JPH0147158B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はセフアロスポリンＣの酵素的脱アセチ
ル化によりデアセチルセフアロスポリンＣを製造
する新規な方法に関する。さらに詳細に述べれ
ば、本発明はセフアロスポリンＣまたはその塩と
オーレオバシデイウム属に属する菌株の新規なエ
ステラーゼとを接触させることによりデアセチル
セフアロスポリンＣまたはその塩を製造する新規
な方法に関する。 本発明の方法は下記の反応式で表される。 本発明の方法の目的化合物（）、即ちデアセ
チルセフアロスポリンＣは医薬として有用なセフ
アロスポリン化合物の合成における価値ある重要
な中間体として知られている。 種々の微生物のエステラーゼによつて、セフア
ロスポリンＣから脱アセチル化によりデアセチル
セフアロスポリンＣが生成されることはすでに知
られているが、これらの従来の方法はこの化合物
の工業的製造方法として必ずしも満足されるもの
ではない。 本発明者らはオーレオバシデイウム属に属する
菌株により生産されるエステラーゼがセフアロス
ポリンＣを脱アセチル化することによりデアセチ
ルセフアロスポリンＣを良好な収率、即ち、ほぼ
100％の転換率で転換することができるという新
知見を得、さらに鋭意研究の結果この発明を完成
した。 本発明によれば、水性媒体中でセフアロスポリ
ンＣまたはその塩をオーレオバシデイウム属に属
する菌株のエステラーゼとを、実質的にすべての
セフアロスポリンＣが脱アセチル化されるまで接
触させ、そしてこのように生成されたデアセチル
セフアロスポリンＣを固体として水性媒体から単
離することによりデアセチルセフアロスポリンを
製造することができる。 セフアロスポリンＣおよびデアセチルセフアロ
スポリンの好ましい塩としてはアルカリ金属塩
（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）またはア
ルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩等）
等が挙げられる。 本発明において使用されるオーレオバシデイウ
ム属に属する菌株には、セフアロスポリンＣの３
位におけるエステル結合を加水分解するエステラ
ーゼを生成するオーレオバシデイウム属に属する
すべての微生物が含まれ、天然に広く分布してい
るかあるいは菌株の保存機関に保存されている。
従つて、これらの菌株は土壌試料のごとき天然物
から分離することができ、また公共の寄託機関に
おけるタイプ・カルチユアから選ぶことができ
る。 上記微生物の代表的な例としては、オーレオバ
シデイウム・プルランスIFO4466を挙げることが
でき、これは寄託機関の１つである財団法人発酵
研究所（IFO）から入手できる。本発明の製法で
はまた、Ｘ線、紫外線照射、変異誘起剤（例え
ば、亜硝酸、Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン）による処理等のごとき通常使
用される変異手段により上記微生物から該エステ
ラーゼ活性を高める目的で得た変異株を用いても
よい。 本発明の方法によれば、セフアロスポリンＣと
微生物のエステラーゼの接触は本方法の種々な態
様で行うことができ、これらは下記の説明から明
らかになるであろう。 本発明の方法の１態様として、セフアロスポリ
ンＣと本発明の微生物のエステラーゼとの接触は
オーレオバシデイウム属に属する菌株の通常の培
養により得た培養物またはその処理物とセフアロ
スポリンＣとを水性媒体中で接触させることによ
り行なわれる。 本発明で使用される微生物の培養は一般に通常
の方法で行うことができ、そして通気撹拌下で有
利に実施できる。使用する培地としては、同化し
得る炭素および窒素源、および無機塩類を含む栄
養培地が使用できる。好適な炭素源としては、例
えば、グルコース、シユークロース、ラクトー
ス、グリセロールおよび澱粉が含まれる。好適な
