらの条件は、各酵素バ
ツチに対し、経験的に決定しなくてはならな
かつた。 Bclで部分開裂したpVE1およびBglで
部分開裂したpVE1を、Bclで開裂した
pIJ39と、他のライゲーシヨンで述べた条件
下で混合、連結し、Thior形質転換株を、上
述の重層法により検出した。 (2) 組換えプラスミドの解析 チオストレプトン耐性集落を２度R2YE−
thio培地上で純化し、各ライゲーシヨンから
のいくつかの培養液を、プラスミド微量調製
分析により解析した。tsr挿入部位と、
BamH 1.9kb tsr断片またはBcl
1.1kb tsr断片の方向性を決定するために制
限消化を行つた。全てのライゲーシヨン実験
について、方向と位置を決めるために制限酵
素Claを用いた。Bclで部分開裂した
pVE1を検討した実験では、酵素Pvuも用
いた。各々が、pVE1を３回（図１参照）お
よびtsr断片を１回（図６参照）開裂するの
で、これらの実験には、この２つの酵素が有
用であつた。tsr BamHまたはBcl断片
は、各々１つの非対照的に位置するCla部
位およびpvu部位を含んでいる。このこと
で、tsr断片に対する方向の決定が可能とな
る。tsr中のPvu部位は、tsrからの２つの
Cla−Bcl断片の小さい方にあるCla部
位のごく近くにマツプされることが決定され
た。組換えThiorプラスミドをClaまたは
Pvuで消化することにより、pVE1および
tsrの制限地図から予言され得た断片が生じ
た。方向１は、BamHまたはBclのtsr断
片が、図２で描かれた組換えプラスミドの回
りを、時計廻りに動いたとき、tsr断片の中
点を過ぎてからClaまたはPvu部位に出
会うような方向と定義した。方向２は、この
向きの反対であつた。 以下の組換えDNAを、プラスミド微量調
製DNAの消化から得られたClaおよびPvu
制限パターンの解析により同定した。
pVE9およびpVE11は、1.9kbのBamH
tsr断片を、pVE1のBamH部位に各々、方
向１および２で含んでいた。pVE13および
pVE17は、1.1kbのBcl断片を、BamH
部位に各々方向１および２で含んでいた。
pVE19およびpVE21は、Bcl tsr断片を、
6.15kbのBgl部位に各々方向２および１で
含んでいた。pVE23は、1.1kbのBcl tsr
断片を、7.15kbのBgl部位に含む。pVE24
およびpVE26は、このtsr断片を、Bcl
1.5kb部位に各々方向２および１で含んでい
た。pVE33およびpVE35は、1.1kb Bcl
tsr断片を、pVE1上の0.33または0.4kbのBcl
部位に各々方向２および１で含んでいた。
しかし、これら２つの部位のどちらに挿入が
位置しているかは決定されなかつた。
pVE37およびpVE39は、この断片をBcl
4.3kb部位中に各々方向２および１で含んで
いた。 pVE1 DNA中に欠失を有する２つの組換
えプラスミドも得られた。欠失の範囲は、図
１中に示した酵素を利用した制限分析により
明らかにした。pVE30は、1.1kb Bcl tsr
断片を、6.15および7.15kbにある２つのBgl
部位間での1.0kbの欠失を伴つたBgl
6.15kb部位に方向２で含んでいた。その結
果、pVE30は、1.5kbの位置にただ１個所の
Bgl部位を有した。pVE28は、1.1kb Bcl
tsr断片を、Bgl6.15kb部位に方向２で
含んでいた。このプラスミドは、ほほ7kbの
欠失によつて、大きさわずかに5.1kbであつ
た。その欠失は、10kbのPvu部位を除去す
ることなく、その近傍に始まり、０／11kb
部位を越えて続き、ほぼ、tsrが挿入された
ところであるBgl6.15kb部位までのpVE1
DNAを除去した。 Ｆ 組換えプラスミドの伝達性の決定 各組換えプラスミドを含むS.lividansの菌株
を用いて接合を行ない、pVE1の自己伝達能に
とつて、どの部位への挿入が必須および必須で
ないかを決定した。S.lividansのストレプトマ
イシン耐性誘導株への接合は、相互組込みプラ
スミドpVE3を用いて、接合実験の項で述べた
ように実施した。接合は、R2YE平板上で行
い、次に、チオストレプトンおよびストレプト
マイシンを含むR2YE培地に転写した。 挿入を、pVE1のBamH部位にもつ４つの
プラスミド（pVE9、11、13および17）は、非
自己伝達性であつた。tsrをBamH部位から
約1.0kb離れたBgl1.5部位に含むpVE24およ
びpVE26も非自己伝達性であつた。大きな7kb
欠失をもつプラスミドpVE28もThiorを伝達し
得なかつた。他の全ての組換え体プラスミド
は、自己伝達（Tra+）であつた。この中には、
Bgl6.15または7.15kb部位どちらかに挿入し
たプラスミド、同様にこれら２つの部位間に
DNAの欠失をもつたpVE30が含まれていた。
0.33または0.4および4.3kbのBcl部位への挿
入を有する４種のプラスミドは、全てTra+で
あつた。 Ｇ pVE1誘導体のS.avermitilis中への形質転換 pVE1がS.avermitilisに対して有用なクロー
ニングベクターであるかを確かめるために、S.
