JPH0476628B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、不均一系２座イムノアツセイの原理
により結合性被分析物を測定する方法及び試薬に
関する。 従来の技術 ２座イムノアツセイ（サンドイツチ試験）は桔
抗イムノアツセイに比較して正確さ、感度及び実
施の迅速性に関して明瞭な利点を呈する。試薬、
使用物質又は試料の濃度が変動すると免疫化学的
測定法では測定値は最大値を通過してしまう。こ
の効果はフツク効果（Hook−Effekt）と表わさ
れる。固相が関与するサンドイツチイムノアツセ
イでは、初めは被分析物の量が上昇すると測定シ
グナルも上昇するのが認められ、その後被分析物
が更に増加すると測定シグナルは再び低下し得
る。この場合に、ある決まつた測定結果は被分析
物の２つの別々の量により得られる（第１図参
照）。被分析物の量に左右されるこの効果は高量
フツク効果（“High Dose”Hook−Effekt）と
表わされ、前記の利点にもかかわらずサンドイツ
チアツセイの使用は限定される。 フツク効果に関しては、レセプター中に存在す
る抗体の不均一性もしくは不完全な洗浄のような
種々の理由が挙げられる〔D.ロツドバード
（Rodbard）及びその他共著、“イムノケミストリ
ー（Immunochemistry）”、第15号、77〜82頁
（1978）参照〕。しかしながらそれとは関係なく理
論的な考察からフツク効果はすべての１工程サン
ドイツチ試験（Einschritt−Sandwich−Teet）
で必然的に起るはずである。この場合、１工程試
験とは、被分析物を、それに対して特異的でその
被分析物と“サンドイツチ”を形成する２つのレ
セプターと、同じ溶液中で反応させ、かつその際
にもしくは引続いて不溶性担持材料に固定させる
すべての試験であり、これは被分析物を第１の特
異的レセプターと反応させかつ形成された複合体
を固相に固定させた後で、結合しなかつた被分析
物を、第２の特異的な標識したレセプターと反応
させる前に固相を洗浄することにより除去する連
続反応法とは異なる。１工程サンドイツチ試験で
は、両方の特異的なレセプターが被分析物に対し
て過少量で存在している場合に、被分析物の一部
だけが接合体と複合しかつこの複合体からもその
一部だけが固相に固定されて、フツク効果が必然
的に生じる。 両方の特異的レセプターが可溶性でありかつ被
分析物とのそれらの複合体が他のレセプターを介
して固相に固定されるDASPサンドイツチ原理を
適用するすべての蛋白質測定も前記の意味で１工
程試験でありかつフツク効果を呈する。これは、
とりわけ例えばAFP、CEA、hCG、IgE等のよう
な腫瘍遺伝標識の場合に、極めて病的な試料でも
正常な範囲の結果をもたらすことがある。それ
故、しばしば医学的な測定に当つて１工程サンド
イツチ法の適用は基本的に否定される。フツク効
果により偽値で得られるそのような測定結果を検
出することは著しい進歩である。それというのも
１工程サンドイツチ法のすべての利点（反応時間
の短縮、感度、正確さ等）を利用することがで
き、しかもフツク効果による間違つた結果を甘受
する必要もないからである。 K.L.ホフマン（Hoffmann）及びその他〔“ク
リニカル・ケミストリー（Clinical
Chemistry）”、第30巻、No.９、1499頁（1984年）〕
は、フツク効果の発生を阻止するために多くの実
験を行なつたことを報告している。例えば、初め
に被分析物を固相に結合しているレセプターと反
応させ、その後固相を粗く洗浄し、次に標識した
可溶性レセプターと第２の恒温保持をし、最後に
２回目の洗浄を行なつて、結合した標識したレセ
プターを結合していないものから分離する工程的
分析が提案されている。その他に、試料の大きさ