窒素源としては有機の窒素源、例えば、肉エキ
ス、ペプトン、グルテンミール、コーンミール、
綿実粕、大豆粉、コーンスチープリカー、酵母エ
キス、カザミノ酸およびアミノ酸、ならびに無機
の窒素源、例えば、アンモニウム塩（例えば、硝
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等）である。
必要に応じて金属塩、例えば、炭酸カルシウム、
燐酸ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩
および銅塩、種々なビタミン類が培地に添加され
る。 培地の適切なPH、適切な培養温度および適切な
培養時間は使用する微生物の種類により異なる。
好ましいPHは通常PH５ないし８の範囲内である。
温度は通常約20℃ないし約30℃から選ばれ、好ま
しくは約25℃である。培養時間は通常15時間ない
し72時間から選ばれ、好ましくは24時間ないし50
時間である。 このようにして得られた培養物自体およびその
処理物がデアセチルセフアロスポリンＣの製造に
使用できる。培養物の処理物とは、酵素活性を高
めるために通常使用される方法で培養物から製造
したものであつてセフアロスポリンＣをデアセチ
ルセフアロスポリンＣに脱アセチル化しうるあら
ゆる加工物を意味する。 このエステラーゼ活性は通常菌糸体中に存在す
る。従つて培養物の処理物としては下記の加工物
を例示することができる。 (1) 過および遠心分離のごとき通常の方法で培
養物から分離した生菌糸体。 (2) 凍結乾燥および真空乾燥のごとき通常の方法
で上記生菌糸体を乾燥して得られた乾燥菌糸
体。 (3) 上記の生菌糸体または乾燥菌糸体を通常の方
法で破壊（例えば、有機溶媒を用いた自己消
化、アルミナ、海砂などを用いた磨砕、または
超音波による菌糸体の処理）して得た無細胞抽
出液。 (4) 上記の無細胞抽出液を通常の方法（例えば、
カラム・クロマトグラフイー）で精製又は部分
精製して得られた酵素溶液。 (5) 上記の菌糸体または酵素を通常の方法で固定
（例えば、アクリルアミド、ガラスビーズ、イ
オン交換樹脂法等を用いる方法）して製造した
固定化菌糸体または固定化酵素。 セフアロスポリンＣを該エステラーゼと接触さ
せることからなる反応は水または緩衝液のごとき
水性媒体中で実施できる。即ち、通常セフアロス
ポリンＣを含有する水または緩衝液のごとき水性
媒体に培養物又はその処理物を溶解もしくは懸濁
させることにより実施できる。 反応混合物の好ましいPH、セフアロスポリンＣ
の濃度、反応時間および反応温度は使用されるエ
ステラーゼを含有する培養物またはその処理物の
特性により異なる。通常、反応はPH３ないし７、
好ましくはPH3.5ないし５において20℃ないし40
℃、好ましくは25℃ないし37℃で２ないし50時間
実施される。 反応混合物における基質としてのセフアロスポ
リンＣの濃度は好ましくは0.1ないし100mg／mlの
範囲から選ばれる。 セフアロスポリンＣをエステラーゼと接触させ
るその他の方法としては工業的規模の生産に便利
な本方法の他の態様を挙げることができる。即
ち、セフアロスポリンＣの生産菌の培養物中のセ
フアロスポリンＣをそのまま培養物からセフアロ
スポリンＣを分離することなくオーレオバシデイ
ウム属に属するエステラーゼ生産菌の培養物中の
菌糸体と直接接触させてデアセチルセフアロスポ
リンＣを生成させる。 この目的にはセフアロスポリンＣ生産菌とオー
レオバシデイウム属に属するエステラーゼ生産菌
株との混合培養法を用いることが好ましい。セフ
アロスポリンＣ生産菌としてはセフアロスポリウ
ム・アクレモニウム（Cephalosporium
acremonium）があり、この菌は公知であり入手
できる（例えば、セフアロスポリウム・アクレモ
ニウムATCC11550）。 上記の混合培養は、培地中でセフアロスポリン
Ｃ生産菌（例えば、セフアロスポリウム・アクレ
モニウム）を培養し、次いで適当な時期にオーレ