avermitilis MA 4990のプロトプラストを
pVE17（BamH部位に1.1kb Bcl tsrをも
つたpVE1）およびpVE28（7kbの欠失をもつた
プラスミド）のプラスミドDNAで形質転換し
た。プロトプラストの調製ならびにプラスミド
DNAによる形質転換は、上述の如くであつた。
Thior形質転換株は、チオストレプトンを含む
軟寒天による重層再生平板法により検出した。
pVE17およびpVE28の両形質転換共S.
avermitilisのチオストレプトン耐性集落をも
たらした。各形質転換より、10個の集落を純化
し、プラスミド微量調製分析により解析した。
制限解析の結果は、全株が、形質転換に用いた
完全なpVE17およびpVE28を高コピー数含ん
でいることを示唆した。本実験は、pVE1の誘
導体がS.avermitilisでのクローニングベクター
として、成功裡に用い得ることを示した。 pVE1レプリコンが、どのように用いられ得
るかについての２つの詳細な例を以下に述べ
た。 例 ２ アバメクチン遺伝子のクローニング pVE17および、pVE28は、成功裡にS.
avermitilis中に導入された。従つて、好適なク
ローニングベクターである。pVE1レプリコン関
連のものはどれも、この目的に機能すると思われ
る。pVE17をBclまたはBglにより部分的に
消化する。同様に、pVE28をBglにより直鎖に
する。S.avermitilisの染色体DNAをSau3Aによ
り部分的に消化する。これらの酵素は、同じ5′4
塩基伸長部を産生する。アガロース・ゲル電気泳
動による分離の後に３から10kbのS.avermitilis
染色体断片を抽出する。これらの断片を開発した
プラスミドDNAと連結する。連結混合物を、ア
バメクチン合成系が遮断されたS.avermitilisの変
異株をチオストレプトン耐性に形質転換するのに
用いる。アバメクチン産生を模索するための簡単
な重層が開発されるまでは、アバメクチン生産を
可能とする組換えDNA上の野生型の相補遺伝子
を含んだ集落を同定するために、チオストレプト
ン耐性集落からの少量の培養液を、高圧液体クロ
マトグラフイーで検索する必要がある。 例 ３ 放線菌中へのＢ型肝炎表面抗原のクローニング Ｂ型肝炎表面抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原のＣ−
末端部の大部分をS.lividans中で発現される遺伝
子中に挿入することによりクローニングすること
ができる。表面抗原挿入部分が正しい方向および
翻訳あるいは、リーデイング・フレーム
（reading frame読みとり枠）にある場合は、Ｂ
型肝炎表面抗原の抗原性を有する融合蛋白が生産
される〔Edman、J.C.、Hallewell、R.H.、
Valenzuela、P.、Goodman、H.M.および
RnHer、W.J.、1981年“Ｂ型肝炎表面および、
コアー抗原の大腸菌中での合成”ネイチヤ
（Nature）291巻：503−506頁〕。本例において
は、Ｂ型肝炎表面抗原を、ネオマイシン耐性を与
える遺伝子中に挿入した。 Neor（図６参照）を与えるaph遺伝子は、pIJ2
DNAをSstにより開裂して得られた。この
1.0kb断片は、アガロースゲル電気泳動で純化し
た。そのベクターDNA（pVE1の唯一のBamH
部位にBcl tsr断片を挿入したpVE1の誘導体
で、例えば、pVE13またはpVE17）を、Sstで
部分的に消化した。pVE1は、数個所のSst部位
を有するので、直鎖分子を高収率で得るために
は、部分消化が必要である。開裂ベクターDNA
を、1.0kbのaph断片と連結し、S.lividansを
Thior Neorに形質転換するのに用いた。 Neor ThiorプラスミドのDNAをBamHで
開裂する。ベクターは、ネオマイシン耐性をコー
ドしている遺伝子の中央に近い位置に唯一の
BamH部位を有する。ベクターに、末端デオ
キシヌクレオチド転移酵素により約10から15デオ
キシグアノシン・ヌクレオチド残基を末端付加す
る。クローンしたＢ型肝炎ウイルスDNAをHinc
で消化し、Ｂ型肝炎表面抗原の部分（22アミノ
末端アミノ酸を欠く）を含む744塩基対をポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Edman、J.C.ほか、
1981年、前出）により単離する。この断片に約10
から15ヂオキシ・シチジンヌクレオチド残基を末
端付加する。この断片を次に、末端付加したベク
ターと対合させ、その混合物をS.lividansプロト
プラストの形質転換に用いてThiorを得、aph遺
伝子中への挿入に由来するネオマイシン感受性に
ついて検索する。これらの株からのプラスミド微
量調製DNAと、制限分析により検討し、Ｂ型肝
炎表面抗原断片の挿入されたプラスミドを同定す
る。これらの株を、期待されるネオマイシン燐酸