を小さくしたり、試験を異なる稀釈度の被分析物
で実施したり又は小さな範囲の検量線だけを使う
ことが提案されている。高濃度の標識したレセプ
ターを使用できるように低活性の標識剤を使用す
ることも推奨され、その際に活性度（放射性、け
い光、酵素、呈色の活性度）は著しく大きくはな
らない。 更に、ホフマン及びその他（前記文献）は、固
相に結合する、標識化レセプター分の増加を動力
学的に追跡し、かつこの数値をコンピユータに蓄
積する１工程サンドイツチ試験測定法を記載して
いる。その後、反応速度を計算する。その際に、
フツク効果により生じた測定結果は、それが著し
く低い複合体結合の増加を有するので、それによ
り他の数値から区別することができる。この方法
は、測定の際にフツク効果が存在するかどうかを
知るために、非常に経費のかかる、高価なコンピ
ユータ法を適用しなければならないという欠点を
有する。その上、この方法は酵素免疫学的測定に
は不適当である。 発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の目的は、フツク効果が惹起す
る誤つた測定結果を簡単に知ることができて、し
かもその際に公知の方法に内在する欠点、例えば
感度、正確さの低下もしくは高められた作業、試
薬及び装置の無駄を甘受する必要のない方法を開
示することである。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、これは不均一系イムノアツセ
イの原理により、被分析物を含有する試料溶液
を、被分析物と結合性で特異的な、溶解相中に存
在する標識した第１レセプター及び第１レセプタ
ーとは交叉反応せずかつ被分析物と第１レセプタ
ーを含有する複合体を固定し得る、固相中に存在
する第２レセプターと共に恒温保持し、恒温保持
後に相分離し、かつ固相に結合した標識を定量測
定することによる結合性被分析物の測定法により
解決され、この方法は固相に結合した標識の溶解
相中への逆解離速度を測定するが、その際逆解離
速度は、固相に結合した標識の第１回目の測定に
対して20秒間乃至60分間の時間をおいて少なくと
も１回第２回目の測定を行なうことにより確定
し、かつ逆解離速度と固相に結合した標識の定量
測定値との商を第１回目の測定の試験結果の正確
さの尺度として使うことを特徴とする。 常法のサンドイツチ試験では、試料−及び試薬
液体の分離後に固相に固定したサンドイツチ複合
体を、結合した標識化レセプター（放射線、酵
素、けい光等により標識した）の量を介して測定
する。この分離及び結合していない標識化レセプ
ターの除去により、被分析物／レセプターの結合
の平衡が妨害されて、サンドイツチ成分の逆解離
が開始し、これは最終的には固相に固定されなか
つた標識化レセプター分子が液相中に存在する結
果をもたらす。逆解離度は固相又は分離された液
相中の標識及び相分離を測定することにより確定
することができる。例えば、液相としては清浄液
及び酵素イムノアツセイでは酵素測定のための基
質溶液が該当する。本発明により、この基質溶液
中で初めに相分離の時点で発生した測定値（呈色
シグナル）を測定し、かつ引続いてそれ以上の色
素形成の動力学を標識の逆解離の尺度として測定
する。 被分析物／レセプター複合体の逆解離により惹
起される標識の遊離は一次反応として進行するの
で、その遊離量は被分析物量もしくはその測定シ
グナルに比例する。従つて、遊離した標識量は商
α（相分離後の単位時間当りの測定値の変化を測
定値により除する）により表わすことができる。
フツク効果が起こつた場合には、商αはフツク効
果が起こらなかつた場合に比べて明瞭に変化する
のは驚異的であつた。 従つて、得られた測定値を検量線を用いて被分
析物量に換算することができるかどうか、あるい
は測定値がフツク効果により得られ、それ故最高