オバシデイウム属に属するエステラーゼ生産菌株
をセフアロスポリンＣ生産菌の培養物中に接種
し、そして培養物中に蓄積されたセフアロスポリ
ンＣがデアセチルセフアロスポリンＣに変換され
るまでさらに培養を続けることにより好適に実施
できる。 換言すれば、混合培養はオーレオバシデイウム
属に属するエステラーゼ生産菌株を、セフアロス
ポリンＣ生産菌の培養期間中の適当な時点におい
てセフアロスポリンＣ生産菌の培養物に接種する
ことにより好適に開始できる。 上記の混合培養工程においては、オーレオバシ
デイウム属に属するエステラーゼ生産菌の接種は
セフアロスポリンＣ生産菌の培養物に上記菌株の
培養物を加えることにより好適に実施できる。さ
らに、エステラーゼ生産菌株を接種するのに適し
た時期は両微生物の菌株の種類および培養条件を
考慮し、かつ好適な条件を見出すための予備実験
に実際上従つて決定できる。そしてセフアロスポ
リンＣ生産菌の菌糸が培地中で生育し増加し始め
た時期およびセフアロスポリンＣ自体が生成し始
めて培養物中に増加し始めた時期が通常好ましい
と云える。より具体的にはエステラーゼ生産菌株
の接種時期は、セフアロスポリンＣ生産菌の培養
開始後２ないし６日、好ましくは３ないし５日に
設定することが適当である。 混合培養に使用する培地は、上記のオーレオバ
シデイウム属に属する菌株用の培地として例示し
たものと同様な成分を含むものを用いればよい。 培地は通常PH５−７の範囲、好ましくはPH５−
６の範囲のPHに調節することが適当である。混合
培養の温度は通常約20−30℃から選ばれ、好まし
くは約25℃である。適当な培養時間は通常少なく
とも２日以上である。 このように反応混合物または混合培養物中に生
成された目的化合物はセフアロスポリンの化学に
おいて使用される通常の方法により単離精製され
る。このような方法としては、適当な溶媒による
精製、減圧濃縮、凍結乾燥、結晶化、再結晶、ア
ニオンまたはカチオン交換樹脂またはマクロポー
ラス非イオン性吸着樹脂による処理等の方法が例
示できる。 上記で詳細に説明した如く、本発明者らはセフ
アロスポリンＣまたはその塩と、オーレオバシデ
イウム属に属する菌株、特にオーレオバシデイウ
ム・プルランスIFO4466のエステラーゼとを接触
させることからなるデアセチルセフアロスポリン
Ｃの新規で効果的な方法を見出したのである。上
記の知見後、本発明者らは本発明で使用されるオ
ーレオバシデイウム属のエステラーゼの特性の確
認および関連先行技術において公知のエステラー
ゼについてのこのエステラーゼの新規性の確認に
引続き鋭意研究を行つた結果、オーレオバシデイ
ウム属のエステラーゼはセフアロスポリンＣをデ
アセチルセフアロスポリンＣに加水分解しうる新
しい酵素であると結論した。 これに関しては関連先行技術として1975年10月
14日登録の米国特許第3912589を挙げることがで
き、これにはセフアロスポリンＣをデアセチルセ
フアロスポリンＣに加水分解しうるロドトルラ
（Rhodotorula）属のエステラーゼが記載されて
おり、そしてロドトルラ属と本発明のオーレオバ
シデイウム属とはそれぞれ酵母に属する微生物の
１種である点においてオーレオバシデイウム属に
近い菌である。 下記にオーレオバシデイウム属に属する代表的
な菌株であるオーレオバシデイウム・プルランス
IFO4466の菌株により生産されるエステラーゼの
性質および関連事項を詳細に説明する。 オーレオバシデイウム・ブルランスIFO4466の
培養物から単離精製してエステラーゼを製造し、
その製法の詳細は下記実施例３に示されている。 実施例３から明らかなごとく、このエステラー
ゼにはセフアロスポリンＣをデアセチルセフアロ
スポリンＣに加水分解しうる２つの酵素成分が含
まれ、そして次の記載から明らかなごとくこのエ
ステラーゼは酢酸エステルを加水分解するが酢酸
エステル以外のエステルは加水分解しない特性を
特徴とする。従つて、オーレオバシデイウム・プ
ルランスIFO4466から生成されるエステラーゼ