転移酵素−Ｂ型肝炎表面抗原融合蛋白の生産に関
して調べる。
図１：プラスミドpVE1の制限地図
位置は、唯一のHind部位である、標準の
０／11キロ塩基点からのその部位の距離がキロ塩
基対として与えられている。地図は、0.1キロ塩
基対以上の断片のアガロースおよびポリアクリル
アミドのゲル電気泳動および臭化エチジウムの染
色により決定し得る部位を酵素群について示して
いる。 図２：pVE1を１個所で切く制限酵素 この図は、便宜的に環状のpVE1プラスミドお
よびその中にある唯一の制限部位の位置を示して
いる。 図３および４：pVE28およびpVE30：pVE1の欠
失変種 これらの図は、各々、pVE1の２つの欠失変種
pVE28およびpVE30を示している。 pVE28およびpVE30は、Bcl tsr断片を、
Bglで部分的に消化したpVE1中にクローンす
る実験により得られたプラスミドである。 tsr遺伝子のpVE30中への挿入は、pVE1上の
6.15および7.15kbにある２つのBgl部位の間に
あるDNAの欠失を伴つている。pVE30は、３個
のBgl部位を含むpVE1に対比して、唯一のBgl
部位のみを含んでいる。 pVE28は、ずつと小型のプラスミドである。
tsr断片のBgl6.15kb部位への挿入は、7.2kbの
自然欠失を伴つている。pVE28は、クローニン
グに適当である唯一のBgl部位を有する。 図５：pVE1およびpIJ39の相互組込み体の構築 この図は、２つの提示されたプラスミドの相互
組込み体を調製するのに用いられた方法を述べて
いる。 図６： この図は、チオストレプトン（tsr）およびネ
オマイシン（aph）に対する耐性をコードする
BamH断片の制限地図を示している。 図７：プラスミド保持に必須でないpVE1の領域 この図中の白い領域は、プラスミドの安定性を
損うことなく欠失させ得る部分を示している。 図８：pVE1の挿入解析 この図は、挿入が安定性および自己伝達能に影
響するプラスミド上の部位を述べている。 図中、Ｕは、この部分への挿入がプラスミドを
不安定にすることを示し：＋は、この部分への挿
入を含むプラスミドがなお自己伝達性であること
を示し：−は、この部分への挿入を含むプラスミ
ドが最早自己伝達性でないことを示す。
０／11キロ塩基点からのその部位の距離がキロ塩
基対として与えられている。地図は、0.1キロ塩
基対以上の断片のアガロースおよびポリアクリル
アミドのゲル電気泳動および臭化エチジウムの染
色により決定し得る部位を酵素群について示して
いる。 図２：pVE1を１個所で切く制限酵素 この図は、便宜的に環状のpVE1プラスミドお
よびその中にある唯一の制限部位の位置を示して
いる。 図３および４：pVE28およびpVE30：pVE1の欠
失変種 これらの図は、各々、pVE1の２つの欠失変種
pVE28およびpVE30を示している。 pVE28およびpVE30は、Bcl tsr断片を、
Bglで部分的に消化したpVE1中にクローンす
る実験により得られたプラスミドである。 tsr遺伝子のpVE30中への挿入は、pVE1上の
6.15および7.15kbにある２つのBgl部位の間に
あるDNAの欠失を伴つている。pVE30は、３個
のBgl部位を含むpVE1に対比して、唯一のBgl
部位のみを含んでいる。 pVE28は、ずつと小型のプラスミドである。
tsr断片のBgl6.15kb部位への挿入は、7.2kbの
自然欠失を伴つている。pVE28は、クローニン
グに適当である唯一のBgl部位を有する。 図５：pVE1およびpIJ39の相互組込み体の構築 この図は、２つの提示されたプラスミドの相互
組込み体を調製するのに用いられた方法を述べて
いる。 図６： この図は、チオストレプトン（tsr）およびネ
オマイシン（aph）に対する耐性をコードする
BamH断片の制限地図を示している。 図７：プラスミド保持に必須でないpVE1の領域 この図中の白い領域は、プラスミドの安定性を
損うことなく欠失させ得る部分を示している。 図８：pVE1の挿入解析 この図は、挿入が安定性および自己伝達能に影
響するプラスミド上の部位を述べている。 図中、Ｕは、この部分への挿入がプラスミドを
不安定にすることを示し：＋は、この部分への挿
入を含むプラスミドがなお自己伝達性であること
を示し：−は、この部分への挿入を含むプラスミ
ドが最早自己伝達性でないことを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記に示される制限酵素開裂地図を有し、作
用しない制限酵素として、Hpa、Kpn、Nco
、Nde、PaeR7及びXhoが挙げられ、高コ
ピー数であり、自己伝達性を有する11Kbpのプラ
スミドpVE1。 【表】
【表】 ２ pVE1のゲノム全域あるいは部分、あるいは
以下のプラスミドから選択されるpVE1の誘導体
よりなるクローニング用ベクター。 （pIJ39とpVE1とがそれらのEcoR部位で結合
