JPH01463A - 検査方法，検査器および検査キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体液等の試料中の被検成分を検出するのに
好適な検査方法、検査器および検査キットに関する。

〔従来の技術〕

臨床検査の分野において、従来の湿式分析法を採用した
分析器は、機器の保守、試薬の調製や保管、操作などの
整雑さに問題があるが、高精度。

高処理能力などの点に優れており、特に臨床化学検査の
分野において広く悴及してきた。これに対して、最近、
乾式分析法（ドライケミストリー）が開発されつつあり
、分析機を操作せずとも、緊急時に検査結果を得ること
ができるようになってきている。たとえば、尿検査に用
いる試験紙もドライケミストリーの一種であるし、近年
、開発された多層フィルム式のドライケミストリーもあ
る。

さらには、ディスポーザブルの担持体を用いて湿式分析
を行ない、反応に用いた水分を担持体に保持させてしま
うというシステムも大きく分類すればドライ方式という
ことができる。これまでは精度の低い結果を出すにすぎ
なかったこれらのドライ方式も、近年になり反応の特異
性を高めて精度の高い検査結果を出すことができるよう
になってきている。また、ドライ方式と免疫分析方法を
組合せた微量成分の高感度検出方法も試みられている。

このような経過により、ドライ方式で使用される化学反
応は、酵素反応あるいは免疫反応などのように特異性が
゛高い反応を採用する場合が多くなった。また複数の反
応のくみあわせにより分析精度や検出感度を高める工夫
もなされているなど、分析法の発展は著しく、将来の応
用範囲は°非常に広い。

例えば、免疫学的に妊娠の有無を判定し得る方法は、特
開昭６１−１８２５７７に示されている。この例では、
活性基を有するラテックス担持体β−ｈＣＧ（ヒト絨毛
性ゴナドトロピンのβ鎖サブユニット）抗血清を組合せ
てｈＣＧの検出を行っている。−方、特開昭５２−８２
８９２には、湿式反応を利用するものであるが、家庭で
妊娠判定の可能な方法が提案されている。この例では、
特定の酵素による皇色反応を利用している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来技術においては、反応担持体での反応の進行状況の
確認や、試薬の活性又は劣化の確認ができなかった。上
述したようなドライ方式は、その簡便さの故に家庭人で
あっても使える利点があるが１反面、おのずと試薬を保
存する期間も長くなることが多く、試薬の保存環境の問
題もあり、試薬の活性が劣化している場合には誤判定を
与える原因となる。保存期間中の試薬の劣化がないこと
や、複数種の化学成分が有効に働くこと等を確認できる
ことは、検査結果の信頼性を向上させる上で重要である
が、従来はそのような確認を簡単に行い得る手段がなか
った。

本発明の目的は、簡単に試薬の劣化を確認できるととも
に、被検成分の有無も確認できる検査方法、検査器およ
び検査キットを提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の検査方法は、被検成分の有無を検査すべき液体
試料を、被検成分と反応する反応性物質を担持した第１
の担持体および被検成分と同種の物質を担持した第２の
担持体に′接触させること、被検成分が存在したときに
着色に関与する着色剤を上記第１および第２の担持体に
接触させることを特徴とする。

本発明の検査器は、被検成分との反応性物質および被検
成分と同種の物質を担持した担持体を備え、上記担持体
を配置した液体試料受入容器を備えたことを特徴とする
。

本発明の検査キットは、被検成分と反応する反応性物質
を担持した第１の試験片と、被検成分と同種の物質を担
持した第２の試験片と、被検成分が存在したときに上記
第１および第２の試験片の着色に関与する着色剤を備え
ていることを特徴とする。

本発明の望ましい実施例では、免疫反応や酵素反応の如
き特異反応を利用しており、免疫反応を利用する場合に
は検出用物質は抗原又は抗体であり、同種の物質は同系
の抗体又は抗原である。酵素反応を利用する場合には同
種の物質として酵素を担持させる。

〔作用〕

本発明では、試薬に活性があって有効であり。

かつ試料中に被検成分が存在すれば、検出用物質および
被検成分に同種の物質の両者が着色する。

試薬に活性があり、かつ試料中に被検成分が存在しなけ
れば、両種の物質だけが着色する。そして、試薬に活性
がなく劣化していれば、両者共に着色しない。従って、
試薬の有効性を筒単にチエツクできる。