は、いわゆる「アセチルエステラーゼ」として命
名すべきものであり、従つて本発明者らは下記の
説明において便宜上本発明のエステラーゼの２つ
の成分をアセチルエステラーゼ4466−およびア
セチルエステラーゼ4466−と命名した。 アセチルエステラーゼ4466−およびアセチル
エステラーゼ4466−は次の酵素学的性質を有し
ている。 (1) 基質特異性（アセチルエステラーゼ4466−
および4466−）： 加水分解し得る基質：酢酸エステル 加水分解し得ない基質：酢酸エステル以外のエ
ステル 基質に対する特異性は下記の方法で測定した。 下記に述べる基質（５mg）を試験管に入れ、
0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）（１ml）中に溶解し
た。この溶液に実施例３で製造した酵素溶液Ａ
（即ち、アセチルエステラーゼ4466−）（0.1ml）
または酵素溶液Ｂ（即ち、アセチルエステラーゼ
4466−）（0.1ml）を加えた。 反応混合物を25℃で１時間振とう機上で加温し
た後、基質の加水分解を下記の方法で測定した。 (i) 分析１ （薄層クロマトグラフイー） 試験溶液（1μ）および標品をそれぞれシリ
カゲルプレート上にスポツトした。このプレート
を70％水性ｎ−プロパノールで展開し、乾燥し
た。検出は紫外線吸収により行なつた。 (ii) 分析２ （ガス・クロマトグラフイー） 試験溶液を下記の条件におけるガス・クロマト
グラフイーで分析した。 カラム：SE30 １ｍ キヤリヤー・ガス：N₂（15ml／分） カラム温度：80℃ 注入温度 ：120℃ 検出温度 ：80℃ 検出器：FID（空気1.0Kg／cm²Ｇ，H₂ 1.0Kg／cm²
Ｇ） 結果を下記の表に示す。

【表】

【表】 ＋：部分的に加水分解される
−：加水分解されない
(2) PHの効果 (A) 基質：セフアロスポリンＣ (a) 至適PH（アセチルエステラーゼ4466−およ
び4466−）：PH４以下 添付図面の第１図に示したごとく、アセチルエ
ステラーゼ4466−（０−０）の至適PHおよびア
セチルエステラーゼ4466−（△−△）の至適PH
は４以下である。 種々なPHにおける酵素活性を次の方法で測定し
た。 (i) 緩衝溶液 PH3.5−6.0：0.05酢酸緩衝液 PH5.0−8.0：0.1Mリン酸緩衝液 PH7.0−9.5：0.1Mトリスー塩酸緩衝液 (ii) 反応 酵素溶液（0.5ml）に上記のごとき種々なPHの
加温した（30℃）緩衝液（４ml）および５％セフ
アロスポリンＣナトリウム・２水和物水溶液
（0.5ml）を加えた。反応混合物を30℃で１時間振
とう機上で加温した。次いで生成したデアセチル
セフアロスポリンＣおよび未反応のセフアロスポ
リンＣを高速液体クロマトグラフイーで測定し
た。 (b) 安定PH範囲（アセチルエステラーゼ4466−
および4466−）：PH4.0−6.0 添付図面の第２図に示したごとく、アセチルエ
ステラーゼ4466−（０−０）およびアセチルエ
ステラーゼ4466−（△−△）はPH4.0−6.0の範
囲において安定である。 この安定度試験は次の方法で実施した。 酵素溶液（１ml）に上記のごとき種々なPHの緩
衝液（９ml）を加えた。この酵素溶液（10ml）を
60℃で１時間加熱した。次いで、アセチルエステ
ラーゼの残留酵素活性を下記に述べる測定方法
に従つて測定した。 (B) 基質：酢酸エチル 至適PH（アセチルエステラーゼ4466−および
4466−）：PH5.25付近 添付図面の第５図に示すごとく、アセチルエス
テラーゼ4466−（０−０）の至適PHおよびアセ
チルエステラーゼ4466−（△−△）の至適PH
は、酢酸エチルを基質とした場合、PH5.25付近で
ある。 種々なPHにおける酵素活性は次の方法で測定し
た。 酢酸エチル（5μ）に上記のごとき種々のPH
の加温した（30℃）緩衝液（１ml）および酵素溶
液（300μ）を加えた。この反応混合物を30℃