された相互組込みプラスミドであるpVE3； 1.9kbのBamH tsr断片を、pVE1のBamH
部位に方向１で含むpVE9； 1.9kbのBamH tsr断片を、pVE1のBamH
部位に方向２で含むpVE11； 1.1kb Bcl tsr断片とpVE1のBamH部位
に方向１で含むpVE13； 1.1kb Bcl tsr断片を、pVE1のBamH部
位に方向２で含むpVE17； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
BamH部位に方向２で含むpVE19； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
BamH部位に方向１で含むpVE21； 1.1kb Bcl tsr断片を、7.15kbでのpVE1の
Bgl部位に含むpVE23； 1.1kb Bcl tsr断片を、1.5kbでのpVE1の
Bgl部位に方向２で含むpVE24； 1.1kb Bcl tsr断片を、1.5kbでのpVE1の
Bgl部位に方向１で含むpVE26； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
Bgl部位に方向２で含み、ほぼ7kbの欠失ゆえ
に大きさは5.1kbであり、この欠失は、10kbでの
Pvu部位を除去することなくその近傍に始ま
り、０／11kb部位を越えて続き、ほぼtsrが挿入
されたところであるBgl6.15kb部位までの
pVE1 DNAを除去したものであるpVE28； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15および7.15での
２つのBgl部位間での1.0kbの欠失を伴なうBgl
6.15kb部位に方向２で含むpVE30； 1.1kb Bcl tsr断片を、0.33又は0.4kbでの
pVE1のBcl部位に方向２で含むpVE33； 1.1kb Bcl tsr断片を、0.33又は0.4kbでの
pVE1のBcl部位に方向１で含むpVE35； 1.1kb Bcl tsr断片を、4.3kbでのpVE1の
Bcl部位に方向２で含むpVE37；及び 1.1kb Bcl tsr断片を、4.3kbでのpVE1の
Bcl部位に方向１で含むpVE39であつて、 ここで方向１はBamH又はBclのtsr断片
が、pVE1プラスミドの回りを時計廻りに動いた
とき、tsr断片の中点を過ぎてからCla又はPvu
部位に出会うような方向として定義され、方向
２は、その向きの反対であると定義される。） ３ pVE1のゲノム全域あるいは部分、あるいは
以下のプラスミドから選択されるpVE1の誘導体
よりなるクローニング用ベクターにより形質転換
された、ストレプトアイセス及び大腸菌からなる
群から選択された微生物。 （pIJ39とpVE1とがそれらのEcoR部位で結合
された相互組込みプラスミドであるpVE3； 1.9kbのBamH tsr断片を、pVE1のBamH
部位に方向１で含むpVE9； 1.9kbのBamH tsr断片を、pVE1のBamH
部位に方向２で含むpVE11； 1.1kb Bcl tsr断片とpVE1のBamH部位
に方向１で含むpVE13； 1.1kb Bcl tsr断片を、pVE1のBamH部
位に方向２で含むpVE17； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
BamH部位に方向２で含むpVE19； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
BamH部位に方向１で含むpVE21； 1.1kb Bcl tsr断片を、7.15kbでのpVE1の
Bgl部位に含むpVE23； 1.1kb Bcl tsr断片を、1.5kbでのpVE1の
Bgl部位に方向２で含むpVE24； 1.1kb Bcl tsr断片を、1.5kbでのpVE1の
Bgl部位に方向１で含むpVE26； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
Bgl部位に方向２で含み、ほぼ7kbの欠失ゆえ
に大きさは5.1kbであり、この欠失は、10kbでの
Pvu部位を除去することなくその近傍に始ま
り、０／11kb部位を越えて続き、ほぼtsrが挿入
されたところであるBgl6.15kb部位までの
pVE1 DNAを除去したものであるpVE28； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15および7.15での
２つのBgl部位間での1.0kbの欠失を伴なうBgl
6.15kb部位に方向２で含むpVE30； 1.1kb Bcl tsr断片を、0.33又は0.4kbでの
pVE1のBcl部位に方向２で含むpVE33； 1.1kb Bcl tsr断片を、0.33又は0.4kbでの