標準値を上廻る被分析物の量のせいかどうかを商
αにより決定することができる。 本発明方法の範囲では被分析物及びレセプタと
して原則的に相互に結合性であるすべての物質の
組み合せであつてよい。この定義において、免疫
学的に結合性の物質の組み合せ以外に、類似の挙
動を示すような物質の組み合せも本発明の範囲に
包含される。まず第一に該当する優れた物質の組
み合せの抗原−抗体（抗体にはポリクロナール並
びにモノクロナールから由来する公知の免疫学的
に活性のフラグメントも包含する）と共に、蛋白
質Ａ−免疫グロブリンＧ、アビジン−ビオチン、
コンカナバリンＡ−レクチン並びにDNA−DNA
（ハイブリツド結合）の組み合せが包含される。
すべてのこれらの組み合せは不均一系イムノアツ
セイ（サンドイツチ試験）の原理により本発明方
法で１工程恒温保持下に測定することができる。 レセプターとして本発明範囲においては、前記
の特異的に結合性の物質組み合せの成分がそのま
まか又はその誘導体、特にしばしば接合体と呼ば
れる、標識分子への共有結合により形成される結
合性物質の誘導体が該当する。本発明範囲で有利
に使われる。接合体として存在するようなレセプ
ターの例は、標識酵素と共有結合している抗体又
は抗体フラグメントである。標識酵素の代りに色
素分子、色素形成成分、特にけい光色素分子又は
検出系に好適な他の物質を使用することもでき
る。この種の接合体は放射性標識されていてもよ
い。 場合により、抗体自体が標識として放射性原子
を含有していてもよい。この場合に、例えば標識
された第１レセプターは放射性抗体から成る。 固相に結合している第２レセプターも前記の結
合性の物質の組み合せの成分からそのままで又は
その誘導体から成つていてよい。固相に結合して
いる第２レセプターはサンドイツチアツセイにお
いて、被分析物と第１レセプターとからの複合体
を固相に固定し、それ故液相から簡単に分離可能
にするのに有用である。この際に、第２レセプタ
ーは直接測定すべき被分析物と結合してよく、こ
の際にこのレセプターは第１レセプターとは別の
被分析物決定因子に対して作用し、それ故モノク
ロナール抗体又はそのフラグメントから成ると有
利である。しかしまた第２レセプターは、被分析
物には存在していない、被分析物と第１レセプタ
ーとからの複合体の他の決定因子に作用してよ
い。この実施形では、同様に被分析物に対して特
異的でありかつ第１レセプターとは別の決定因子
を識別する第３レセプターを使用すると有利であ
る。被分析物、第１レセプター及び第３レセプタ
ーは１つの複合体を形成し、この場合には第２レ
セプターとして第３レセプターと結合する抗体を
使用すると有利である。特に優れた実施形におい
て特異的な第１レセプターは抗体フラグメント、
特にFab−フラグメントを含有し、かつ第３レセ
プターは完全抗体より成り、その際に第３レセプ
ター及び第１レセプターの抗体部分はモノクロナ
ールである。この場合に第２レセプターは、第１
レセプターがFab−フラグメントを含有する場合
に第３レセプターの一部、特に有利に第３レセプ
ターのFc部分に対して作用すると有利である。
第３レセプターを誘導化しかつこの誘導化位置に
対して作用する第２レセプターを使用することも
可能である。 本発明方法に重要な、固相に結合した標識の逆
解離速度は、被分析物に対して作用するレセプタ
ーと被分析物との間の結合強度により測定する。
本発明の優れた実施形により、逆解離速度を少な
くとも１つの被分析物濃度に対して平均値に調節
し、即ち非常に高い逆解離速度も、非常に低い逆
解離速度も望ましくない。速度が非常に高い場
合、測定間隔は次第に短くなり、これは不正確さ
をもたらす。非常に低い解離速度は本方法を実施
するのに必要な時間を長くし、かつフツク効果が
存在する場合に起るように低い逆解離速度の認識