で１時間振とう機上で加温した。次いで生成した
エタノールと未反応の酢酸エチルをガス・クロマ
トグラフイーで測定した。 (3) 温度の影響 (a) 至適温度（アセチルエステラーゼ4466−お
よび4466−）：37℃付近 添付図面の第３図に示したごとく、アセチルエ
ステラーゼ4466−（０−０）の至適温度および
アセチルエステラーゼ4466−（△−△）は37℃
付近である。 種々な温度における酵素活性は次の方法で測定
した。 酵素溶液（0.5ml）に所定の温度に温めた
0.05M酢酸緩衝液（PH4.0）（４ml）、および５％
セフアロスポリンＣナトリウム・２水和物水溶液
（0.5ml）を加えた。この反応混合物を所定の温度
で１時間振とう機上で加温した。次いで、生成し
たデアセチルセフアロスポリンＣおよび未反応の
セフアロスポリンＣを高速液体クロマトグラフイ
ーで測定した。 (b) 安定温度範囲（アセチルエステラーゼ4466−
および4466−）：60℃以下 添付図面の第４図に示すごとく、アセチルエス
テラーゼ4466―（０−０）およびアセチルエス
テラーゼ4466−（△−△）は60℃以下で安定で
ある。 この安定度試験は下記の方法で実施した。 酵素溶液（PH4.0）を所定温度（25−70℃）で
１時間放置した。次いで残留酵素活性を下記に述
べる測定方法に従つて測定した。 (4) Kmの測定 （基質がセフアロスポリンＣの場合） アセチルエステラーゼ4466−： Km＝11.5mM アセチルエステラーゼ4466−： Km＝13.7mM アセチルエステラーゼ4466−およびアセチル
エステラーゼ4466−のKm値は次の方法で測定
した。 セフアロスポリンＣナトリウム・２水和物を
種々な濃度（0.2−５％）で含有する0.05M酢酸
緩衝液（PH4.0）（4.5ml）に酵素溶液（0.5ml）を
加えた。 この反応混合物を30℃で１時間振とう機上で加
温した。次いで生成したデアセチルセフアロスポ
リンＣおよび未反応のセフアロスポリンＣを高速
液体クロマトグラフイーで測定した。各エステラ
ーゼのKm値は常法により計算した。 (5) 金属イオンの影響 アセチルエステラーゼ4466−およびアセチル
エステラーゼ4466−の酵素活性はCu²⁺，
Mn²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Fe³⁺
のごとき金属イオンに影響されない。 このアセチルエステラーゼに対する金属イオン
の影響は次の方法で測定した。 酵素溶液（0.5ml）に上述のごとき金属イオン
の１つを含有する（５×10^-4mol）0.05M酢酸緩
衝液（PH4.0）および５％セフアロスポリンＣナ
トリウム・２水和物水溶液（0.5ml）を加えた。
この反応混合物を30℃で１時間振とう機上で加温
した。次いで生成したデアセチルセフアロスポリ
ンＣおよび未反応のセフアロスポリンＣを高速液
体クロマトグラフイーにより測定した。 対照として、上述の方法において金属イオンを
含まない0.05M酢酸緩衝液（PH4.0）を用いた。 エステラーゼの酵素活性は次の方法で測定でき
る。 測定方法 (a) 反応 酵素溶液（0.5ml）に加温した（30℃）0.05M
酢酸緩衝液（４ml）およびセフアロスポリンＣナ
トリウム・２水和物（50mg／ml）を含有する
0.05M酢酸緩衝液（0.5ml）を加える。反応混合
物を30℃で１時間振とう機上で加温する。次い
で、生成したデアセチルセフアロスポリンＣおよ
び未反応のセフアロスポリンＣをそれぞれ下記の
条件において高速液体クロマトグラフイーで決定
した。 固定相：ポリゴシル60−10C₁₈（商品名、住友化
学工業株式会社製） 移動相：メタノール、水および酢酸（100：
900：５）の混合物 カラムの長さ：30cm カラム温度：室温 検出：250nmにおける紫外線吸収 流速：1.0ml／分 酵素活性（mg／時・mlまたはmg）は上記の反応
条件における酵素製剤（１mlまたは１mg）当りの
得られたデアセチルセフアロスポリンＣの量