pVE1のBcl部位に方向１で含むpVE35； 1.1kb Bcl tsr断片を、4.3kbでのpVE1の
Bcl部位に方向２で含むpVE37；及び 1.1kb Bcl tsr断片を、4.3kbでのpVE1の
Bcl部位に方向１で含むpVE39であつて、 ここで方向１はBamH又はBclのtsr断片
が、pVE1プラスミドの回りを時計廻りに動いた
とき、tsr断片の中点を過ぎてからCla又はPvu
部位に出会うような方向として定義され、方向
２は、その向きの反対であると定義される。） ４ 該微生物がストレプトマイセス・アベルミタ
イリスである特許請求の範囲第３項記載の微生
物。 ５ pVE1のゲノム全域あるいは部分、あるいは
pIJ39とpVE1とがそれらのEcoR部位で結合さ
れた相互組込みプラスミドであるpVE3； 1.9kbのBamH tsr断片を、pVE1のBamH
部位に方向１で含むpVE9； 1.9kbのBamH tsr断片を、pVE1のBamH
部位に方向２で含むpVE11； 1.1kb Bcl tsr断片とpVE1のBamH部位
に方向１で含むpVE13； 1.1kb Bcl tsr断片を、pVE1のBamH部
位に方向２で含むpVE17； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
BamH部位に方向２で含むpVE19； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
BamH部位に方向１で含むpVE21； 1.1kb Bcl tsr断片を、7.15kbでのpVE1の
Bgl部位に含むpVE23； 1.1kb Bcl tsr断片を、1.5kbでのpVE1の
Bgl部位に方向２で含むpVE24； 1.1kb Bcl tsr断片を、1.5kbでのpVE1の
Bgl部位に方向１で含むpVE26； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15kbでのpVE1の
Bgl部位に方向２で含み、ほぼ7kbの欠失ゆえ
に大きさは5.1kbであり、この欠失は、10kbでの
Pvu部位を除去することなくその近傍に始ま
り、０／11kb部位を越えて続き、ほぼtsrが挿入
されたところであるBgl6.15kb部位までの
pVE1 DNAを除去したものであるpVE28； 1.1kb Bcl tsr断片を、6.15および7.15での
２つのBgl部位間での1.0kbの欠失を伴なうBgl
6.15kb部位に方向２で含むpVE30； 1.1kb Bcl tsr断片を、0.33又は0.4kbでの
pVE1のBcl部位に方向２で含むpVE33； 1.1kb Bcl tsr断片を、0.33又は0.4kbでの
pVE1のBcl部位に方向１で含むpVE35； 1.1kb Bcl tsr断片を、4.3kbでのpVE1の
Bcl部位に方向２で含むpVE37；及び 1.1kb Bcl tsr断片を、4.3kbでのpVE1の
Bcl部位に方向１で含むpVE39であつて、 ここで方向１はBamH又はBclのtsr断片
が、pVE1プラスミドの回りを時計廻りに動いた
とき、tsr断片の中点を過ぎてからCla又はPvu
部位に出会うような方向として定義され、方向
２は、その向きの反対であると定義されるプラス
ミドから選択されたpVE1の誘導体中に追加
DNAを取込ませる方法において、これらプラス
ミドを制限エンドヌクレアーゼにより開裂させ、
開裂プラスミドを追加DNAと組合せ、及びもと
のプラスミドの全体もしくは部分DNAと追加
DNAとを取込んだプラスミドの形成を伴なう結
合を行わせるためにその混合物を処理することよ
り成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47318183A | 1983-03-08 | 1983-03-08 | |
| US473181 | 1983-03-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59169496A JPS59169496A (ja) | 1984-09-25 |
| JPH0145355B2 true JPH0145355B2 (ja) | 1989-10-03 |
Family
ID=23878525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044794A Granted JPS59169496A (ja) | 1983-03-08 | 1984-03-08 | ｒＤＮＡクロ−ニング用ベクタ−ｐＶＥ１，欠失および雑種変異体、およびその組換え誘導体、生産物および方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0118367B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59169496A (ja) |