を困難にする。この方法を常用の自動分析器で実
施すると有利であるので、装置の能力をもはや完
全には利用できない。 平均逆解離速度とは、約20秒間乃至60分間の測
定間隔を可能にするものである。この範囲の解離
速度は、レセプターとその結合成分である被分析
物との間の結合強度の相応する選択、例えば抗体
の結合強度の好適な選択により及び／又は結合強
度に作用を与える反応媒体中の添加物、例えば界
面活性物質及び塩により達成することができる。
そのために特に清浄剤及び／又はケイオトロープ
（caotrop）イオンを使用する。その際に、種々
の成分と所望の測定時間を、少なくとも１つの被
分析物濃度でこの時間（測定間隔）内に固相に結
合している標識の少なくとも10％が逆解離するよ
うに選択する。 酵素標識した第１レセプターを使用する本発明
の優れた実施形では、有利には全成分を恒温保持
しかつ相分離した後に、分離した固相を標識酵素
を測定するための呈色試薬の溶液と恒温保持し、
引続いて呈色試薬溶液を再度固相から分離し、か
つ分離した溶液中の逆解離速度を一定の時間間隔
で少なくとも２回測定することにより確定すると
有利である。この実施形は、呈色試薬溶液と固相
との間の接触の間に固相に結合した標識酵素の全
量及び場合によりこの恒温保持の間に解離する標
識酵素が色素形成に関与することをベースとす
る。相分離後に解離した標識酵素に帰因する他の
色素形成が行なわれる。それ故、解離した標識酵
素の量（これは被分析物と第１レセプターとから
の複合体の解離量に相当する）は２回の測定によ
り簡単に測定することができる。 本発明の他の実施形によれば、第１相分離後の
固相を基質溶液との代りに酵素標識したレセプタ
ーの場合には再び液相と恒温保持しかつ再度相分
離した後で固相に結合していた標識の減少か又は
液相中に移行した標識を測定する。特に、この実
施形は放射性標識又は色素標識もしくはけい光標
識に好適である。 原則的に、本発明方法はすべてのサンドイツチ
試験系に適用することができる。前提は、液相中
に残留した結合していない第１レセプターを分離
した後の標識化第１レセプターの測定可能な逆解
離だけである。 本発明方法の条件は、フツク効果を伴なつて及
びそれなしに良好に測定可能な逆解離が起るよう
に選択する。 実施例 次に本発明を添付図面に関連して実施例により
詳説する。 例 １ AFPの測定 (A) 試薬溶液の製造 (1) 基質緩衝剤 HEPES／NaOH PH7.0 70ミリモル／ 塩化ナトリウム 154μモル／ 牛血清アルブミン ３ｇ／ クロルフエノールレツド−β−Ｄ−ガラクト
シド（西ドイツ国特許第3345748号により製
造） ５ミリモル／ ツイーン20（非イオン系清浄剤） ２ｇ／ (2) レセプター１溶液 レセプター１としてモノクロナールのマウ
ス−抗−AFP−抗体を使用し、これはレセ
プター３とは別個の抗原決定因子を識別す
る。この抗体を含有する腹水に硫酸アンモニ
ウム全量1.8モル／を加える。沈殿を、塩
化ナトリウム50ミリモル／を含有するリン
酸ナトリウム（PH7.0）15ミリモル／中に
取る。このようにして得られた溶液をDEAE
−セルロースを介して通過させる。完全抗体
を公知方法でFab−フラグメントに分解す
る。得られたFab−フラグメントをE.イシカ
ワ（Ishikawa）著、“ジヤーナル・オブ・イ
ムノアツセイ（J.of Immunoassay）”、第４
巻、209〜327頁（1983年）の方法によりβ−
ガラクトシダーゼと結合させる。 (3) レセプター２溶液 羊−抗−マウス−Fcγ−抗血清を前記の(2)
に記載したように精製し、同様にDEAE−セ
ルロースを介して通過させる。 (4) レセプター３溶液 レセプター３としては、レセプター１とは
別個の決定因子を識別するモノクロナールの
マウス−抗−AFP−抗体を使用する。この