（mg）で表わされる。 (b) 比活性の計算方法 (i) 蛋白含有量の決定 酵素製剤における蛋白含有量は標準サンプルと
して牛血清アルブミンを用いてロウリー
（Lawry）法〔ジヤーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー193、265（1951）参照〕に従つ
て決定できる。 (ii) 比活性の計算 比活性は下記の式に従つて計算できる。 比活性＝酵素活性（mg／時間・mlまたはmg）／蛋白含
有量（mg／mlまたはmg） 上記で説明したごとき酵素学的性質の観察か
ら、本発明のアセチルエステラーゼは既知のエス
テラーゼと比較して非常に特異な性質、特にセフ
アロスポリンＣをデアセチルセフアロスポリンＣ
に加水分解する能力、非常に狭い基質特異性（即
ち、このアセチルエステラーゼは酢酸エステルの
みを加水分解するが他のエステルを加水分解しな
い）および独特な至適PH（即ち、このアセチルエ
ステラーゼはかなりの酸性側に至適PHを有する）
を有している。 さらに、セフアロスポリンＣをデアセチルセフ
アロスポリンＣに加水分解しうる既知のエステラ
ーゼ、即ち、ロドトルラ属、その代表的なものと
してロドトルラ・グルチニスIFO1125により生産
されるエステラーゼと本発明のアセチルエステラ
ーゼを比較すれば、本発明のアセチルエステラー
ゼ（以下AEと称す）は、例えば次の点において
ロドトルラ属により生産されるエステラーゼ（以
下REと称す）と全く相違する。即ち、AEの至適
PHはPH４以下であるがREのそれはPH５ないし６
付近であり、AEの至適温度は約37℃であるがRE
のそれは約50℃であり、そしてAEの安定PH範囲
は約PH4.0〜6.0であるのに対し、REのそれは約PH
6.0である。 上述の結果を鋭意研究および分析することによ
り、本発明者らはアセチルエステラーゼ4466−
およびアセチルエステラーゼ4466−は新規な酵
素であると結論した。 下記の実施例は本発明を例示する目的で示した
ものである。 実施例 １ グルコース１％、ペプトン0.3％および肉エキ
ス0.3％を含有する水性培地（PH7.0）（100ml）を
４本の500ml容エーレンメーヤー・フラスコの
各々に注入し、120℃で20分間滅菌した。各々の
培地にオーレオバシデイウム・プルランス
IFO4466の斜面培養物の１白金耳量を加え、菌を
振とう機上25℃で２日間生育させた。 さらに、上記と同じ水性培地（20）を30容
のジヤー・フアーメンターに注入し、120℃で20
分間滅菌した。この培地に上記の培養物の全量を
加えた。 菌は25℃で２日間生育させた。 このようにして得られた培養物を下記のデアセ
チルセフアロスポリンＣの製造に用いた。 (1) （オーレオバシデイウム・プルランスの菌糸
体を用いたデアセチルセフアロスポリンＣの製
造）。 上記の培養物を遠心分離して得た湿潤菌糸体
（10ｇ）を、セフアロスポリンＣナトリウム・２
水和物（25mg／ml）を含有する水溶液（300ml）
に加えた。反応混合物を、混合物中でセフアロス
ポリンＣが消失するまでPH4.5および30℃で10時
間撹拌した。得られた混合物を過した。液を
PH7.0に調節し、減圧下で濃縮して結晶を得、こ
れを１夜５℃で放置した。この結晶に少量の75％
水性エタノールを加え、混合物をらいかいした。 結晶を過してとり出し、真空中で乾燥して結
晶状のデアセチルセフアロスポリンＣ（３・８ｇ）
を得た。 上記で得られた結晶のIRスペクトルはデアセ
チルセフアロスポリンＣの標品のそれと一致し
た。 (2) （オーレオバシジイウム・プルランスの菌糸
体から得た酵素抽出物を用いたデアセチルセフ
アロスポリンＣの製造）上記と同様にして得
た。 湿潤菌糸体（10ｇ）に少量のクロロホルムを加
えた。この混合物を室温で30分間放置した。この
混合物に蒸留水（20ml）を加えた。 室温で１日放置した後、混合物を遠心分離して
酵素抽出物（20ml）を得た。この酵素抽出物を、