〔実施例〕

例えば、反応用支持体の一部分に、あらかじめ測定対象
成分を担持させておくと１反応用支持体において試料中
の測定成分と、前記担持成分は、分析試薬に対して同等
の反応性を示すので、前記担持成分による反応で試薬の
状態や反応の進行をチエツクしながら、試料成分を分析
することができる。

また、例えば、反応の特異性の高い免疫反応を反応支持
体上で行なわせる場合の反応としては。

測定成分である抗原に対する抗体を反応支持体上に固定
化して、試料成分と反応させたのちに、標識された第２
の抗体を反応させて、反応支持体上の標識量をもとに成
分を分析する方法を考えることができる。例えば、標識
物質が酵素である場合には、反応支持体にあらかじめ前
記酵素を担持させた部分をつくっておくことにより、酵
素反応の進行を確認することができる。免疫分析方法に
限らず、呈色反応などに酵素が関与する場合には、同様
にして反応が進行していることを確認しながら試料成分
を分析することができる。

また、上記の酵素以外であっても、試料成分の分析のた
めの反応に関与する成分を反応支持体に担持させておく
ことにより、反応の進行を確認しながら試料成分の分析
が可能である。

これまで、反応支持体を用いて成分を分析するいわゆる
ドライケミストリーの領域においては、例えば呈色反応
により結果を判定する場合に、予想される呈色が認めら
れないときに、呈色反応を含めて分析のための反応の進
行に支障があったのか、あるいは、成分の１度が検出限
界以下であったのかを区別することはできなかった。

本発明に基づけば、液体試料中の被検成分を検出するた
めの反応に関与する物質を平面状の反応用支持体に担持
させることにより達成される。二のとき、該担持物質は
、反応支持体りで本来の測定成分である試料中の被検成
分が反応する部位とは異なる部位（場所）にあらかじめ
担持される。

すなわち、分析結果判定時に、反応の進行状況をチエツ
クする部位と、被検成分の分析結果の判定部位を、それ
ぞれ別個に判定できるように、被検成分を検出するため
の反応に関与する物質は、反応支持体に担持される。

試薬と反応させたとき、反応支持体上の反応のチエツク
部位が、呈色などの変化を何ら示さない場合には、反応
の進行上で何らかの支障があったと推定される。このた
め、試料成分の分析部位においても呈色などの変化が認
められなかった場合においても、試料成分が含まれてい
ないか、あるいは検出限界濃度以下であるかを判断する
ことはできない。しかしながら、例えば、反応支持体」
二の反応チエツク部位は呈色などの変化を示しているの
に対して、試料成分の分析部位には変化が認められない
場合には、試料中に被検成分が含まれていないか、ある
いは、存在していたとしてもその濃度は、分析方法の検
出限界の濃度以下であると判断することができる。

本発明において用いられる反応用支持体は、従来よりド
ライケミストリーの分野で繁用されている濾紙でもよい
し、ナイロンフィルム、ポリエステルフィルムなどでも
よい。また、反応用支持体として各種充てん剤を使用し
、これらをカラムに充てんして使用してもよい。充てん
剤としては、ラテックス粒子や、ビーズ型のアガロース
、セファロースなど種々のものを使用することができろ
。

本発明に基づく検査キットは、試料中の被検成分の分析
のための反応に関与する成分を担持させた反応用支持体
、抗体溶液、呈色液および緩衝液から成る。各成分の組
成および濃度は、分析対象の成分の種類によって至適条
件が決められる。

以下に本発明の詳細な説明する。

実施例１ 第１図において、同筒状ケース１０は試薬に対して安定
な材料例えば、ガラスや合成樹脂から形成される。ケー
ス１０の底部付近には１円板状の担持体２ｏが固定され
、この担持体２０は多孔性物質からなる層２１とセルロ
ース膜２２を備えている。セルロース膜２２には、試料
中の測定対象成分と同種の物質２３が局在するよう担持
され、かつ試薬と反応して着色を生じ得る検出用物質２
４が局在するよう担持される。これらの物質は、所定形
状のパターンを形成するよう局在される。