抗体を含有する腹水に硫酸アンモニウム全量
1.8モルを加える。沈殿を塩化ナトリウム50
ミリモル／を含有するリン酸ナトリウム緩
衝剤（PH7.0）15ミリモル／中に取る。こ
のようにして得られた溶液をDEAE−セルロ
ースを介して通過させる。 (B) 試薬担体の製造 (1) 試薬担体１ 溶液１当り、リン酸ナトリウムPH7.3（73
℃） 100ミリモル 塩化マグネシウム ２ミリモル 塩化ナトリウム ９ｇ 牛血清アルブミン ５ｇ マウスからの抗−AFP−モノクロナール抗
体（レセプター３溶液） ５mg 抗−AFP−抗体−（マウス）−Fab−フラグメ
ント−β−ガラクトシダーゼ−接合体（レセ
プター１溶液）；活性はオルト−ニトロフエ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシドにより37℃で測
定 2000U を含有する溶液40μを、市販のポリエステ
ル紙より成るフリース上に滴下する。室温で
乾燥させる。このフリースは使用するまで４
℃及び相対湿度20％で貯蔵する。 (2) 試薬担体２ セルロースフリース上にブロムシアン活性
化法（西ドイツ国特許公開第1768512号明細
書）によりマウス−抗体のFcγ部分に対する
羊−抗体（レセプター２溶液）を固定させ
る。その際に繊維材料１ｇ当り抗体10μｇが
固定に使われる。洗浄により結合していない
抗体を除去しかつフリースを注意深く室温で
乾燥させる。このようにして得られたフリー
スの貯蔵は試薬担体１と同じように行なう。 この両方の試薬担体１及び２を用いる測定は、
西ドイツ国特許公開第3425008号明細書に記載さ
れている分析測定を実施するための装置（第２
図）により行なう。該明細書は１つの構造部材よ
り成る自動遠心分析器用回転子挿入部材を開示し
ており、この部材は一定の試薬で含浸された吸収
性担持材料をそれぞれ包含する複数個の試薬区分
と連結している試料装入室、少なくとも１個の混
合弁室及び測定室を有しており、同時にこれら
は、挿入部材が回転子上に固定されかつ溶液を収
する少なくとも１個の他の室、及びこの室から測
定部に通じていて、試料液体輸送路と少なくとも
部分的に同一である輸送路を有する際に、半径方
向で内側から外側へ案内する試料液体輸送路を構
成する。その際に、試料液体輸送路は試料装入室
Ｐから、吸収性材料が充填され、緩衝液を含有す
る室ａ、室ｃ及び室ａとｃとの間に配置した第１
弁室VK１を介して第２弁室VK２に連結しかつ
弁室VK２から室ｄ及び捕集室AKを介して測定
室Ｋに接続している。他の液体を収容するため、
ポンプ室として構成した基質室PKが設けられて
おり、この基質室PKは配置室DK及び毛管Kap
より成る配置装置と溢流室U¨Kを介して第２弁室
VK２と連結している。第２図は使用される回転
子挿入部材を図示したものである。試薬担体１は
回転子挿入部材の区分ｃに配置しかつ試薬担体２
は区分ｄに配置する。試料40μは直接区分ａに
上縁部の開口部を通してピペツト装入する。試料
は0.9％−NaCl溶液で１：５に稀釈し、基質溶液
270μを室PK中にピペツト装入する。高い回転
数と停止とを交互に組合わせた好適な遠心プログ
ラムにより試料と基質は分離マトリツクスとキユ
ベツトの方向に供給される。 プログラムの進行に伴なつてレセプター１及び
３は試料液体により区分ｃから溶離し、かつ引続
いて均質な混合物が反応する。区分ｄで、形成さ
れた複合体はレセプター２に結合する。試料の区
分ｃから区分ｄへの移行は非常に短時間で行なわ
れる。 基質溶液は配置室DKを通して少量ずつに分け
られ、そのうちの第１の少量分は複合しなかつた
過剰の接合体の洗浄除去に使われる。複合体形成
を介して区分ｄで結合したβ−ガラクトシダーゼ
活性は試料中に含有されAFP量に比例する。こ
の活性度は他の基質分で測定し、その際に基質は