セフアロスポリンＣナトリウム・２水和物（25
mg／ml）を含む水溶液（300ml）に加えた。反応
混合物を、混合物中のセフアロスポリンＣが消失
するまでPH4.5および30℃で10時間撹拌した。得
られた混合物に活性炭（３ｇ）を加え、混合物を
過した。液をPH7.0に調節し、減圧下で濃縮
して結晶を得、これに少量の75％水性エタノール
を加え、混合物をらいかいした。過して結晶を
分離し、真空中で乾燥して結晶状のデアセチルセ
フアロスポリンＣ（3.6ｇ）を得た。 上記で得られた結晶のIRスペクトルはデアセ
チルセフアロスポリンＣの標品のそれと一致し
た。 (3) （固定化菌糸体を用いたデアセチルセフアロ
スポリンＣの製造） 凍結し氷解したオーレオバシデイウム・プルラ
ンスIFO4466の菌糸体（24ｇ）をアクリルアミド
（7.5ｇ）およびＮ，N′−メチレンビスアクリルア
ミド（0.4ｇ）を含有する水溶液（20ml）に加え
た。この混合物に５％Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラ
メチルエチレンジアミン水溶液（５ml）および１
％過硫酸アンモニウム水溶液（５ml）を４℃で窒
素雰囲気中で加えた。反応混合物をガラス管中４
℃で１時間重合した。このようにして生成したポ
リアクリルアミド・ゲルを押出し、粉砕器で砕い
た。砕いたゲルをカラム（100ml容）に充填し、
0.1M酢酸緩衝液および冷水（１）で洗浄した。
セフアロスポリンＣナトリウム・２水和物（1.6
mg／ml）を含有する水溶液（１）を上記で調製
したカラムにSV＝0.5の流速で通液した。流出液
にセフアロスポリンＣナトリウム・２水和物が存
在しないことが確認された後、流出液をPH7.0に
調節し、減圧下で濃縮し、５℃で１夜放置した。
残渣に75％水性エタノールを加え、充分混合して
結晶を析出させ、結晶を分離し、真空中で乾燥し
て結晶状のデアセチルセフアロスポリンＣ（0.9
ｇ）を得た。 この結晶のIRスペクトルはデアセチルセフア
ロスポリンＣの標品のそれと一致した。 実施例 ２ 大豆粉３％、シユークロース２％、グルコース
１％、コーン・スチープ・リカー１％および炭酸
カルシウム0.5％を含有する水性培地（PH7.0）
（100ml）を４本の500ml容エーレンメーヤー・フ
ラスコの各々に注入し、120℃で20分間滅菌した。
各々の培地上にセフアロスポリウム・アクレモニ
ウムATCC11550の斜面培養物の１白金耳量を接
種した。菌を振とう機上30℃で５日間生育させ
た。 １方、落花生粉３％、大豆粉１％、コーン・ス
チープ・リカー２％、オレイン酸メチル２％、硫
酸アンモニウム0.5％、DL−メチオニン0.6％、廃
糖密２％、グルコース２％および炭酸カルシウム
0.8％を含有する水性培地（PH7.0）（20）を30
容のジヤー・フアーメンターに注入し、120℃
で20分間滅菌した。この培地に上記の培養物の全
量を接種した。菌は25℃で３日間生育させた。 さらに、グルコース１％、ペプトン0.3％およ
び肉エキス0.3％を含有する水性培地（100ml）
（PH7.0）を４本の500ml容のエーレンメーヤー・
フラスコの各々に注入し、120℃で20分間滅菌し
た。この培地の各々にオーレオバシデイウム・プ
ルランスIFO4466の１白金耳量を接種した。菌は
25℃で２日間培養した。培養物の全量を、上記の
ごとく得られたセフアロスポリウム・アクレモニ
ウムの３日間培養物に接種し、この混合培養物を
25℃で２日間加温した。次いで、混合培養物をバ
チラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
を用いてバイオオートグラフイーおよびバイオア
ツセイにより検定した。検定の結果、培養物中の
セフアロスポリンＣのすべてがデアセチルセフア
ロスポリンに変換されておりそしてデアセチルセ
フアロスポリンＣの収量が0.5mg／mlであること
が確認された。 実施例 ３ 実施例１に記載したものと実質的に同じ方法で