ケース１０は、担持体を通過した試料液および試薬液を
受は入れる排液用受器３０に着脱可能に装着される。担
持体２０の本来の色は白色であり、担体された物質は反
応の種類によって各種の色に着色し得る。

次に、このような一実施例を用いた実験例について説明
する。

市販のセルロース膜２２の一部分にヒトＨＣＧ２３を結
合させ、他の部分に抗ヒトＨＣＧ抗体２４を結合させた
。次に、前記セルロース膜２２を吸水性の多孔性物質２
１に吸着させた。第１図のように構成した後、このＨＣ
Ｇ検出用の反応担持体２０上に、尿試料１００μＱを添
加し５分間放置した。次に、アルカリホスファターゼ標
識抗ヒトＨＣＧ抗体を１００μＱ添加し、余分の水分を
多孔性物質を吸水させたのち、５分間室温に放置した。

その後、トリス液酸緩衝液（ｐＨ７，８）を１μＱ添加
し、水分と過剰の標識抗体液は、多孔性物質２１に吸水
させて除いた。さらに基質であるＰ−二１−ロフェニル
リン酸溶液を加えて反応支持体上で５分間、酵素反応さ
せた。生成するｐ−ニトロフェノールに由来する黄色の
着色の有無により、試料中にＨＣＧが含まれていたか否
かを判定した。試料中のＨＣＧの有無によらず、前記Ｈ
ＣＧ結合部位は、黄色に着色した。このことから酵素反
応は、支障なく進行したことが確認できた。

第２図に、判定の一例を示す。

反応担持体にあらかじめ担持させる成分の担持場所（パ
ターン）を工夫することにより、定性判定において被検
成分のないマイナス判定ではマイナス印に、被検成分の
あるプラス判定の場合にはプラス印に着色させることも
可能である。例えば、第２図の例で説明すると、あらか
じめ、ＨＣＧを２３の部位に担持させ、２４の部位に抗
ＨＣＧ抗体を担持させておくと、試料中にＨＣＧが含ま
れないとき（第２図Ａ）にはマイナスに、ＨＣＧが含ま
れるとき（第２図Ｂ）にはプラスに着色する。

しかし、各成分を担持させる部位は、この限りでないこ
とはいうまでもない。また、試薬が劣化している場合に
は、マイナス印も、プラス自現われない。

第　　１　　表 第１表には、実施例１に基づぐ方法と従来法との検査結
果の比較を示す。第１表では、いずれも正常妊娠法１０
０例で陽性と判断された試料を用いて、試薬の経時変化
による有効性をチエツクした結果を示す。本発明を適用
した欄における分子の数値は、尿が陽性を示した試料数
を示し、分母の数値は、担持体のＩ（ＣＧ固定部位が着
色した（すなわち試薬の活性が認められた）試料数を示
す。分子と分母は一致している。従来法の欄において１
００との差の数は、本来陽性であるにもかかわらず、結
果が陰性であるとして誤判断された数に相当する。

例えば、試薬キット調製後１２ケ月を経た試薬を用いる
と１本発明の場合には、試料１００例中、８０例におい
て、反応の進行に支障がなく、あわせてこの金側におい
て、試料成分分析部に呈色が認められた。しかし、１０
０例中２０例については１反応チエツク部位であるＨＣ
Ｇ結合部位の呈色は認められず１分析反応の進行上支障
がおきていると判断できた。従来試薬では、１００例中
７５例がＨＣＧ陽性という結果を得たが、残る２５例に
ついては、ＨＣＧ陽性尿であるにもかかわらず、ＨＣＧ
陰性を示した。

実施例２ 濾紙（ＴＯＹＯＮａ５１）をＩＸ２ｃＭに切り抜き、試
験片母材とした。約１ｇ（５００枚）の母材を２０ｍＱ
の５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ１２，１）に懸濁し
て１０ｍＱの水を加えた。スター５−で撹拌しながら１
０ｍＱのＢｒＣＮ溶液（０，１ｇ／ｍＱ）を２分間はど
で徐々に加え、さらに６分間反応させた。反応は４℃で
行なった。反応後、直ちに氷冷した大量の０．００５Ｍ
　Ｎａ１（Ｃｏ３溶液で洗浄し、５ｍｇの精製抗ＡＦＰ
抗体と室温で８時間反応させた。さらに１Ｍエタノール
アミン（ｐＨ８，０）と４℃で一晩反応させたのち、０
　、５　Ｍ　ＮａＨＣＯａ　。