５分間の反応で着色生成物に変換される。形成さ
れた色素及び液相中の発色度／分をキユベツト
中、600nｍで測定する。 これらの条件下に次の結果が得られた：

【表】 すべての測定は600nｍ及び層厚0.3cmで実施し
かつ層厚ｄ＝１cmに換算した。 例 ２ IgE測定 例１と同様に行なつたが、次の点で異なつてい
る： (a) レセプター３としてヒトIgEに対して作用す
るモノクロナールのマウス−抗−IgE−抗体を
使用する。 (b) レセプター１として、レセプター３とは別個
の抗原決定因子を識別するモノクロナールのマ
ウス−抗−IgE−抗体を使用する。 (c) 試薬担体１の製造ではレセプター１溶液12ｍ
Ｕ／試験を使用する。 (d) 試料はNaCl溶液で１：３に稀釈する。 相応する条件下に次の結果が得られた：

【表】

【表】
〓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 不均一系イムノアツセイの原理により、被分
   析物を含有する試料溶液を、被分析物と結合性で
   特異的な、溶解相中に存在する標識した第１レセ
   プター及び第１レセプターとは交叉反応せずかつ
   被分析物と第１レセプターを含有する複合体を固
   定し得る、固相中に存在する第２レセプターと共
   に恒温保持し、恒温保持後に相分離し、かつ固相
   に結合した標識を定量測定することにより、結合
   性被分析物を測定する方法において固相に結合し
   た標識の溶解相中への逆解離速度を測定するが、
   この際逆解離速度は、固相に結合した標識の第１
   回目の測定に対して20秒間乃至60分間の時間をお
   いて少なくとも１回第２回目の測定を行なうこと
   により確定し、かつ逆解離速度と固相に結合した
   標識の定量測定値との商を第１回目の測定の試験
   結果の正確さの尺度として使うことを特徴とする
   結合性被分析物の測定法。 ２ 酸素標識した第１レセプターを使用し、標識
   酵素を測定するための呈色試薬の溶液と共に固相
   を恒温保持し、その後試薬溶液を固相から分離
   し、かつ試薬溶液中で一定の時間間隔で少なくと
   も２回測定することにより逆解離速度を確定する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 第１の測定後に、固相を再び液相と共に恒温
   保持し、かつ逆解離速度を、固相に残留している
   標識又は液相中に移行した標識を測定することに
   より確定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 第１レセプターとは別個の、被分析物の決定
   因子に対して作用する、被分析物に特異的な第３
   レセプターを添加し、かつ第２レセプターが第３
   レセプターと結合可能である特許請求の範囲第１
   項から第３項までのいずれか１項記載の方法。 ５ 第３レセプターとしてモノクロナール抗体を
   使用し、第１レセプターはモノクロナール抗体の
   Fab−フラグメントを含有し、かつ第２レセプタ
   ーは第３レセプターのFc−部分と結合可能であ
   る特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 試薬中の少なくとも１種のレセプターの逆解
   離速度は、抗体の結合定数による選択及び／又は
   清浄剤及び／又はケイオトロープイオンの添加に
   より調節する特許請求の範囲第１項から第５項ま
   でのいずれか１項記載の方法。 ７ 少なくとも１種のレセプターの逆解離速度
   は、少なくとも、測定時間中の被分析物の濃度で
   は固相に結合した標識の少なくとも10％が再び解
   離するように選択する特許請求の範囲第６項記載
   の方法。