製造したオーレオバシデイウム・プルランス
IFO4466の培養物（10）から遠心分離で菌糸体
（350ml）を採取した。この菌糸体に1/5容量のク
ロロホルムを加えた。 混合物を30分間撹拌し、２倍量の水を混合物に
加えた。この水性混合物を25℃で24時間放置し
た。 混合物を過して「酵素抽出物」（1000ml）
を得、PH4.0に調節し、次いで過して不溶性の
物質を除去した。液を膜（分子量：0.1ミクロ
ン・カツト）の限外過にかけて濃縮物（80ml）
を得、これを凍結乾燥して粗製粉末を得た。この
粗製粉末（４ｇ）を0.05M酢酸緩衝液（PH4.0）
（20ml）に溶かし、CM−セフアデツクスＣ−25
のカラム（商品名、フアルマシアAB社製、カラ
ムの内径40mm、カラムの高さ675mm）に通夜し、
このカラムを上述のものと同じ酢酸緩衝液で展開
した（流速、64ml／時間）。目的化合物を含有す
る分画（440ml）を集め、DEAE−セフアデツク
スＡ−25のカラム（商品名、フアルマシアAB社
製、カラムの内径40mm、カラムの高さ785mm）に
通液した。このカラムを0.05M酢酸緩衝液（PH
4.0）で洗浄し、直線傾斜法において（0.05M−
0.25M）酢酸緩衝液（PH4.0）で展開して（流速、
64ml／時間）「分画Ａ」（360ml）および「分画Ｂ」
（980ml）を得た。 分画Ａは分画Ｂよりも1.7倍の比活性を有した。
分画Ａおよび分画Ｂをそれぞれ限外過で濃縮
し、セフアロース4Bのカラム（商品名、フアル
マシアAB社製、カラムの内径29mm、カラムの高
さ535mm）に通液した。各々のカラムを0.05M酢
酸緩衝液（PH4.0）で展開してそれぞれ分画Ａか
ら「酵素溶液Ａ」（72ml）および分画Ｂから「酵
素溶液Ｂ」（32ml）を得た。 上記のごとく製造した酵素製剤のおのおのの比
活性を下記の表に相対的比活性として示す。これ
に関して、「相対的比活性」は「酵素抽出物」
の活性を１とした基準で計算された数値で示す。 酵素製剤 相対的比活性 酵素抽出物 １ 分画Ａ 110 分画Ｂ 64 酵素溶液Ａ 167 酵素溶液Ｂ 105

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図、第４図および第５図
はこの発明のアセチルエステラーゼ4466−およ
び4466−のPH活性曲線（基質：セフアロスポリ
ンＣ）、PH安定曲線、温度活性曲線、温度安定化
曲線およびPH活性曲線（基質：酢酸エチル）をそ
れぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ セフアロスポリンＣから酵素的加水分解によ
   りデアセチルセフアロスポリンＣを製造する方法
   において、セフアロスポリンＣまたはその塩類を
   オーレオバシデイウム（Aureobasidium）属の
   菌株またはその変異株により産生されるエステラ
   ーゼと接触させることを特徴とするデアセチルセ
   フアロスポリンＣまたはその塩類の製法。 ２ オーレオバシデイウム属の菌株がオーレオバ
   シデイウム・プルランス（Aureobasidium
   pullulans）の菌株である特許請求の範囲第１項
   記載の製法。 ３ セフアロスポリンＣをオーレオバシデイウム
   属の菌株の培養物に含まれるエステラーゼと接触
   させることにより行なう特許請求の範囲第１項記
   載の製法。 ４ セフアロスポリンＣをオーレオバシデイウム
   属の菌株の培養物から得られた処理物中に含まれ
   るエステラーゼと接触させることにより行なう特
   許請求の範囲第１項記載の製法。 ５ 処理物が菌株、固定化菌体、固定化酵素、精
   製酵素標品である特許請求の範囲第４項記載の製
   法。 ６ セフアロスポリンＣとエステラーゼとの接触
   をセフアロスポリンＣ生産菌株とオーレオバシデ
   イウム属に属する菌株との混合培養により行なう
   特許請求の範囲第１項記載の製法。