| DE (1) | DE3477936D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5194387A (en) * | 1988-05-09 | 1993-03-16 | Merck & Co., Inc. | Process for the incorporation of DNA molecules into microorganisms with methyl-specific restriction systems |
| DE69023036T2 (de) * | 1989-03-31 | 1996-06-13 | Merck & Co Inc | Klonierung von Streptomyces avermitilis Genen zur Biosynthese von Avermectin und Verfahren zu ihrer Verwendung. |
| US5252474A (en) * | 1989-03-31 | 1993-10-12 | Merck & Co., Inc. | Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use |
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| BR112015002724B1 (pt) | 2012-08-07 | 2022-02-01 | Total Marketing Services | Método para produzir um composto não catabólico heterólogo, e, composição de fermentação |
| AU2014227811C1 (en) | 2013-03-15 | 2018-09-27 | Amyris, Inc. | Use of phosphoketolase and phosphotransacetylase for production of acetyl-coenzyme a derived compounds |
| WO2015020649A1 (en) | 2013-08-07 | 2015-02-12 | Amyris, Inc. | Methods for stabilizing production of acetyl-coenzyme a derived compounds |
| EP3313996A1 (en) | 2015-06-25 | 2018-05-02 | Amyris, Inc. | Maltose dependent degrons, maltose-responsive promoters, stabilization constructs, and their use in production of non-catabolic compounds |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57188600A (en) * | 1981-05-15 | 1982-11-19 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Novel actinomycetic plasmid |
| DE3128669A1 (de) * | 1981-07-20 | 1983-02-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "plasmid p svh 1 und seine verwendung" |
-
1984
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- 1984-03-06 DE DE8484400446T patent/DE3477936D1/de not_active Expired
- 1984-03-08 JP JP59044794A patent/JPS59169496A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION CATALOG OF STRAINS I FIFTEENTH EDITION=1982 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0118367A2 (en) | 1984-09-12 |
| DE3477936D1 (en) | 1989-06-01 |
| JPS59169496A (ja) | 1984-09-25 |
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| EP0118367A3 (en) | 1985-08-14 |
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