０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）、０．０１５Ｍ　Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７，２）で順次洗浄し、１．５ｍＭ　　ＰＢ
Ｓ（ｐＨ７，２）中で凍結乾燥した。こうして、第１の
試験片を得た。

同様の方法で、濾紙片にＡＦＰを結合させて凍結乾燥し
、第２の試験片を得た。

検体１００μＱを抗ＡＦＰ抗体結合試験片およびＡＦＰ
結合試験片にそれぞれ加えて、室温で１６時間反応させ
た。１ｍＱの０．９％ＮａＣＱで２回洗浄したのち、ア
ルカリホスファターゼ標識抗体０．１ｍＱを加えて室温
で２４時間反応させた。

それぞれの試験片を別々のガラスの試験管に移し、１ｍ
（ｌの０．９％ＮａＣＱで３回洗ったのち、基質溶液１
ｍＱを加えて２５°Ｃ６０分間反応させた。

Ａ　Ｆ　Ｔ”結合試験片と抗ＡＦＰ抗体結合試験片が両
方とも着色した場合を、ＡＦＰ陽性とした。この場合、
ＡＦＰ結合試験片は、試薬の有効性を判別するために用
いられている。

この実施例方法は、ＡＦＰ検査キットとしてユーザーに
供給する。すなわち、検査キットは、抗ＡＦＰ抗体結合
試験片、ＡＦＰ　（抗原）結合試験片、洗浄用ＮａＣＱ
溶液、アルカリホスファターゼ標識抗体試薬液、基質試
薬液、および反応容器としての試験管等を備えている。

実施例２においても、試薬の活性はあるが試料中の被検
成分濃度が所定濃度以下であるときには、被検成分と同
種の物質のある場所が着色し、試薬の活性があって試料
中の被検成分濃度が所定濃度以上であるときには、被検
成分と同種の物質のある場所および被検成分との反応性
物質のある場所の両方が着色するという現象を利用して
いる。

実施例２では、それぞれの試験片を別の反応容器中で反
応させたが、２種類の試験片を接合するなどして実質的
に一体化し、実施例１のように１つの容器中で反応させ
ることもできる。この場合、検査用キットには、２種類
が一体化された試験片が準備される。

〔発明の効果〕

本発明によれば、反応の進行状況や試薬の劣化を確認で
き、同時に被検成分の検出も行うことができるので、検
査結果の信頼性が向上する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の概略構成を示す断面図、第
２図は定性反応の判定パターンの一例を示す図である。 １０・・・ケース、２０・・・担持体、２３・・・ＨＣ
Ｇ担持部、２４・・・抗ＨＣＧ抗体担持部。　　　　　
　　　２．Ｘ′、フサ！　　・・　詐

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被検成分の有無を検査すべき液体試料を、被検成分
   と反応する反応性物質を担持した第１の担持体および被
   検成分と同種の物質を担持した第２の担持体に接触させ
   ること、被検成分が存在したときに着色に関与する着色
   剤を上記第１および第２の担持体に接触させることを特
   徴とする検査方法。 ２、被検成分との反応性物質および被検成分と同種の物
   質を担持した担持体を備え、上記担持体を配置した液体
   試料受入容器を備えたことを特徴とする検査器。 ３、特許請求の範囲第２項記載の検査器において、上記
   検出用物質は抗原又は抗体であり、上記同種の物質は同
   系の抗体又は抗原であることを特徴とする検査器。 ４、特許請求の範囲第２項記載の検査器において、上記
   同種の物質は酵素であることを特徴とする検査器。 ５、被検成分と反応する反応性物質を担持した第１の試
   験片と、被検成分と同種の物質を担持した第２の試験片
   と、被検成分が存在したときに上記第１および第２の試
   験片の着色に関与する着色剤を備えていることを特徴と
   する検査キット。